CN103063778A

CN103063778A - 拉米夫定有关物质检查的分析方法

Info

Publication number: CN103063778A
Application number: CN2012105927630A
Authority: CN
Inventors: 王立强; 张晓明
Original assignee: BEIJING YUANYAN MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Beijing Yuan Yuan pharmaceutical Polytron Technologies Inc
Priority date: 2012-12-31
Filing date: 2012-12-31
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2032-12-31
Also published as: CN103063778B

Abstract

本发明涉及拉米夫定有关物质检查的分析方法。具体而言，本发明涉及一种拉米夫定质量分析的方法，该方法包括使用高效液相色谱法对拉米夫定原料药或者包含拉米夫定的药物制剂进行质量分析的步骤。本发明方法中使用的色谱柱是BDS色谱柱；柱温是30～40℃。本发明用高效液相色谱法，在一定色谱条件下有效分离拉米夫定及其各杂质，通过该方法能准确的测定拉米夫定中各个杂质的量。

Description

拉米夫定有关物质检查的分析方法

技术领域

本发明属于药物分析化学领域，涉及对抗肝炎药拉米夫定质量进行分析的方法，具体涉及用液相色谱法分离测定拉米夫定及其多种已知杂质的分析方法。

背景技术

拉米夫定(Lamivudine，LAM，CAS No:134678-17-4)，化学名为(2R-顺)-4-氨基-1-[2-(羟甲基)-1,3-氧杂硫杂环戊烷-5-基]-2(1H)-嘧啶酮，其结构式如下：

拉米夫定为先驱的核苷(酸)类似物(简称NA)，开辟了慢性乙型肝炎(CBH)治疗的新领域，是CBH治疗中的一个创新。1998年2月初美国FDA批准LAM为抗HBV药物上市，第一个口服抗HBV药就此诞生。其化学名称为：(2R-顺式)-4-氨基-1-(2-羟甲基-1,3-氧硫杂环戊-5-基)-1H-嘧啶-2-酮。其合成工艺中会引入及产生(2RS,5RS)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1-(2H)-基)-1,3-氧硫杂环戊烷-2-羧酸(本发明中简称杂质A)、(2R,5R)-4-氨基-1-(2-羟甲基-1,3-氧硫杂环戊-5-基)-1H-嘧啶-2-酮和(2S,5S)-4-氨基-1-(2-羟甲基-1,3-氧硫杂环戊-5-基)-1H-嘧啶-2-酮(本发明中简称杂质B)、水杨酸(本发明中简称杂质C)、(2S,5R)-4-氨基-1-(2-羟甲基-1,3-氧硫杂环戊-5-基)-1H-嘧啶-2-酮(本发明中简称杂质D)、胞嘧啶(本发明中简称杂质E)、尿嘧啶(本发明中简称杂质F)。拉米夫定在储存过程中会产生1-[(2R,5S)-2-羟甲基-1,3-氧硫杂环戊-5-基]-1H,3H-嘧啶-2,4-二酮(本发明中简称杂质G)。因此，实现拉米夫定及其各杂质间的有效分离对测定拉米夫定和各杂质的量具有重大的意义。

杂质D为右旋拉米夫定，其测定需用以β-环糊精柱为手性的分离柱，在欧洲药典和美国药典的拉米夫定药品标准中对异构体的测定方法已详近说明，此方法的重现性亦很好。故此发明中的拉米夫定有关物质测定的方法不包括右旋拉米夫定的测定。

对拉米夫定其他杂质的测定，欧洲药典7.0版(亦可称为EP7.0)和美国药典32版(亦可称为USP32)的拉米夫定药品标准有详细的描述。具体如下：以BDS C₁₈为色谱柱，以0.025mol/L醋酸铵溶液(取醋酸铵1.9g，加水900ml使溶解，用冰醋酸调节pH值至3.8±0.2，加水稀释至1000ml)-甲醇(95:5)为流动相，杂质A、B、E、F和主峰间的分离度应不低于1.5.我们以拉米夫定进行了方法学验证，结果表明：该方法在样品的降解试验中并不能把降解峰与已知杂质很好的分离，且未能检出所有的降解峰。

因此本领域仍然期待有用于控制拉米夫定质量的有效方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于控制拉米夫定质量的有效方法。本发明人令人意外地发现，用特定的色谱分析条件例如使用BDSHYPERSIL C18色谱柱分离测定拉米夫定及其制剂有关物质的高效液相色谱方法，可以有效地实现拉米夫定及其杂质的分离及测定。

为此，本发明第一方面提供了一种拉米夫定质量分析的方法，该方法包括使用高效液相色谱法对拉米夫定原料药或者包含拉米夫定的药物制剂进行质量分析的步骤。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱是BDS色谱柱。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱是BDS HYPERSIL C18色谱柱。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱是品牌为THERMO BDS HYPERSIL C18的色谱柱。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法分离分析时色谱柱的柱温是30~40℃，例如33~37℃，例如约35℃。本发明已经发现，在柱温为33~37℃的范围内具有相当好的分离效果。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法是使用梯度洗脱进行分离分析的。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法是使用梯度洗脱进行分离分析的，所述梯度洗脱使用A、B两种流动相。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法是使用梯度洗脱进行分离分析的，所述梯度洗脱使用A、B两种流动相，流动相A为醋酸铵溶液，流动相B为甲醇。在一个实施方案中，所述醋酸铵溶液是浓度为1.9g/L的醋酸铵溶液。在一个实施方案中，所述醋酸铵溶液是浓度为1.9g/L的醋酸铵溶液，并且其pH值为3.0~5.0，例如pH值为3.5~4.5，例如pH值为3.5~4.5，例如pH值为3.6~4.0，例如pH值为3.8±0.05。本发明已经发现，在pH值为3.6~4.0的范围内具有相当好的分离效果。

根据本发明第一方面的方法，其中所述流动相A是照如下方法配制的：取醋酸铵1.9g，加水约900ml溶解，摇匀，用冰醋酸调节pH值至规定pH值范围(例如pH值为3.6~4.0，例如pH值为3.8±0.05)，加水稀释至1000ml，即得。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法是使用梯度洗脱进行分离分析的，所述梯度洗脱使用A、B两种流动相，流动相A为醋酸铵溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序中在0~45分钟内(例如在0~30分钟内)的比例为A:B=98：2～A:B=96：4；优选地，梯度洗脱程序中在0~30分钟内的比例为A:B=97：3。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法是使用梯度洗脱进行分离分析的，所述梯度洗脱使用A、B两种流动相，流动相A为醋酸铵溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序是：

时间(min)	流动相A(%)	流动相B(%)
			0	97	3
30	97	3
			45	70	30
60	70	30

63	97	3
			73	97	3

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法中流动相的流速为0.5～1.5ml/min，流动相的流速优选为1ml/min。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法中检测器为紫外检测器。在一个实施方案中，所述紫外检测器所用的检测波长是260nm～290nm，优选的检测波长为277nm。

根据本发明第一方面的方法，其中用于进行高效液相色谱法测试的样品供试溶液是如下方式配制的：将拉米夫定原料药或者包含拉米夫定的药物制剂用流动相溶解样品，并稀释成每1ml含拉米夫定0.1～2.5mg/ml的样品溶液，特别是配制成0.5～2.5mg/ml的溶液。在一个实施方案中，用于配制样品供试溶液的溶剂是流动相A：流动相B=97：3的混合液。

根据本发明第一方面的方法，其中进行高效液相色谱法测试时，测试溶液注入液相色谱仪的量为10～100μl，例如10～50μl，例如10～20μl。

根据本发明第一方面的方法，该方法包括以下步骤：

(1)、取拉米夫定或含拉米夫定的药物制剂样品适量，用流动相溶解样品，并配制成每1ml含拉米夫定0.1～2.5mg/ml的样品溶液：

(2)、设置流动相的流速为0.5～1.5ml/min；使用紫外检测器，检测波长为：260nm～290nm；使用BDS色谱柱；色谱柱的柱箱温度测定为：30℃～40℃；流动相的初始比例为：A:B=98：2～A:B=96：4；流动相A：1.9g/L醋酸铵溶液的pH值3.5～4.5。

(3)取步骤(1)的溶液10～100μl，注入液相色谱仪，进行梯度洗脱，记录色谱图至主成分保留时间的至少3倍，获得高效液相色谱分析图，从中读取和/或计算杂质的以下至少一个信息：杂质数量、杂质种类、杂质相对量、各色谱峰之间的分离度。

根据本发明的方法，其任一实施方案可以与其它方案任意进行组合，只要这种组合不会出现矛盾。

下面对本发明作进一步详细描述。

在本发明中，提及BDS，是指一类液相色谱柱，其填料使用碱基去活的十八烷基硅烷(ODS)键合硅胶填料(英文名Base Deactived Silica，简称为BDS)，这类色谱柱可以用于分析含有碱性基团的样品。

有文献报道在对拉米夫定进行分析时使用色谱柱为ODS-2，此款色谱柱的选择性较强，分离效果优于普通的ODS柱，但对弱碱性物质的分离效果不如BDS柱(为碱基去活ODS柱)。本发明人经大量反复试验，使用BDS柱，将分析方法调整为梯度洗脱的方法，此方法不仅可以很好的分离各杂质与降解峰，还可以比之前的方法检出更多的降解杂质。从而更准确的控制了拉米夫定的质量。本发明可以简单、准确的测定拉米夫定的有关物质。

在一个实施方案中，本发明所说的用液相色谱法分离测定拉米夫定及其制剂的有关物质的方法，是以碱性去活的十八烷基硅烷键和硅胶为填料的色谱柱。以1.9g/L醋酸铵溶液(取醋酸铵1.9g，加水约900ml溶解，摇匀，用冰醋酸调节pH值至3.8±0.2后，加水稀释至1000ml)为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱。

在一个实施方案中，上述所用色谱柱选自品牌为THERMO BDSHYPERSIL C₁₈的色谱柱。

在一个实施方案中，本发明所述的分离测定方法，可按以下方法实现：

1)取拉米夫定或含拉米夫定的制剂样品适量，用流动相溶解样品，并配制成每1ml含拉米夫定0.1～2.5mg/ml的样品溶液：

2)设置流动相的流速为0.5～1.5ml/min,流动相的流速优选为1ml/min；检测波长为：260nm～290nm，最佳波长为277nm；色谱柱的柱箱温度为：20℃～40℃，柱箱最佳温度为35℃；流动相的初始比例为：A:B=98：2～A:B=96：4，流动相的初始比例最佳为：A:B=97：3；流动相A：1.9g/L醋酸铵溶液的pH值3.5～4.5,其优选为3.8。

3)取步骤1)的溶液10～100μl，注入液相色谱仪，完成拉米夫定有关物质的测定。

在一个实施方案中，高效液相色谱仪可以是使用岛津LC-10AD/SIL-10AD/SPD-M10A/SCL-10A/DGU-14A高效液相色谱仪，或者也可以采用其它色谱系统。

在一个实施方案中，使用的色谱柱为：BDS HYPERSIL C₁₈，填料粒度可以是5μm，柱内径可以是4.6mm，柱长可以是10~40cm，例如柱长可以是15~30cm，例如25cm。

在一个实施方案中，使用的色谱柱柱温：35℃。

在一个实施方案中，使用的流动相和洗脱模式是：以1.9g/L醋酸铵溶液(取醋酸铵1.9g，加水约900ml溶解，摇匀，用冰醋酸调节pH值至3.8±0.2后，加水稀释至1000ml)为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

时间(min)	流动相A(%)	流动相B(%)
			0	97	3
30	97	3
			45	70	30
60	70	30
			63	97	3
73	97	3

流速：1.0ml/min。

在一个实施方案中，使用的检测器的检测波长：277nm。

在一个实施方案中，液相分析进样体积为：10μl。

本发明采用BDS HYPERSIL C₁₈色谱柱，采用梯度洗脱的程序，能够有效的分离拉米夫定及其杂质；选用流动性相溶解样品，确保了溶液的稳定性；本发明解决了分离测定拉米夫定已知杂质和未知杂质测定的问题，从而保证了拉米夫定及其制剂的质量可控。

附图说明

图1、空白溶剂的高效液相色谱图(图的横坐标单位为分钟，下同)。

图2、系统适用性溶液的高效液相色谱图。

图3、拉米夫定高温降解溶液的高效液相色谱图。

图4、EP7.0版拉米夫定药品标准下高温降解溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式：

通过以下实例对本发明做进一步具体说明，但应该理解，以下实例不限于本发明的范围。

以下各实施例和对照例使用的试剂可从市场上容易地购得。

实施例1

仪器及条件：

岛津LC-10AD/SIL-10AD/SPD-M10A/SCL-10A/DGU-14A高效液相色谱仪及岛津的工作站；用碱性去活十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(BDS HYPERSIL C₁₈，4.6mm×25cm×5μm，THERMO)；以1.9g/L醋酸铵溶液(取醋酸铵1.9g，加水约900ml溶解，摇匀，用冰醋酸调节pH值至3.8后，加水稀释至1000ml)为流动相A，以甲醇为流动相B；检测波长为277nm；柱温为35℃。流动相流速：1.0ml/min，液相分析进样体积为：10μl；按下表进行梯度洗脱：

试验步骤：

取胞嘧啶对照品10.12mg，尿嘧啶对照品10.23mg，水杨酸5.75mg各置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取上述溶液各1ml，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀为溶液A；另取含拉米夫定、拉米夫定羧酸和拉米夫定非对映异构体的系统适用性对照品(见自SIGMA公司)5.04mg，加2ml流动相溶解后，再加入2ml溶液A，用流动相稀释至10ml，作为系统适用性溶液。

取拉米夫定原料约100mg，置20ml量瓶中，加流动相5ml，摇匀，80°C水浴5h，冷至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液4ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为高温降解溶液。

分别取空白溶剂、系统适用性溶液和高温降解溶液各10μl，按上述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图(记录时间为主峰保留时间的3倍以上)，结果分别见图1、图2、图3。

图1为空白溶剂的高效液相色谱图，空白梯度与空白溶剂无吸收峰，均不干扰样品测定。

图2中保留时间11.963分钟的色谱峰为拉米夫定的色谱峰，10.980分钟的色谱峰为拉米夫定非对映异构体，3.090分钟、3.592分钟、4.128分钟和27.201分钟的峰分别为胞嘧啶、尿嘧啶、拉米夫定羧酸和水杨酸的色谱峰。各峰间的分离度良好(相邻两色谱峰之间的分离度均在2.0以上)。

图3表明在降解试验样品中，可以读取到主峰以及10个杂质峰，各峰间的分离良好(相邻两色谱峰之间的分离度均在2.0以上，任意相邻两峰之间的分离度，最小值为2.36)。以上结果表明此条件可以较准确的测定各杂质的含量。

比较例1

仪器及条件

参考EP7.0版拉米夫定药品标准下高温降解溶液的高效液相色谱方法进行。岛津LC-10AD/SIL-10AD/SPD-M10A/SCL-10A/DGU-14A高效液相色谱仪及岛津的工作站；用碱性去活十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(同实施例1)；以1.9g/L醋酸铵溶液(取醋酸铵1.9g，加水约900ml溶解，摇匀，用冰醋酸调节pH值至3.8后，加水稀释至1000ml)-甲醇=(95：5)作为固定比率的流动相；检测波长为277nm；柱温为35℃。

试验步骤

取高温降解溶液10μl，按上述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图(记录时间为主峰保留时间的3倍以上)。结果见图4(30min以后未检出杂质峰)。

图4的各峰间的分离度亦能达到基线分离(相邻两色谱峰之间的分离度均在2.0以上)，但检出的杂质个数少于图3，仅检测到5个杂质峰，表明在此条件下降解杂质不能完全检出。

实施例2

基本上与实施例1相同的方法，不同的是在配制流动相A时，配制成不同的pH值，然后照实施例1的方法对高温降解溶液进行检测，以检出的杂质个数以及全部色谱峰中任意相邻两色谱峰之间的分离度的最小值为指标，考察不同pH值的流动相A在梯度洗脱中的分离效果，进样体积为20ul。结果如下：

流动相A的pH值	杂质个数	最小分离度
			3.0	10	0.75
3.2	10	0.80
			3.4	10	0.91
3.6	10	2.03
			3.8	10	2.35
4.0	10	2.13
			4.2	8	1.85
4.4	6	2.23
			4.6	5	2.18
4.8	5	2.42
			5.0	4	2.64

对于药物的高效液相色谱分析方法而言，本领域技术人员清楚，通常而言可接受的分离离一般需要在1.0以上，通常分离度大于1.5时认为可以满足质量控制方法要求的标准。本发明人出人意料地发现，在使用梯度洗脱过程中，当流动相A的pH值在3.6~4.0的范围内时，不但分离度良好，而且可以检测到最多的杂质；而低于此pH值范围时，虽然可以检测到较多的杂质，但它们之间的分离度不能满足一般的分析要求；而当高于此pH值范围时，虽然各杂质峰之间的分离度可以满足一般的分析要求，但是最多仅能检测到8个杂质，这对于化学药品严格的质量分析方法是不可取的。

实施例3

基本上与实施例1相同的方法，不同的是在进行分离时测定不同的色谱柱温度，照实施例1的方法对高温降解溶液进行检测，以检出的杂质个数以及全部色谱峰中任意相邻两色谱峰之间的分离度的最小值为指标，考察不同pH值的流动相A在梯度洗脱中的分离效果，结果如下：

柱温(℃)	杂质个数	最小分离度
			25	7	0.55
27	8	0.73
			29	8	0.88
31	10	1.13
			33	10	2.15
35	10	2.36
			37	10	2.02
39	10	1.22
			41	10	0.98
43	9	0.86
			45	9	0.67

本发明人出人意料地发现，在使用梯度洗脱过程中，当色谱柱的柱温在33~37的范围内时，不但分离度良好，而且可以检测到最多的杂质；而低于此温度范围时，可以检测到的杂质减少，并且它们之间的分离度不能满足一般的分析要求；而当高于此柱温范围时，不但各杂质峰之间的分离度会降低，而且能够检测到的杂质数亦呈减少的趋势，这对于化学药品严格的质量分析方法是不可取的。

实施例4

基本上与实施例1相同的方法，不同的是使用260nm、270nm、290nm三种波长进行检测，对降解试验样品进行测定。结果与实施例1的结果基本相同，色谱图中可以读取到主峰以及10个杂质峰，各峰间的分离良好(相邻两色谱峰之间的分离度均在2.0以上，任意相邻两峰之间的分离度，最小值为2.31)。表明检测波长在260nm~290nm范围内均可满足测定要求。

实施例5

基本上与实施例1相同的方法，不同的是配制降解试验样品样品时，浓度分别为0.5、1.0、或2.5mg/ml的溶液，对这些降解试验样品进行测定。结果与实施例1的结果基本相同，色谱图中可以读取到主峰以及10个杂质峰，各峰间的分离良好(相邻两色谱峰之间的分离度均在2.0以上，任意相邻两峰之间的分离度，最小值为2.33)。表明样品浓度在0.5~2.5mg/ml范围内均可满足测定要求。

实施例6

基本上与实施例1相同的方法，不同的是在梯度洗脱程序中，0~30分钟内，流动相A的比例为96%或98%，对降解试验样品进行测定。结果与实施例1的结果基本相同，色谱图中可以读取到主峰以及10个杂质峰，各峰间的分离良好(相邻两色谱峰之间的分离度均在2.0以上，任意相邻两峰之间的分离度，最小值为2.28)。表明梯度洗脱时流动相A和B的比例适当调整仍然可以满足测定要求。

本发明人在另外的试验中，照实施例1的方法，使用ODS柱(4.6mm×25cm×5μm，THERMO)，结果在对降解试验样品进行测定时，仅能检测到4个杂质，并且最小分离度为0.62。

实施例7

使用实施例1的方法，测定3批拉米夫定原料药，以及三批分别此3批原料药制备成的片剂(加入有乳糖、微晶纤维素、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮以便压制成片)。按照药物分析领域对药品进行有关物质检查的一般要求进行测定，结果表明，三批原料药的有关物质总量分别为0.33%、0.46%、0.41%；分别由此3批原料药制备成的片剂的有关物质总量(扣除辅料影响)分别为0.35%、0.45%、0.44%，显示原料与制剂有良好的一致性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种拉米夫定质量分析的方法，该方法包括使用高效液相色谱法对拉米夫定原料药或者包含拉米夫定的药物制剂进行质量分析的步骤。

2.根据权利要求1的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱是BDS色谱柱；例如所述高效液相色谱法使用的色谱柱是BDS HYPERSIL C18色谱柱。

3.根据权利要求1的方法，其中所述高效液相色谱法分离分析时色谱柱的柱温是30~40℃，例如33~37℃，例如约35℃。

4.根据权利要求1的方法，其中所述高效液相色谱法是使用梯度洗脱进行分离分析的，所述梯度洗脱使用A、B两种流动相；进一步地，流动相A为醋酸铵溶液，流动相B为甲醇。

5.根据权利要求4的方法，所述醋酸铵溶液是浓度为1.9g/L的醋酸铵溶液，并且其pH值为3.0~5.0，例如pH值为3.5~4.5，例如pH值为3.5~4.5，例如pH值为3.6~4.0，例如pH值为3.8±0.05。

6.根据权利要求1的方法，其中所述高效液相色谱法是使用梯度洗脱进行分离分析的，所述梯度洗脱使用A、B两种流动相，流动相A为醋酸铵溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序中在0~45分钟内(例如在0~30分钟内)的比例为A:B=98：2～A:B=96：4；优选地，梯度洗脱程序中在0~30分钟内的比例为A:B=97：3。

7.根据权利要求4的方法，其中所述高效液相色谱法是使用梯度洗脱进行分离分析的，所述梯度洗脱使用A、B两种流动相，流动相A为醋酸铵溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序是：

时间(min) 流动相A(%) 流动相B(%)

0 97 3 30 97 3 45 70 30 60 70 30 63 97 3 73 97 3

8.根据权利要求1-7的方法，其中所述高效液相色谱法中流动相的流速为0.5～1.5ml/min，流动相的流速优选为1ml/min；所述紫外检测器所用的检测波长是260nm～290nm，优选的检测波长为277nm。

9.根据权利要求1-8的方法，其中用于进行高效液相色谱法测试的样品供试溶液是如下方式配制的：将拉米夫定原料药或者包含拉米夫定的药物制剂用流动相溶解样品，并稀释成每1ml含拉米夫定0.1～2.5mg/ml的样品溶液，特别是配制成0.5～2.5mg/ml的溶液。

10.根据权利要求1-9的方法，其中进行高效液相色谱法测试时，测试溶液注入液相色谱仪的量为10～100μl,例如10～50μl,例如10～20μl。

11.根据权利要求1-10的方法，该方法包括以下步骤：