CN103108957B - 全蛋蛋白肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

提供了一种全蛋蛋白肽及其制备方法。其中所述全蛋蛋白肽是通过采用由木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶组成的复合蛋白酶对全蛋蛋白粉进行酶解获得的。该全蛋蛋白肽可用于制备增强免疫力的产品。

Description

全蛋蛋白肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种新型肽类免疫剂全蛋蛋白肽的制备方法与应用。

背景技术

通常肽类免疫剂都属于多肽激素类，主要是药物，如胸腺肽、胸腺五肽、免疫球蛋白、丙种球蛋白、人血清白蛋白、干扰素、肿瘤细胞坏死因子、白细胞介素I、白细胞介素II、白细胞介素III等。这些肽类免疫剂都是从动物的腺体、组织或血液中分离提取的。这些多肽药物大都是针剂，只能对一定的病人使用，使用过程中，容易产生排异、过敏和副作用反应，须谨慎，必须在医生严格监督下使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种肽类免疫剂全蛋蛋白肽及其制备方法。

本发明所提供的全蛋蛋白肽是按照下述方法制备得到的：采用复合植物蛋白酶对全蛋蛋白粉进行酶催化降解，得到所述全蛋蛋白肽。

其中，所述复合植物蛋白酶可由木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶组成，其酶活力比为(100～120万)U:(30～40万)U:(560～700万)U。

所述全蛋蛋白粉可由下述至少一种禽鸟蛋为原料制备得到的：鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鹌鹑蛋、麻雀蛋、鸽蛋、斑鸠蛋和鸵鸟蛋。

所述酶催化降解的反应体系中，全蛋蛋白粉与水的质量份数比为1：8-10，酶解每克全蛋蛋白粉所需各种酶的量为:木瓜蛋白酶5～6万U,无花果蛋白酶1.5～2万U,菠萝蛋白酶28～35万U。所述酶催化降解的温度为48～50℃,时间为3～4小时，pH值为7.5～8.5。

在酶催化降解反应结束后，还需对酶解液进行灭菌和酶灭活处理，然后再对所述酶解液进行冷却、冷冻处理，即得到最终的全蛋蛋白肽。所述冷冻的温度为4～8℃，时间为48小时；所述灭菌和酶灭活的条件为：温度100℃，时间10分钟。

本发明中，酶活力单位U是指在特定条件下（25℃，pH7.0），每1分钟转化1微摩尔的底物所需的酶量或转化1微摩尔的有关基团所需的酶量。

本发明所得到的全蛋蛋白肽含有多肽，寡肽，20种氨基酸(其中有8种是人体必需而又不能合成的氨基酸)，多种维生素(VA、VC、VE、Bl、B2、B6、B12)，钙及多种人体极易吸收的有机天然的各种微量元素(CPPS，蛋白锌、硒、镁、铜、铁、锰等，这些微量元素与蛋白质天然螯合)。所述多肽和寡肽的相对分子质量均在1000Da以下，由2-6个氨基酸组成。所述全蛋蛋白肽可以以浓缩液、冻干粉、喷雾干燥干粉、水剂或固体剂的形式存在。

本发明的另一个目的是提供所述全蛋蛋白肽的应用。

本发明所提供的全蛋蛋白肽的应用是其在制备增强免疫力的产品中的应用。

本发明的再一个目的是提供一种用于增强免疫力的产品。

本发明所提供的用于增强免疫力的产品，其活性成分包括本发明所提供的全蛋蛋白肽。所述产品可为药品或保健品。

当然，还可根据需要在所述产品中加入其它能增强免疫力的物质,如大枣多糖和枸杞多糖。所述增强免疫力产品中，全蛋蛋白肽、大枣多糖和枸杞多糖的质量比可为（900-1200）：（8-30）：（3-15）。

以全蛋蛋白肽为活性成分制备的增强免疫力的药物或保健品，需要的时候，在上述药物或保健品中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

所述增强免疫力的药物可以制成口服液、片剂、颗粒剂、胶囊、膏剂、膜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备，所得到的药物均无苦味。

以全蛋蛋白粉为原料进行酶解是本发明的一个显著特点。上述蛋类的蛋白质评分均接近100分，其蛋白质与人体蛋白质接近，容易被人体吸收和利用。而选择全蛋是科学的选择，若仅选择蛋清蛋白质，蛋黄中的蛋白质和很多营养素会丢失；若仅选择蛋黄，蛋清中的蛋白质也同样丢失，选择全蛋也就是选择了一个完整的营养体系，不仅营养全面，而且各营养物质彼此可发挥协同增效作用。

本发明采用复合植物蛋白酶，即木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶，三酶科学配方形成复合酶制剂，对全蛋蛋白粉进行催化降解，获得全蛋蛋白肽。该全蛋蛋白肽可替代多肽激素类免疫剂，起到多肽激素类免疫剂的免疫调节作用。多肽激素类免疫剂是药物，只能对病人使用，而本发明的产品可以制成口服的多肽营养免疫剂，不仅能对病人起到治疗的效果，而且能对无病的人起到增强免疫力、防病健体的作用。该产品是一种口服制剂，比针剂携带方便、使用安全，使用时不会产生排异、过敏或其他副作用反应，不需在医生的监督下使用。可用于免疫功能低下、免疫功能障碍、免疫功能下降、免疫器官受损等引起的诸多疾病和亚健康状态，还可用于蛋白质营养缺乏者，因蛋白质营养缺乏引起的诸多病症及亚健康状态的人群，可用于预防感冒，可用于运动后、产后、病后、术后人群，促进“负氮平衡”，对产后恢复、病后恢复、伤口愈合、保肝护肝、醒酒、恢复食欲、促进睡眠、恢复肾脏功能、刺激巨噬细胞的吞噬能力、抑制肿瘤细胞的生长、升高白血球等有较好的作用。

本发明以全蛋蛋白粉为底物，采用复合植物蛋白酶：即木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶，三酶科学配方形成复合酶制剂，对全蛋蛋白粉进行催化、降解，得到全蛋蛋白肽。该产品具有较高的生物活性，是一种新型的免疫调节剂和免疫增强剂。本发明的全蛋蛋白肽可用于开发免疫药剂、保健食品、功能食品、抗衰老和婴幼儿食品及重病患者的营养补充剂。本发明通过冷冻干燥制成冻干粉,进而可制成胶囊或片剂,可深度开发肿瘤辅助治疗药物（增强免疫功能，增强放化疗患者抗辐射能力、升高红、白血球）、抗炎药物及肝炎治疗药物、非典型肺炎的防治药物,也可作为其他药物原料或作为食品添加剂。无论哪类药物、保健品、功能食品的开发都将产生巨大的经济和社会效益，其前景非常广阔。

附图说明

图1为本发明制备全蛋蛋白肽的生产工艺流程图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、制备增强免疫力的全蛋蛋白肽口服液

将全蛋蛋白粉（冷冻干燥干粉或喷雾干燥干粉）放到发酵罐内，加相当于全蛋蛋白粉质量10倍的水，逐步将温度升至50℃时，将按酶解每克全蛋蛋白粉所需各种酶的量为:木瓜蛋白酶5万U,无花果蛋白酶2万U,菠萝蛋白酶35万U配伍成的复合蛋白酶加入发酵罐中酶解。温度始终保持在50℃，酶解4小时后，进行灭菌和酶灭活处理,然后冷却至60℃进行装桶，再冷却至常温时放入冷藏室，冷冻沉降2天后过滤，即获得全蛋蛋白肽浓缩液。然后进行配制，配制的功效成分构成为：每100ml口服液中含全蛋蛋白肽1000mg±10%,配制后灌装并于100℃灭菌10分钟，即得到增强免疫力的口服液。

实施例2、制备含大枣多糖和枸杞多糖的增强免疫力的全蛋蛋白肽口服液

将全蛋蛋白粉（冷冻干燥干粉或喷雾干燥干粉）放到发酵罐内，加相当于全蛋蛋白粉质量8倍的水，逐步将温度加温至48℃时，按照酶解每克全蛋蛋白粉需木瓜蛋白酶6万U，无花果蛋白酶1.5万U,菠萝蛋白酶28万U，将上述三种酶配伍成复合蛋白酶加入发酵罐中进行酶解，温度始终保持在48℃，酶解3.5小时后，进行灭菌和酶灭活处理，然后冷却至60℃进行装桶，再冷却至常温时放入冷藏室，冷冻沉降2天后过滤，即获得全蛋蛋白肽浓缩液。然后进行配制，配制的功效成分构成为：每100ml口服液中含全蛋蛋白肽1000mg±10%，大枣多糖10mg，枸杞多糖5mg，配制后灌装并于100℃灭菌10分钟，即得到增强免疫力的口服液。

实施例3、制备含大枣多糖和枸杞多糖的增强免疫力的全蛋蛋白肽口服液

将全蛋蛋白粉（冷冻干燥干粉或喷雾干燥干粉）放到发酵罐内，加相当于全蛋蛋白粉质量8倍的水，逐步将温度加温至50℃时，按照酶解每克全蛋蛋白粉需木瓜蛋白酶6万U，无花果蛋白酶2万U,菠萝蛋白32万U，将上述三种酶配伍成复合蛋白酶加入发酵罐中进行酶解，，温度始终保持在50℃，酶解3小时后，进行冷却装桶，再冷却12℃时放入冷藏室，冷冻沉淀2天后过滤，即获得全蛋蛋白肽浓缩液。然后进行配制，配制的功效成分构成为：每100ml口服液中含全蛋蛋白肽1000mg±10%，大枣多糖15mg，枸杞多糖10mg，配制后灌装并于100℃灭菌10分钟，即得到增强免疫力的口服液。

实施例4、增强免疫力的口服液初步稳定性试验

试验样品：实施例1制备的口服液

考察指标：

1、性状：按常规方法对样品的形状（含颜色）及气味进行检查。

2、含量测定：

对样品中的主要成分，即以有机氮（%）表示肽及氨基酸含量，测定方法参照GB5009。

3、卫生学及理化指标检查：按照食品卫生国标GB4789、GB5009要求对产品中的细菌总数、大肠菌群、致病菌、霉菌及酵母和砷、铅、汞含量进行检测。

4、加速试验：

将三批不同日期生产的样品（批号分别为090718、090720、090724，均为玻璃瓶装）置于相对湿度为75%的干燥器内（干燥器底部放置氯化钠饱和溶液），然后将干燥器放入37℃恒温箱中，连续加热三个月，定期抽样（0、1、2、3月），测定相关指标（结果见表1-3）。在三个月的加速试验中各项指标均未发生明显变化，由此可推算出：本品的室温留样期大于2年。

表1、批号090718样品的稳定性结果

表2、批号090720样品的稳定性结果

表3、批号090724样品的稳定性结果

结论：本品对热比较稳定，在常温下可保存两年。

实施例5、增强免疫力的口服液的安全性评价试验

1）急性毒性试验

动物：昆明种小鼠18-20g，雌雄各半，共20只；动物由湖北省医学实验动物中心提供。

受试药物：实施例1制备的增强免疫力的口服液。

给药方式：受试动物按0.3ml/10g.b.w灌胃。灌胃前禁食12h，观察一周。

结果：小鼠灌胃后无中毒症状，一周内无死亡，LD50＞30ml/kg。按急性毒性分级，该受试品属无毒类物质。

2）微核试验

动物：昆明种小鼠，25-27g。

试验方法：两次灌胃给予受试药物，第二次灌胃6h后，处死动物，取胸骨髓用小牛血清稀释涂片，Gimsa染色，每只动物显微镜下观察1000个嗜多染红细胞。记录微核细胞形成的数目，以千分率表示。结果见表4。其中，CP组为环磷酰胺阳性对照组。

表4

结论：各实验组与阴性对照组结果比较，无显著性差异；表明该受试产品骨髓微核试验结果为阴性。

3）小鼠精子畸形试验：

动物：昆明种小鼠23-25g。

试验方法：连续灌胃5天后，再继续饲喂30天。处死动物，取两侧副睾制片。每只动物计数1000个结构完整的精子，计算精子畸形发生率。结果见表5。其中，CP组为环磷酰胺阳性对照组。

表5

结论：各实验组与阴性对照组结果比较，无显著性差异；表明该受试产品精子畸形试验结果为阴性。

4）Ames试验

采用经鉴定符合生物学要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株菌株进行试验：采用多氯联苯（PCB）诱导的大鼠肝匀浆作为体外活化系统（+S₉）。受试产品分为三个剂量组，样品稀释成不同浓度，灭菌每皿加入0.5ml，使浓度分别为1：10、1：100、1：1000。采用掺入法记录两次重复的平行样品结果。结果见表6。

表6

注：-S₉阳性对照组为3-硝基9-芴酮（2.4.7-TNFone），+S9阳性对照组为2-氨基芴(2-AF)

由上表可知，各实验组回变菌落数均未超过自发回变数的两倍；且无剂量反应关系，试验结果为阴性。

实施例6、全蛋蛋白肽的免疫调节作用检测

1、试验动物：昆明种小鼠18-22g，雌雄各半。（湖北省医学实验动物中心提供）

2、分组：剂量分组为：对照组，灌胃蒸馏水；“实施1制备的口服液”的浓度为1%（即1000mg/100ml），低、中、高剂量组分别以100mg/kg．b．w、300mg/kg．b．w、900mg/kg．b．w的口服液灌胃；低、中、高剂量组剂量分别相当于人推荐摄入量的6、18、54倍。灌胃一个月，然后进行各项实验。

3、实验方法与结果：

3.1ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验

方法：MTT法（ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验）对各组加ConA孔与不加ConA孔吸光度差值的均值进行单因素方差分析。

结果：见表7。

从表7可见，组间差距显著,“口服液”低剂量组显著性增强ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力。

表7“口服液”对小鼠细胞免疫功能的影响

与对照组比较*P<0.05注：取0.2ml测定OD₅₇₀值

3.2二硝基氟苯（DNFB）诱导迟发型变态反应（DTH）

方法：耳肿胀法。用DNFB致敏小鼠后，第五天再用DNFB攻击右耳，24h后处死动物剪下左右耳壳用打孔器取下直径8mm的耳片，称重，以左右耳的重量之差来表示DTH的程度。

结果：见表7。

从表7可见：“口服液”低剂量组可显著提高小鼠对DNFB诱发的DTH反应。

3.3血清溶血素的测定

方法：血凝法。根据血清凝聚程度的级别计算出抗体积数,对各组抗体积数的均值进行单因素方差分析.

结果：见表8。

从表8可见，组间差距显著,“口服液”低、高剂量组可显著性增加血清溶血素含量。

表8“口服液”对小鼠体液免疫功能的影响

与对照组比较*P<0.01

3.4腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验

方法：半体内法。制备20%的鸡红细胞悬液；每只鼠腹腔注射1mL该悬液，30min后处死动物，开腹，经腹腔注入生理盐水2mL，平均分滴于2片载玻片上，37℃温育30min；育毕用生理盐水漂洗，晾干，以1:1的丙酮甲醇溶液固定，4%Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数：

结果：见表9。从表9可见，“口服液”低、高剂量组吞噬率明显高于对照组；低剂量组吞噬指数明显高于对照组。

表9“口服液”对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

与对照组比较*P<0.05与对照组比较**P<0.01

3.5小鼠碳廓清试验

方法：依程序规定的方法。根据注入墨汁2min、10min后血中碳浓度（测吸光值），计算出各组小鼠的吞噬指数。

结果：见表10。从表10可见，“口服液”低剂量组可显著增强小鼠碳廓清吞噬指数。

表10“口服液”对小鼠碳廓清功能的影响

与对照组比较*P<0.05

免疫调节作用实验结果表明：“全蛋蛋白肽的口服液”1）可增强ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力；2）增强二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应；3）提高小鼠血清溶血素含量；4）增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能和碳廓清能力。依据《保健食品功能学评价程序和检验方法》第3.1项规定的免疫调节作用的评价方法，可认为本发明所制备的全蛋蛋白肽具有免疫调节作用。

Claims (6)

1.一种制备全蛋蛋白肽的方法，是采用复合植物蛋白酶对全蛋蛋白粉进行酶催化降解，得到所述全蛋蛋白肽；所述复合植物蛋白酶由木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶组成；

所述复合植物蛋白酶中，木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶的酶活力比为(100～120万)U:(30～40万)U:(560～700万)U；所述全蛋蛋白粉是由下述至少一种禽鸟蛋为原料制备得到的：鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鹌鹑蛋、麻雀蛋、鸽蛋、斑鸠蛋和鸵鸟蛋；

所述酶催化降解的反应体系中，全蛋蛋白粉与水的质量份数比为1：8-10；酶解每克全蛋蛋白粉所需各种酶的量为：木瓜蛋白酶5～6万U,无花果蛋白酶1.5～2万U,菠萝蛋白酶28～35万U；所述酶催化降解的温度为48-50℃，时间为3～4小时，pH值为7.5～8.5。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在酶催化降解反应结束后，对酶解液进行灭菌和酶灭活处理，然后再对所述酶解液进行冷却、冷冻处理的步骤；所述冷冻的温度为4-8℃，时间为48小时；所述灭菌和灭酶的条件为：温度100℃，时间10分钟。

3.权利要求1或2所述方法制备得到的全蛋蛋白肽。

4.权利要求3所述的全蛋蛋白肽在制备增强免疫力产品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述产品为药品或保健品。

6.一种增强免疫力的产品，其活性成分包括权利要求3所述的全蛋蛋白肽、大枣多糖和枸杞多糖；所述增强免疫力产品中，全蛋蛋白肽、大枣多糖和枸杞多糖的质量比为（900-1200）：（80-140）：（40-70）。