CN103044254A - 2, 4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物及其应用 - Google Patents

2, 4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物及其应用 Download PDF

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CN103044254A CN201310028582XA CN201310028582A CN103044254A CN 103044254 A CN103044254 A CN 103044254A CN 201310028582X A CN201310028582X A CN 201310028582XA CN 201310028582 A CN201310028582 A CN 201310028582A CN 103044254 A CN103044254 A CN 103044254A
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Abstract

本发明公开了一类2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物及其在制备抗革兰氏阴性致病菌抑制剂中的应用。试验证实本发明所述2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物具有显著地抑制革兰氏阴性菌三型分泌系统的作用；该类抑制剂不抑制鼠伤寒沙门氏菌的生长，但能抑制鼠伤寒沙门氏菌对宿主细胞的侵袭，可作为革兰氏阴性致病菌的三型分泌系统抑制剂应用，进一步的可作为抗细菌毒力因子制剂用于制备抗革兰氏阴性致病菌的药物。

Description

2, 4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物及其应用
技术领域
本发明涉及一类取代-苯基脂肪酮衍生物及其应用，尤其涉及一类2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮衍生物及其作为细菌毒力因子抑制剂的应用，属于有机化合物医药应用技术领域。
背景技术
目前，随着抗生素的滥用，致病菌的耐药性逐渐成为人类面临的重大课题，多重耐药菌的不断出现也使人们面临着类似抗生素缺乏年代的困扰。因此，寻找新型抗生素已成为迫在眉睫需要解决的问题。多重耐药菌中，大多数为条件致病菌，其中革兰氏阴性杆菌占较大比例，如大肠杆菌、志贺菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌等。同时由于革兰氏阴性致病菌存在广泛的宿主范围，目前已对人类、食源性动物和农作物等造成了很大的健康和生存威胁，带来巨大的经济损失。
革兰氏阴性致病菌在致病过程中，存在多种致病因子，促进其对宿主细胞的粘附或侵袭，从而引起进一步的感染。其中，三型分泌系统是许多革兰氏阴性致病菌分泌毒性蛋白进入宿主细胞的蛋白复合体，在致病菌的致病性方面起到非常重要的作用。三型分泌系统在革兰氏阴性致病菌中存在广泛性和结构的保守型，同时在宿主正常菌群中不存在，因此成为一个新颖的抗菌靶点。然而，经检索2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮衍生物作为革兰氏阴性致病菌三型分泌系统抑制剂的应用还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一类2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮衍生物及其作为革兰氏阴性致病菌三型分泌系统抑制剂的应用。
本发明所述的2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物，其化学结构通式为：
Figure BDA00002775072300011
其中：n=0～8；R=乙基、甲氧乙基或氢。
上述化学结构通式中优选的实施方式是：n=4～6，R=乙基或甲氧乙基。
上述2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物最优选是当n=5时，R=乙基；当n=6时，R=甲氧乙基。
上述2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物的制备
以3,5-二甲氧基苯乙酸1为起始原料，乙醇中加入浓硫酸回流得到3,5-二甲氧基苯乙酸乙酯2，再加入三溴化硼和二氯甲烷-20°C反应得到3,5-二羟基苯乙酸乙酯3，然后加入溴苄和碳酸钾，丙酮中回流得到苄基保护产物4，产物4在脂肪酸和三氟乙酸酐的作用下酰化得到中间体2-酰基-3,5-二苄氧基苯乙酸乙酯衍生物5，中间体5在钯碳催化下脱掉苄基得到2-酰基-3,5-二羟基苯乙酸乙酯类衍生物C series。
上述C系列化合物在2-甲氧基乙醇和硫酸作用下回流得到E series衍生物。
上述C系列化合物脱羧得到羧基化衍生物A series。
上述制备反应路线参见实施例1。
本发明所述2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物在制备抗革兰氏阴性致病菌抑制剂中的应用。
上述2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物优选化学结构通式中当R=乙基时，n=4,5,6或8；当R=甲氧乙基时，n=6所表述的化合物。
本发明的2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物可作为革兰氏阴性致病菌毒力因子三型分泌系统的抑制剂应用。具体地说，作为抗细菌毒力因子制剂用于制备抗革兰氏阴性致病菌的药物。
本发明所述治疗革兰氏阴性致病菌感染的药物，其中：所述药物含有上述的2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物和药学上可接受的辅料。
本发明所述治疗革兰氏阴性致病菌感染的食品或饲料添加剂，其中：所述添加剂含有上述的2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物添加剂制备中可接受的辅料。
上述药学上可接受的辅料或生物添加剂制备中可接受的辅料通常选用本领域常规的辅料，如乳糖、微晶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素（羟丙基甲基纤维素）、醋酸纤维素酞酸酯、羟丙甲纤维素酞酸酯、醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯、邻苯二甲酸聚乙烯醇酯（PVAP）、苯乙烯马来酸共聚物（StyMA）、丙烯酸树脂（肠溶型I、II、III号）、Eudragit L100、Eudragit S 100、醋酸纤维素或氯化钠及硬脂酸镁等。
本发明通过对沙门氏菌三型分泌系统分泌毒性蛋白的抑制作用筛选及多项试验证明，发现：本发明的2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物能显著降低沙门氏菌对宿主细胞的侵袭，可作为革兰氏阴性致病菌的三型分泌系统抑制剂应用，进一步的可作为抗细菌毒力因子制剂用于制备抗革兰氏阴性致病菌的药物。
本发明的2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物的抗三型分泌系统活性及其抗革兰氏阴性菌的作用是本领域中首次应用，故对于开发广谱高效且具有自主知识产权的新型抗生素具有重要意义。
附图说明
图1：2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮衍生物secocurvulin、C5、Csn-B与阳性药物INP0403对鼠伤寒沙门氏菌侵袭能力的活性测试图。
图2：2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮衍生物secocurvulin、C5和Csn-B对鼠伤寒沙门氏菌生长曲线测试图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，其中所述化合物的编号以发明内容中涉及表述为准，所述百分比数没有特别说明的均为质量百分比，所使用原料没有特别说明的均为市售。
实施例1：2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮衍生物制备的反应路线
Figure BDA00002775072300031
上述合成路线中所用试剂和反应条件是：(i)乙醇，硫酸，回流;(ii)三溴化硼，二氯甲烷，-20°C，5h;(iii)溴苄，碳酸钾，丙酮，回流;(iv)脂肪酸，三氟乙酸酐;(v)钯碳,氢气；(vi)2-甲氧基乙醇，硫酸；(vii)氢氧化钠，乙醇；盐酸。
实施例2：C系列2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮衍生物的制备
制备反应路线参见实施例1。
1g3,5-二甲氧基苯乙酸(1)加入到30mL无水乙醇中，然后加入1mL浓硫酸，加热回流，TLC监测反应进程。6h后反应混合物中加入30mL饱和的碳酸氢钠水溶液以中和硫酸，然后用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯萃取液用无水硫酸钠脱水后，减压蒸干。反应物用乙酸乙酯/环己烷梯度洗脱硅胶柱进行纯化，得无色油状物(2)，收率95%。MS(ESI):m/z225(M+1)。
0.9g3,5-二甲氧基苯乙酸乙酯(2)溶解于20mL无水二氯甲烷中，-20°C搅拌，然后加入18mL BBr3，搅拌，TLC监测反应进程，5小时后，反应混合物在-20°C下加入50mL饱和碳酸氢钠溶液，用乙酸乙酯萃取3次，然后用无水硫酸钠脱水，减压蒸干。反应物用乙酸乙酯/环己烷梯度洗脱硅胶柱进行分离纯化，得白色固体(3)，收率60%。MS(ESI):m/z197(M+1)。
1.4mL溴苄加入至含1g3,5-二羟基苯乙酸乙酯(3)的50mL丙酮溶液中，加热回流，TLC监测反应进程，3小时后，反应混合物冷却至室温，然后减压蒸去溶剂。反应物加入水混悬，然后用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠脱水后，减压蒸干。反应粗产物用乙酸乙酯/环己烷梯度洗脱硅胶柱层析进行分离、纯化，得无色油状物3,5-二苄氧基苯乙酸乙酯(4)，收率92%。3,5-二苄氧基苯乙酸乙酯(4)光谱分析数据:
1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ7.43-7.37(m,8H),7.33(t,J=7.2Hz,2H),6.55(d,J=9.0Hz,2H),5.02(s,4H),4.15(q,J=7.2Hz,2H),3.55(s,2H),1.25(t,J=7.2Hz,3H);13C-NMR(150MHz,CDCl3):δ171.4,160.0,136.8,136.1,128.6,127.9,127.5,108.5,100.8,70.1,61.0,41.7,14.41MS(ESI):m/z377[M+H]+.
1mmol3,5-二苄氧基苯乙酸乙酯(4)与1.2mmol不同的脂肪酸在6mL三氟乙酸酐的作用下40°C搅拌，TLC检测反应进程，12小时后，在0°C下用20mL饱和碳酸氢钠水溶液中和，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液用无水硫酸钠干燥后，减压蒸干溶剂。反应粗产物用乙酸乙酯/环己烷梯度洗脱硅胶柱层析进行分离纯化，得无色油状物2-羰基-3,5-二苄氧基苯乙酸乙酯衍生物(5)，收率60～70%。
0.5g不同的2-羰基-3,5-二苄氧基苯乙酸乙酯衍生物（5）用30mL乙醇溶解后，加入0.5g钯碳，在氢气作用下室温搅拌，TLC监测反应进程。反应12小时后，反应混合物过滤，减压蒸干，然后用乙酸乙酯/环己烷梯度洗脱硅胶柱层析分离得到白色固体C系列2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮衍生物，收率89～92%。
制备化合物Curvulin：所用脂肪酸为乙酸，中间体（5）为2-乙酰基-3,5-二苄氧基苯乙酸乙酯。
Curvulin
1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ12.14(s,1H),9.57(s,1H),6.35(s,1H),6.26(s,1H),4.16(q,J=7.2Hz2H),3.81(s,2H),2.58(s,3H),1.25(t,J=7.2Hz,3H);13C-NMR(150MHz,CDCl3):δ203.2,171.0,164.4,162.2,137.0,116.0,112.7,102.8,61.0,41.5,30.9,14.1;MS(ESI):m/z239[M+H]+.
制备化合物C1：所用脂肪酸为正丙酸，中间体（5）为2-正丙酰基-3,5-二苄氧基苯乙酸乙酯。
Figure BDA00002775072300042
C1
1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ10.99(s,1H),9.23(s,1H),6.27(dt,J=1.9Hz,1H),6.17(s,1H),4.05(q,J=7.2Hz2H),3.65(s,2H),2.82(q,J=7.2Hz,2H),1.17(t,J=7.2Hz,3H),1.06(t,J=7.2Hz,3H);13C-NMR(150MHz,CDCl3):δ206.9,171.2,160.9,136.0,111.8,102.6,60.8,36.7,14.2,14.1,8.7;MS(ESI):m/z253[M+H]+.
制备化合物C2：所用脂肪酸为正丁酸，中间体（5）为2-正丁酰基-3,5-二苄氧基苯乙酸乙酯。
Figure BDA00002775072300051
C2
1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ10.99(s,1H),9.23(s,1H),6.27(d,t,J=1.9Hz,1H),6.17(s,1H),4.05(q,J=7.2Hz,2H),3.65(s,2H),2.82(q,J=7.2Hz,2H),1.17(t,J=7.2Hz,3H),1.06(t,J=7.2Hz,3H);13C-NMR(150MHz,CDCl3):δ206.93,171.2,160.9,136.0,111.8,102.6,60.8,36.66,14.2,14.2,8.7;MS(ESI):m/z267[M+H]+.
制备化合物C3：所用脂肪酸为正戊酸，中间体（5）为2-正戊酰基-3,5-二苄氧基苯乙酸乙酯。
Figure BDA00002775072300052
C3
1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ10.99(s,1H),9.23(s,1H),6.27(d,J=1.9Hz,1H),6.17(s,1H),4.05(q,J=7.2Hz,2H),3.65(s,2H),2.82(q,J=7.2Hz,2H),1.17(t,J=7.2Hz,3H),1.06(t,J=7.2Hz,3H);13C-NMR(150MHz,CDCl3):δ206.9,171.23，160.9,136.0,111.8,102.6,60.8,36.7,14.2,14.13,8.7;MS(ESI):m/z253[M+H]+.
制备化合物Secocurvularin：所用脂肪酸为正己酸，中间体（5）为2-正己酰基-3,5-二苄氧基苯乙酸乙酯。
Figure BDA00002775072300053
Secocurvularin
1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ11.97(s,1H),6.32(s,1H),6.26(d,J=2.5Hz,1H),6.24(d,J=2.5Hz,1H),4.21(q,J=7.1Hz，2H),3.82(s,2H),2.82(t,J=7.4Hz,2H),1.71-1.67(m,2H),1.31-1.27(m,7H),0.89(t,J=6.9Hz,2H);13C-NMR(150MHz,CDCl3):δ206.7,171.7,164.2,160.3,136.5,116.6,112.7,103.3,61.7,43.4,41.8,31.4,24.6,22.5,14.1,14.0;MS(ESI):m/z295[M+H]+.
制备化合物C5：所用脂肪酸为正庚酸，中间体（5）为2-正庚酰基-3,5-二苄氧基苯乙酸乙酯。
Figure BDA00002775072300061
C5
1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ11.97(s,1H),6.40(s,1H),6.28(s,1H),6.27(s,1H),4.23(q,J=7.0Hz,2H),3.84(s,2H),2.84(t,J=7.0Hz,2H),1.72-1.68(m,2H),1.31-1.29(m,9H),0.89(t,J=6.1Hz,3H);13C-NMR(150MHz,CDCl3):δ206.76,171.76,164.15,160.29,136.52,116.63,112.72,103.28,61.73,43.44,41.77,31.59,28.93,24.92,22.52,14.16,14.13,14.05;MS(ESI):m/z309[M+H]+.
制备化合物Csn-B：所用脂肪酸为正辛酸，中间体（5）为2-正辛酰基-3,5-二苄氧基苯乙酸乙酯,
Figure BDA00002775072300062
Csn-B
1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ12.13(s,1H),6.30(d,J=2.4Hz,1H),6.28(d,J=2.4Hz,1H),5.85(s,1H),4.21(q,J=7.1Hz,2H),3.86(s,2H),2.84(t,J=7.4Hz,2H),1.74-1.69(m,2H),1.32-1.6(m,11H),0.90(t,J=6.9Hz,3H);13C-NMR(150MHz,CDCl3):δ206.7,171.3,164.5,160.1,136.7,116.6,112.5,103.3,61.6,43.4,41.8,31.7,29.2,29.1,25.0,22.6,14.1,14.1;MS(ESI):m/z323[M+H]+.
制备化合物C8：所用脂肪酸为正癸酸，中间体（5）为2-正癸酰基-3,5-二苄氧基苯乙酸乙酯。
Figure BDA00002775072300063
C8
1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ6.27(s,2H),4.21(s,2H),3.81(s,2H),2.84(s,2H),1.69(s,2H),1.29(dd,J=15.6,8.3Hz,15H),0.89(t,J=7.0Hz,3H);13C-NMR(150MHz,CDCl3):δ206.9,171.9,160.4,136.4,116.8,112.7,103.2,61.7,43.5,41.7,31.9,29.5,29.3,25.0,22.7,14.1;MS(ESI):m/z351[M+H]+。
实施例3：E系列2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮衍生物的制备
制备反应路线参见实施例1。
50mg不同的C系列衍生物溶解于15mL2-甲氧基乙醇后，加入2滴浓硫酸，50°C下搅拌，TLC检测反应进程，12–16小时后，用乙酸乙酯萃取，然后用饱和碳酸氢钠和氯化钠溶液洗萃取液，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥后，减压蒸干得反应粗产物。
用乙酸乙酯/环己烷梯度洗脱硅胶柱层析进行分离、纯化，得无色油状物E系列衍生物，收率60-80%。
制备化合物E0：所用C系列衍生物为Curvulin。
Figure BDA00002775072300071
E0
1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ11.64(s,1H),9.51(s,1H),6.26(d,J=2.4Hz,1H),6.15(d,J=2.4Hz,1H),4.15(s,1H),4.21(q,J=7.1Hz,2H),3.73(d,J=12.2Hz,2H),3.48(t,J=4.4Hz,2H),3.26(d,J=12.7Hz,2H),2.46(d,J=12.5Hz,3H);13C-NMR(150MHz,CDCl3):δ203.1,171.1,163.5,161.8,136.6,116.7,112.5,102.7,70.2,63.8,43.5,41.0,40.4,40.3,40.1,40.0,39.8,39.7,32.0;MS(ESI):m/z269[M+H]+.
制备化合物E1：所用C系列衍生物为C1。
E1
1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ11.68(s,1H),6.33(d,J=6.5Hz,1H),6.24(d,J=6.5Hz,1H),4.23-4.21(m,2H),3.81(d,J=8.6Hz,2H),3.55(m,3H),3.34(d,J=8.8Hz,2H),2.87(m,2H),1.13(m,3H);13C-NMR(150MHz,CDCl3):206.7,171.1,163.3,161.5,136.1,112.5,102.9,70.3,63.9,58.9,41.2,40.3,40.2,40.1,,36.5,8.9;MS(ESI):m/z282[M+H]+.
制备化合物E2：所用C系列衍生物为C2。
Figure BDA00002775072300081
E2
1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ11.67(s,1H),7.28(s,1H),7.12(s,1H),6.26(d,J=6.8Hz,1H),6.22(s,1H),4.39-4.28(m,2H),3.85(s,2H),3.66(d,J=3.4Hz,2H),3.42(s,3H),2.83(t,J=7.2Hz,2H),1.78-1.67(m,2H),0.94(dd,J=18.2,10.8Hz,3H);13C-NMR(150MHz,CDCl3):δ206.7,171.8,163.7,160.5,136.3,116.8,112.6,103.1,70.3,64.2,58.9,45.4,41.4,18.4,13.9;MS(ESI):m/z297[M+H]+.
制备化合物E3：所用C系列衍生物为C3。
Figure BDA00002775072300082
E3
1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ12.21(s,1H),6.32(d,J=2.4Hz,1H),6.28(d,J=2.3Hz,1H),6.02(s,1H),4.32-4.27(m,2H),3.91(s,2H),3.40(s,2H),2.86(t,J=7.4Hz,2H),1.74–1.67(m,2H),1.37(dd,J=15.0,7.5Hz,2H),0.94(t,J=7.4Hz,3H);13C-NMR(150MHz,CDCl3):δ112.4,103.21,43.1,41.6,27.1,22.3,13.9;MS(ESI):m/z311[M+H]+.
制备化合物E4：所用C系列衍生物为secocurvulin。
Figure BDA00002775072300083
E4
1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ11.83(s,1H),6.93(s,1H),6.27(s,1H),6.22(s,1H),4.32(s,2H),3.86(s,2H),3.66(d,J=3.9Hz,2H),3.42(s,3H),2.84(t,J=7.4Hz,2H),1.70(dd,J=14.1,7.0Hz,2H),1.32(t,J=13.4Hz,4H),0.90(t,J=6.7Hz,3H);13C-NMR(150MHz,CDCl3):δ206.8,171.7,163.9,160.5,136.3,116.7,112.6,103.2,70.3,64.3,58.9,43.4,41.5,31.4,24.6,22.5,14.0;MS(ESI):m/z325[M+H]+.
制备化合物E5：所用C系列衍生物为C5。
Figure BDA00002775072300091
E5
1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ11.68(s,1H),7.15(s,1H),6.26(s,1H),6.21(s,1H),4.32(s,2H),3.84(s,2H),3.66(d,J=4.2Hz,2H),3.42(s,3H),2.84(t,J=7.4Hz,2H),1.68(dd,J=14.1,7.0Hz,2H),1.30(d,J=9.6Hz,7H),0.89(t,J=6.6Hz,3H);13C-NMR(150MHz,CDCl3):δ206.8,171.8,163.7,160.5,136.3,116.8,112.6,103.1,70.3,64.2,58.9,43.5,41.4,31.6,28.9,24.9,22.5,14.1;MS(ESI):m/z339[M+H]+.
制备化合物E6：所用C系列衍生物为Csn-B。
Figure BDA00002775072300092
E6
1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ12.10(s,1H),6.29(d,J=2.4Hz,1H),6.24(d,J=2.4Hz,1H),4.34–4.31(m,2H),3.89(s,2H),3.67-3.63(m,2H),3.42(s,2H),2.84(t,J=7.4Hz,2H),1.70(dd,J=14.2,7.2Hz,2H),1.34-1.26(m,7H),0.89(t,J=6.9Hz,3H);13C-NMR(150MHz,CDCl3):δ206.8,171.7,171.6,163.8,160.5,136.3,116.7,112.6,103.2,70.3,64.2,58.9,43.5,41.5,31.70,29.2,29.2,25.0,22.6,14.1.MS(ESI):m/z353[M+H]+。
实施例4：A系列2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮衍生物的制备
制备反应路线参见实施例1。
50mg C系列衍生物用10mL无水乙醇溶解后加入1mL氢氧化钠溶液，室温搅拌，TLC检测反应进程，3～4小时后，反应液用盐酸(6M)调pH值至2～3，反应混合物用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用饱和氯化钠溶液清洗后，用无水硫酸钠脱水，然后减压蒸干。反应产物用氯仿/甲醇梯度洗脱硅胶柱层析进行分离纯化，得棕色固体A系列衍生物，收率80-90%。
制备化合物A2：所用C系列衍生物为C2。
Figure BDA00002775072300101
A2
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ12.09(s,1H),9.90(s,1H),9.69(s,1H),6.27(d,J=2.0Hz,1H),6.14(d,J=1.9Hz,1H),3.45(d,J=15.6Hz,2H),2.77(t,J=7.3Hz,2H),1.55(m,2H),0.87(t,J=7.4Hz,3H);13C-NMR(150MHz,DMSO-d6):δ205.9,172.8,159.6,157.7,136.1,120.7,110.6,101.8,45.9,39.2,17.7,14.3;MS(ESI):m/z239[M+H]+.
制备化合物A3：所用C系列衍生物为C3。
Figure BDA00002775072300102
A3
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ12.11(s,1H),9.92(s,1H),9.70(s,1H),6.27(s,1H),6.14(s,1H),3.44(s,2H),2.79(t,J=6.7Hz,2H),1.55(m,2H),1.28(m,4H),0.88(t,J=7.0Hz,3H);13C-NMR(150MHz,DMSO-d6):δ206.0,172.8,159.5,157.7,136.0,120.7,110.6,101.8,43.7,39.2,26.5,22.4,14.5;MS(ESI):m/z275[M+H]+.
制备化合物A4：所用C系列衍生物为Secocurvulin。
Figure BDA00002775072300103
A4
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ12.11(s,1H),9.88(d,J=41.3Hz,1H),9.67(d,J=41.5Hz,1H),6.27(s,1H),6.14(s,1H),3.44(s,2H),2.78(s,2H),1.53(s,2H),1.26(s,4H),0.88(s,3H);13C-NMR(150MHz,DMSO-d6):δ206.0,172.8,159.5,157.7,136.0,120.7,110.6,101.8,43.9,39.2,31.5,24.0,22.5,14.4;MS(ESI):m/z267[M+H]+.
制备化合物A5：所用C系列衍生物为C5。
Figure BDA00002775072300111
A5
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ12.10(s,1H),9.91(s,1H),9.70(s,1H),6.27(s,1H),6.14(s,1H),3.43(s,2H),2.78(s,2H),1.52(s,2H),1.27(s,6H),0.87(s,3H);13C-NMR(150MHz,DMSO-d6):δ206.0,172.8,159.5,157.7,136.0,120.7,110.6,101.8,43.9,39.2,31.7,28.9,24.3,22.5,14.41;MS(ESI):m/z281[M+H]+。
实施例5：2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮衍生物体外抗三型分泌系统毒性蛋白分泌的抑制作用
（参见文献Hudson DL,et.al.Antimicrobe Agents Chemother,2007.51:2631-2635.）
测试原理：三型分泌系统是鼠伤寒沙门氏菌致病过程中非常重要的一种毒力因子，其借助于三型分泌系统分泌毒性蛋白以促进对宿主细胞的侵袭和在宿主细胞内的繁殖与扩散。因此阻断毒性蛋白的分泌可以抑制鼠伤寒沙门氏菌对宿主细胞的入侵。本实验通过体外诱导的方法，促使鼠伤寒沙门氏菌通过三型分泌系统分泌毒性蛋白至培养的菌液中，然后利用SDS-PAGE和Western Blots进行检测，评价2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮衍生物化合物对毒性蛋白分泌的抑制作用。
测试材料：
(1)鼠伤寒沙门氏菌：武汉大学菌种保藏中心（保藏编号CCTCCM91098）。
(2)丙烯酰胺-双丙烯酰胺（40%），APS，TEMED，考马斯亮蓝R250，硝酸纤维素PVDF膜均为市售品。
(3)SipC鼠单克隆抗体：tgcBioMICS公司产品；
辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG二抗：Jackson ImmunoResearch公司产品。
(4)样品处理：样品临用前溶于DMSO配成100mM,-20°C保存。
(5)阳性对照药：INP0403(文献Hudson DL,et.al.Antimicrobe Agents Chemother,2007.51:2631-2635报道)。
测试方法：
取沙门氏菌菌种悬液，按1:100转接至LB（0.2%L-ara）中，25°C，220rpm振荡培养过夜。然后将过夜培养物，按1:10转接至1mL新鲜LB（0.2%L-ara）培养基中，加入1μl设定浓度的待测定药物化合物，37°C，220rpm振荡培养4h。取各培养物，稀释10倍，测定OD600值。其余培养物12000g，4°C离心5min。轻轻吸取上清800μl，然后加入88μl100%TCA至终浓度10%，轻轻振荡几次，冰上放置30min。12000g，4°C离心5min，倒掉上清，每管加入400μl-20°C保存的丙酮，轻轻振荡几次，冰上10min，12000g，4°C离心5min。完全挥干丙酮后，根据OD600值，加入其体积1倍量的上样缓冲液溶解蛋白，95°C加热5min，促进蛋白变性。取制备好的蛋白样品，进行10%SDS-PAGE，然后用0.1%（w/v）考马斯亮蓝R250染色、脱色，利用凝胶成像系统成像观察，或利用Western Blots进行检测，利用凝胶成像系统进行成像和毒性蛋白SipC的定量。最后根据Western Blots中SipC斑点光密度的大小进行定量，以空白对照DMSO组SipC的分泌量为100%，计算不同目标化合物对SipC的抑制作用。
测试结果见表1：
表1.目标化合物对鼠伤寒沙门氏菌毒性蛋白SipC分泌的影响
Figure BDA00002775072300121
*化合物测试浓度为100μM。
由表1结果可以看出化合物Secocurvulin、C5、Csn-B、C8和E6对SipC的分泌均有明显的抑制作用。
实施例6：2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮衍生物对鼠伤寒沙门氏菌侵袭作用的活性测试
(参见文献Negrea A,et.al.Antimicrobe Agents Chemother,2007,51:2867-2876.)
测试原理：
鼠伤寒沙门氏菌是胞内繁殖的革兰氏阴性致病菌，因此阻断其对宿主细胞的侵袭可有效阻止其在胞内的繁殖和扩散，从而降低致病性。本活性测试方法以体外细胞为模型，加入用2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮衍生物处理过的鼠伤寒沙门氏菌，然后共培养，通过菌落计数的方法计算侵袭进入宿主细胞内的菌的数目，从而评价目标化合物对鼠伤寒沙门氏菌侵袭能力的影响。
测试材料：
(1)鼠伤寒沙门氏菌：武汉大学菌种保藏中心（保藏编号CCTCCM91098）。
(2)HeLa细胞：ATCC产品。
(3)样品处理：样品临用前溶于DMSO配成100mM,-20°C保存。
(5)阳性对照药：INP0403(文献报道)。
测试方法：
HeLa细胞（DMEM，10%FBS）接种于24孔细胞培养板，每孔接种2×104个细胞，放置于37°C，5%CO2培养箱中培养过夜。沙门氏菌在LB（0.2%L-ara）培养基中25°C，220rpm振荡过夜。然后按1:10稀释过夜培养液，加入待测定目标化合物（secocurvulin、C5、Csn-B与阳性药物INP0403）100μM，37°C，220rpm振荡培养4h。取实验量的菌液，测定OD600值，然后用DMEM稀释至设定浓度，备用。HeLa细胞吸掉培养液，用PBS润洗1次，然后每孔加入300μL DMEM（无血清）培养基，预培养30min后，每孔加入200μL备用的稀释菌液（侵染指数为50，即每孔加入1×106CFU），37°C，5%CO2条件下，培养1h。然后吸掉培养液，PBS洗一次，每孔加入400μL含100μg/ml庆大霉素的DMEM培养基，继续培养1h，以杀死胞外未入侵的细菌。吸掉培养液，HeLa细胞用PBS清洗三次，以除去细胞外细菌。每孔加入200μL0.1%TritonX-100，裂解细胞。然后细胞裂解液梯度稀释，再分别将稀释液涂布于LB平板中，37°C倒置培养过夜，数出单菌落数，计算得出每孔中进入HeLa细胞的沙门氏菌的菌落数。然后根据公式计算侵袭率（%invasion），结果见图1。
%invasion=（进入HeLa细胞菌落数÷加入每孔中总菌落数）×100%
由图1结果可以看出化合物C5，Csn-B以及阳性对照化合物INP0403对沙门氏菌对HeLa细胞的入侵均有极显著的抑制作用（p≤0.001），而化合物secocurvulin对沙门氏菌对HeLa细胞的入侵有显著的抑制作用（p≤0.05）。
实施例7：2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮衍生物对鼠伤寒沙门氏菌生长的影响
取鼠伤寒沙门氏菌25°C过夜培养物，按1:10转接至1mL LB（0.2%L-ara）中，同时各加入待测定目标化合物C5，Csn-B和secocurvulin，然后置于37°C震荡培养。每个样品设立三个重复。每隔1h，测定1次OD600，然后绘制沙门氏菌生长曲线。
测试结果见图2。
由图2可以看出，与空白对照DMSO组比较，目标化合物对鼠伤寒沙门氏菌的生长几乎没有影响。
实施例8：治疗革兰氏阴性致病菌感染的药物
Figure BDA00002775072300131
Figure BDA00002775072300141
制备方法：将Csn-B与乳糖和玉米淀粉混合，用水均匀润湿后，过筛，制成颗粒，然后干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，均匀后压片，每片重240mg，Csn-B含量为1mg。
实施例9：防治革兰氏阴性致病菌感染的饲料添加剂
制备方法：将10mg Csn-B与10g玉米粉混匀后，将剩余玉米粉和豆粕完全混匀，然后将两组混合物完全混匀。每1kg鸡饲料，Csn-B含量为10mg。

Claims (7)

1.一类2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物，其化学结构通式为：
其中：n=0～8；R=乙基、甲氧乙基或氢。
2.如权利要求1所述2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物，其特征在于：所述化学结构通式中n=4～6，R=乙基或甲氧乙基。
3.如权利要求2所述2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物，其特征在于：所述2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物是当n=5时，R=乙基；当n=6时，R=甲氧乙基。
4.权利要求1所述2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物在制备抗革兰氏阴性致病菌抑制剂中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物是化学结构通式中当R=乙基时，n=4,5,6或8；当R=甲氧乙基时，n=6所表述的化合物。
6.一种治疗革兰氏阴性致病菌感染的药物，其特征在于：所述药物含有权利要求1所述的2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物和药学上可接受的辅料。
7.一种治疗革兰氏阴性致病菌感染的食品或饲料添加剂，其特征在于：所述添加剂含有权利要求1所述的2,4-二羟基-6-取代-苯基脂肪酮类衍生物添加剂制备中可接受的辅料。
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