CN103074312B - D4去饱和酶和d5延伸酶 - Google Patents

Abstract

公开了涉及ONC-T18、D4-去饱和酶、D5延伸酶和分离、表征、产生、鉴定它们的方法和组合物，和它们用于脂肪酸产生的应用，以及包含这些组合物的有机体和表达这些组合物的有机体。

Description

D4去饱和酶和D5延伸酶

本申请为分案申请，其原申请的申请日为2007年10月31日，申请号为200780100540.5（国际申请号为PCT/IB2007/004553），名称为“D4去饱和酶和D5延伸酶”。

I.背景

有压倒性的科学证据表明，(n-3)高级不饱和脂肪酸诸如二十二碳六烯酸(DHA)对心血管循环疾病、慢性炎症和脑功能障碍有积极作用。另一方面，已经注意到(n-6)脂肪酸诸如二十碳五烯酸(EPA)在类花生酸类固醇诸如前列腺素、白细胞三烯或类似的类花生酸类固醇中作为中间代谢产物。

目前，这些高级不饱和脂肪酸的主要来源是鱼，注意到EPA和DHA在各种海洋鱼类(blue fish)(诸如沙丁鱼和金枪鱼)中分别以大约20%和10%的量存在。认为这样一种脂肪酸谱是通过在每种鱼类中自然选择最佳表现的最佳比例而发生的。然而，如果人们想要使用鱼油作为这些脂质的唯一来源，还存在许多缺陷，诸如味道污染的问题，可获得性的不可控的波动，和天然鱼油成分的变化性。此外，如果人们想要从这些来源获得高度纯化的(n-3)或(n-6)油，很难优先分离并纯化它们。

此前公开了能够产生高量DHA和EPA以及其它首选脂肪酸的破囊壶菌目(Thraustochytriales)真核生物ONC-T18和相关有机体。ONC-T18公开在国际申请PCT/IB2006/003977和美国临时申请60/751401和60/821084，这些都通过参考至少涉及ONC-T18和其中产生的脂肪酸的信息的方式并入本文。期望操纵DHA和EPA途径。本文公开了来自ONC-T18、牵涉在这些途径中的两种酶D4去饱和酶和D5延伸酶的分离和表征。

II.概述

公开了涉及ONC-T18、D4-去饱和酶、D5延伸酶和分离、表征、产生、鉴定它们的方法和组合物，和它们用于脂肪酸产生的应用，以及包含这些组合物的有机体和表达这些组合物的有机体。

III.附图简述

并入本文并构成说明书一部分的附图，阐释了多种实施方式，并连同描述阐释了公开的组合物和方法。

图1显示EPA和DHA产生的途径。

图2A显示分离的D4去饱和酶的系统进化(phylogentic)树，图2B显示分离的D5-延伸酶的系统进化(phlogenetic)树。

图3显示分离的D4去饱和酶的图示遗传概述。

图4显示分离的D5延伸酶的图示遗传概述。

IV.详述

公开和描述本发明的化合物、组合物、物品、装置和/或方法之前，应理解的是，除非另外指明，否则它们不限于具体合成方法或具体重组生物技术方法，或除非另外指明，否则不限于具体试剂，因为本发明的这些化合物、组合物、物品、装置和/或方法当然都可以变化。还应理解的是，本文所用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，不意为限制。

A.定义

在说明书和所附的权利要求书中所用的，除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多数指示物。因此，例如，提到“一种药物运载体”包括两种或多种所述运载体(carrier)的混合物，等等。

本文中范围可表示为从“约”一个具体值和/或到“约”另一个具体值。当表示这种范围时，另一实施方案包括从一个具体值和/或到另一个具体值。类似地，当数值通过使用先行词“约”表示为近似值时，应理解的是，该具体值形成另一实施方案。进一步应理解的是，每个范围的端点在相对于另一端点和独立于另一端点两种情况下都是有意义的。还应理解的是，本文公开了许多数值，每个数值除了该数值本身，还在本文公开为“约”该具体值。例如，如果公开数值“10”，那么还公开了“约10”。还应理解的是，当公开数值时，还公开了“小于或等于”该数值、“大于或等于该数值”和数值之间的可能范围，如本领域技术人员适当地理解的。例如，如果公开“10”，则还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解的是，在本申请中，数据以多种不同形式提供，且该数据代表端点和起点，以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开具体数据点“10”和具体数据点15，则应理解的是，认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15以及10与15之间。还应理解的是，还公开了两个具体单位之间的每个单位。例如，如果公开10和15，那么还公开了11、12、13和14。

在说明书和所附的权利要求书中，将提及许多术语，这些术语应被界定为具有以下含义：

“任选”或“任选地”是指其后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括其中所述事件或情况发生的情形和所述事件或情况不发生的情形。

“引物”是能够支持一些类型的酶促操纵并能与靶核酸杂交以使酶促操纵可发生的探针亚组。引物可从本领域可获得而不干扰酶促操纵的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合制备。

“探针”是能够与靶核酸相互作用的分子，所述相互作用典型地是以序列特异性方式例如经由杂交。核酸的杂交是本领域熟知的，并在本文讨论。典型地探针可从本领域可获得的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合制备。

在本申请中，参照了多种出版物。这些出版物的公开完整地通过参考并入本申请，以更完全地描述本申请所属领域的技术状态。公开的参考文献还单独和具体地通过参考包含在其中的材料而并入本文，所述材料在参考文献所依赖的语句中讨论。

公开了将用于制备公开的组合物的组分以及将用于本文公开的方法的组合物本身。本文公开这些和其它材料，应理解的是，当公开这些材料的组合、亚组、相互作用、组等等时，尽管可能没有明确地公开具体地提及这些化合物的每种不同的单独和共同的组合和排列，但本文具体地预期并描述每一种。例如，如果公开和讨论具体的D4去饱和酶和D5延伸酶，并讨论可对包括D4去饱和酶和D5延伸酶的大量分子进行的大量修饰，则具体地预期D4去饱和酶和D5延伸酶的每一种和每种组合和排列以及可能的修饰，除非具体地指明相反。因此，如果公开一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F并公开组合分子A-D的一个实例，那么即使没有单独地提及每一种，也单独和共同地预期每一种，即认为公开了组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E、和C-F。类似地，还公开了这些的任何亚组或组合。因此，例如，将认为公开了A-E、B-F、和C-E的亚组。这一概念应用到本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用公开的组合物的方法的步骤。因此，如果有可进行的多个另外步骤，应理解的是，这些另外步骤的每一个可与公开的方法的任何具体的实施方案或实施方案的组合一起进行。

B.组合物

在强化某些食品以促进健康饮食方面，ω-3浓缩物(二十碳五烯酸EPA，即20:5n-3，和二十二碳六烯酸DHA，即22:6n-3)的使用已经变得重要。破囊壶菌Thraustochytrid是天然地产生DHA的海洋原生生物，产生的DHA达其生物量的20%。发酵这些有机体的能力提供了这些ω-3油的可再生的、长期来源。脂肪酸代谢途径的表征(图1)揭示了负责延伸EPA为二十二碳五烯酸(DPA、22:5n-3)的D5-延伸酶、以及牵涉在去饱和DPA为DHA的D4-去饱和酶的重要性。操纵特定酶活性可以影响由我们的ONC-T18菌株产生EPA和DHA的产率，如由市场和我们的顾客的需要所要求的。

使用从不同破囊壶菌Thraustochytrid菌株(用于D4-去饱和酶的破囊壶菌Thraustochytrium sp.(CS020087)、金黄色破囊壶菌Thraustochytriumaureum(AF391546)、破囊壶菌Thraustochytrium sp.ATCC34304(AF391543)、破囊壶菌Thraustochytrium sp.ATCC21685(AF489589)和破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10(DQ133575)；用于D5-延伸酶的破囊壶菌Thraustochytrium sp.(CS160897)和金黄色破囊壶菌Thraustochytriumaureum(CS160879))的酶的基因序列中的保守区域构建的简并引物，从ONC T-18分离了D4-去饱和酶和D5延伸酶。进一步PCR扩增来自基因组DNA的基因的一部分(分别是967bp和593bp)。基因组步移(APAgeneGOLD试剂盒,BIO S&T，Montreal,Quebec)用于延伸已知序列以掺入完整的开放阅读框，并进一步延伸以鉴定任一侧上的相邻基因以及启动子区域。随后对完整序列构建引物以产生掺入完整的开放阅读框的全基因PCR产物(分别是1758bp和1099bp)。将PCR产物克隆到pT7-Blue3载体(Novagen,San Diego,California)并转化到大肠杆菌NovaBlue(DE3)(Novagen,San Diego,California)，随后测序。

使用UltraClean6Minute Mini质粒制备试剂盒(MO BIOLaboratories,Inc.,Solana Beach,California)纯化获得的基因质粒。随后使用限制酶BamHI和NotI切下基因插入片段并克隆到pYES2酵母表达载体(Invitrogen,Carlsbad,California)。随后使用S.c.EasyComp转化试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,California)，在半乳糖启动子Gal1控制下，转化鉴定为pYDes(D4-去饱和酶)和pYElo(D5-延伸酶)的新载体构建体到酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVSc1。阴性对照菌株是包含未改变的pYES2载体的INVSc1，使这些菌株同时生长。使用酵母菌株的尿嘧啶营养缺陷型进行载体筛选，并使用无尿嘧啶的SC培养基。

使用酵母表达体系确定D4-去饱和酶和D5延伸酶的活性和特异性。转化的酵母在包含2%葡萄糖、1%Tergitol NP-40的SC-U培养基中在30℃150RPM下生长48hr。制备包含SC-U、2%半乳糖、1%棉子糖、1%Tergitol NP-40和500μM特定自由脂肪酸的底物培养基。将转化的酵母培养物以0.5的OD600接种到100ml底物培养基，并将培养物在20℃培养5天。以2000RPM离心5min，100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤一次，随后冷冻干燥来回收生物量。其后进行脂肪酸甲基酯气相色谱以确定脂肪酸去饱和与延伸的效率。通过计算(产物)/(底物+产物)*100而确定底物的转化百分比。

BLASTx结果显示，ONC T-18D4去饱和酶与破囊壶菌Thraustochytrium sp.ATCC21685D4-去饱和酶96%相似。图2A显示当与ONC-T18D4-去饱和酶序列相比时的置根邻接系统进化树(rootedneighbour-joining phylogenetic tree)，该系统进化树使用ClustalX，使用BLASTx搜寻结果的自展分析(1000x)确定。D4-去饱和酶基因具有1560bp的开放阅读框，转录519氨基酸的蛋白。该蛋白的分析显示细胞色素b5结构域、三个组氨酸盒基序和四个跨膜区，所有元件都是前端去饱和酶的特征。与该基因相邻的是五个推定的TATA盒、多个重复区、两个启动子和上游鉴定的蛋白激酶以及下游的AP2结合蛋白(图3)。

相反，BLASTx搜寻鉴定D5-延伸酶蛋白为与破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10多不饱和的脂肪酸延伸酶具有89%的同一性。图2B显示当与ONC-T18D5-延伸酶序列相比时的置根邻接系统进化树，该系统进化树使用ClustalX，使用BLASTx搜寻结果的自展分析(1000x)确定。进一步分析确定该831bp长的延伸酶编码276氨基酸的蛋白，包含对线粒体特异性的四个跨膜区、和一个组氨酸盒基序。该D5-延伸酶区的上游组分包含线粒体输入受体之前的单个TATA盒、多个重复区和启动子，而在下游鉴定了膜占据和识别连结(recognition nexus)基序的开始(图4)。

n-3和n-6途径的pYDes的表征(表1)显示14%的DPA n-3或二十二碳四烯酸(DTA 22:4 n-6)分别转化为DHA或DPA n-6。

表1：D4-去饱和酶的酶活性和表征

当饲喂相应的D4-去饱和酶底物二高-g-亚麻酸(DGLA，20:3 n-6)时，未检测到转化。为了增加pYDes活性，向培养基加入痕量金属诸如柠檬酸铁，导致DPA向DHA的转化增加(表1)。相反，当饲喂EPA或花生四烯酸(ARA20:4n-6)时，目前pYElo显示最少的转化。

已经成功分离并克隆来自高脂肪酸产生菌株破囊壶菌Thraustochytrium sp.ONC-T18的D4-去饱和酶和D5-延伸酶基因，随后在酿酒酵母中表达。

而且，显示D4-去饱和酶以其天然形式和经由补充痕量金属转化DPA或DTA两者为其各自的终产物。用其它脂肪酸的饲喂研究证实该去饱和酶的D4特异性活性。经由使用基因操纵技术诸如易错PCR，将进一步增强该活性以实现我们的菌株中DHA产生的增加。

公开了包含D4去饱和酶的组合物，其中该D4去饱和酶与SEQ IDNO:26具有至少或大于70%、80%、89%、90%、95%、96%、97%的同一性。

还公开了组合物，其中不同于SEQ ID NO:26的任何变化是保守性变化。

还公开了包含核酸的组合物，其中该核酸编码任何D4去饱和酶。

还公开了组合物，其还包含载体。

还公开了包含细胞的组合物，其中该细胞包含任何的该组合物。

还公开了组合物，其中该细胞是真核生物、原核生物、破囊壶菌Thraustochytrid、酵母或大肠杆菌的细胞。

还公开了包含非人类动物的组合物，其中该非人类动物包含任何的该组合物。

还公开了组合物，其中该组合物比不存在D4去饱和酶的组合物产生更多的多不饱和的脂肪酸。

还公开了组合物，其中该脂肪酸是EPA或DHA。

还公开了组合物，其中该去饱和酶包含至少一个组氨酸盒。

还公开了组合物，其中该去饱和酶包含至少2个组氨酸盒。

还公开了组合物，其中该去饱和酶包含至少三个组氨酸盒。

还公开了组合物，其中该组氨酸盒包含序列HXXHH，其中X是任何氨基酸。

还公开了组合物，其中该组氨酸盒包含序列QXXHH。

还公开了组合物，其中该去饱和酶还包含细胞色素b5结构域。

还公开了组合物，其中该细胞色素b5结构域位于5’-端。

还公开了组合物，其中该去饱和酶是在去饱和酶底物存在下。

还公开了组合物，其中该底物具有至少100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM或1000μM的浓度。

还公开了组合物，其中该底物是二十二碳五烯酸(22:5n-3)、二十二碳四烯酸(22:4n-6)或二高-γ-亚麻酸(20:3n-6)。

还公开了组合物，其中该去饱和酶转化至少0.1%、0.5%、1%、5%、10%、30%、50%、70%、90%、95%的可获得的底物。

还公开了组合物，其中该去饱和酶转化表1所示的量的底物。

还公开了组合物，其中该组合物是分离的。

还公开了包含D5延伸酶的组合物，其中该D5延伸酶与SEQ ID NO:15具有至少或大于70%、80%、89%、90%、95%、96%、97%的同一性。

还公开了组合物，其中不同于SEQ ID NO:15的任何变化是保守性变化。

还公开了包含核酸的组合物，其中该核酸编码任何D5延伸酶。

还公开了编码延伸酶或去饱和酶的组合物，其还包含载体。

还公开了组合物，其中该组合物比不存在D5延伸酶的组合物产生更多的多不饱和的脂肪酸，诸如DHA或EPA。

还公开了组合物，其中该延伸酶是在延伸酶底物存在下。

还公开了组合物，其中该底物是二十碳五烯酸(20:5n-3)或花生四烯酸(20:4n-6)。

还公开了组合物，其中该延伸酶转化至少0.1%、0.5%、1%、5%、10%、30%、50%、70%、90%、95%的可获得的底物。

还公开了组合物，其中该组合物是分离的。

还公开了组合物，其包含公开的任何去饱和酶组合物和公开的任何延伸酶组合物。

还公开了产生多不饱和的脂肪酸的方法，其包括使用一种或多种任何这种组合物。

还公开了方法，其中产生的脂肪酸是EPA或DHA。

还公开了产生权利要求1-37所述的组合物的方法，其包括分离任何这种组合物。

1.序列相似性

应理解的是，如本文讨论的，使用术语同源性和同一性表示与相似性相同的含义。因此，例如，如果在两条非天然序列之间使用词语同源性，应理解的是，这不必表示这两条序列之间的进化关系，而是关注其核酸序列之间的相似性或关联性。确定两种进化上相关分子之间同源性的许多方法为了测量序列相似性的目的常规地适用于任何两种或多种核酸或蛋白，而不论它们是否进化上相关。

大体上，应理解的是，界定本文公开的基因和蛋白的任何已知的变体和衍生物或可能产生的变体和衍生物的一种方式是经由在对特定已知序列的同源性方面界定变体和衍生物。本文公开的具体序列的该同一性也在本文别处讨论。大体上，本文公开的基因和蛋白的变体通常与所指的序列或天然序列具有至少约70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99的同源性百分比。本领域技术人员易于理解如何确定两种蛋白或核酸诸如基因的同源性。例如，可经过比对两条序列以使同源性处在最高水平之后，计算同源性。

计算同源性的另一方式可通过公开的算法进行。用于比较的序列的最佳比对可通过Smith和Waterman Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法进行，通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法进行，通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444(1988)的搜寻相似性方法进行，通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)进行，或通过目测进行。

对核酸可获得相同类型的同源性，通过例如公开在Zuker，M.Science244:48-52,1989，Jaeger等人.Proc.Natl.Acad.Sci USA86:7706-7710,1989，Jaeger等人.Methods Enzymol.183:281-306,1989的算法，这些参考文献通过参考至少涉及核酸比对的材料并入本文。应理解的是，通常可使用任何的这些方法，并且在某些情形下，这些不同方法的结果可以不同，但本领域技术人员理解，如果以至少一个这些方法发现同一性，那么将认为序列具有所指的同一性，并公开在本文。

例如，如本文所用的，列为对另一序列具有特定同源性百分比的序列是指序列具有所指的如由上述任何一种或多种计算方法计算的同源性。例如，如果使用Zuker计算方法计算第一序列为与第二序列具有80%的同源性，则即使由任何其它计算方法计算第一序列与第二序列不具有80%同源性，仍认为第一序列与第二序列具有80%的如本文界定的同源性。作为另一实例，如果使用Zuker计算方法以及Pearson和Lipman计算方法两种方法计算第一序列为与第二序列具有80%的同源性，则即使由Smith和Waterman计算方法、Needleman和Wunsch计算方法、Jaeger计算方法或任何其它计算方法计算第一序列与第二序列不具有80%同源性，仍认为第一序列与第二序列具有80%的如本文界定的同源性。作为又另一实例，如果使用每一种计算方法计算第一序列为与第二序列具有80%的同源性(尽管实际上，不同计算方法通常将导致不同的计算的同源性百分比)，认为第一序列与第二序列具有80%的如本文界定的同源性。

2.杂交/选择性杂交

术语杂交通常是指至少两个核酸分子诸如引物或探针与基因之间的序列驱动的相互作用。序列驱动的相互作用是指以核苷酸特异性方式发生在两个核苷酸或核苷酸类似物或核苷酸衍生物之间的相互作用。例如，G与C相互作用或A与T相互作用是序列驱动的相互作用。通常序列驱动的相互作用发生在核苷酸的Watson-Crick面或Hoogsteen面。两个核酸的杂交受本领域技术人员已知的大量条件和参数影响。例如，反应的盐浓度、pH和温度都影响两个核酸分子是否将杂交。

两个核酸分子之间选择性杂交的参数是本领域技术人员公知的。例如，在一些实施方案，选择性杂交条件可界定为严紧性杂交条件。例如，杂交的严紧性由杂交和洗涤步骤之一或两者的温度和盐浓度两者控制。例如，实现选择性杂交的杂交条件可包括在高离子强度溶液(6X SSC或6XSSPE)中在比Tm(一半的分子从其杂交伴侣解离的解链温度)低约12-25℃的温度下杂交，随后是在选择以使洗涤温度约比Tm低5℃至20℃的温度和盐浓度的组合下洗涤。易于在预备试验中按照经验确定温度和盐条件，其中固定在滤膜上的参照DNA样品与标记的目标核酸杂交，随后在不同严紧性条件下洗涤。对于DNA-RNA和RNA-RNA杂交，杂交温度通常较高。可如上述地或如本领域已知地使用条件以实现严紧性。(Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆实验室指南),第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor，New York,1989；Kunkel等人.Methods Enzymol.1987:154:367,1987，其通过参考至少设计核酸杂交的材料并入本文)。对DNA：DNA杂交优选的严紧性杂交条件可为在约68℃(水溶液中)在6X SSC或6X SSPE，随后是在68℃洗涤。如果期望，杂交和洗涤严紧性可随着期望的互补性程度的减少而相应地减少，并进一步依赖于在其中搜寻变异性的任何区域的G-C或A-T丰富度。类似地，如果期望，杂交和洗涤严紧性可随着期望的同源性增加而相应地增加，并进一步依赖于在其中期望高同源性的任何区域的G-C或A-T丰富度，都如本领域已知的。

界定选择性杂交的另一方式是通过观察与另一核酸结合的核酸的量(百分比)。例如，在一些实施方案，当至少约60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%的限制性核酸(limitingnucleic acid)结合于非限制性核酸时，将是选择性杂交条件。通常，非限制性引物是例如10或100或1000倍过量的。这种类型的检测可在其中限制性与非限制性引物两者例如10倍或100倍或1000倍地低于它们的k_d、或其中仅核酸分子之一是10倍或100倍或1000倍、或其中核酸分子之一或两者高于它们的k_d的条件下进行。

界定选择性杂交的另一方式是通过观察在需要杂交来促进期望的酶促操纵的条件下被酶促操纵的引物百分比。例如，在一些实施方案，在促进酶促操纵的条件下当至少约60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%的引物被酶促操纵时，将是选择性杂交条件，例如如果该酶促操纵是DNA延伸，那么当至少约60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%的引物分子被延伸时将是选择性杂交条件。优选的条件还包括制造商建议的条件或本领域中指出适合酶进行操纵的条件。

正如对于同源性一样，应理解的是，本文公开的有多种方法用于确定两个核酸分子之间的杂交水平。应理解的是，这些方法和条件可能提供两个核酸分子之间不同百分比的杂交，但除非另外指明，否则满足这些方法中的任一种方法的参数就足够。例如如果需要80%杂交，则只要在这些方法中的任一种方法的所需参数中发生杂交，就认为是本文公开的。

应理解的是，本领域技术人员理解如果组合物或方法共同地或单独地满足用于确定杂交的这些标准的任一个，则认为该组合物或方法是本文公开的组合物或方法。

3.核酸

本文公开的有多种分子是基于核酸的，包括例如编码例如本文公开的分离的D4去饱和酶和D5延伸酶以及任何其它蛋白的核酸、以及各种功能性核酸。公开的核酸由例如核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸取代物组成。这些和其它分子的非限制性实例在本文讨论。应理解的是，例如当载体在细胞中表达时，表达的mRNA将通常由A、C、G和U组成。类似地，应理解的是，如果例如反义分子经由例如外源递送被引入细胞或细胞环境，反义分子由减少反义分子在细胞环境中降解的核苷酸类似物组成是有利的。

a)核苷酸和相关分子

核苷酸是包含碱基部分、糖部分和磷酸酯部分的分子。核苷酸可经由其磷酸酯部分和糖部分连接到一起，产生核苷间的键。核苷酸的碱基部分可为腺嘌呤-9-基(A)、胞嘧啶-1-基(C)、鸟嘌呤-9-基(G)、尿嘧啶-1-基(U)、和胸腺嘧啶-1-基(T)。核苷酸的糖部分是核糖或脱氧核糖。核苷酸的磷酸酯部分是五价的磷酸酯。核苷酸的非限制性实例将是3'-AMP(3'-腺苷单磷酸酯)或5'-GMP(5'-鸟苷单磷酸酯)。

核苷酸类似物是包含对碱基、糖或磷酸酯部分的一些类型修饰的核苷酸。对核苷酸的修饰是本领域公知的，并包括例如，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤和2-氨基腺嘌呤以及在糖或磷酸酯部分的修饰。

核苷酸取代物是具有与核苷酸类似的功能特性但不包含磷酸酯部分的分子，诸如肽核酸(PNA)。核苷酸取代物是将以Watson-Crick或Hoogsteen方式识别核酸，但经由磷酸酯部分以外的部分连接在一起的分子。当与适合的靶核酸相互作用时，核苷酸取代物能够符合双螺旋型结构。

还可能连接其它类型的分子(共轭物)到核苷酸或核苷酸类似物以增强例如细胞摄取。共轭物可化学地连接到核苷酸或核苷酸类似物。这种共轭物包括但不限于脂质部分诸如胆固醇部分。(Letsinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553-6556)。

Watson-Crick相互作用是与核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸取代物的Watson-Crick面的至少一种相互作用。核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸取代物的Watson-Crick面包括基于嘌呤的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸取代物的C2、N1和C6位置，和基于嘧啶的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸取代物的C2、N3、C4位置。

Hoogsteen相互作用是发生在核苷酸或核苷酸类似物的Hoogsteen面的相互作用，该Hoogsteen面暴露在双螺旋DNA的大沟中。Hoogsteen面包括N7位置和在嘌呤核苷酸C6位置的反应性基团(NH2或O)。

b)序列

有关于例如分离的D4去饱和酶和D5延伸酶以及本文公开的任何其它蛋白的多种序列公开在Genbank，这些序列和其它序列通过参考完整地以及对于其中包含的单独子序列并入本文。

多种序列提供在本文，并且这些序列和其它序列可见于Genbank，在www.pubmed.gov。本领域技术人员理解如何分辨序列差别和差异，以及如何将关于具体序列的组合物和方法调整为其它相关序列。有了本文公开的和本领域已知的信息，可对任何序列设计引物和/或探针。

c)引物和探针

公开了包括能够与本文公开的基因相互作用的引物和探针的组合物。在某些实施方案，引物用于支持DNA扩增反应。通常引物将能够以序列特异性方式延伸。引物以序列特异性方式延伸包括其中引物与之杂交或以其它方式缔合的核酸分子的序列和/或组成指引或影响通过延伸引物产生的产物的组成或序列的任何方法。因此以序列特异性方式延伸引物包括但不限于，PCR、DNA测序、DNA延伸、DNA聚合、RNA转录或逆转录。以序列特异性方式扩增引物的技术和条件是优选的。在某些实施方案，引物用于DNA扩增反应，诸如PCR或直接测序。应理解的是，在某些实施方案，还可使用非-酶促技术延伸引物，其中例如用于延伸引物的核苷酸或寡核苷酸被修饰以使其将发生化学反应来通过序列特异性方式延伸引物。通常，公开的引物与核酸或核酸的区域杂交，或与核酸的互补序列或核酸区域的互补序列杂交。

d)功能性核酸

功能性核酸是具有特定功能诸如结合靶分子或催化特定反应的核酸分子。功能性核酸分子可分为以下种类，这不意为限制。例如，功能性核酸包括反义分子、适体、核酶、形成三螺旋的分子、和外部引导序列。功能性核酸分子可作用为靶分子具备的特定活性的影响剂(affector)、抑制剂、调节剂和刺激剂，或功能性核酸分子可具备独立于任何其它分子的全新活性。

功能性核酸分子可与任何大分子诸如DNA、RNA、多肽或糖链相互作用。因此，功能性核酸可与分离的D4去饱和酶和D5延伸酶的mRNA、或分离的D4去饱和酶和D5延伸酶的基因组DNA相互作用，或可与分离的D4去饱和酶和D5延伸酶的多肽或片段相互作用。通常功能性核酸设计为基于靶分子与功能性核酸分子之间的序列同源性与其它核酸相互作用。在其它情况，功能性核酸分子与靶分子之间的特异性识别不是基于功能性核酸分子与靶分子之间的序列同源性，而是基于形成允许发生特异性识别的三级结构。

反义分子设计为经由规范或非-规范的碱基配对与靶核酸分子相互作用。反义分子与靶分子的相互作用设计为经由例如RNA酶H介导的RNA-DNA杂合体降解而促进破坏靶分子。作为选择，反义分子设计为阻碍通常将在靶分子发生的加工功能，诸如转录或复制。反义分子可基于靶分子的序列设计。存在通过寻找靶分子的最可及区域用于优化反义效率的许多方法。示例性方法将是体外筛选试验和使用DMS和DEPC的DNA修饰研究。优选地，反义分子以小于或等于10^-6、10^-8、10^-10或10^-12的解离常数(k_d)结合靶分子。目的是设计和使用反义分子的方法和技术的代表性实例可见于以下美国专利的非限制性列表：5,135,917、5,294,533、5,627,158、5,641,754、5,691,317、5,780,607、5,786,138、5,849,903、5,856,103、5,919,772、5,955,590、5,990,088、5,994,320、5,998,602、6,005,095、6,007,995、6,013,522、6,017,898、6,018,042、6,025,198、6,033,910、6,040,296、6,046,004、6,046,319和6,057,437。

适体是与靶分子相互作用优选地以特异性方式相互作用的分子。通常适体是折叠为确定的二级和三级结构诸如茎环或G-四联体的长度从15-50碱基的小核酸。适体可结合小分子诸如ATP(美国专利5,631,146)和茶碱(theophiline)(美国专利5,580,737)，以及大分子诸如逆转录酶(美国专利5,786,462)和凝血酶(美国专利5,543,293)。适体可以小于10^-12M的k_d非常紧密地结合靶分子。优选地，适体以小于10^-6、10^-8、10^-10或10^-12的k_d结合靶分子。适体可以非常高程度的特异性结合靶分子。例如，已经分离了适体，其对靶分子与仅在分子上的一个位置不同的另一分子的结合亲和性具有大于10000倍的差异(美国专利5,543,293)。优选地，适体与靶分子的k_d比与背景结合分子的k_d低至少10、100、1000、10,000或100,000倍。优选例如当对多肽进行比较时，背景分子为不同的多肽。例如，当确定分离的D4去饱和酶和D5延伸酶适体的特异性时，背景蛋白可为血清白蛋白。如何制备和使用适体来结合多种不同靶分子的代表性实例可见于以下美国专利的非限制性列表：5,476,766、5,503,978、5,631,146、5,731,424、5,780,228、5,792,613、5,795,721、5,846,713、5,858,660、5,861,254、5,864,026、5,869,641、5,958,691、6,001,988、6,011,020、6,013,443、6,020,130、6,028,186、6,030,776和6,051,698。

核酶是能够催化分子内或分子间化学反应的核酸分子。因此核酶是催化性核酸。优选地，核酶催化分子间反应。有大量不同类型的核酶催化核酸酶或核酸聚合酶类型反应，这是基于在天然体系中发现的核酶，诸如锤头状核酶(例如但不限于如下美国专利：5,334,711、5,436,330、5,616,466、5,633,133、5,646,020、5,652,094、5,712,384、5,770,715、5,856,463、5,861,288、5,891,683、5,891,684、5,985,621、5,989,908、5,998,193、5,998,203、Ludwig和Sproat的WO9858058、Ludwig和Sproat的WO9858057、以及Ludwig和Sproat的WO9718312)、发夹核酶(例如但不限于如下美国专利：5,631,115、5,646,031、5,683,902、5,712,384、5,856,188、5,866,701、5,869,339和6,022,962)、和四膜虫核酶(例如但不限于如下美国专利：5,595,873和5,652,107)。还有大量核酶未见于天然体系，但已被工程化以催化全新的特异性反应(例如但不限于如下美国专利：5,580,967、5,688,670、5,807,718和5,910,408)。优选的核酶裂解RNA或DNA底物，更优选地裂解RNA底物。核酶通常经由识别并结合靶底物，随后裂解而裂解核酸底物。该识别通常主要基于规范或非-规范碱基对相互作用。这一特性使得核酶成为靶特异性裂解核酸的特别好的候选物，由于识别靶底物是基于靶底物序列。如何制备和使用核酶来催化多种不同反应的代表性实例可见于以下美国专利的非限制性列表：5,646,042、5,693,535、5,731,295、5,811,300、5,837,855、5,869,253、5,877,021、5,877,022、5,972,699、5,972,704、5,989,906和6,017,756。

形成三螺旋的功能性核酸分子是可与双链或单链核酸相互作用的分子。当三螺旋分子与靶区域相互作用时，形成称为三螺旋的结构，其中DNA的三条链形成依赖于Watson-Crick和Hoogsteen碱基-配对的复合体。三螺旋分子是优选的，由于其可以以高的亲和性和特异性结合靶区域。优选地，形成三螺旋的分子以小于10^-6、10^-8、10-¹⁰或10^-12的k_d结合靶分子。如何制备和使用形成三螺旋的分子来结合多种不同靶分子的代表性实例可见于以下美国专利的非限制性列表：5,176,996、5,645,985、5,650,316、5,683,874、5,693,773、5,834,185、5,869,246、5,874,566和5,962,426。

外部引导序列(EGS)是结合靶核酸分子并形成复合体的分子，该复合体被裂解靶分子的RNA酶P识别。EGS可设计为特异性靶向所选的RNA分子。RNA酶P帮助加工细胞中的转移RNA(tRNA)。通过使用致使靶RNA：EGS复合体模拟天然tRNA底物的EGS，可募集细菌RNA酶P以裂解基本上任何RNA序列(Yale的WO92/03566，Forster和Altman,Science238:407-409(1990))。

类似地，真核EGS/NA酶P指引的RNA裂解可用于裂解真核细胞中期望的靶。(Yuan等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:8006-8010(1992)；Yale的WO93/22434；Yale的WO95/24489；Yuan和Altaian,EMBO J14:159-168(1995)，和Carrara等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)92:2627-2631(1995))。如何制备和使用EGS分子来促进裂解多种不同靶分子的代表性实例可见于以下美国专利的非限制性列表：5,168,053、5,624,824、5,683,873、5,728,521、5,869,248和5,877,162。

4.核酸递送

在上述包括施用并摄取外源DNA到受试者的细胞的方法中(即，基因转导或转染)，公开的核酸可为裸DNA或RNA的形式，或核酸可在用于向细胞递送核酸的载体中，藉以使编码抗体的DNA片段处在启动子的转录调节下，如本领域技术人员将理解的。载体可为可购买获得的制品，诸如腺病毒载体(Quantum Biotechnologies,Inc.(Laval,Quebec,Canada)。可经由多种机制递送核酸或载体到细胞。作为一个实例，递送可经由脂质体，使用可购买获得的脂质体制品诸如LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL,Inc.,Gaithersburg,MD)、SUPERFECT(Qiagen,Inc.Hilden,Germany)和TRANSFECTAM(Promega Biotec,Inc.,Madison,WI)、以及根据本领域中的标准方案开发的其它脂质体。此外，公开的核酸或载体可通过电穿孔体内递送，该技术可从Genetronics,Inc.(San Diego,CA)获得，以及依靠SONOPORATION机器(ImaRx Pharmaceutical Corp.,Tucson,AZ)。

作为一个实例，载体递送可经由病毒体系，诸如逆转录病毒载体体系，该体系可包装重组的逆转录病毒基因组(参见，例如Pastan等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:4486,1988；Miller等人,Mol.Cell.Biol.6:2895,1986)。随后重组的逆转录病毒可用于感染并从而将编码广泛地中和的抗体(或其活性片段)的核酸递送到受感染的细胞。将改变的核酸引入哺乳动物细胞的确切方法当然不限于使用逆转录病毒载体。对该方案其它技术是广泛可获得的，包括使用腺病毒载体(Mitani等人,Hum.Gene Ther.5:941-948,1994)、腺相关病毒(AAV)载体(Goodman等人,Blood84:1492-1500,1994)、慢病毒载体(Naidini等人,Science272:263-267,1996)、假型逆转录病毒载体(Agrawal等人,Exper.Hematol.24:738-747,1996)。还可使用物理转导技术，诸如脂质体递送和受体介导的递送以及其它胞吞机制(参见，例如Schwartzenberger等人,Blood87:472-478,1996)。这些公开的组合物和方法可联合任何这些或其它常用的基因转移方法使用。

作为一个实例，如果编码抗体的核酸在腺病毒载体中递送到受试者的细胞，施用腺病毒于人类的剂量可从每次注射约10⁷变化到10⁹个空斑形成单位(pfu)，但也可高达每次注射10¹²pfu(Crystal,Hum.Gene Ther.8:985-1001,1997；Alvarez和Curiel,Hum.Gene Ther.8:597-613,1997)。受试者可接受单次注射，或如果需要另外的注射，可以六个月的间隔重复(或其它合适的时间间隔，如熟练的操作者确定的)无限的时间段和/或直到确立治疗的效力。

如果使用，肠胃外施用核酸或载体通常以注射为特征。注射液可制备为常规形式，作为液态溶液或悬浮液、适于在注射前溶解或悬浮于液体的固体形式或作为乳剂。对于肠胃外施用，最近修正的方法包括使用慢释放或缓释体系以使保持恒定剂量。治疗化合物的适合的制剂和各种施用途径的另外讨论参见，例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(雷氏药学理论和实践)(第19版)A.R.Gennaro编辑,Mack PublishingCompany,Easton,PA1995。

5.表达体系

递送到细胞的核酸通常包含表达控制体系。例如，病毒和逆转录病毒体系中插入的基因通常包含启动子、和/或增强子来帮助控制期望基因产物的表达。启动子通常是当相对于转录起始位点处于相对固定的位置时起作用的一个或多个DNA序列。启动子包含RNA聚合酶和转录因子的基本相互作用所需的核心元件，并可能包含上游元件和响应元件。

a)病毒启动子和增强子

在哺乳动物宿主细胞中控制从载体转录的优选启动子可从多种来源获得，例如病毒基因组，诸如：多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和最优选地巨细胞病毒，或来自异源哺乳动物启动子，如β肌动蛋白启动子。SV40病毒的早期和晚期启动子方便地获得为SV40限制性片段，其还包含SV40病毒的复制起点(Fiers等人,Nature,273:113(1978))。人类巨细胞病毒的最早期启动子方便地获得为HindIII E限制性片段(Greenway,P.J.等人,Gene18:355-360(1982))。当然，来自宿主细胞或相关物种的启动子也可用在本文。

增强子通常是指在离转录起始位点不固定的距离起作用的DNA序列，并可在转录单元的5’(Laimins,L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.78:993(1981))或3’(Lusky,M.L.,等人,Mol. Cell Bio.3:1108(1983))。而且，增强子可位于内含子中(Banerji,J.L.等人,Cell33:729(1983))以及位于编码序列本身中(Osborne,T.F.,等人,Mol.Cell Bio.4:1293(1984))。它们通常长度是10至300bp，并顺式作用。增强子作用以增加从附近启动子的转录。增强子通常还包含介导转录调节的响应元件。启动子也可包含介导转录调节的响应元件。增强子通常决定基因表达的调节。尽管现在已知有来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列，人们通常使用来自真核细胞病毒的增强子用于总的表达。优选的实例是复制起点后侧的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。

启动子(promotor)和/或增强子可被光或触发其功能的特定化学事件特异性地活化。体系可被试剂诸如四环素和地塞米松调节。还有通过接触辐射诸如γ辐射或烷化化疗药物来增强病毒载体基因表达的方法。

在某些实施方案，启动子和/或增强子区域可作为组成型启动子和/或增强子以使待转录的转录单元的区域表达最大化。在某些构建体中，启动子和/或增强子区域在所有真核细胞类型中是活性的，即使在特定时间它仅在特定细胞类型表达。这一类型的优选启动子是CMV启动子(650碱基)。其它优选的启动子是SV40启动子、巨细胞病毒(全长启动子)、和逆转录病毒载体LTR。

已经显示，可克隆所有特异性调节元件并用于构建在特定细胞类型诸如黑素瘤细胞中选择性地表达的表达载体。胶质细胞原纤维酸性蛋白(glialfibrillary acetic protein)(GFAP)启动子已经用于在胶质来源的细胞中选择性地表达基因。

用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或有核的细胞)的表达载体还可包含终止转录需要的序列，其可影响mRNA表达。这些区域转录为编码组织因子蛋白的mRNA的非翻译部分中的多腺苷酸化的区段。3’非翻译区域还包括转录终止位点。优选地，转录单元还包含多腺苷酸化区域。该区域的一个益处是，其增加转录的单元将像mRNA一样被加工和运输的可能性。已经确立表达构建体中多腺苷酸化信号的鉴定和使用。优选地，同源多腺苷酸化信号用于转基因构建体。在某些转录单元，多腺苷酸化区域起源于SV40早期多腺苷酸化信号并由约400个碱基组成。转录的单元包含单独的或联合上述序列的其它标准序列以改进从构建体的表达或构建体的稳定性也是优选的。

b)标记

病毒载体可包括编码标记产物的核酸序列。该标记产物用于确定基因是否已经被递送到细胞，且递送之后是否被表达。优选的标记基因是大肠杆菌的lacZ基因，其编码β-半乳糖苷酶，和绿色荧光蛋白。

在一些实施方案，该标记可以是选择性标记。对哺乳动物细胞合适的选择性标记的实例是二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物G418、潮霉素(hydromycin)和嘌呤霉素。当这种选择性标记被成功地转移到哺乳动物宿主细胞时，转化的哺乳动物宿主细胞在被置于选择压下时可存活。有两种广泛使用的不同类的选择方案。第一类是基于细胞的代谢和使用突变细胞系，该突变细胞系缺乏独立于补充的培养基生长的能力。两个实例是：CHO DHFR-细胞和小鼠LTK-细胞。这些细胞缺乏在不加入营养物诸如胸苷或次黄嘌呤时生长的能力。由于这些细胞缺乏完整核苷酸合成途径必需的某些基因，除非缺少的核苷酸提供在补充的培养基，否则其不能存活。补充培养基的替代方案是向缺乏DHFR或TK基因的细胞引入完整的相应的基因，从而改变其生长需求。未转化DHFR或TK基因的单独细胞在非补充的培养基将不能存活。

第二类是显性选择，这是指用于任何细胞类型，不要求使用突变细胞系的选择方案。这些方案通常使用药物来阻碍宿主细胞生长。具有新基因的细胞将表达传递药物抗性的蛋白并在选择中存活。这种显性选择的实例使用药物新霉素(Southern P.和Berg,P.,J.Molec.Appl.Genet.1:327(1982))、霉酚酸(Mulligan,R.C.和Berg,P.Science209:1422(1980))或潮霉素(Sugden,B.等人,Mol.Cell.Biol.5:410-413(1985))。这三种实例采用处于真核控制下的细菌基因以分别传递对适当药物G418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。其它药物包括新霉素类似物G418和嘌呤霉素(puramycin)。

6.肽

a)蛋白变体

如本文讨论的，分离的D4去饱和酶和D5延伸酶蛋白的许多变体是已知和本文预期的。此外，对于已知的功能性的分离的D4去饱和酶和D5延伸酶菌株变体，有也在公开的方法和组合物中起作用的分离的D4去饱和酶和D5延伸酶蛋白的衍生物。蛋白变体和衍生物是本领域技术人员已知的并可包括氨基酸序列修饰。例如，氨基酸序列修饰通常属于三类中的一类或多类：取代、插入或缺失变体。插入包括氨基和/或羧基末端融合以及序列内插入单个或多个氨基酸残基。插入通常是比氨基或羧基末端融合小的插入，例如，以一个到四个残基的级别。免疫原性融合蛋白衍生物，诸如实施例中描述的免疫原性融合蛋白衍生物，是通过经由体外交联来融合足够大以对靶序列赋予免疫原性的多肽而制备，或通过以编码融合蛋白的DNA转化的重组细胞培养物而制备。缺失的特征是从蛋白序列除去一个或多个氨基酸残基。通常，不超过约2至6个残基在蛋白分子中任何一个位点缺失。这些变体通常是在编码蛋白的DNA中位点特异性诱变核苷酸，从而产生编码变体的DNA，之后在重组细胞培养物中表达DNA而制备。在具有已知序列的DNA中的预定位点制造取代突变的技术是公知的，例如M13引物诱变和PCR诱变。氨基酸取代通常是单个残基的取代，但也可一次发生在大量不同位置；插入通常将以约从1到10个氨基酸残基的级别；缺失将从约1到30个残基。缺失或插入优选地在相邻的对进行，即缺失2个残基或插入2个残基。取代、缺失、插入或其任何组合可能联合以获得最终的构建体。突变必须不将序列放置在阅读框外且优选地不产生可能产生二级mRNA结构的互补区域。取代变体是其中至少一个残基已被除去且不同的残基插入此位的变体。这种取代通常根据下表2和3进行，并称为保守性取代。

功能或免疫同一性的显著改变是通过选择比表3中的取代保守性更小的取代而进行的，即，选择在保持以下方面的效力更显著不同的残基：(a)取代区域多肽骨架的结构，例如作为折叠或螺旋构象，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的堆积(bulk)。预计大体上产生蛋白特性最大变化的取代将是如下取代：(a)亲水残基如丝氨酰或苏氨酰取代(或被取代为)疏水残基如亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代(或被取代为)任何其它残基；(c)具有带正电的侧链的残基如赖氨酰、精氨酰、或组氨酰取代(或被取代为)带负电的残基如谷氨酰或天冬氨酰；或(d)具有堆积侧链的残基如苯丙氨酸在此情形取代(或被取代为)不具有侧链的残基如甘氨酸；(e)通过增加硫酸化和/或糖基化位点的数目。

表2：氨基酸缩写

氨基酸

缩写

丙氨酸	Ala A
		精氨酸	Arg R
天冬酰胺	Asn N
		天冬氨酸	Asp D
半胱氨酸	Cys C
		谷氨酸	Glu E
谷氨酰胺	Gln K
		甘氨酸	Gly G
组氨酸	His H
		异亮氨酸	Ile I
亮氨酸	Leu L
		赖氨酸	Lys K
苯丙氨酸	Phe F
		脯氨酸	Pro P
丝氨酸	Ser S
		苏氨酸	Thr T
酪氨酸	Tyr Y
		色氨酸	Trp W
缬氨酸	Val V
		蛋氨酸	Met M

例如，本领域技术人员已知用一个氨基酸残基代替生物和/或化学上类似的另一氨基酸残基是保守性取代。例如，保守性取代将是用一个疏水残基代替另一疏水残基，或一个极性残基代替另一极性残基。取代包括组合诸如，例如Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg和Phe，Tyr。每种明确地公开的序列的这种保守性地代替的变化包括在本文提供的嵌合多肽中。

可采用取代诱变或缺失诱变以插入用于N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或O-糖基化(Ser或Thr)的位点。缺失半胱氨酸或其它不稳定残基也是期望的。缺失或取代可能的蛋白水解位点如Arg，通过例如缺失碱性残基之一或用谷氨酰胺酰或组氨酰残基取代来实现。

表3：氨基酸取代
	原始残基示例性保守取代，其它取代是本领域已知的。
Ala；ser
	Arg；lys，gln
Asn；gln；his
	Asp；glu
Cys；ser
	Gln；asn，lys
Glu；asp
	Gly；pro
His；asn；gln
	Ile；leu；val
Leu；ile；val
	Lys；arg；gln
Met；Leu；ile
	Phe；met；leu；tyr
Ser；thr
	Thr；ser
Trp；tyr
	Tyr；trp；phe
Val；ile；leu

某些翻译后衍生化是重组宿主细胞对表达的多肽作用的结果。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基通常翻译后脱酰胺为相应的谷氨酰和天冬氨酰(asparyl)残基。作为选择，这些残基在弱酸性条件下脱酰胺。其它翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的o-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties(蛋白：结构和分子特性),W.H.Freeman&Co.,San Francisco第79-86页[1983])，N-末端胺的乙酰化，和在一些情形C-末端羧基的酰胺化。

应理解的是，界定本文公开的蛋白的变体和衍生物的一种方式是经由在对特定已知序列的同源性/同一性方面界定变体和衍生物。例如，SEQ IDNO:15列出D5延伸酶的特定序列，SEQ ID NO:26列出D4去饱和酶蛋白的特定序列。具体公开的是与所指的序列具有至少70%或75%或80%或85%或90%或95%同源性的本文公开的这些蛋白和其它蛋白的变体。本领域技术人员易于理解如何确定两种蛋白的同源性。例如，可经过比对两条序列以使同源性处在最高水平之后，计算同源性。具体公开的序列具有与SEQ ID NO:15和26的大于96%的同一性和89%的同一性。

计算同源性的另一方式可通过公开的算法进行。用于比较的序列的最佳比对可通过Smith和Waterman Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法进行，通过Needleman和Wunsch,J.MoL Biol.48:443(1970)的同源性比对算法进行，通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444(1988)的搜寻相似性方法进行，通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)进行，或通过目测进行。

对核酸可获得相同类型的同源性，通过例如公开在Zuker，M.Science244:48-52,1989，Jaeger等人.Proc.Natl.Acad.Sci USA86:7706-7710,1989，Jaeger等人.Methods Enzymol.183:281-306,1989的算法，这些参考文献通过参考至少涉及核酸比对的材料并入本文。

应理解的是，保守性突变和同源性的描述可以任何组合联合在一起，诸如与特定序列具有至少70%同源性的实施方案，其中变体是保守性突变。

虽然说明书讨论了各种蛋白和蛋白序列，应理解的是，还公开了可编码这些蛋白序列的核酸。这将包括关于特定蛋白序列的所有简并序列，即具有编码一种特定蛋白序列的序列的所有核酸以及编码蛋白序列的公开的变体和衍生物的所有核酸，包括简并核酸。因此，虽然本文未写出每种具体的核酸序列，应理解的是，经由公开的蛋白序列本文事实上公开和描述了每一种和每一序列。例如，可编码列在SEQ ID NO:15的蛋白序列的许多核酸序列之一列在SEQ ID NO:14。还应理解，尽管没有氨基酸序列表示哪种具体的DNA序列在有机体中编码该蛋白，但是当本文公开了公开的蛋白的特定变体时，在产生该蛋白的特定菌株中编码该蛋白的已知核酸序列也是已知的，并在本文公开和描述。

应理解的是，有许多氨基酸和肽类似物可掺入公开的组合物。例如，有许多D氨基酸或具有不同于表2和表3中显示的氨基酸的功能性取代基的氨基酸。公开了天然产生肽的相对立体异构体、以及肽类似物的立体异构体。这些氨基酸可容易地掺入多肽链，通过使tRNA分子负荷上所选氨基酸和加工利用例如琥珀密码子的遗传构建体以将类似物氨基酸以位点特异性方式插入肽链(Thorson等人,Methods in Molec.Biol.77:43-73(1991)，Zoller，Current Opinion in Biotechnology,3:348-354(1992)；Ibba,Biotechnology&Genetic Engineering Reviews13:197-216(1995)，Cahill等人,TIBS,14(10):400-403(1989)；Benner，TIB Tech,12:158-163(1994)；Ibba和Hennecke,Bio/technology,12:678-682(1994)，所有文献都通过参考至少涉及氨基酸类似物的材料并入本文)。

可产生类似肽的分子，但其不经由天然肽键连接。例如，氨基酸或氨基酸类似物的键可包括CH₂NH--、--CH₂S--、--CH₂--CH₂--、--CH=CH--(顺式和反式)、--COCH₂--、--CH(OH)CH₂--和--CHH₂SO-(这些和其它可见于Spatola,A.F.Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides,andProteins(氨基酸、肽和蛋白的化学和生物化学),B.Weinstein编辑,MarcelDekker，New York,第267页(1983)；Spatola,A.F.,Vega Data(1983年3月),第1卷,第3期,Peptide Backbone Modifications(肽骨架修饰)(总的综述)；Morley,Trends Pharm Sci(1980)第463-468页；Hudson,D.等人,Int J Pept Prot Res14:177-185(1979)(--CH₂NH--、CH₂CH₂--)；Spatola等人.Life Sci38:1243-1249(1986)(--CH H₂-S)；Ham J.Chem.Soc PerkinTrans.I307-314(1982)(--CH--CH--，顺式和反式)；Almquist等人.J.Med.Chem.23:1392-1398(1980)(--COCH₂--)；Jennings-White等人.Tetrahedron Lett23:2533(1982)(--COCH₂--)；Szelke等人.EuropeanAppln,EP45665CA(1982):97:39405(1982)(--CH(OH)CH₂--)；Holladay等人.Tetrahedron.Lett24:4401-4404(1983)(--C(OH)CH₂--)；以及HrubyLife Sci31:189-199(1982)(--CH₂--S--)；每篇文献都通过参考并入本文。特别优选的非肽键是--CH₂NH--。应理解的是，肽类似物在成键原子之间可具有多于一个原子，诸如b-丙氨酸、g-氨基丁酸和类似物。

氨基酸类似物和类似物以及肽类似物通常具有增强的或期望的特性，诸如，生产更经济、更大的化学稳定性、增强的药理学特性(半衰期、吸收、效能、效力等等)、改变的特异性(如，广谱的生物活性)、减少的抗原性、及其它。

D-氨基酸可用于产生更稳定的肽，因为D氨基酸不被肽酶等等识别。以相同类型的D-氨基酸系统取代共有序列的一个或多个氨基酸(如，D-赖氨酸代替L-赖氨酸)可用于产生更稳定的肽。半胱氨酸残基可用于环化或将两条或多条肽连接到一起。这可有利于将肽限制于特定构象。(Rizo和Gierasch Ann.Rev.Biochem.61:387(1992)，通过参考并入本文)。

7.抗体

(1)抗体总述

术语“抗体”在本文以广泛含义使用，包括多克隆和单克隆抗体两者。除了完整免疫球蛋白分子，术语“抗体”还包括这些免疫球蛋白分子的片段或聚合物、和免疫球蛋白分子或其片段的人类或人源化形式，只要根据它们与分离的D4去饱和酶和D5延伸酶相互作用的能力选择以使它们可被鉴定、结合、纯化或具有改变的活性。还公开了结合D4去饱和酶和D5延伸酶的公开的区域的抗体。可使用本文描述的体外检测或通过类似方法测试抗体的期望活性，此后根据已知的临床测试方法测试其体内治疗和/或预防活性。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从大致均一的抗体群体获得的抗体，即，该群体中的单独抗体相同，除了抗体分子小亚组中可能存在的可能的天然产生的突变。本文的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体，其中重和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而该链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及嵌合抗体的片段，只要其表现期望的拮抗活性(参见，美国专利4,816,567和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。

公开的单克隆抗体可使用产生单克隆抗体的任何方案制备。例如，公开的单克隆抗体可使用杂交瘤方法制备，诸如描述在Kohler和Milstein,Nature,256:495(1975)的杂交瘤方法。杂交瘤方法中，通常以免疫剂免疫小鼠或其它合适的宿主动物以引发产生或能够产生将特异性结合免疫剂的抗体的淋巴细胞。作为选择，也可体外免疫淋巴细胞，如，使用本文描述的HIV Env-CD4-共受体复合体。

单克隆抗体还可通过重组DNA方法制备，诸如描述在美国专利4,816,567(Cabilly等人)的方法。使用常规方案(如，通过使用能够特异性地结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，编码公开的单克隆抗体的DNA可容易地分离并测序。还可使用噬菌体展示技术产生和筛选抗体或活性抗体片段的文库，如，在授予Burton等人的美国专利5,804,440和授予Barbas等人的美国专利6,096,441中描述的技术。

体外方法也适于制备单价抗体。消化抗体来产生其片段尤其是Fab片段，这可使用本领域已知的常规技术实现。例如，消化可使用木瓜蛋白酶进行。木瓜蛋白酶消化的实例描述在1994年11月22日公开的WO94/29348和美国专利4,342,566。木瓜蛋白酶消化抗体通常产生称为Fab片段的两个相同的抗原结合片段，其各带有一个抗原结合位点，以及残余的Fc片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原组合位点并仍能够交联抗原的片段。

无论是否与其它序列连接，片段还可包括特定区域或具体氨基酸残基的插入、缺失、取代或其它选择的修饰，只要与未修饰的抗体或抗体片段相比抗体或抗体片段的活性未显著改变或损害。这些修饰可提供一些另外的特性，诸如除去/增加能够形成二硫键的氨基酸、增加其生物寿命、改变其分泌特征等等。在任何情况下，该抗体或抗体片段必须具备生物活性特性，诸如对其同类抗原特异性结合。抗体或抗体片段的功能性或活性区域可通过诱变蛋白特定区域，随后表达并测试表达的多肽来鉴定。这种方法对本领域技术人员是明显的，并可包括位点特异性诱变编码抗体或抗体片段的核酸。(Zoller，MJ.Curr.Opin.Biotechnol.3:348-354,1992)。

如本文所用的，术语“抗体”还可指人类抗体和/或人源化抗体。许多非人类抗体(如，衍生自小鼠、大鼠或兔的抗体)在人类是天然抗原性的，因此当施用于人类时可产生不期望的免疫响应。因此，在方法中使用人类或人源化抗体用于减小施用于人类的抗体将引起不期望的免疫响应的可能性。

(2)人类抗体

公开的人类抗体可使用任何技术制备。产生人类单克隆抗体的技术的实例包括Cole等人(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗),Alan R.Liss,第77页,1985)和Boerner等人.(J Immunol,147(1):86-95,1991)描述的技术。人类抗体(和其片段)还可使用噬菌体展示文库产生(Hoogenboom等人,J.Mol. Biol.,227:381,1991；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581,1991)。

公开的人类抗体还可从转基因动物获得。例如，已经描述了能够响应于免疫产生人类抗体的全部清单(repertoire)的转基因、突变小鼠(参见，例如Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551-255(1993)；Jakobovits等人,Nature,362:255-258(1993)；Bruggermann等人,Year inImmunol,7:33(1993))。具体地，这些嵌合和种系突变小鼠抗体重链接合区(J(H))基因的纯合缺失导致完全抑制内源抗体产生，成功地转移人类种系抗体基因阵列到这种种系突变小鼠导致在抗原攻击时产生人类抗体。使用Env-CD4-共受体复合体选择具有期望活性的抗体，如本文描述的。

(3)人源化抗体

抗体人源化技术通常包括使用重组DNA技术来操纵编码抗体分子的一个或多个多肽链的DNA序列。因此，非人类抗体(或其片段)的人源化形式是嵌合抗体或抗体链(或其片段，诸如Fv、Fab、Fab’或抗体的其它抗原结合部分)，其包含整合到人类(受者)抗体的构架中的来自非人类(供者)抗体的抗原结合位点的一部分。

为了产生人源化抗体，来自受者(人类)抗体分子一个或多个互补决定区(CDR)的残基被来自供者(非人类)抗体分子一个或多个CDR的残基代替，已知供者(非人类)抗体分子具有期望的抗原结合性(如，对靶抗原某水平的特异性和亲和性)。在一些情况，人类抗体的Fv构架(FR)残基被相应的非人类残基代替。人源化抗体还可包含既不在受者抗体中也不在输入的CDR或构架序列中的残基。通常，人源化抗体具有从非人类来源引入的一个或多个氨基酸残基。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基代替的人类抗体。人源化抗体通常包含抗体恒定区(Fc)的至少一部分，其通常是人类抗体的(Jones等人,Nature,321:522-525(1986)，Reichmann等人,Nature,332:323-327(1988)，和Presta,Curr.Opin.Struct.Biol.,2:593-596(1992))。

用于人源化非人类抗体的方法是本领域公知的。例如，人源化抗体可根据Winter和合作者的方法产生(Jones等人,Nature,321:522-525(1986)，Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)，Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988))，该方法是通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人类抗体的相应序列。可用于产生人源化抗体的方法还描述在美国专利4,816,567(Cabilly等人)、美国专利5,565,332(Hoogenboom等人)、美国专利5,721,367(Kay等人)、美国专利5,837,243(Deo等人)、美国专利5,939,598(Kucherlapati等人)、美国专利6,130,364(Jakobovits等人)和美国专利6,180,377(Morgan等人)。

(4)抗体的施用

抗体的施用可如本文公开的进行。还存在用于抗体递送的核酸方法。抗体和抗体片段还可作为编码抗体或抗体片段的核酸制品(如，DNA或RNA)施用于患者或受试者或细胞，以使患者或受试者自身的细胞获取核酸并产生和分泌编码的抗体或抗体片段。核酸的递送可通过任何手段，例如如本文公开的手段。

8.药物运载体/药物产品的递送

如上述的，组合物还可在药学可接受的运载体中体内施用。“药学可接受的”是指不是生物学上或以其它方式不期望的材料，即，该材料可与核酸或载体一起施用于受试者，而不导致任何不期望的生物效应或与包含其的药物组合物的任何其它组分以有害的方式相互作用。运载体将天然地被选择以使活性成分的任何降解最少并使受试者中的任何不良副作用最少，如本领域技术人员公知的。

组合物还可经口、肠胃外(如，静脉内)、通过肌内注射、通过腹膜内注射、经皮、身体外、局部或类似方式施用，包括局部鼻内施用或通过吸入器施用。如本文所用的，“局部鼻内施用”是指经由鼻孔之一或两者将组合物递送到鼻和鼻道，并可包括通过喷雾机器或液滴机器递送，或经由核酸或载体烟雾化递送。通过吸入器施用组合物可通过喷雾机器或液滴机器经过鼻或口递送。还可通过插管直接递送到呼吸系统的任何部位(如，肺)。需要的组合物的确切量将在受试者之间变化，取决于受试者的物种、体重和大致情况、被治疗的过敏性紊乱的严重度、使用的具体核酸或载体、施用方式等等。因此，不可能对每种组合物指定确切的量。然而，由本文获得的教导，本领域技术人员仅使用常规试验就可确定合适的量。

如果使用肠胃外施用组合物，通常以注射为特征。注射液可制备为常规形式，作为液态溶液或悬浮液、适于在注射前溶解或悬浮于液体的固体形式或作为乳剂。对于肠胃外施用，最近修正的方法包括使用慢释放或缓释体系以使保持恒定剂量。参见，例如美国专利3,610,795，其通过参考并入本文。

材料可以在溶液、悬浮液中(例如，掺入微粒、脂质体、或细胞)。这些可能经由抗体、受体或受体配体靶向特定细胞类型。以下参考文献是使用该技术以将特异性蛋白靶向肿瘤组织的实例(Senter等人,BioconjugateChem.,2:447-451,(1991)；Bagshawe,K.D.,Br.J.Cancer,60:275-281,(1989)；Bagshawe,等人,Br.J.Cancer,58:700-703,(1988)；Senter，等人,Bioconjugate Chem.,4:3-9,(1993)；Battelli等人,Cancer Immunol.Immunother.,35:421-425,(1992)；Pietersz和McKenzie,Immunolog.Reviews,129:57-80,(1992)；和Roffler等人,Biochem.Pharmacol,42:2062-2065,(1991))。载运体(vehicle)诸如“stealth”和其它共轭到抗体的脂质体(包括脂质介导的药物至结肠癌的靶向)、经由细胞特异性配体的受体介导的DNA的靶向、淋巴细胞指引的肿瘤靶向、和鼠神经胶质瘤细胞的体内高特异性的治疗性逆转录病毒靶向。以下参考文献是使用这种技术将特异性蛋白靶向肿瘤组织的实例(Hughes等人,Cancer Research,49:6214-6220,(1989)；和Litzinger和Huang,BiochimicaetBiophysica Acta,1104:179-187,(1992))。大体上，受体牵涉在组成型或配体诱导的胞吞作用途径中。这些受体聚集在网格蛋白包被的凹陷中，经由网格蛋白包被的囊泡进入细胞，经过在其中分选受体的酸化的内涵体，随后再循环到细胞表面、变成细胞内储存或在溶酶体中降解。内在化途径用于多种功能，诸如营养摄取、除去活化的蛋白、清除大分子、病毒和毒素的条件性进入、解离和降解配体、以及受体水平的调节。许多受体参与多于一种细胞内途径，取决于细胞类型、受体浓度、配体类型、配体价位和配体浓度。已经综述了受体介导的胞吞作用的分子和细胞机制(Brown和Greene,DNA and CellBiology10:6,399-409(1991))。

a)药学可接受的运载体

包括抗体的组合物可用于治疗性地与药学可接受的运载体组合。

合适的运载体和其制剂描述在Remington:The Science and Practice ofPharmacy(雷氏药学理论和实践)(第19版)A.R.Gennaro编辑,MackPublishing Company,Easton,PA1995。通常，合适的量的药学上可接受的盐用于制剂中以使得制剂等渗。药学上可接受的运载体的实例包括但不限于，盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。溶液的pH优选地从约5到约8，更优选地从约7到约7.5。进一步的运载体包括缓释制品，诸如包含抗体的固态疏水聚合物的半透基质，该基质以有形物品的形式，如，膜、脂质体或微粒。对本领域技术人员明显的是，取决于例如施用途径和被施用的组合物浓度，某些运载体可能是更优选的。

药物运载体是本领域技术人员已知的。这些最通常地将是用于施用药物于人类的标准运载体，包括溶液诸如无菌水、盐水和生理pH的缓冲溶液。组合物可肌内或皮下施用。其它化合物将根据本领域技术人员使用的标准方案施用。

除了所选分子以外，药物组合物可包括运载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂和类似物。药物组合物还可包括一种或多种活性成分，诸如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂和类似活性成分。

取决于是否期望局部或全身治疗和待治疗的部位，药物组合物可以许多方式施用。施用可为局部(包括眼部、阴道、直肠、鼻内)、经口、通过吸入、或肠胃外，例如通过静脉内滴注、皮下、腹膜内或肌内注射。公开的抗体可静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内或经皮施用。

用于肠胃外施用的制品包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油、和注射用有机酯诸如油酸乙酯。水性运载体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载运体包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格氏、或不挥发油。静脉内载运体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏右旋糖的补充剂)、和类似载运体。也可存在防腐剂和其它添加剂，诸如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体和类似添加剂。

用于局部施用的制剂可包括软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾、液体剂和粉末剂。水性、粉末或油性基质的常规药物运载体、增稠剂和类似物可为需要的或期望的。

用于经口施用的组合物包括粉末或颗粒、水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、囊剂或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可为期望的。

一些组合物可能地作为药学可接受的酸或碱加成盐施用，所述盐通过与无机酸诸如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、和磷酸、和有机酸诸如甲酸、乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和反丁烯二酸反应而形成，或通过与无机碱诸如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾、和有机碱诸如单烷基胺、二烷基胺、三烷基胺和芳基胺以及取代的乙醇胺反应而形成。

b)治疗应用

用于施用组合物的有效剂量和时间表可根据经验确定，进行这种决定在本领域技术人员能力范围内。用于施用组合物的剂量范围是足够大以产生其中疾患的症状受影响的期望的效应的那些范围。剂量不应太大而导致不良副作用，诸如不希望的交叉反应、过敏反应和类似的不良副作用。通常，剂量将随着患者的年龄、条件、性别和疾病程度、施用途径、或其它药物是否包含在治疗方案中而变化，并可由本领域技术人员确定。在任何禁忌症的事件时，剂量可由具体的医师调整。剂量可变化，并可每天施用一个或多个剂量，持续一天或数天。对指定类型的药物产品的合适剂量，指导可见于文献。例如，对抗体选择合适的剂量的指导可见于关于抗体治疗应用的文献，如，Handbook of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体手册),Ferrone等人编辑,Noges Publications,Park Ridge,NJ.,(1985)第22章和第303-357页；Smith等人,Antibodies in Human Diagnosis and Therapy(人类诊断和治疗中的抗体),Haber等人编辑,Raven Press,New York(1977)第365-389页。取决于上述因素，单独使用的抗体的典型每日剂量可能从每天约1μg/kg体重到高达100mg/kg体重或更多。

与分离的D4去饱和酶和D5延伸酶相互作用、不具有具体药学(pharmacuetical)功能，但例如可用于追踪细胞染色体变化或用于递送诊断工具的其它分子可以对药物产品描述的方式类似的方式递送。

9.芯片和微阵列

公开了芯片，其中至少一个地址是列在本文公开的任何核酸序列中的序列或序列的部分。还公开了芯片，其中至少一个地址是列在本文公开的任何肽序列中的序列或序列的部分。

还公开了芯片，其中至少一个地址是列在本文公开的任何核酸序列中的序列或序列的部分的变体。还公开了芯片，其中至少一个地址是列在本文公开的任何肽序列中的序列或序列的部分的变体。

10.计算机可读介质

应理解的是，公开的核酸和蛋白可表示为由氨基酸的核苷酸组成的序列。有多种方式来展示这些序列，例如核苷酸鸟苷可被G或g代表。类似地氨基酸缬氨酸可被Val或V代表。本领域技术人员理解如何用存在的多种方式的任一种展示和表达任何核酸或蛋白序列，认为这些方式的每一种公开在本文。本文具体地预期在计算机可读介质上展示这些序列，所述计算机可读介质诸如，可购买获得的软盘、磁带、芯片、硬盘驱动器、光盘、视盘、或其它计算机可读介质。还公开了公开的序列的二进码形式。本领域技术人员理解什么计算机可读介质。因此，在其上记录、储存或保存核酸或蛋白序列的计算机可读介质。

公开了计算机可读介质，其包含序列和关于本文列出的序列的信息。

11.通过以公开的组合物/组合化学筛选而鉴定的组合物

a)组合化学

公开的组合物可用作任何组合技术的靶以鉴定以期望的方式与公开的组合物相互作用的分子或大分子分子。本文公开的核酸、肽和相关分子可用作组合方法的靶。还公开了经由组合技术或筛选技术鉴定的组合物，其中在例如SEQ ID NO:14、15、25或26公开的组合物或其部分用作组合或筛选方案中的靶。

应理解的是，当在组合技术或筛选方法中使用公开的组合物时，将鉴定具有特定的期望特性诸如抑制或刺激靶分子的功能的分子，诸如大分子的分子。还公开了当使用公开的组合物时鉴定和分离的分子，诸如脂肪酸。因此，使用涉及公开的组合物的组合或筛选方法产生的产物，诸如脂肪酸，也认为在本文公开。

应理解的是，用于鉴定抑制例如，分离的D4去饱和酶与D5延伸酶之间的相互作用的分子的公开的方法可使用高通量手段进行。例如，可使用荧光共振能量转移(FRET)鉴定推定的抑制剂以快速鉴定相互作用。该技术的基本理论是当两个分子在空间中接近时，即以超过背景的水平相互作用，则产生信号或信号可被猝灭。随后可进行多种试验，包括例如，加入推定的抑制剂。如果该抑制剂与两种信号分子之间的相互作用竞争，信号将在空间中彼此除去，取决于所用的信号类型，这将导致信号减少或增加。这种减少或增加的信号可与推定的抑制剂的存在或不存在相关。可使用任何信号传导手段。例如，公开了鉴定任何两种公开的分子之间相互作用的抑制剂的方法，该方法包括使第一分子与第二分子在推定的抑制剂存在下接触，其中第一分子或第二分子包括荧光供体，其中第一或第二分子，通常是不包括供体的分子，包括荧光受体；并在推定的抑制剂存在和推定的抑制剂不存在下测量荧光共振能量转移(FRET)，其中推定的抑制剂存在下FRET与推定的抑制剂不存在下FRET测量值相比减少表示推定的抑制剂抑制这两种分子之间的结合。这种类型的方法还可以细胞体系进行。

组合化学包括但不限于用于分离小分子或能够结合小分子或另一大分子的大分子的所有方法，通常是以迭代的方法。蛋白、寡核苷酸和糖类是大分子的实例。例如，具有催化性或配体结合的指定功能的寡核苷酸分子可从随机寡核苷酸的复杂混合物中分离，这已被称为“体外遗传学”(Szostak,TIBS19:89,1992)。人们合成带有随机和界定的序列的分子的大池，并对该复杂混合物，例如大约100μg的100核苷酸RNA中10¹⁵种单独序列进行一些选择和富集处理。经由亲和性色谱和PCR扩增结合于柱上配体的分子的重复循环，Ellington和Szostak(1990)估计10¹⁰RNA分子中的1个以结合小分子染料的方式折叠。还已分离了具有这种配体结合行为的DNA分子(Ellington和Szostak,1992；Bock等人,1992)。对小的有机分子、蛋白、抗体和本领域技术人员已知的其它大分子存在针对类似目标的技术。筛选分子组的期望活性，无论是否基于小有机文库、寡核苷酸或抗体，都宽泛地称为组合化学。组合技术特别适合于界定分子之间的结合相互作用并适于分离具有特异性结合活性的分子，当大分子是核酸时该分子通常称为适体。

已有大量方法用于分离具有全新活性或修饰的活性的蛋白。例如，噬菌体展示文库已被用于分离许多与特定靶相互作用的肽。(参见，例如美国专利6,031,071；5,824,520；5,596,079和5,565,332，其通过参考至少涉及噬菌体展示的材料和涉及组合化学的方法并入本文)。

用于分离具有指定功能的蛋白的优选方法描述在Roberts和Szostak(Roberts R.W.和Szostak J.W. Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94(23)12997-302(1997)。该组合化学方法联合了蛋白的功能性能力和核酸的遗传能力。产生RNA分子，其中嘌呤霉素分子共价连接于RNA分子的3’-端。这一修饰的RNA分子的体外翻译导致翻译该RNA编码的正确蛋白。此外，由于连接有嘌呤霉素，不能延伸肽基(peptdyl)受体，生长中的肽链连接于连接到RNA的嘌呤霉素。因此，蛋白分子连接于编码其的遗传材料。现在可进行普通的体外选择步骤以分离功能性肽。完成对肽功能的选择步骤后，进行常规核酸操纵步骤以扩增编码所选的功能性肽的核酸。扩增遗传材料后，转录在3’-端带有嘌呤霉素的新RNA，翻译新肽并进行又一功能性选择循环。因此，可如同核酸选择技术一样以迭代方式进行蛋白选择。翻译的肽由与嘌呤霉素连接的RNA的序列控制。该序列可为来自为了最佳翻译而加工的随机序列的任何序列(即无终止密码子等等)，或可为已知RNA分子的简并序列以搜寻已知肽的改进或改变的功能。核酸扩增和体外翻译的条件对于本领域技术人员是公知的，优选地如Roberts和Szostak(Roberts R.W.和Szostak J.W. Proc.Natl.Acad.Sci. USA,94(23)12997-302(1997))进行。

设计为分离肽的组合方法的另一优选的方法描述在Cohen等人(Cohen B.A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(24):14272-7(1998))。该方法利用并修改了双杂交技术。酵母双杂交体系可用于检测和分析蛋白：蛋白相互作用。双杂交体系最初描述在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，是一种用于鉴定新的对目标蛋白特异性的调节性分子的强有力的分子遗传技术(Fields和Song,Nature340:245-6(1989))。Cohen等人修改该技术以使可鉴定结合所选分子的合成或工程化的肽序列之间的新型相互作用。这类技术的益处是，选择是在细胞内环境进行。该方法利用连接于酸性活化结构域的肽分子文库。所选的肽，例如分离的D4去饱和酶或D5延伸酶的部分连接于转录活化蛋白诸如Gal4的DNA结合结构域。通过对这类体系进行双杂交技术，可鉴定结合分离的D4去饱和酶或D5延伸酶的该部分的分子。

使用本领域技术人员公知的方法联同各种组合文库，人们可分离并表征与期望的靶结合或相互作用的小分子或大分子。使用竞争结合研究可比较这些化合物的相对结合亲和性并鉴定最佳化合物，这是本领域技术人员公知的。

用于制备组合文库并筛选组合文库以分离结合期望的靶的分子的技术是本领域技术人员公知的。代表性的技术和方法可见于但不限于美国专利5,084,824、5,288,514、5,449,754、5,506,337、5,539,083、5,545,568、5,556,762、5,565,324、5,565,332、5,573,905、5,618,825、5,619,680、5,627,210、5,646,285、5,663,046、5,670,326、5,677,195、5,683,899、5,688,696、5,688,997、5,698,685、5,712,146、5,721,099、5,723,598、5,741,713、5,792,431、5,807,683、5,807,754、5,821,130、5,831,014、5,834,195、5,834,318、5,834,588、5,840,500、5,847,150、5,856,107、5,856,496、5,859,190、5,864,010、5,874,443、5,877,214、5,880,972、5,886,126、5,886,127、5,891,737、5,916,899、5,919,955、5,925,527、5,939,268、5,942,387、5,945,070、5,948,696、5,958,702、5,958,792、5,962,337、5,965,719、5,972,719、5,976,894、5,980,704、5,985,356、5,999,086、6,001,579、6,004,617、6,008,321、6,017,768、6,025,371、6,030,917、6,040,193、6,045,671、6,045,755、6,060,596和6,061,636。

使用大量的不同合成技术，组合文库可从广泛阵列的分子制备。例如，包含融合的2,4-嘧啶二酮类(美国专利6,025,371)、二氢苯并吡喃(美国专利6,017,768和5,821,130)、醇酰胺类(美国专利5,976,894)、羟基-氨基酸酰胺类(美国专利5,972,719)、糖类(美国专利5,965,719)、1,4-苯二氮-2,5-二酮(美国专利5,962,337)、环状化合物(美国专利5,958,792)、联芳氨基酸酰胺类(美国专利5,948,696)、噻吩类(美国专利5,942,387)、三环四氢喹啉类(美国专利5,925,527)、苯并呋喃类(美国专利5,919,955)、异喹啉类(美国专利5,916,899)、乙内酰脲和乙内酰硫脲(美国专利5,859,190)、吲哚类(美国专利5,856,496)、咪唑-吡啶并-吲哚和咪唑-吡啶并-苯并噻吩类(美国专利5,856,107)、取代的2-亚甲基-2,3-二氢噻唑类(美国专利5,847,150)、喹啉类(美国专利5,840,500)、PNA(美国专利5,831,014)、包含标签(美国专利5,721,099)、聚酮类(美国专利5,712,146)、吗啉代-亚基(美国专利5,698,685和5,506,337)、磺酰胺类(美国专利5,618,825)、和苯二氮卓类(美国专利5,288,514)的文库。

如本文所用的，组合方法和文库包括常规筛选方法和文库以及用于迭代方法中的方法和文库。

b)计算机辅助的药物设计

公开的组合物可用作任何分子建模技术的靶以鉴定公开的组合物的结构或鉴定以期望的方式与公开的组合物相互作用的可能的或实际的分子诸如小分子。本文公开的核酸、肽和相关分子可用作任何分子建模程序或方法中的靶。

应理解的是，当在建模技术中使用公开的组合物时，将鉴定具有特定期望的特性诸如抑制或刺激靶分子功能的分子诸如大分子的分子。还公开了当使用公开的组合物诸如分离的D4去饱和酶或D5延伸酶时鉴定和分离的分子。因此，使用涉及公开的组合物诸如分离的D4去饱和酶或D5延伸酶的分子建模方法产生的产物也认为在本文公开。

因此，分离结合所选分子的分子的一种方式是经由合理设计。这经由结构信息和计算机建模实现。计算机建模技术允许所选分子的三维原子结构可视化和合理设计将与分子相互作用的新化合物。三维构建通常取决于对所选分子的x-射线结晶学分析或NMR成像的数据。分子动力学需要力场数据。计算机制图系统能够预测新化合物将如何连接靶分子并允许试验性操纵化合物和靶分子的结构以使结合特异性最佳。预测当在分子或化合物之一或两者进行小的变化时分子-化合物相互作用将是什么样子需要分子力学软件和密集计算的计算机，该软件和计算机通常伴有分子设计程序与用户之间用户友好的、菜单驱动的界面。

分子建模体系的实例是CHARMm和QUANTA程序，PolygenCorporation,Waltham,MA。CHARMm进行能量最小化和分子动力学功能。QUANTA进行构建、图示建模和分析分子结构。QUANTA允许互动式构建、修饰、可视化、和分析分子彼此的行为。

大量文章综述了与特定蛋白相互作用的药物的计算机建模，诸如Rotivinen等人,1988Acta Pharmaceutica Fennica 97,159-166；Ripka,NewScientist 54-57(1988年6月16日)；McKinaly和Rossmann,1989Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29,111-122；Perry和Davies,QSAR:QuantitativeStructure-Activity Relationships in Drug Design(QSAR：药物设计中的定量结构-活性关系)第189-193页(Alan R.Liss,Inc.1989)；Lewis和Dean,1989Proc.R.Soc.Lond.236,125-140和141-162；以及，关于核酸组分的模型酶，Askew等人,1989J.Am.Chem.Soc.111,1082-1090。筛选和图解地表示化学物的其它计算机程序可从以下公司获得，诸如BioDesign,Inc.,Pasadena,CA.、Allelix,Inc,Mississauga,Ontario,Canada和Hypercube,Inc.,Cambridge,Ontario。尽管这些主要为应用于对特定蛋白特异性的药物而设计，它们也可适用于在鉴定该区域之后设计与DNA或RNA的具体区域特异性相互作用的分子。

尽管上述提及设计和产生可以改变结合的化合物，人们也可以从已知化合物的文库，包括天然产物或合成化学品和包括蛋白的生物活性材料筛选改变底物结合或酶促活性的化合物。

12.试剂盒

本文公开了关于可用于实践本文公开的方法的试剂的试剂盒。试剂盒可包括本文讨论的任何试剂或试剂组合或将理解为实践公开的方法所需或有益于实践公开的方法的任何试剂或试剂组合。例如，试剂盒可包括引物以进行在方法的某些实施方案讨论的扩增反应，以及如计划地使用引物所需的缓冲液和酶。

13.具有类似功能的组合物

应理解的是，本文公开的组合物具有某些功能，诸如公开的酶促功能。本文公开了用于实现公开的功能的某些结构要求，应理解的是，有关于公开的结构的多种结构可实现相同功能，这些结构最终将实现相同结果，例如刺激或抑制酶促功能。

C.制备组合物的方法

除非另外具体地指明，否则本文公开的组合物和进行公开的方法必需的组合物可使用本领域技术人员对该特定试剂或化合物已知的任何方法制备。

1.核酸合成

例如，核酸诸如将用作引物的寡核苷酸可使用标准化学合成方法制备或可使用酶促方法或任何其它已知方法产生。这种方法可从标准酶促消化随后是核苷酸片段分离(参见，例如Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(分子克隆实验室指南),第2版(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor，N.Y.,1989)第5、6章)到单纯的合成方法，例如通过使用Milligen或Beckman系统1Plus DNA合成仪(例如，Milligen-Biosearch,Burlington,MA的8700型自动合成仪或ABI380B型)的氰乙基亚磷酰胺方法。可用于制备寡核苷酸的合成方法还描述在Ikuta等人,Ann.Rev.Biochem.53:323-356(1984)(磷酸三酯和亚磷酸三酯方法)，和Narang等人,Methods Enzymol.,65:610-620(1980)(磷酸三酯方法)。蛋白核酸分子可使用已知方法制备，诸如Nielsen等人,Bioconjug.Chem.5:3-7(1994)描述的方法。

2.肽合成

产生公开的蛋白诸如SEQ ID NO:23的一种方法是通过蛋白化学技术将两个或多个肽或多肽连接在一起。例如，肽或多肽可使用目前可获得的实验室设备使用Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)或Boc(叔丁氧基羰基)化学合成(Applied Biosystems,Inc.,Foster City，CA)。本领域技术人员可容易地明白，例如对应于公开的蛋白的肽或多肽，可通过标准化学反应合成。例如，肽或多肽可被合成并不从其合成树脂上切下，而肽或蛋白的其它片段可被合成且其后从树脂上切下，从而将功能性地封闭的末端基团暴露于该其它片段。通过肽缩合反应，这两种片段可经由肽键分别在其羧基末端和氨基末端共价连接，以形成抗体或其片段。(Grant GA(1992)Synthetic Peptides:A User Guide(合成肽的使用者指南).W.H.Freeman and Co.,N.Y.(1992)；Bodansky M和Trost B.编辑.(1993)Principles of Peptide Synthesis(肽合成原理).Springer-Verlag Inc.,NY(其通过参考至少关于涉及肽合成的材料并入本文)。作为选择，肽或多肽如本文描述的独立地体内合成。在分离后，这些独立的肽或多肽可经由类似肽缩合反应被连接以形成肽或其片段。

例如，酶促连接克隆的或合成的肽区段允许连接相对小的肽片段以产生较大的肽片段、多肽或完整蛋白结构域(Abrahmsen L等人,Biochemistry,30:4151(1991))。作为选择，天然化学连接合成肽可用于从较小肽片段合成地构建大的肽或多肽。该方法由两步化学反应组成(Dawson等人.Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation(通过天然化学连接合成蛋白).Science,266:776-779(1994))。第一步是未保护的合成肽-硫酯与包含氨基-末端Cys残基的另一未保护的肽区段化学选择性反应以产生硫酯-连接的中间产物作为最初的共价产物。不需改变反应条件，该中间产物将经历自发、快速的分子内反应以形成在连接位点的天然肽键(Baggiolini M等人.(1992)FEBS Lett.307:97-101；Clark-Lewis I等人,J.Biol.Chem.,269:16075(1994)；Clark-Lewis I等人,Biochemistry,30:3128(1991)；Rajarathnam K等人,Biochemistry33:6623-30(1994))。

作为选择，未保护的肽区段被化学连接，其中作为化学连接的结果，肽区段之间形成的键是非天然(非肽)键(Schnolzer，M等人.Science,256:221(1992))。这一技术已经用于合成蛋白结构域的类似物以及大量具有完全生物活性的相对纯的蛋白(de Lisle Milton RC等人,Techniques inProtein Chemistry IV(蛋白化学中的技术IV).Academic Press,New York,pp.257-267(1992))。

3.关于制备组合物的方法权利主张

公开了用于制备组合物以及制备将产生该组合物的中间产物的方法。例如，公开了SEQ ID NO:14和25的核酸。有多种方法可用于制备这些组合物，诸如合成化学方法和标准分子生物学方法。应理解的是，具体地公开了用于制备这些和其它公开的组合物的方法。

公开了包括以可操作方式连接例如包含列在SEQ ID NO:14和25的序列的核酸与控制该核酸表达的序列的方法而产生的核酸分子。

还公开了包括以可操作方式连接例如包含与列在SEQ ID NO:14和25的序列具有80%同一性的序列的核酸分子与控制该核酸表达的序列的方法而产生的核酸分子。

公开了包括以可操作方式连接例如包含在严紧性杂交条件下与列在SEQ ID NO:14和25的序列杂交的序列的核酸分子与控制该核酸表达的序列的方法而产生的核酸分子。

公开了包括以可操作方式连接例如包含编码列在SEQ ID NO:15和26的肽的序列的核酸分子与控制该核酸分子表达的序列的方法而产生的核酸分子。

公开了包括以可操作方式连接例如包含编码与列在SEQ ID NO:15和26的肽具有80%同一性的肽的序列的核酸分子与控制该核酸分子表达的序列的方法而产生的核酸分子。

公开了包括以可操作方式连接例如包含编码与列在SEQ ID NO:15和26的肽具有80%同一性、且例如其中不同于SEQ ID NO:15和26的任何变化是保守性变化的肽的序列的核酸分子与控制该核酸分子表达的序列的方法而产生的核酸。

公开了以公开的任何核酸转化细胞的方法产生的细胞。公开了以非天然产生的公开的任何核酸转化细胞的方法产生的细胞。

公开了由表达任何公开的核酸的方法产生的任何公开的肽。公开了由表达任何公开的核酸的方法产生的任何非天然产生的公开的肽。公开了由表达任何非天然公开的核酸的方法产生的任何公开的肽。

公开了由以本文公开的任何核酸分子转染动物中细胞的方法产生的动物。公开了以本文公开的任何核酸分子转染动物中的细胞的方法产生的动物，其中该动物是哺乳动物。还公开了以本文公开的任何核酸分子转染动物中的细胞的方法产生的动物，其中该哺乳动物是小鼠、大鼠、兔、牛、绵羊、猪或灵长类。

还公开了通过向动物加入本文公开的任何细胞的方法而产生的动物。

D.实施例

提出以下实施例以对本领域技术人员提供如何制备和评价本文公开的化合物、组合物、物品、装置和/或方法的完整公开和说明，并且仅意为示例性而不意为限制本公开。已经努力确保关于数字(如，量、温度等等)的准确性，但应当说明有一些误差和偏差。除非另外指明，否则部分是按重量计的部分，温度以℃表示或在室温，压力是在大气压或接近大气压。

1.实施例1

为了从破囊壶菌Thraustochytrid ONC-T18分离去饱和酶和延伸酶而设计简并寡核苷酸

分析破囊壶菌Thraustochytrid ONC-T18的脂肪酸组成揭示，存在可观量的较长链PUFA诸如花生四烯酸(ARA,20:4n-6)、二十碳五烯酸(EPA,20:5n-3)、肾上腺酸(ADA,22:4n-6)、二十二碳五烯酸22:5n-6)、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸(DHA,22:6n-3)。因此认为该有机体包含能够转化ARA为ADA或转化EPA为的活性Δ5-延伸酶和去饱和ADA为或去饱和为DHA的活性Δ4-去饱和酶(图1)。因此目标是试图从破囊壶菌Thraustochytrid ONC-T18分离这些去饱和酶和延伸酶基因，并最终通过在另一宿主表达而证实功能性。

为了分离编码功能性去饱和酶的基因，从有机体提取基因组DNA。将破囊壶菌Thraustochytrid ONC-T18培养物在生长培养基(5g/l酵母提取物、5g/l蛋白胨、40g/l D(+)-葡萄糖、1.25ml/l痕量元素、1.25ml/l维生素、40g/l海盐；(痕量元素：5g/l NaH₂PO₄.H₂O、3.15g/l FeCl₃.6H₂O、4.36g/l Na₂EDTA.2H₂O、0.6125mg/l CuSO₄.5H₂O、0.0597g/l Na₂MoO₄.2H₂O、0.022g/l ZnSO₄.7H₂O、0.01g/l CoCl₂.6H₂O、0.18g/l MnCl₂.4H₂O、13μg/lH₂SeO₃、2.7mg/l NiSO₄.6H₂O、1.84mg/l Na₃VO₄、1.94mg/l K₂CrO₄)、(维生素：1mg/l维生素B12、1mg/l生物素、0.20g/l硫胺素HCl))在26℃生长16-20小时，伴随不断搅动。将细胞在室温在Sorvall Super T21离心机中用转子ST-H750、使用适配器(adapter)Sorvall#00436以500rpm离心5min，除去80%上清液，在剩余培养基中重悬细胞，并继续提取。使用Ultraclean Microbial DNA分离试剂盒(MO BIO Laboratories,Inc,Solana Beach,California)按照制造商的实验方案，从细胞分离基因组DNA。

采用的方法是设计在已知的去饱和酶中保守的简并寡核苷酸(即，引物)。这些引物可用在PCR反应中以鉴定包含来自破囊壶菌Thraustochytrium的预测的去饱和酶基因中保守区域的片段。五条序列可从破囊壶菌Thraustochytrium sp.、金黄色破囊壶菌Thraustochytriumaureum、破囊壶菌Thraustochytrium sp.ATCC34304、破囊壶菌Thraustochytrium sp.ATCC21685和破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10获得(分别具有EMBO登录号CS020087、Genbank登录号AF391546、AF391543、AF489589、DQ133575)。使用Kodon引物设计软件，使用的简并引物如下：引物4desat308(正向)(SEQ ID NO:1)5’-GGRACAGCGASTTTTACAGGG-3’、引物4desatl369(反向)(SEQ IDNO:2)5’-GTGCTCAATCTGGTGGTTKAG-3’。

采用相同方法来设计在已知的延伸酶中保守的简并寡核苷酸(即，引物)。这些引物可用在PCR反应中以鉴定包含来自破囊壶菌Thraustochytrium sp.的预测的延伸酶基因的保守区域的片段。两条序列可从破囊壶菌Thraustochytrium sp.和金黄色破囊壶菌Thraustochytriumaureum获得(分别具有EMBO登录号CS160897和CS160879)。使用Kodon引物设计软件，使用的简并引物如下：引物5elo202F(正向)(SEQ IDNO:3)5’-AAGCCYTTCGAGCTCAAGTYC-3’、引物5elo768R(反向)(SEQ ID NO:4)5’-GCACGAARAAGTTGCCGAAG-3’。寡核苷酸序列的简并性密码子是：K=G、T，R=A、G，S=G、C，Y=C、T。

2.实施例2

从破囊壶菌Thraustochytrium sp.ONC-T18分离Δ5-延伸酶的核苷酸序列

为了分离Δ5-延伸酶基因，在包含以下的50μl体积中进行PCR扩增：200ng破囊壶菌Thraustochytrium sp.ONC-T18的基因组DNA、10μl甜菜碱、10mM Tris-HCl,pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl₂、0.001%明胶、200μM每种脱氧核糖核苷酸三磷酸酯、1μM各种引物和0.2单位TaqDNA聚合酶(Sigma,Oakville,Ontario)。在55.7℃的退火温度进行热循环，在0.8%低熔点的琼脂糖凝胶上分辨PCR反应物，凝胶纯化~600bp的条带。用水从琼脂糖上洗脱PCR产物，随后用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Valencia,California)纯化。按照制造商的说明书将这些DNA片段克隆到pT7Blue-3Perfectly钝端克隆试剂盒(Novagen,San Diego,California)。将重组质粒转化到NovaBlue感受态细胞(Novagen,San Diego,California)，并对克隆测序。这样分离了对此前鉴定的Δ5-延伸酶显示序列同源性的一个克隆。该克隆如下描述：对克隆#600-16(SEQ ID NO:5)测序，从593bp推断的氨基酸序列与破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10的多不饱和的脂肪酸延伸酶1显示95%同一性作为BLASTx搜寻中的最高得分匹配。

为了分离3’-端，按照制造商的实验方案使用APAgene GOLD基因组步移试剂盒(BIO S&T,Montreal,Quebec)进行基因组步移，并使用从破囊壶菌Thraustochytrium sp.ONC-T18纯化的基因组DNA以及寡核苷酸3’GSPa(SEQ ID NO:6)(5’-CGCTGCGCCCGTACATTACTACCATCCA-3’)和3’GSPb(SEQ IDNO:7)(5’-GTCGTCCAGTCCGTCTATGAC-3’)。这两种寡核苷酸是基于推定的Δ5-延伸酶的#600-16片段设计的。在0.8%低熔点的琼脂糖凝胶上分辨PCR片段，凝胶纯化～500至2000bp的条带。用水从琼脂糖上洗脱PCR产物，随后用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Valencia,California)纯化。按照制造商的说明书将这些DNA片段克隆到pT7Blue-3Perfectly钝端克隆试剂盒(Novagen,San Diego,California)。将重组质粒转化到NovaBlue感受态细胞(Novagen,San Diego,California)，并对克隆测序。克隆3’C2-1(SEQ ID NO:8)包含358bp的插入片段，基于与已知的Δ5-延伸酶的序列同源性和存在‘TGA’终止密码子，鉴定该插入片段包含推定的Δ5-延伸酶基因的3’-端。

为了分离5’-端，按照制造商的实验方案使用APAgene GOLD基因组步移试剂盒(BIO S&T，Montreal,Quebec)进行基因组步移，并使用从破囊壶菌Thraustochytrium sp.ONC-T18纯化的基因组DNA，以及寡核苷酸5’GSPa(SEQ ID NO:9)(5’-CTCGGCACCCTTCTCC ATCGGGTTGCCA-3’)和5’GSPb(SEQ IDNO:10)(5’-GTTGCCAAAGAGCTTGTAGCCGCCGA-3’)。这两种寡核苷酸是基于推定的Δ5-延伸酶的#600-16片段设计的。在0.8%低熔点的琼脂糖凝胶上分辨PCR片段，凝胶纯化～500至2000bp的条带。用水从琼脂糖上洗脱PCR产物，随后用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Valencia,California)纯化。按照制造商的说明书将这些DNA片段克隆到pT7Blue-3Perfectly钝端克隆试剂盒(Novagen,San Diego,California)。将重组质粒转化到NovaBlue感受态细胞(Novagen,San Diego,California)，并对克隆测序。如此获得克隆5’D2-11(SEQ ID NO:11)，其包含含有新Δ5-延伸酶的推定的‘ATG’起始位点的519bp插入片段。当与已知的Δ5-延伸酶比对时，该片段的推定的氨基酸序列显示89%同一性。

通过PCR扩增完整地分离该Δ5-延伸酶基因，使用破囊壶菌Thraustochytrium ONC-T18基因组DNA作为模板和以下寡核苷酸：ONC-T18elo1(正向)(SEQ ID NO:12)5’-GCTGATGATGGCCGGGACC-3’、ONC-T18elo1099(反向)(SEQ IDNO:13)5’-GGTCCACTCGAATTCGTAGCG-3’。

使用50μl体积中的以下进行PCR扩增：100ng破囊壶菌Thraustochytrium ONC-T18基因组DNA、25mM TAPS-HCl,pH9.3、50mM KCl、2mM MgCl₂、1mMβ-巯基乙醇、1.5μlDMSO、200μM每种脱氧核糖核苷酸三磷酸酯、0.5μM各种引物和1单位的Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes,Espoo,Finland)。热循环条件如下：最初在98℃将模板变性30sec，随后是[98℃持续10sec、62℃持续30sec、72℃持续30sec]的30个循环，最终在72℃延伸循环5分钟。按照制造商的说明书将如此获得的PCR产物克隆到pT7Blue-3Perfectly钝端克隆试剂盒(Novagen,San Diego,California)。将重组质粒转化到NovaBlue感受态细胞(Novagen,San Diego,California)，并对克隆测序。使用UltraClean6Minute Mini质粒制备试剂盒(MO BIO Laboratories,Inc,Solana Beach,California)纯化质粒。以BamHI/NotI消化如此获得的质粒并克隆到酵母表达载体pYES2(Invitrogen,Carlsbad,California)以产生克隆pYElo，其随后用于表达研究。

Δ5-延伸酶全长基因插入片段的长度是1099bp(SEQ ID NO:14)，从第一ATG开始，包含编码276个氨基酸的831bp开放阅读框。全长基因的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)包含与来自破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10、地钱Marchantia polymorpha、小立碗藓Physcomitrella patens和高山被孢霉Mortierella alpina的Δ5-延伸酶同源的区域。

3.实施例3

从破囊壶菌Thraustochytrium ONC-T18分离Δ4-去饱和酶核苷酸序列

为了分离Δ4-去饱和酶基因，在包含以下的50μl体积中进行PCR扩增：100ng破囊壶菌Thraustochytrium ONC-T18的基因组DNA、20mMTris-HCl,pH8.4、50mM KCl、2mM MgCl₂、400μM每种脱氧核糖核苷酸三磷酸酯、2μM各种引物和0.1单位Taq DNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,California)。在59.5℃的退火温度进行热循环，在0.8%琼脂糖凝胶上分辨PCR反应物的一部分，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Valencia,California)从剩余的PCR反应物纯化~1100bp的条带。按照制造商的说明书将这一DNA片段克隆到TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,California)以测序。将重组质粒转化到TOP10感受态细胞(Invitrogen,Carlsbad,California)，并对克隆测序。这样分离了对此前鉴定的Δ4-去饱和酶显示序列同源性的一个克隆。该克隆如下描述：对克隆#10-3(SEQ ID NO:16)测序，从967bp推断的氨基酸序列与破囊壶菌Thraustochytrium sp.ATCC21685的Δ-4脂肪酸去饱和酶显示96%同一性作为BLASTx搜寻中的最高得分匹配。

为了分离3’-端，按照制造商的实验方案使用APAgene GOLD基因组步移试剂盒(BIO S&T，Montreal,Quebec)进行基因组步移，并使用从破囊壶菌Thraustochytrium ONC-T18纯化的基因组DNA以及寡核苷酸4desat3'a(SEQ ID NO:17)(5’-TTACGCTTCCAAGGACGCGGTC-3’)和4desat3'b(SEQ ID NO:18)(5’-ATGAACAACACGCGCAAGGAGG-3’)。这两种寡核苷酸是基于推定的Δ4-去饱和酶的#10-3片段设计的。在0.8%低熔点的琼脂糖凝胶上分辨PCR片段，凝胶纯化～500至2000bp的条带。用水从琼脂糖上洗脱PCR产物，随后用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Valencia,California)纯化。按照制造商的说明书将这些DNA片段克隆到pT7Blue-3Perfectly钝端克隆试剂盒(Novagen,San Diego,California)。将重组质粒转化到NovaBlue感受态细胞(Novagen,San Diego,California)，并对克隆测序。克隆3’D2-92(SEQ ID NO:19)包含782bp的插入片段，基于与已知的Δ4-去饱和酶的序列同源性和存在‘TGA’终止密码子，鉴定该插入片段包含推定的Δ4-去饱和酶基因的3’-端。

为了分离5’-端，按照制造商的实验方案使用APAgene GOLD基因组步移试剂盒(BIO S&T,Montreal,Quebec)进行基因组步移，并使用从破囊壶菌Thraustochytrium sp.ONC-T18纯化的基因组DNA，以及寡核苷酸4desat5’a(SEQ ID NO:20)(5’-CTGGATACACGTGCCCACGAAG-3’)和4desat5’b(SEQ ID NO:21)(5’-CACATCCAGTACAACGAGCTCCAGAA-3’)。这两种寡核苷酸是基于推定的Δ4-去饱和酶的#10-3片段设计的。在0.8%低熔点的琼脂糖凝胶上分辨PCR片段，凝胶纯化～500至2000bp的条带。用水从琼脂糖上洗脱PCR产物，随后用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Valencia,California)纯化。按照制造商的说明书将这些DNA片段克隆到pT7Blue-3Perfectly钝端克隆试剂盒(Novagen,San Diego,California)。将重组质粒转化到NovaBlue感受态细胞(Novagen,San Diego,California)，并对克隆测序。如此获得克隆5’-217(SEQ ID NO:22)，其包含含有新Δ4-去饱和酶的推定的‘ATG’起始位点的946bp插入片段。当与已知的Δ4-去饱和酶(desaaturase)比对时，该片段的推断的氨基酸序列显示96%同一性。

通过PCR扩增完整地分离该Δ4-去饱和酶基因，使用破囊壶菌Thraustochytrium sp.ONC-T18基因组DNA作为模板和以下寡核苷酸：ONC-T184des380F(正向)(SEQ ID NO:23)5’-CGATTGAGAACCGCAAGCTTT-3’、ONC-T184DES1687R(反向)(SEQ ID NO:24)5’-GCAGCACTGCTGTGCTCTGGT-3’。

使用50μl体积中的以下进行PCR扩增：300ng破囊壶菌Thraustochytrium ONC-T18基因组DNA、25mM TAPS-HCl,pH9.3、50mM KCl、2mM MgCl₂、1mMβ-巯基乙醇、1.5μlDMSO、200μM每种脱氧核糖核苷酸三磷酸酯、0.5μM各种引物和1单位的Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes,Espoo,Finland)。热循环条件如下：最初在98℃将模板变性30sec，随后是[98℃持续10sec、61℃持续30sec、72℃持续30sec]的30个循环，最终在72℃延伸循环5分钟。按照制造商的说明书将如此获得的PCR产物克隆到pT7Blue-3Perfectly钝端克隆试剂盒(Novagen,San Diego,California)。将重组质粒转化到NovaBlue感受态细胞(Novagen,San Diego,California)，并对克隆测序。使用UltraClean6Minute Mini质粒制备试剂盒(MO BIO Laboratories,Inc,Solana Beach,California)纯化质粒。以BamHI/NotI消化如此获得的质粒并克隆到酵母表达载体pYES2(Invitrogen,Carlsbad,California)以产生克隆pYDes，pYDes随后用于表达研究。

Δ4-去饱和酶全长基因插入片段的长度是1757bp(SEQ ID NO:25)，从第一ATG开始，包含编码519个氨基酸的1509bp开放阅读框。全长基因的氨基酸序列(SEQ ID NO:26)包含与来自破囊壶菌Thraustochytrium sp.ATCC21685、破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10和金黄色破囊壶菌Thraustochytrium aureum的Δ4-去饱和酶同源的区域。其还包含三个见于所有已知的膜结合的去饱和酶中的保守的‘组氨酸盒’。(Okuley等人.(1994)The Plant Cell6:147-158)。这些组氨酸盒存在于氨基酸181-185、217-222和454-458。如同其它膜结合的Δ4-去饱和酶，发现破囊壶菌Thraustochytrium ONC-T18Δ4-去饱和酶中的第三个组氨酸-盒基序(HXXHH)是QXXHH。该序列还包含在5’-端的细胞色素b5结构域。认为该细胞色素充当这些酶中的电子供体。

4.实施例4

在酵母中表达破囊壶菌Thraustochytrium ONC-T18Δ4-去饱和酶和Δ5-延伸酶基因

将由克隆到pYES2(Invitrogen,Carlsbad,California)中的全长Δ4-去饱和酶组成的克隆pYDes和由pYES2中的全长Δ5-延伸酶基因组成的克隆pYElo转化到感受态酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVSc1。酵母转化使用S.c.EasyComp转化试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,California)根据制造商指明的条件进行。在缺乏尿嘧啶的培养基(SC-Ura)上筛选转化子的尿嘧啶营养缺陷型。为了检测这些克隆的特异性去饱和酶活性，使转化子在下列500μM特异性脂肪酸底物存在下生长：A)二十二碳五烯酸(22:5n-3)(转化为二十二碳六烯酸将表示Δ4-去饱和酶活性)、B)二十二碳四烯酸(22:4n-6)(转化为二十二碳五烯酸(22:5n-6)将表示Δ4-去饱和酶活性)、C)二高-γ-亚麻酸(20:3n-6)(转化为花生四烯酸(20:4n-6)将表示Δ5-去饱和酶活性)、D)二十碳五烯酸(20:5n-3)(转化为二十二碳五烯酸(22:5n-3)将表示Δ5-延伸酶活性)、E)花生四烯酸(20:4n-6)(转化为二十二碳四烯酸(22:4n-6)将表示Δ5-延伸酶活性)。

阴性对照菌株是包含未改变的pYES2载体的INVSc1，使这些菌株同时生长。剧烈搅动(150rpm)培养物并使其在20℃在500μM(终浓度)各种底物存在下生长96小时。将细胞成团并在100mM磷酸盐缓冲液,pH7.0中洗涤，冷冻干燥细胞小团。随后萃取脂质并衍生为脂肪酸甲酯(FAME)用于气相色谱分析(GC)。使用100mg冷冻干燥的细胞进行转酯和萃取，以C19：0作为内标，加入转酯反应混合物(甲醇：盐酸：氯仿，10：1：1)，混合并在90℃加热2小时，随后允许冷却到室温。通过加入1ml水和2ml己烷：氯仿(4：1)来萃取FAME，并允许有机相与水相分离。萃取有机层并用0.5g无水硫酸钠处理以除去颗粒和残余水。在氩气流下蒸发有机溶剂。将FAME重悬在异辛烷中并通过GC-FID分析。转化百分比通过将产生的产物除以(产生的产物+加入的底物)的总和随后乘以100来计算。表4表示分离的基因的酶活性，该酶活性是基于加入的底物的转化百分比。

表4-Δ4-去饱和酶的酶活性和表征。

包含来自破囊壶菌Thraustochytrium ONC-T18的Δ4-去饱和酶基因的pYDes克隆转化14%的22:5n-3底物为22:6n-3，以及转化14%的22:4n-6底物为22:5n-6。这证实该基因编码Δ4-去饱和酶。这种情况下没有背景(底物的非特异性转化)。

5.实施例5

以柠檬酸铁操纵ONC-T18Δ4-去饱和酶活性

将由克隆到pYES2(Invitrogen,Carlsbad,California)中的全长Δ4-去饱和酶组成的克隆pYDes转化到感受态酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeINVSc1。阴性对照菌株是包含未改变的pYES2载体的INVSc1，使这些菌株同时生长。剧烈搅动培养物(150RPM)并使其在20℃在500μM(终浓度)DPA和0.01%柠檬酸铁存在下生长96小时。随后如上述地处理细胞以确定DPA向DHA的转化百分比。在柠檬酸铁存在下转化百分比是38.70%，这种情况下Δ4-去饱和酶活性增加2.75倍。

Claims (13)

1.一种组合物，其包含D5延伸酶，其中所述D5延伸酶由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成。

2.一种包含核酸的组合物，其中所述核酸编码权利要求1所述的D5延伸酶。

3.根据权利要求2所述的组合物，其还包含载体。

4.一种包含细胞的组合物，其中所述细胞包含权利要求1-3任一项所述的组合物。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述细胞是真核生物或原核生物。

6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述细胞是破囊壶菌(Thraustochytrid)、酵母或大肠杆菌。

7.根据权利要求1-6任一项所述的组合物，其还包含延伸酶底物。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述底物具有至少100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM或1000μM的浓度。

9.根据权利要求7所述的组合物，其中所述底物是二十碳五烯酸或花生四烯酸。

10.根据权利要求7所述的组合物，其中所述延伸酶转化至少0.1％、0.5％、1％、5％或10％的可获得的底物。

11.一种产生多不饱和的脂肪酸的方法，包括使用权利要求1-10任一项所述的组合物中的一种或多种。

12.根据权利要求11所述的方法，其中产生的所述脂肪酸是EPA或DHA。

13.一种产生权利要求1-10任一项所述的组合物的方法，其包括分离权利要求1-10任一项所述的组合物。