CN103006736A - 苍术总萜醇提取物在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及苍术总萜醇提取物,尤其涉及在制备抗幽门螺杆菌药物中应用。所述的苍术总萜醇提取物为通过提取、精制步骤从菊科植物苍术的干燥根茎中获得的富含苍术倍半萜醇的提取物。苍术总萜醇提取物不仅具有抑制胃酸分泌的作用,而且具有抗幽门螺旋杆菌的活性,抗菌活性随培养基pH值的降低而增强,从而阻断消化性溃疡两大致病因素,即胃酸分泌过多和幽门螺旋杆菌。
Description
技术领域
本发明涉及苍术总萜醇提取物,尤其涉及在制备抗幽门螺杆菌药物中应用。
背景技术
苍术具有悠久的临床应用历史,中医认为其性温,味辛、苦,归脾、胃、肝经,具有健脾燥湿的作用,主要用于湿困脾土、脘痞腹胀、食欲不振、呕吐、腹泻、疟疾、痰饮、水肿等症的治疗。健脾燥湿是中医治疗消化性溃疡的常用治法之一。苍术总萜醇提取物为从菊科植物茅苍术干燥根茎中提取得到的以茅术醇和β-桉叶醇为主要活性成分的总萜醇,临床拟用于消化性溃疡。
消化性溃疡会导致胃酸分泌过多,胃粘膜的抵抗力下降,或两者兼而有之。消化性溃疡形成的主要原因是当胃酸的分泌相对地超过了胃分泌的粘液对胃的保护能力和(或)碱性的十二指肠液中和胃酸的能力时,含有胃蛋白酶和低PH值的胃液会使胃壁消化,就会发生消化性溃疡。
利用现代药理研究,对苍术有效成分的胃溃疡药效筛选证实,苍术总萜醇提取物中茅术醇对H+,K+-ATP酶有较强的抑制作用,当茅术醇浓度到达1.0×10-5M,就对H+,K+-ATP酶产生抑制作用,当茅术醇浓度为4.0×10-4M则能完全抑制H+,K+-ATP酶,其对Na+-ATP酶,Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、H+-ATP酶亦有一定的抑制作用。茅术醇、β-桉叶醇对幽门结扎溃疡、阿司匹林所致的胃溃疡均有抑制作用。然而,茅术醇和β-桉叶醇抗溃疡机理并不一致,茅术醇是质子泵抑制剂,β-桉叶醇是组胺H2受体阻断剂,两个倍半萜醇类化合物协同作用而抑制胃液分泌,从而发挥抗溃疡的作用。
消化性溃疡的主要原因之一是幽门螺杆菌,幽门螺杆菌感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构将幽门螺杆菌定为Ⅰ类致癌原。目前国内外常用的抗幽门螺杆菌药物有胃复春片、羟氨苄青霉素、四环素、强力霉素、呋喃唑酮、有机铋、胃得乐、乐得胃等,但由于口服,胃酸的环境使药效大大受到影响。目前,消化性溃疡采用质子泵抑制剂或H2受体拮抗剂联合两种抗生素的“三联疗法”原则,疗程一般为2周,但又有耐药性问题的产生。因此,替换性治疗或预防策略值得重视。
感染幽门螺杆菌(HP)会导致慢性胃炎和肠胃溃疡病。如今,领域内已有如下共识:(1)胃黏膜正常的志愿者,口服HP混悬液可造成胃炎症状和病理改变。(2)患慢性胃炎时HP检出率非常高,而胃黏膜正常者则不能检出此菌。(3)慢性胃炎病人血清中HP抗体明显增高,胃液中可检出抗HP免疫球蛋白,这表明HP是有致病性的抗原(病原体)。(4)针对HP进行治疗,会使慢性胃炎病人胃黏膜明显改善。(5)60%-80%的胃溃疡和70%-100%的十二指肠溃疡病人的胃窦部可检出HP,血清学检查证实,这些人血清HP抗体滴度较高。(6)用传统抗溃疡药物治疗无效的难治性溃疡,改用抗HP药物治疗后,大多数溃疡能愈合。(7)用HP感染恒河猴,能让之发生慢性胃炎,胃黏膜的病理改变与人类感染相似,即制备HP胃炎动物模型获得了成功。以上说明,HP与慢性胃病有相关性是确凿无疑的。HP肯定是慢性胃炎的致病菌,与溃疡病和胃癌关系也极为密切。即是说,HP是引发慢性胃病的元凶和罪魁祸首。
申请人的中国专利申请200810239177.1名称为苍术总萜醇提取物及其制备方法和用途的后续发明。中国专利申请200810239177.1公开了苍术总萜醇提取物为通过提取、精制步骤从菊科植物苍术Atractylis lancea和/或Atractylodes chinensis(Atractylodes lancea DC.var.chinensis Kitam.)的干燥根茎中获得的富含苍术倍半萜醇的提取物,所述苍术总萜醇提取物的组成成分为:(1)苍术醇的含量范围为65%~95%重量,其中,所述苍术醇为茅术醇与β-桉叶醇的混合物,两者比例为1∶0.5~2;(2)苍术素的含量为2.5%~20%重量;以及(3)余量的其他倍半萜醇类、倍半萜烯及聚炔类化合物;其中,倍半萜烯的总含量不超过2%重量。上述的总萜醇提取物可以有效保留和突出提取物的药理药效学作用,同时也大幅度降低提取物的急性毒性以及与刺激性相关的副作用。
综上所述,目前技术领域内认为,苍术总萜醇提取物中的茅术醇和β-桉叶醇具有抑制H+,K+-ATP酶的作用,以发挥抑制胃酸分泌的作用,从而达到抗消化性溃疡的作用。然而苍术总萜醇提取物具有抗幽门螺杆菌性质并未被发现与应用。这阻碍了苍术总萜醇提取物在治疗其他胃病以及其他由幽门螺杆菌引发疾病的药物研发与应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种苍术总萜醇提取物的新用途,即在在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。本发明人是在验证苍术总萜醇提取物具有抑制胃酸分泌作用的同时,发现苍术总萜醇提取物具有抗幽门螺杆菌的作用,且抗菌活性随培养基PH值的降低而增强。本发明所述的苍术总萜醇提取物为通过提取、精制步骤从菊科植物苍术的干燥根茎中获得的富含苍术倍半萜醇的提取物。
所述苍术总萜提取物的组成成分为:
(1)苍术醇的含量范围为50%~90%重量,其中,所述苍术醇为茅术醇与β-桉叶醇的混合物,两者比例为1:0.5~2;
(2)苍术素的含量为2.5%~20%重量;以及
(3)余量的其他倍半萜醇类、倍半萜烯及聚炔类化合物;其中,倍半萜烯的含量不超过2%重量。
其具有体外抗幽门螺旋杆菌的活性,其活性随培养基pH值条件的降低而增强。该提取物从具有悠久应用历史的中药材中得到,副作用小。
苍术总萜醇提取物对临床分离的幽门螺旋杆菌有体外抑制作用,苍术总萜醇提取物70%(苍术醇含量70%)的MIC范围为0.16~2.56mg/ml,MIC50值为0.64mg/ml,MIC90值为2.56mg/ml。当培养基PH条件由7.2降低至2.0时,苍术总萜醇提取物对幽门螺旋杆菌的抗菌活性增强,其MIC50值由0.64mg/ml降低至0.32mg/ml,MIC90值由2.56mg/ml降低至0.64mg/ml。
本发明的积极效果是苍术总萜醇提取物不仅具有抑制胃酸分泌的作用,而且具有抗幽门螺旋杆菌的活性,抗菌活性随培养基pH值得降低而增强,阻断消化性溃疡两大致病因素,即胃酸分泌过多和幽门螺旋杆菌。
具体实施方式
下面将描述本发明的几个实施例,但本发明的内容完全不局限于此。(几个提取物制备方法相同,成品含量近似,删除了原来的实施例1)
实施例1苍术总萜醇提取物的制备
采用生品矛苍术干燥根茎,粉碎,过筛2kg,放进蒸馏装置中,加正己烷10L回流提取1h,提取3次,合并提取液,减压回收溶剂得油状提取物。然后减压(精馏精制设置精馏塔塔柱直径80mm,填料:2.0×2.0mm的高效不锈钢θ环,有效填料段高度:1.5m;塔釜容积:5L,采用外循环导热油系统加热,加热总功率20kw,功率可调;塔顶冷凝器为蛇管式,换热面积0.5m2;真空泵,抽气速率10L/s,极限真空20Pa)。苍术水蒸气蒸馏提取物200g,装入塔釜,循环水冷却,抽真空,使系统压力维持在8mmHg,外循环导热油系统加热使塔釜梯度升温。根据预实验结果,收集120~180℃馏分。经GC-MS测定苍术总萜醇提取物(茅术醇和β-桉叶醇两者含量之和)含量为77.5%。均质后,装入药瓶密封,消毒制成产品。
实施例2苍术总萜醇提取物的制备
采用生品矛苍术干燥根茎,粉碎,过筛,取2.5kg。置于二氧化碳超临界萃取设备中,进行连续萃取3h。萃取条件:萃取压力为15MPa,萃取温度为40℃,分离压力为5~6MPa,分离温度为45℃。然后减压(精馏精制设置精馏塔塔柱直径80mm,填料:2.0×2.0mm的高效不锈钢θ环,有效填料段高度:1.5m;塔釜容积:5L,采用外循环导热油系统加热,加热总功率20kw,功率可调;塔顶冷凝器为蛇管式,换热面积0.5m2;真空泵,抽气速率10L/s,极限真空20Pa)。苍术水蒸气蒸馏提取物200g,装入塔釜,循环水冷却,抽真空,使系统压力维持在8mmHg,外循环导热油系统加热使塔釜梯度升温。根据预实验结果,收集120~180℃馏分。经GC-MS测定苍术总萜醇提取物(茅术醇和β-桉叶醇两者含量之和)含量为89.6%。均质后,装入药瓶密封,消毒制成产品。
实施例3苍术总萜醇提取物的制备
采用炮制矛苍术干燥根茎,粉碎,过筛2.5kg,放进蒸馏装置中,水蒸气蒸馏提取8h,使油水分离,收集挥发油。然后减压(精馏精制设置精馏塔塔柱直径80mm,填料:2.0×2.0mm的高效不锈钢θ环,有效填料段高度:1.5m;塔釜容积:5L,采用外循环导热油系统加热,加热总功率20kw,功率可调;塔顶冷凝器为蛇管式,换热面积0.5m2;真空泵,抽气速率10L/s,极限真空20Pa)。苍术水蒸气蒸馏提取物200g,装入塔釜,循环水冷却,抽真空,使系统压力维持在8mmHg,外循环导热油系统加热使塔釜梯度升温。根据预实验结果,收集120~180℃馏分。经GC-MS测定苍术总萜醇提取物(茅术醇和β-桉叶醇两者含量之和)含量为50.5%。均质后,装入药瓶密封,消毒制成产品。
为更好的理解本发明的实质,下面将用不同含量苍术总萜醇提取物体外抗幽门螺杆菌MIC值测定试验及结果说明其在制备抗幽门螺旋杆菌药物中的应用。
实施例4不同苍术醇含量的苍术总萜醇提取物体外抗幽门螺杆菌MIC值测定试验内容及其结果如下:
(1)受试样品为样品1-1:苍术总萜醇提取物50%提取物(苍术醇含量50%)。样品1-2:苍术总萜醇提取物70%提取物(苍术醇含量70%)。样品1-3:苍术总萜醇提取物:90%提取物(苍术醇含量90%)。样品2:胃复春片。样品3:克拉霉素。
(2)实验菌株选取临床分离幽门螺杆菌40株,幽门螺杆菌标准菌株
ATCC43504为质控菌株,菌株由三甲医院分离并鉴定。
(3)试验方法:含药平板的制备
样品1含药平板的制备:精密称取样品819.2mg,置于无菌试管,加入0.5mlDMSO,轻轻振荡使全部溶解,继续加入无菌水至8ml,得102.4mg/ml溶液,取4ml加入4ml无菌水,得51.2mg/ml溶液;同法依次取4ml加入4ml无菌水系列倍比稀释,得浓度分别为25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2mg/ml的系列样品溶液。
分别取上述样品溶液1ml加入9cm无菌平板,加入幽门螺杆菌固体培养基9ml,立即混匀,置水平台待凝后得到浓度依次为2.56、1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02mg/ml的含药平板。
胃复春片含药平板制备:取胃复春片五片,无菌操作研磨成细粉末,精密称取1024mg,加入无菌水10ml,置60℃水浴恒温2小时,于4℃冰箱放置24小时,无菌操作滤除残渣,于100℃加热15分钟灭菌,补足无菌水至10ml,得相当于原药102.4mg/ml的提取液,取4ml加入4ml倍比稀释,得51.2mg/ml稀释液,同法依次取4ml加入4ml无菌水系列倍比稀释,得浓度分别为25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2mg/ml的系列稀释液。分别取上述样品溶液1ml加入9cm无菌平板,加入幽门螺杆菌固体培养基9ml,立即混匀,置水平台待凝后得到浓度依次为5.12、2.56、1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02mg/ml的含药平板。
克拉霉素含药平板制备:取克拉霉素10片,测定平均片重,无菌操作研磨成细粉末,精密称取适量(约相当于128mg克拉霉素),置100ml灭菌容量瓶,加入无水乙醇约20ml溶解,加入pH6.5磷酸盐缓冲液定容,得1280ug/ml克拉霉素溶液,取4ml加入4ml磷酸盐缓冲液系列倍比稀释,得浓度分别为640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156ug/ml的系列稀释液;分别取上述样品溶液1ml加入9cm无菌平板,加入幽门螺杆菌固体培养基9ml,立即混匀,置水平台待凝后得到浓度依次为8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03、0.015ug/ml的含药平板。
(4)菌悬液制备:取试验菌株,接种幽门螺杆菌平板培养基,37℃培养48小时,用接种环刮取菌苔至无菌生理盐水,混旋仪混匀后与麦氏比浊管比浊,约为1×108cfu/ml。
(5)接种及培养:将试验菌悬液按顺序加入96孔板相应孔内,放置于多点接种仪。取已制备的各含药平板按浓度由低至高顺序接种。于37℃培养48小时,取出观察结果,记录生长状况。
(6)试验结果
DMSO溶剂培养基对照平板生长结果:各临床菌株在DMSO浓度分别0.156%、0.078%、0.039%、0.0195%的平板培养基均能生长良好,菌落形态及镜检结果均符合幽门螺旋杆菌特征。样品及对照药物对临床菌株的MIC测定结果见表1,各药物的MIC50、MIC90及MICR值统计结果见表2
表1苍术总萜醇提取物对临床菌株的MIC测定结果
备注:克拉霉素对ATCC43504的MIC值符合CLSI提供的质控标准。
表2样品与对照药物的MIC结果统计
实施例5培养基不同PH条件对苍术总萜醇提取物MIC值的影响
为更进一步了解培养基pH值对苍术总萜醇提取物的影响,做如下试验:培养基不同PH条件对苍术总萜醇提取物MIC值的影响。
(1)受试样品为样品1:苍术总萜醇提取物提70%取物。样品2:胃复春片。样品3:克拉霉素。
(2)实验菌株选取临床分离幽门螺杆菌40株,幽门螺杆菌标准菌株ATCC43504为质控菌株,上述菌株分别由上海、南京、武汉、重庆的三甲医院分离并鉴定。
(3)试验方法:含药平板的制备
样品含药平板的制备:同实施例1。胃复春片含药平板制备:同实施例1。卡拉霉素含药平板制备:同实施例1
不同pH的培养基含药平板制备:取幽门螺杆菌培养基,按配方配制3份后加热溶解,稍冷后加入盐酸适量分别调节至pH5.5、pH4.0、pH2.0,取方法“样品含药平板的制备”样品溶液1ml分别加入9cm无菌平板,加入配制的不同pH培养基9ml,立即混匀,置水平台待凝后得到浓度依次为2.56、1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02mg/ml的pH5.5、pH4.0、pH2.0含药平板。
菌悬液制备:同实施例1
接种及培养:同实施例1
(4)试验结果
DMSO溶剂培养基对照平板生长结果同实施例1。苍术总萜醇提取物在不同培养基PH条件下,对临床菌株的MIC的结果见表3。不同培养基PH条件下的MIC50、MIC90及MICR值统计见表4。
表3培养基不同pH条件下MIC的测定结果(单位:mg/ml)
表4培养基不同pH条件对MIC值的影响(mg/ml)
Claims (2)
1.一种苍术总萜醇提取物在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用,所述的苍术总萜醇提取物为通过提取、精制步骤从菊科植物苍术的干燥根茎中获得的富含苍术倍半萜醇的提取物,所述苍术总萜提取物的组成成分按重量比(w/w)计:
(1)苍术醇的含量范围为50%~90%,其中,所述苍术醇为茅术醇与β-桉叶醇两者重量比为1:0.5~2的混合物;
(2)苍术素的含量为2.5%~20%;
(3)余量是其他倍半萜醇类、倍半萜烯及聚炔类化合物;其中,倍半萜烯的含量不超过2%重量。
2.如权利要求1所述的苍术总萜醇提取物在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用,其特征是:所述的苍术醇的含量为70%。
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