CN102965444A

CN102965444A - 转基因大豆a2704-12的lamp检测引物及方法

Info

Publication number: CN102965444A
Application number: CN2012105306936A
Authority: CN
Inventors: 邵碧英; 陈文炳; 曾莹; 缪婷玉; 彭娟
Original assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Fujian Entry Exit Inspection and Quarsntine Bureau
Current assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Fujian Entry Exit Inspection and Quarsntine Bureau
Priority date: 2012-12-11
Filing date: 2012-12-11
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2032-12-11
Also published as: CN102965444B

Abstract

本发明提供了一种转基因大豆A2704-12的LAMP检测引物及方法。所述LAMP检测引物如SEQIDNO：1-6，利用所述的LAMP检测引物，以Bst DNA聚合酶大片段启动环介导等温扩增，通过观察浊度，或加入显色液观察颜色变化来判定检测结果。本发明提供的一种普遍适用于基层实验室的快速、简便、准确、特异检测转基因大豆A2704-12的LAMP检测引物及方法，快速、高效、简便，扩增特异性高，保证了结果的准确性。

Description

转基因大豆A2704-12的LAMP检测引物及方法

技术领域

本发明提供了一种转基因大豆A2704-12的LAMP检测引物及方法。

背景技术

随着全球转基因产品的日益增多，以及越来越多的转基因作物特异品系获得商品化生产，检测特异性品系已成为国际上转基因成分检测的发展趋势。目前，检测转基因特异品系的方法主要有普通PCR方法和实时荧光PCR方法。普通PCR方法，具有耗时长，操作繁琐，灵敏度不够，容易产交叉污染，质控复杂，假阳性、假阴性比例偏高等缺点。实时荧光PCR方法则具有成本昂贵、技术要求高、需要大型的仪器设备等缺点，均已经不能满足食品中转基因成分的日常监管和食品生产行业内部质控的需求。因此，目前急需建立能够普遍适用于检验检疫一线的基层实验室的快速、简便、准确的转基因品系检测方法。

环介导等温扩增技术 ( loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000 年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6 个区域设计4~6 条特异引物，利用一种链置换DNA 聚合酶在等温条件(63 ℃左右) 保温30－60分钟，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物（焦磷酸镁），形成乳白色沉淀，通过观察浊度，或加入显色液观察颜色变化来判定结果。LAMP技术具有简便、高效、特异、快速等优点，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，在灵敏度、特异性能媲美甚至优于普通PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。LAMP技术在食源性致病微生物的快速检测中已得到广泛应用，但在转基因产品检测上的应用研究很少。目前，国内采用LAMP技术对转基因成分的研究尚处于起步阶段，且主要应用于启动子、外源基因的检测，极少应用于转基因品系的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种普遍适用于基层实验室的快速、简便、准确、特异检测转基因大豆A2704-12的LAMP检测引物及方法。

本发明首先提供了一种转基因大豆A2704-12的LAMP检测引物，所述LAMP检测引物如下：

外引物F3：5'-GAC ACA TCT CAT TGC ACT GA-3'

外引物B3：5'-CGA GTT CTG TTA GGT CCT CTA-3'

内引物FIP：5'-TGG CGT AAT AGC GAA GAG GCG TGA GTT ATT TAT CAG CCA AGC-3'

内引物BIP：5'-GGA TGT GCT GCA AGG CGA TTT ACA ACG TCG TGA CTG G-3'

环引物LF：5'-CCG CAC CGA CAT AAG AAG A-3'

环引物LB：5'-AAG TTG GGT AAC GCC AGG-3'。

本发明还提供了一种转基因大豆A2704-12的LAMP检测方法，利用所述的LAMP检测引物，以Bst DNA聚合酶大片段启动环介导等温扩增，通过观察浊度，或加入显色液观察颜色变化来判定检测结果。

环介导等温扩增的反应条件为：63℃温育1h，80℃保温5min；反应体系为：10 ×ThermoPol缓冲液2.5μL，10 μmol/L外引物F3 0.5μL，10 μmol/L外引物B3 0.5μL，40 μmol/L环引物LF 0.5μL，40 μmol/L环引物LB 0.5μL，40 μmol/L内引物FIP 1.0μL，40 μmol/L内引物BIP 1.0μL，10 mmol/L dNTPs 4.0μL，5 mol/L甜菜碱 6.0μL，150 mmol/L硫酸镁1.0μL，8 U/μL Bst DNA聚合酶大片段1.0μL，100 ng/μL DNA模板2.0μL，ddH₂O 4.5μL。

本发明建立的LAMP检测方法的优点：①快速、高效：扩增约1 h即可完成，且产率高；②简便：在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物-焦磷酸镁沉淀，通过观察浊度或加入显色液观察颜色变化就可判定检测结果，不需要特殊的、昂贵的仪器设备，操作非常简便；③高特异性：采用六个区段、四条或六条引物，扩增特异性高，保证了结果的准确性。

国内外还未见转基因大豆A2704-12品系的LAMP检测引物及方法的报道，本发明首次设计、筛选到了转基因大豆A2704-12品系的LAMP检测引物，并建立了LAMP检测方法。

附图说明

图1为转基因大豆A2704-12的特异序列，加框的是大豆基因组内含子，阴影的是大肠杆菌lacZ基因，加下划线的是CaMV 35S启动子。

图2为4套引物反应温度的测试结果。

A. set1引物；B. set2引物；C. set3引物；D. set4引物；1-6. 反应温度分别为：60.0℃、61.2℃、61.9℃、63.3℃、64.1℃、64.8℃。

图3为第一、三、四套引物在反应温度为60℃的特异性测定结果。

A. set1引物；B. set3引物；C. set4引物；1. ddH₂O；2. 非转基因大米；3. 非转基因小麦；4. 非转基因玉米；5. 非转基因大豆；6. 转基因大豆GTS-40-3-2品系；7. 转基因大豆Mon89788品系；8. 5％转基因大豆A2704-12品系。

图4为LAMP方法的特异性试验结果。

1. ddH₂O；2. 非转基因大米；3. 非转基因小麦；4. 非转基因玉米；5. 非转基因大豆；6. 转基因大豆DP-305423-1品系；7. 转基因大豆DP356043品系；8. 转基因大豆GTS-40-3-2品系；9. 转基因大豆Mon89788品系；10. 转基因玉米GA21品系（5%）；11. 5％A2704-12；12. 2704-12标准品。

图5为LAMP法灵敏度测定实时监控结果。

1. 5% A2704-12；2. 0.5% A2704-12；3. 0.1% A2704-12；4. 1% A2704-12；5. 0.05% A2704-12；6. 0.01% A2704-12；7. 非转基因大豆。

图6为LAMP法灵敏度测定结果。

1. 非转基因大豆；2. 0.01% A2704-12；3. 0.05% A2704-12；4. 0.1% A2704-12；5. 0.5% A2704-12；6. 1% A2704-12；7. 5% A2704-12。

图7为送检样品中A2704-12品系的LAMP检测结果。

A1~10分别为：ddH₂O、非转基因大豆、油豆腐、脱脂大豆、香干、正康鸡蛋豆奶、正康草莓豆奶、玉米种子、奶香味韩味玉米、辣味韩味玉米；B1~10分别为：玉米淀粉、大米、白粿干、米粉干、小麦、面粉、饼干、马铃薯淀粉、薯片、番茄；C1~10分别为：番茄酱、进口转基因玉米、转基因玉米酒糟粕、进口转基因油菜籽、进口转基因非种用黄大豆、美国进口转基因大豆、巴西进口转基因大豆、阿根廷进口转基因大豆、0.1% A2704-12、5% A2704-12。

具体实施方式

1 试验材料

A2704-12标准品DNA购自北京世纪奥科生物技术有限公司。非转基因大豆、油豆腐、脱脂大豆、香干、正康鸡蛋豆奶、正康草莓豆奶、玉米种子、奶香味韩味玉米、辣味韩味玉米、玉米淀粉、大米、白粿干、米粉干、小麦、面粉、饼干、马铃薯淀粉、薯片、番茄、番茄酱、进口转基因玉米、转基因玉米酒糟粕、进口转基因油菜籽、进口转基因非种用黄大豆、美国进口转基因大豆、巴西进口转基因大豆、阿根廷进口转基因大豆由本实验室收集。采用CTAB法提取试验材料的DNA，-20℃保存备用。

2 主要试剂、耗材

dNTPs溶液（每种核苷酸浓度10 mmol/L）购自厦门泰京公司；Bst DNA聚合酶大片段（8 U/μL）及10×ThermolPol缓冲液为美国NEB公司产品；甜菜碱（5mol/L）、硫酸镁溶液（1mol/L）为Sigma公司产品；SYBR Green I 荧光染料（10000×）为厦门百维信生物科技有限公司产品；LAMP专用薄壁管、稳定液购自广州华峰生物科技有限公司。

3 主要仪器与设备

冷冻混合研磨仪、涡旋仪、水浴锅、台式离心机、生物安全柜、梯度PCR仪、实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司的7500）。

4 LAMP引物的设计

用于设计转基因大豆A2704-12品系LAMP引物的序列如图1所示。委托广州迪澳生物科技有限公司设计，获得4套LAMP引物（表1）。委托上海生工公司合成所用引物。用ddH₂O将外引物稀释至10μmol/L，环引物、内引物稀释至40μmol/L，按外引物：环引物：内引物体积比为1：1：2的比例混匀内、外、环引物，作为引物混合液，分别标记为set1、set2、set3和set4。

表1 LAMP引物

Figure 2012105306936100002DEST_PATH_IMAGE002

5 模拟DNA样品的制备

取非转基因大豆样品（即空白样品0%）的DNA溶液，稀释至100ng/μL，按体积比，将含量为100%的A2704-12标准品DNA配制成含量分别为5％、1%、0.5%、0.1%、0.05%和0.01%的模拟样品DNA。

6 LAMP引物的筛选

以5％A2704-12模拟样品DNA为模板，取60℃~65℃，进行4套LAMP引物扩增效果的测试。反应体系为：甜菜碱4μL、dNTPs 3.5μL，引物混合液2μL，10×ThermolPol缓冲液2.5μL，硫酸镁（100mol/L）1μL，Bst DNA聚合酶大片段1μL，DNA模板2μL，ddH₂O调节总体积至25μL。在LAMP专用薄壁管的一侧加20μL稳定液和1μL SYBR Green I 荧光染料（1000×），另一侧（反应区）加反应混合液。反应条件：60℃~65℃，1h；80℃ 5min。

反应完成后，颠倒管子，将两侧的液体混匀、显色，立即观察结果，若反应区的混合液呈桔色（黑白显示时呈透明）的即为阴性结果，呈绿色（黑白显示时呈浑浊）的即为阳性结果。根据温度筛选结果，选定反应温度，测定选定的LAMP引物的特异性。

筛选结果如图2所示，第一套、第四套引物的6个温度均呈浑浊，即为阳性结果；而第二套引物的6个温度、第三套引物在63.3℃时均呈透明，即为阴性结果，因而放弃第二套引物进行下一步的测试。

分别以ddH₂O、非转基因大米、非转基因小麦、非转基因玉米、非转基因大豆、转基因大豆GTS-40-3-2品系、转基因大豆Mon89788品系和5％转基因大豆A2704-12品系的DNA为模板，选取第一、三、四套引物均为阳性结果的60℃为反应温度，进行这3套引物的特异性测试。结果如图3所示，第一套引物扩增非转基因大豆时也会得到阳性结果，第三套引物均为阴性结果，而第四套引物只有5％转基因大豆A2704-12品系为阳性结果。第四套引物的稳定性、特异性最好，因此选定第四套引物作为转基因大豆A2704-12品系的LAMP引物。

7 LAMP反应温度的优化

在LAMP反应体系中加入SYBR Green I 荧光染料（10×），在实时荧光定量PCR仪上进行实时监控。反应条件：60℃~65℃ 1h，80℃ 5 min。反应体系加SYBR Green I 荧光染料（10×）0.5μL，其余成分同上。重复2管。以反应曲线的出峰时间、出峰高度、重复性作为评价指标，选取适宜的反应温度。

由于第四套引物在60℃~65℃都能得到阳性结果，到底哪个温度最适宜，因此首先对反应温度进行了优化，结果显示，61℃、62℃时，2个重复的出峰时间差距较大，表明稳定性不好；60℃、63℃、64℃和65℃时，2个重复的出峰时间均较一致，而63℃时的出峰高度为最大。因此，选用63℃作为A2704-12的LAMP检测的适宜反应温度。

8 LAMP反应体系的优化

选取Mg²⁺浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度、引物用量共4个变量参数，用筛选到的引物、优化后的反应温度，进行单因素变化实验，对LAMP反应体系进行优化。Mg²⁺浓度分别为4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10mmol/L。甜菜碱浓度分别为0.6mol/L、0.8mol/L、1.0mol/L、1.2mol/L。dNTPs浓度分别为1.2mmol/L、1.4mmol/L、1.6mmol/L、1.8mmol/L。引物混合液分别取1μL、2μL、4μL。以反应曲线的出峰时间、出峰高度（以出峰时间为主）作为评价指标，对上述参数进行比较。

优化结果得出最佳参数为：Mg²⁺浓度6mmol/L、甜菜碱1.2mol/L、dNTPs 1.6mmol/L、引物混合液4μL。建立的最佳反应体系如表2所示。

表2 优化后的LAMP反应体系（25μL）

9 LAMP方法的特异性测定

选择不同转基因大豆品系、不同植物的DNA，按照优化好的反应温度、反应体系进行LAMP反应，从而验证建立的LAMP方法的特异性。结果如图4所示，仅5％A2704-12模拟样品和A2704-12标准品为阳性结果，其他均为阴性结果，表明建立的转基因大豆A2704-12品系的LAMP检测方法特异性很好，没有出现假阳性结果。

10 LAMP方法的灵敏度测定

各取2μL上述配制的模拟DNA样品，测定LAMP法的灵敏度。结果如图5、6所示，实时监控和显色的测定结果完全一致，最低限均可达到0.1%。实时监控结果（图5）显示，所有阳性结果的出峰时间均在25min之前，因此，反应时间设为60min已足够。

转基因大豆A2704012品系是允许商品化生产的、我国农业部允许进口的转基因品系。目前各国对允许商品化生产的转基因品系普遍采用标识管理，而对转基因产品管理最严的欧盟将标识的最低限量定为0.9%，即当食品中某一成分的转基因含量达到0.9%时，必须进行标识。因此，本发明建立的转基因大豆A2704012品系LAMP检测方法的灵敏度已达到目前对转基因产品进行标识的限量要求，能满足日常检测需求。

11 送检样品中A2704-12品系的LAMP检测

用建立的LAMP方法检测送检样品DNA中是否含有A2704-12品系，结果如图7所示，除阳性对照（0.1% A2704-12、5% A2704-12）外，仅进口转基因非种用黄大豆、美国进口转基因大豆、巴西进口转基因大豆、阿根廷进口转基因大豆中检出A2704-12品系，而市场流通的黄大豆（即非转基因大豆）及豆制品、其他作物及其制品中均未检出A2704-12品系。

<110> 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 转基因大豆A2704-12的LAMP检测引物及方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gacacatctc attgcactga 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgagttctgt taggtcctct a 21

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggcgtaata gcgaagaggc gtgagttatt tatcagccaa gc 42

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggatgtgctg caaggcgatt tacaacgtcg tgactgg 37

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccgcaccgac ataagaaga 19

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aagttgggta acgccagg 18

Claims

1.一种转基因大豆A2704-12的LAMP检测引物，其特征在于：所述LAMP检测引物如下：

外引物F3：5'-GAC ACA TCT CAT TGC ACT GA-3'

外引物B3：5'-CGA GTT CTG TTA GGT CCT CTA-3'

内引物FIP：5'-TGG CGT AAT AGC GAA GAG GCG TGA GTT ATT TAT CAG CCA AGC-3'

内引物BIP：5'-GGA TGT GCT GCA AGG CGA TTT ACA ACG TCG TGA CTG G-3'

环引物LF：5'-CCG CAC CGA CAT AAG AAG A-3'

环引物LB：5'-AAG TTG GGT AAC GCC AGG-3'。

2.一种转基因大豆A2704-12的LAMP检测方法，其特征在于：利用权利要求1所述的LAMP检测引物，以BstDNA聚合酶大片段启动环介导等温扩增，通过观察浊度，或加入显色液观察颜色变化来判定检测结果。

3.根据权利要求2所述的转基因大豆A2704-12的LAMP检测方法，其特征在于：环介导等温扩增的反应条件为：63℃温育1h，80℃保温5min；反应体系为：10 ×ThermoPol缓冲液2.5μL，10 μmol/L外引物F3 0.5μL，10 μmol/L外引物B3 0.5μL，40 μmol/L环引物LF 0.5μL，40 μmol/L环引物LB 0.5μL，40 μmol/L内引物FIP 1.0μL，40 μmol/L内引物BIP 1.0μL，10 mmol/L dNTPs 4.0μL，5 mol/L甜菜碱 6.0μL，150 mmol/L硫酸镁1.0μL，8 U/μL Bst DNA聚合酶大片段1.0μL，100 ng/μL DNA模板2.0 μL，ddH₂O 4.5μL。