CN102977183A - 一种基因工程包涵体的洗涤方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因工程包涵体的洗涤方法，该方法采用中空纤维膜处理基因工程包涵体的洗涤，可实现连续自动操作，工艺过程简单，操作方便，提高了生产效率，得到的包涵体收率高、纯度高、特别适合于大规模工业化生产上的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种基因工程包涵体的洗涤方法，特别涉及了一种利用中空纤维滤膜对基因工程包涵体进行洗涤的方法。
背景技术
基因重组技术可以用来大量生产自然界极其微量的功能蛋白或多肽，大肠杆菌等原核生物因其生长速度快，营养要求低，通常作为基因重组技术的首选宿主菌。然而，用大肠杆菌高效表达的重组蛋白常常会形成不溶性的且无活性的包涵体。包涵体是重组基因在表达过程中因蛋白质的二级结构错误折叠所形成的一种致密性的结构，这种结构有利于重组蛋白不被胞内蛋白酶水解，保证了重组蛋白的高效表达。基因工程包涵体可以通过变性剂将其溶解，再缓慢除去变性剂，从而使其恢复天然活性。
由于基因包涵体不仅仅含有重组蛋白，还有外膜蛋白，质粒DNA和其他杂质，因此为了提高包涵体的质量，增加其中重组蛋白的含量，以利于重组蛋白重新折叠恢复其天然构象，通常需要将包涵体经过充分洗涤，以除去细胞膜等脂溶性组分，杂蛋白，核酸等物质，提高包涵体的纯度。包涵体洗涤的传统方法为：第一次洗涤加入含一定比例去垢剂（曲拉通、吐温等）的缓冲液，将包涵体悬液搅拌洗涤一定时间后离心去除上清，收集沉淀；第二次洗涤加入含低浓度变性剂（2-4M脲、1-2M 盐酸胍）的缓冲液，将包涵体悬液搅拌洗涤一定时间后离心去除上清，收集沉淀；根据需要再洗涤第三次或第四次，同样离心去除上清，收集沉淀。李晓红等在《重组人胰岛素制备工艺》（《四川大学学报》，2007年）中报道了重组人胰岛素原包涵体的收集和洗涤，包涵体先用含2 M 尿素的缓冲液洗涤第一次，4度17000g离心收集沉淀；沉淀再用含2%脱氧胆酸钠的缓冲液洗涤第二次，4度17000g离心收集沉淀；沉淀再用Tris缓冲液洗涤两次，同样4度17000g离心收集沉淀。但对洗涤得到的包涵体的纯度和收率没有详细的数据报道。许崇利等在《重组人γ-干扰素纯化工艺的建立》（《中国兽药杂志》，2012年）中报道了γ-干扰素包涵体的纯化，加入洗涤液洗涤四次，以10000r/m离心收集包涵体，电泳检测其纯度达90%。
传统洗涤方法需要使用高速离心机或者连续流离心机来完成，由此带来一系列的问题：如成本高昂、操作繁琐、容易产生污染、维修成本高、工艺放大困难。虽然获得的包涵体纯度较高，但包涵体的收率较低。中空纤维过滤膜以其独特的开放式流路结构，温和低剪切力，可以很好地满足对剪切力敏感的生物大分子以及成分较复杂的生物样品不同规模的浓缩和过滤需要，广泛用于单抗、病毒类疫苗、菌苗、多糖、核酸、中草药、生化药以及乳品饮料等各个领域。中空纤维膜开放式的流路，可以直接处理菌体发酵液或高密度细胞培养液等含有固体的复杂料液而不会堵塞流路，省去离心等繁琐的前处理步骤。然而，目前还没有将中空纤维滤膜用于包涵体洗涤的文献报道。
发明内容
为了解决现在基因工程包涵体洗涤工艺中存在的问题，达到减少复杂操作，易于工业化生产的目的，本发明人经过大量创造性试验研究，提供一种利用中空纤维滤膜进行基因工程包涵体洗涤的方法。
本发明的目的是这样实现的：
一种基因工程包涵体的洗涤方法，包括如下步骤：
a、膜平衡：取中空纤维膜，用纯化水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为（trans-membrane pressure、TMP）5～15 bar，透过通量（Flux，单位：升/平米/小时，L/㎡/hr、LMH）为10～30 LMH；
b、第一次洗涤：配制洗涤缓冲液Ⅰ，按5～15：1（V/W）加入包涵体，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进所述中空纤维膜，使过膜压力（trans-membrane pressure、TMP）为5～15 bar，透过通量（Flux，单位：升/平米/小时，L/㎡/hr、LMH）为10～30 LMH，包涵体悬液被浓缩3～5倍后停止进液，收集包涵体浓缩液；所述洗涤缓冲液Ⅰ的组成为20～100 mM Tris-HCl，1～5% 曲拉通-X-100，pH9.0，或者组成为20～100 mM Tris-HCl，1～5% 吐温-20，pH9.0；
c、第二次洗涤：配制洗涤缓冲液Ⅱ，按5～15：1（V/W）加入步骤b处理后的包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进所述中空纤维膜，使过膜压力（trans-membrane pressure、TMP）为5～15bar，透过通量（Flux，单位：升/平米/小时，L/㎡/hr、LMH）为10～30 LMH，包涵体悬液被浓缩3～5倍后停止进液，收集包涵体浓缩液；所述洗涤缓冲液Ⅱ的组成为20～100 mM Tris-HCl，2～4 M 尿素，pH9.0，或者组成为20～100 mM Tris-HCl，1～3 M 盐酸胍，pH9.0；
d、第三次洗涤：配制洗涤缓冲液Ⅲ，按5～15：1（V/W）加入步骤c处理后的包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进所述中空纤维膜，使过膜压力为（trans-membrane pressure、TMP）5～15 bar，透过通量（Flux，单位：升/平米/小时，L/㎡/hr、LMH）为10～30 LMH，包涵体悬液被浓缩3～5倍后停止进液，收集包涵体浓缩液；所述洗涤缓冲液Ⅲ的组成为20～100 mM Tris-HCl，pH9.0。
中空纤维滤膜的材质会显著影响滤膜的化学耐受性、过滤速度、吸附性能，因此本发明对用于基因工程包涵体洗涤所用的中空纤维滤膜进行了优选。优选地，所述基因工程包涵体的洗涤方法，其中所述中空纤维膜的材质为聚醚砜（PES）,或是再生纤维素（RC），或是醋酸纤维素（CA）,或是亲水性聚偏氟乙烯（PVDF）。
中空纤维滤膜同时具有多种纤维管内径可选，应用于不同性质的料液，因此本发明对用于基因工程包涵体洗涤的中空纤维滤膜的纤维管内径进行了优选。优选地，所述基因工程包涵体的洗涤方法，其中所述中空纤维膜的纤维管内径为0.75-1.75mm。
另外，本发明对用于基因工程包涵体洗涤的中空纤维滤膜的滤膜孔径进行了优选。优选地，所述基因工程包涵体的洗涤方法，其中所述中空纤维膜的滤膜孔径为750 k、0.1 μm、0.2 μm或0.45 μm。
本发明与现有技术相比具有如下优点和显著的进步：
中空纤维膜开放式的流路，可以直接处理菌体发酵液或高密度细胞培养液等含有固体的复杂料液而不会堵塞流路，省去离心等繁琐的前处理步骤。本发明利用中空纤维膜处理基因工程包涵体的洗涤，可实现连续自动操作，工艺过程简单，操作方便，提高了生产效率，得到的包涵体纯度高、收率高、特别适合于大规模工业化生产上的应用。
具体实施方式
现通过以下实施例来进一步描述本发明的有益效果，实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。
实施例1 大肠杆菌表达重组人胰岛素原包涵体（0.2 公斤）的洗涤
中空纤维膜（聚醚砜材质，纤维管内径为1 mm，滤膜孔径为0.1 μm）先用纯化水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为15 bar，透过通量为30 LMH。将3 L洗涤缓冲液Ⅰ（20 mM Tris-HCl，1% 曲拉通-X-100，pH9.0）加入0.2 公斤大肠杆菌表达重组人胰岛素原包涵体，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力为5 bar，透过通量为10 LMH，包涵体悬液被浓缩3倍后停止进液。
将5 L洗涤缓冲液Ⅱ（100 mM Tris-HCl，2 M 尿素，pH9.0）加入上述包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力15 bar，透过通量为30 LMH，包涵体悬液被浓缩5倍后停止进液。
将5 L洗涤缓冲液Ⅲ（20 mM Tris-HCl，pH9.0）加入上述包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力15 bar，透过通量为30 LMH，包涵体悬液被浓缩5倍后停止进液。收集得到的包涵体经变性的SDS-PAGE凝胶电泳表明重组蛋白占包涵体总蛋白的含量为90%，包涵体收率经计算为87%。
实施例2大肠杆菌表达重组人胰岛素原包涵体（1公斤）的洗涤
中空纤维膜（聚醚砜材质，纤维管内径为1.75 mm，滤膜孔径为0.2μm）先用纯化水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为5 bar，透过通量为10 LMH。将15 L洗涤缓冲液Ⅰ（20 mM Tris-HCl，5% 吐温-20，pH9.0）加入大肠杆菌表达重组人胰岛素原包涵体，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力为5 bar，透过通量为10 LMH，包涵体悬液被浓缩5倍后停止进液。
将45 L洗涤缓冲液Ⅱ（100 mM Tris-HCl，3 M 盐酸胍，pH9.0）加入上述包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力15 bar，透过通量为30 LMH，包涵体悬液被浓缩5倍后停止进液。
将45 L洗涤缓冲液Ⅲ（100 mM Tris-HCl，pH9.0）加入上述包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力5 bar，透过通量为10 LMH，包涵体悬液被浓缩5倍后停止进液。收集得到的包涵体经变性的SDS-PAGE凝胶电泳表明重组蛋白占包涵体总蛋白的含量为91%，包涵体收率经计算为86%。
实施例3大肠杆菌表达重组人胰岛素原包涵体（5公斤）的洗涤
中空纤维膜（聚醚砜材质，纤维管内径为1 mm，滤膜孔径为0.2 μm）先用纯化水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为10 bar，透过通量为20 LMH。将75 L洗涤缓冲液Ⅰ（100 mM Tris-HCl，5% 曲拉通-X-100，pH9.0）加入大肠杆菌表达重组人胰岛素原包涵体，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力为15 bar，透过通量为30 LMH，包涵体悬液被浓缩5倍后停止进液。
将45 L洗涤缓冲液Ⅱ（100 mM Tris-HCl，4 M 尿素，pH9.0）加入上述包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力5 bar，透过通量为10 LMH，包涵体悬液被浓缩3倍后停止进液。
将75 L洗涤缓冲液Ⅲ（20 mM Tris-HCl，pH9.0）加入上述包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力15 bar，透过通量为30 LMH，包涵体悬液被浓缩5倍后停止进液。收集得到的包涵体经变性的SDS-PAGE凝胶电泳表明重组蛋白占包涵体总蛋白的含量为88%，包涵体收率经计算为85%。
实施例4 大肠杆菌表达重组人γ-干扰素包涵体（0.2 公斤）的洗涤
中空纤维膜（聚醚砜材质，纤维管内径为1 mm，滤膜孔径为0.1 μm）先用纯化水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为15 bar，透过通量为30 LMH。将3 L洗涤缓冲液Ⅰ（20 mM Tris-HCl，1% 曲拉通-X-100，pH9.0）加入大肠杆菌表达重组人γ-干扰素包涵体，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力为15 bar，透过通量为30 LMH，包涵体悬液被浓缩3倍后停止进液。
将5 L洗涤缓冲液Ⅱ（100 mM Tris-HCl，2 M 尿素，pH9.0）加入上述包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力5 bar，透过通量为10 LMH，包涵体悬液被浓缩3倍后停止进液。
将25 L洗涤缓冲液Ⅲ（20 mM Tris-HCl，pH9.0）加入上述包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力15 bar，透过通量为30 LMH，包涵体悬液被浓缩5倍后停止进液。收集得到的包涵体经变性的SDS-PAGE凝胶电泳表明重组蛋白占包涵体总蛋白的含量为89%，包涵体收率经计算为86%。
实施例5 大肠杆菌表达重组人γ-干扰素包涵体（1公斤）的洗涤
中空纤维膜（聚醚砜材质，纤维管内径为1.75 mm，滤膜孔径为0.2μm）先用纯化水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为5 bar，透过通量为10 LMH。将15 L洗涤缓冲液Ⅰ（20 mM Tris-HCl，1% 吐温-20，pH9.0）加入大肠杆菌表达重组人γ-干扰素包涵体，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力为5 bar，透过通量为10 LMH，包涵体悬液被浓缩5倍后停止进液。
将15 L洗涤缓冲液Ⅱ（100 mM Tris-HCl，1 M 盐酸胍，pH9.0）加入上述包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力15 bar，透过通量为30 LMH，包涵体悬液被浓缩5倍后停止进液。
将45 L洗涤缓冲液Ⅲ（100 mM Tris-HCl，pH9.0）加入上述包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力5 bar，透过通量为10 LMH，包涵体悬液被浓缩3倍后停止进液。收集得到的包涵体经变性的SDS-PAGE凝胶电泳表明重组蛋白占包涵体总蛋白的含量为85%，包涵体收率经计算为89%。
实施例6 大肠杆菌表达重组人γ-干扰素包涵体（5公斤）的洗涤
中空纤维膜（聚醚砜材质，纤维管内径为1 mm，滤膜孔径为0.2 μm）先用纯化水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为15 bar，透过通量为30 LMH。将25 L洗涤缓冲液Ⅰ（20 mM Tris-HCl，5% 曲拉通X-100，pH9.0）加入大肠杆菌表达重组人γ-干扰素包涵体，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力为15 bar，透过通量为30 LMH，包涵体悬液被浓缩5倍后停止进液。
将75 L洗涤缓冲液Ⅱ（100 mM Tris-HCl，4 M尿素，pH9.0）加入上述包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力15 bar，透过通量为30 LMH，包涵体悬液被浓缩5倍后停止进液。
将75 L洗涤缓冲液Ⅲ（20 mM Tris-HCl，pH9.0）加入上述包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力15 bar，透过通量为30 LMH，包涵体悬液被浓缩5倍后停止进液。收集得到的包涵体经变性的SDS-PAGE凝胶电泳表明重组蛋白占包涵体总蛋白的含量为90%，包涵体收率经计算为85%。
实施例7 大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体（0.2 公斤）的洗涤
中空纤维膜（聚醚砜材质，纤维管内径为1 mm，滤膜孔径为0.1 μm）先用纯化水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为5 bar，透过通量为10 LMH。将1 L洗涤缓冲液Ⅰ（20 mM Tris-HCl，1% 曲拉通X-100，pH9.0）加入大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力为5bar，透过通量为10 LMH，包涵体悬液被浓缩3倍后停止进液。
将1.5 L洗涤缓冲液Ⅱ（100 mM Tris-HCl，2 M尿素，pH9.0）加入上述包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力5 bar，透过通量为10 LMH，包涵体悬液被浓缩3倍后停止进液。
将7.5 L洗涤缓冲液Ⅲ（20 mM Tris-HCl，pH9.0）加入上述包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力15 bar，透过通量为30 LMH，包涵体悬液被浓缩5倍后停止进液。收集得到的包涵体经变性的SDS-PAGE凝胶电泳表明重组蛋白占包涵体总蛋白的含量为92%，包涵体收率经计算为89%。
实施例8 大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体（1公斤）的洗涤
中空纤维膜（聚醚砜材质，纤维管内径为1.75 mm，滤膜孔径为0.2μm）先用纯化水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为5 bar，透过通量为10 LMH。将15 L洗涤缓冲液Ⅰ（20 mM Tris-HCl，5% 吐温-20，pH9.0）加入大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力为5bar，透过通量为10 LMH，包涵体悬液被浓缩3倍后停止进液。
将25 L洗涤缓冲液Ⅱ（100 mM Tris-HCl，3 M盐酸胍，pH9.0）加入上述包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力15 bar，透过通量为30 LMH，包涵体悬液被浓缩5倍后停止进液。
将75 L洗涤缓冲液Ⅲ加入上述包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力15 bar，透过通量为30 LMH，包涵体悬液被浓缩5倍后停止进液。收集得到的包涵体经变性的SDS-PAGE凝胶电泳表明重组蛋白占包涵体总蛋白的含量为87%，包涵体收率经计算为88%。
实施例9 大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体（5公斤）的洗涤
中空纤维膜（聚醚砜材质，纤维管内径为1 mm，滤膜孔径为0.2 μm）先用纯化水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为15 bar，透过通量为30 LMH。将25 L洗涤缓冲液Ⅰ（20 mM Tris-HCl，5%曲拉通X-100，pH9.0）加入大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力为15 bar，透过通量为30 LMH，包涵体悬液被浓缩5倍后停止进液。
将75 L洗涤缓冲液Ⅱ（20 mM Tris-HCl，2 M尿素，pH9.0）加入上述包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力15 bar，透过通量为30 LMH，包涵体悬液被浓缩5倍后停止进液。
将75 L洗涤缓冲液Ⅲ加入上述包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进中空纤维膜，使过膜压力15 bar，透过通量为30 LMH，包涵体悬液被浓缩5倍后停止进液。收集得到的包涵体经变性的SDS-PAGE凝胶电泳表明重组蛋白占包涵体总蛋白的含量为90%，包涵体收率经计算为87%。
Claims (4)
1.一种基因工程包涵体的洗涤方法，其特征在于包括如下步骤：
a、膜平衡：取中空纤维膜，用纯化水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为5～15 bar，透过通量为10～30 LMH；
b、第一次洗涤：配制洗涤缓冲液Ⅰ，按5～15：1（V/W）加入包涵体，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进所述中空纤维膜，使过膜压力为5～15 bar，透过通量为10～30 LMH，包涵体悬液被浓缩3～5倍后停止进液，收集包涵体浓缩液；所述洗涤缓冲液Ⅰ的组成为20～100mM Tris-HCl，1～5% 曲拉通-X-100，pH9.0，或者组成为20～100mM Tris-HCl，1～5% 吐温-20，pH9.0；
c、第二次洗涤：配制洗涤缓冲液Ⅱ，按5～15：1（V/W）加入步骤b处理后的包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进所述中空纤维膜，使过膜压力为5～15 bar，透过通量为10～30 LMH，包涵体悬液被浓缩3～5倍后停止进液，收集包涵体浓缩液；所述洗涤缓冲液Ⅱ的组成为20～100 mM Tris-HCl，2～4 M 尿素，pH9.0，或者组成为20～100 mM Tris-HCl，1～3 M 盐酸胍，pH9.0；
d、第三次洗涤：配制洗涤缓冲液Ⅲ，按5～15：1（V/W）加入步骤c处理后的包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进所述中空纤维膜，使过膜压力为5～15 bar，透过通量为10～30 LMH，包涵体悬液被浓缩3～5倍后停止进液，收集包涵体浓缩液；所述洗涤缓冲液Ⅲ的组成为20～100 mM Tris-HCl，pH9.0。
2.根据权利要求1所述基因工程包涵体的洗涤方法，其特征在于：所述中空纤维膜的材质为聚醚砜、再生纤维素、醋酸纤维素或亲水性聚偏氟乙烯。
3.根据权利要求1所述基因工程包涵体的洗涤方法，其特征在于：所述中空纤维膜的纤维管内径为0.75～1.75mm。
4.根据权利要求1所述基因工程包涵体的洗涤方法，其特征在于：所述中空纤维膜的滤膜孔径为750 k、0.1 μm、0.2 μm或0.45 μm。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhao Zhiquan Inventor after: Xiong Jiyuan Inventor after: Liu Changqing Inventor after: Gao Qianqian Inventor before: Zhao Zhiquan Inventor before: Xiong Jiyuan Inventor before: Liu Changqing |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |