CN102988421B - 五倍子抗肿瘤有效组分提取物及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

一种五倍子抗肿瘤有效组分提取物，它是五倍子干燥后粉碎，加入石油醚去油，晾干，水提醇沉，滤液蒸去乙醇后用乙醚提取，乙醚萃取液浓缩后得到的五倍子抗肿瘤有效组分提取物。研究证明，该有效组分提取物具有体外抑制U251（胶质瘤细胞）生长的活性，因此，可用于制备开发抗肿瘤药物。本发明公开了其制法。

Description

五倍子抗肿瘤有效组分提取物及其制法和用途

技术领域

本发明涉及五倍子抗肿瘤有效部位提取物、含有它的药物组合物及其制备方法和用途。

背景技术

肿瘤是当今世界上危害人类健康的最严重疾病之一，目前，肿瘤的治疗有手术、放化疗、介入等多种手段，但死亡率依然居高不下，现已上升为第一位 [参见：肖震宇，何少忠，彭卫卫. 2011，22（23）：2204-2206]。世界各国的专家学者都在积极研究寻找治疗肿瘤的方法和药物。中医药对于治疗癌症等疑难病症有着悠久的历史，药用植物中的活性成分可通过多种途径、多个靶点发挥其生物学作用。特别是植物来源的药物及其衍生物，如长春新碱、羟基喜树碱、紫杉醇、多西紫杉醇等已广泛应用并作为一线用药，抗癌中药及其靶向给药系统的研究已经受到了极大关注。

作为中药和化工原料，五倍子在国内外市场享有盛誉。[参见：李春远，丁唯嘉，渠桂荣. 中草药，2008，39（8）：1129-1132. 乔彩云，李建科. 食品工业科技，2011，32（7）：458-462 ]五倍子(Galla Chinensis)，别名倍子、百虫仓、百药煎、麸木、木麸子、文蛤等，为瘿绵蚜科( Pemphigidae)的一些蚜虫寄生在漆树科盐肤木属植物盐肤木( Rhus chinensis Mill) 、青麸杨(R.potanini Maxim.) 或红麸杨(R.punjabensis Stew.Var. Sinica Rehd. Et Wils)等的叶或叶柄上而形成的囊状虫瘿，以叶上虫瘿(又称角倍、肚倍、花倍、药倍) 入药。五倍子适宜生长在温暖湿润的山区和丘陵，在我国主产区集中在贵州、四川、湖北、湖南、陕西、云南等六省，这些省的五倍子产量约占全国总产量的90% 以上。此外，湖南、河南、甘肃、广东、安徽、浙江、江西、福建、山西等地亦产[参见周劲光. 海峡药学，2010，22（4）：30-32 ]。

五倍子主要有效成分五倍子单宁又称五倍子鞣质，由7～9 个分子没食子酸和1 分子葡萄糖缩合而成，含量约为60%～70%，甚至高达80%；另外尚有没食子酸2%～4%，脂肪、树脂以及蜡质等。因五倍子盛产于我国，国际上又将五倍子鞣质称为中国鞣质( Chinese gallotannin) ，它是倍酰葡萄糖的混合物，即葡萄糖上的羟基与没食子酸所形成的酯类化合物的混合物，属水解类鞣质。五倍子的鞣质含量很高，最高可达70% 以上。没食子酸也是五倍子中主要成分之一，它的含量约占2%~ 4%。五倍子油的化学成分为癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等。五倍子油与其他种子油相比，含有大量的月桂酸和肉豆蔻酸。有文献报道五倍子油对糖尿病有一定的疗效[参见：李秀萍, 李春远, 渠桂荣, 李彩丽. 中医药学报，2002，30 （3）：72-74. 韩瑞，李建科，曹立强，邓红. 粮食与油脂, 2008,11:26-28] 。

五倍子目前研究认为其主要药理作用为止血和抑菌[刘现兵，杜镇镇，王冬，等.中国实用医药，2008，7（3）：96―97. Jaw-Chyun Chen，Tin-Yun Ho，Yuan-Shiun Chang，et al. Journal of Ethnopharmacology，2006 ，103：385―391.]。近年来，开始有学者对五倍子有效成分9201的癌化学预防作用进行了系统的研究，应用苯并芘B (a) P 诱发V 79 细胞体外转化模型，B (A)诱发小鼠肺腺瘤模型以及DMBA /巴豆油诱发的小鼠皮肤乳头状瘤模型。证明9201 能明显抑制苯并芘对中国仓鼠肺细胞(V 79) 的恶化转化，在体内明显抑制苯并花诱发的小鼠肺腺瘤的形成，使生瘤率降低，而且还能有效抑制DMB A/巴豆油诱发的小鼠皮肤乳头状瘤的形成，使潜伏期延长，皮肤乳头状瘤的发生率降低[陈晓光,李燕,韩锐.医学研究通讯，2000,29（3）：15-16]。有效成分9201的具体成分由相关文献可见应为五倍子的鞣质部分[陈晓光. 五倍子有效成分9201的癌化学预防作用及其机理的研究（博士论文），中国协和医科大学，1994]。目前尚未见到有关五倍子醚提物成分抗肿瘤作用研究与应用方面的报道。

有关五倍子成分研究，国内外文献均集中在鞣质类成分上，有关五倍子醚提物研究很少。

中国专利申请CN200710041748.6《一种五倍子鞣质的提取方法》，涉及了五倍子鞣质的提取方法，未涉及醚提成分。

中国专利申请CN CN200710150082.8、CN200710150138.X、CN200710150139.4、CN200710150154.9、CN200710150159.1及CN200710150161.9《五倍子有效组分及其制备方法与用途》，涉及了五倍子乙酸乙酯和乙醇混合提取的部分，未涉及醚提部分。

本发明的目的之一是，提供一种五倍子乙醚提取物的抗肿瘤有效部位及其制备方法。

本发明的目的之二是，提供一种以所说部位为有效成分的药物组合物。

本发明的目的之三是，提供所说有效部位在制备抗肿瘤及相关药物中的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于开发五倍子新的药用部位，提供一种从五倍子中提取具有抗肿瘤作用的有效部位。本发明的优点和效果在于采用简单的方法提取得到五倍子中具有抗肿瘤作用的提取物，并经实验证明对恶性肿瘤细胞具有较强的抑制作用。

本发明的技术方案如下：

五倍子抗肿瘤有效组分提取物，它是五倍子干燥后粉碎，加入石油醚去油，晾干，水提醇沉，滤液蒸去乙醇后用乙醚提取，浓缩后得到的五倍子抗肿瘤有效组分提取物。

一种制备上述的五倍子抗肿瘤有效组分提取物的方法，它包括以下步骤：

（1）五倍子为原料，药材五倍子干燥后粉碎，取80-400g加入石油醚均匀搅拌，静置，滤去石油醚，晾干，加水回流提取，药渣重复提取1次，收集滤液，蒸发缩至约300ml，加入2-6倍体积的95%乙醇搅拌，静置过夜，过滤，得提取液；

（2）步骤（1）的提取液浓缩去除乙醇后用2-5倍体积的乙醚进行萃取，乙醚萃取液蒸发浓缩后，即得五倍子抗肿瘤有效组分提取物。

本发明提供的五倍子抗肿瘤有效组分提取物经过进一步分离提纯及碳谱氢谱分析鉴定主要含有没食子酸、没食子酸乙酯及其他未知物。

本发明进一步提供五倍子抗肿瘤有效组分提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。以抑制U251增殖能力为活性指标进行抗肿瘤活性实验。实验结果表明，在体外细胞毒实验中，可以明显抑制U251的增殖，具有抗肿瘤作用，可用于制备抗肿瘤治疗药物。

本发明还提供了以所述方法制备的五倍子抗肿瘤有效组分提取物的药物组合物。所述药物组合物是以本发明的五倍子抗肿瘤有效组分提取物为有效成分，与药学上可接受的载体所组成，并以适合药用的制剂形式存在，这些制剂形式可以是片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、缓释片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊剂、口服液、合剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、粉针剂、冻干粉针剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、滴丸剂和贴剂等。

有益效果

（1）本发明的优点和效果在于采用溶剂提取、萃取等常规方法，从五倍子中提取得到了具有抗肿瘤作用的有效组分的乙醚提取物，该有效组分经实验证明具有体外抑制脑胶质细胞U251生长的活性。

（2）本发明拓展了抗肿瘤药物的原料渠道，扩大了五倍子的用途，使五倍子发展成为高效的抗肿瘤药物组分的原料，可显著提高五倍子的附加值。

具体实施方式

以下所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：五倍子抗肿瘤有效组分提取物的制备

药材五倍子干燥后粉碎。取400g药粉，加入石油醚250ml，均匀搅拌5min，静置1h，过滤除去石油醚，重复3次，取出药品晾干。将上述样品分成4份，加入水1L，回流提取2h，药渣重复提取4次，收集滤液。用旋转蒸发仪浓缩滤液至约200ml，加入95%乙醇450ml搅拌，静置过夜。过滤，取滤液，用旋转蒸发仪将乙醇蒸出，蒸至无乙醇味，得粗提液200ml。用乙醚分4次萃取粗提液（每次乙醚250 ml），合并乙醚层，用旋转蒸发仪蒸至无乙醚味，得褐色浸膏，即五倍子抗肿瘤有效组分提取物。

五倍子抗肿瘤有效组分提取物经过液相制备色谱进一步分离纯化及NMR碳谱氢谱分析，初步判定主要含有没食子酸、没食子酸乙酯及其他未知物。

实施例2：五倍子抗肿瘤有效组分提取物的制备

药材五倍子干燥后粉碎。取400g药粉，加入石油醚350ml，静置过夜，过滤除去石油醚，取出药品晾干。将上述样品分成4份，加入水1L，回流提取3h，药渣重复提取2次，收集滤液。用旋转蒸发仪浓缩滤液至约300ml，加入95%乙醇600ml搅拌，静置过夜。过滤，取滤液，用旋转蒸发仪将乙醇蒸出，蒸至无乙醇味，得粗提液300ml。用同体积的乙醚萃取粗提液三次，合并乙醚层，用旋转蒸发仪蒸至无乙醚味，得褐色浸膏，即为五倍子抗肿瘤有效组分提取物。

五倍子抗肿瘤有效组分提取物经过液相色谱分析，保留时间与市购对照品比较定性，确认其主要含有没食子酸、没食子酸乙酯及其他未知物。

实施例3：固态五倍子抗肿瘤有效组分提取物的制备

药材五倍子干燥后粉碎。取80g 药粉，加入石油醚80ml，均匀搅拌，静置过夜，过滤除去石油醚，取出药品晾干。将上述样品加入水600ml，回流提取2h，药渣重复提取2次，收集滤液。用旋转蒸发仪浓缩滤液至约80ml，以95%乙醇∶药液6∶1的比例加入95%乙醇，搅拌10分钟，静置过夜，过滤，取滤液，用旋转蒸发仪将乙醇蒸出，蒸至无乙醇味，得粗提液80ml。以100ml乙醚萃取粗提液，萃取2次，每次约10 min，取乙醚层合并，用旋转蒸发仪蒸至无乙醚味，烘干得约4.8g黄色粉末状的固态五倍子抗肿瘤有效组分提取物。

固态五倍子抗肿瘤有效组分提取物经过液相色谱分析，保留时间与市购对照品比较定性，确认其主要含有没食子酸、没食子酸乙酯及其他未知物。

实施例4：固态五倍子抗肿瘤有效组分提取物的制备

药材五倍子干燥后粉碎。取80g 药粉，加入石油醚80ml，均匀搅拌5min，静置过夜，去除石油醚，取出药品晾干。将上述样品加入水700ml，回流提取2h，药渣重复提取2次，收集滤液。用旋转蒸发仪浓缩滤液至约60ml，以95%乙醇∶药液5∶1的比例加入95%乙醇，搅拌5分钟，静置过夜，过滤，取滤液，用旋转蒸发仪将乙醇蒸出，蒸至无乙醇味，得粗提液60ml。用300ml乙醚萃取粗提液1次，取上清液（乙醚层），用旋转蒸发仪蒸至无乙醚味，烘干得约3.8g黄色粉末状的固态五倍子抗肿瘤有效组分提取物。

实施例5： MTT法体外抗肿瘤活性评价

以实施例1得到的五倍子抗肿瘤有效组分提取物为受试药物，体外培养U251，取指数生长期的细胞，用胰酶消化后，1500r﹒min^-1离心5min，将细胞重悬于培养基中，细胞浓度调至2×104个/ml，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，放置细胞培养箱（37℃，5%CO₂）中培养24h，之后加入受试药物20μl，阴性对照组加入终浓度为0.5%DMSO，各组均设3个复孔。在加药48h后，每孔加入5mg﹒ml^-1MTT试剂20μl，继续置于37℃培养4h。每孔加入DMSO100μl，振荡混匀，测定各孔在波长570nm处的吸光度值。计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-实验组吸光度/对照组吸光度）×100%，结果见表1。

以实施例2-4得到的五倍子抗肿瘤有效组分提取物重复本实施例得到相同结果。

表1  五倍子抗肿瘤有效组分提取物的抗肿瘤活性实验（U251）

Claims (4)

1.一种制备五倍子抗肿瘤有效组分提取物的方法，其特征是它包括以下步骤：

(1)药材五倍子干燥后粉碎，取80-400g加入石油醚均匀搅拌，静置，滤去石油醚，晾干，加水回流提取，药渣重复提取1次，收集滤液，蒸发缩至约300ml，加入2-6倍体积的95％乙醇搅拌，静置过夜，过滤，得提取液；

(2)步骤(1)的提取液浓缩去除乙醇后用2-5倍量乙醚进行萃取，乙醚萃取液蒸发浓缩后，即得五倍子抗肿瘤有效组分提取物。

2.根据权利要求1所述的制备方法制得的五倍子抗肿瘤有效组分提取物。

3.权利要求2所述的五倍子抗肿瘤有效组分提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的五倍子抗肿瘤有效组分提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征是：所述的抗肿瘤药物是以五倍子抗肿瘤有效组分提取物为有效成分，与药学上可接受的载体所组成，并以药用的制剂形式存在，这些制剂形式是片剂、胶囊剂、口服液、合剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、粉针剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或滴丸剂。