CN108715905A - 一组桑花叶型萎缩病的lamp检测引物及试剂盒 - Google Patents

一组桑花叶型萎缩病的lamp检测引物及试剂盒 Download PDF

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CN108715905A CN201810559352.9A CN201810559352A CN108715905A CN 108715905 A CN108715905 A CN 108715905A CN 201810559352 A CN201810559352 A CN 201810559352A CN 108715905 A CN108715905 A CN 108715905A
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Abstract

本发明公开了一组桑花叶型萎缩病、桑花叶型萎缩病病毒和/或桑花叶型萎缩病病毒REP基因的LAMP检测引物组，所述引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～6所示｡进一步根据此LAMP检测引物组建立了桑花叶型萎缩病、桑花叶型萎缩病病毒和/或桑花叶型萎缩病病毒REP基因的检测方法和检测试剂盒。本发明的制备得到的引物及其试剂盒检测特异性和灵敏性都很优异，比以REP基因为靶基因的PCR检测方法灵敏度高一个数量级，针对感染桑花叶型萎缩病病毒的桑叶所提的DNA都能够很特异清晰的检测出来，而且耗费时间较短，这对桑园桑树病害中桑花叶型萎缩病的快速检测具有重要意义。

Description

一组桑花叶型萎缩病的LAMP检测引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及植物病害检测技术领域，更具体地，涉及一组桑花叶型萎缩病的LAMP检测引物及试剂盒
背景技术
桑在蚕桑产业发展和变革中，有着基础性的地位，起着先导性的作用。随着桑产业的转型，在桑树资源的综合利用及桑树产业的不断开发和桑全基因组测序完成，全面开展功能基因研究的背景下，桑树的基础研究将成为桑产业发展和创新的重要支撑。
桑花叶型萎缩病作为最重要的桑树病毒病之一，在我国各蚕区发生较普遍且危害严重。该病对桑叶的产量影响非常大，由于杂交桑品种的大面积栽植，使桑花叶型萎缩病的发病面积猛增，危害严重。
桑花叶型萎缩病为多症状病害，初春至夏初期间，其症状表现有皱缩、花叶、环状叶、网状叶(沿脉绿色)和丝状叶5种。桑花叶型萎缩病的发生与温度的关系密切，每年早春当气温上升到15℃以上时，桑花叶型萎缩病的环斑症状便开始出现，20℃～24℃是环斑症状发病的高峰期。25℃～28℃则是花叶、丝状叶和网状等症状发病的高峰期。当温度升高至28℃以上时，桑花叶型萎缩病桑的各种症状消失，具有明显的高温隐症现象。
在桑病毒病病原的鉴定上，由于病毒小、难分离、不可培养等特点，使它在柯赫式法则验证上存在困难，以至延缓桑病毒病研究进展。桑病毒病的防控主要靠隔离病原，由于桑病毒病存在潜隐现象，在不适宜的条件不会产生病症，难以辨别没有症状的桑叶是否携带病原，很难隔离防控。
环介导等温扩增法(Loop mediated isothermal amplification,LAMP)是日本学者Notomi等(2000)发明的一种新型体外等温扩增特异核酸片段的技术。LAMP法具有特异性强、快速、高效、敏感性高、操作简便、检测方法简单等优点,肉眼即可判断结果,从而简化了检测过程,检测时间也大大缩短,已广泛应用于农、林、牧、渔、食品以及人类疾病的诊断研究中。
LAMP技术在在病毒的检测上应用非常广泛。利用LAMP技术对双生病毒进行检测已有报道，但利用LAMP技术检测桑树病毒的研究至今还没有开展，桑花叶型萎缩病相关病毒为双生病毒的一个新种，其LAMP检测还需进一步研究。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有检测桑树中是否感染桑花叶型萎缩病病毒技术的不足，以桑花叶型萎缩病病毒REP基因为靶基因设计LAMP检测引物用于检测桑树桑花叶型萎缩病病毒，提供一种比PCR检测方法更加简单和快速的检测方法。
本发明的第一个目的是提供一组桑花叶型萎缩病、桑花叶型萎缩病病毒和/或桑花叶型萎缩病病毒REP基因的LAMP检测引物组。
本发明的第二个目的是提供一种桑花叶型萎缩病、桑花叶型萎缩病病毒和/或桑花叶型萎缩病病毒REP基因LAMP检测的试剂盒。
本发明的第三个目的是提供一种桑花叶型萎缩病、桑花叶型萎缩病病毒和/或桑花叶型萎缩病病毒REP基因的LAMP检测方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明公开了一组用于桑花叶型萎缩病病毒检测的LAMP引物组，是以REP基因序列为靶基因设计REP F/R引物，使用该PCR引物验证靶基因的特异性，结果表明该引物具有特异性，再以该引物为参考，REP基因为靶基因设计多组LAMP引物，根据LAMP引物的设计原则以及各组引物的扩增序列位置筛选出3组LAMP引物，然后根据引物的有效性实验进一步筛选出一组即6条特异性引物作为LAMP检测用引物,即外侧引物REP F3/REP B3和内侧引物REP FIP/REPBIP；同时在只有6条特异性引物完全识别靶基因的6个区域的情况下，才能进行扩增,从而保证了其对桑花叶型萎缩病病毒REP基因扩增的特异性和检测的全面性。
因此，本发明要求保护一组桑花叶型萎缩病、桑花叶型萎缩病病毒和/或桑花叶型萎缩病病毒REP基因的LAMP检测引物组，所述引物组包括一对外侧引物REP F3/REP B3、一对内侧引物REP FIP/REP BIP和一对环引物REP LF/REP LB，所述引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～6所示。
其中，REP F3(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)：
5＇-ACACATTTAGGAAAAGTGCTTTA-3＇；
REP B3(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)：
5＇-AATTTGTTACAGAAGGACTCC-3＇；
REP FIP(F1c+F2)(核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)：
5＇-CTCTCTTATCACGTTTTCCATTTCA AAGGGAAAAGAGCTCGGA-3＇；
REP BIP(B1c+B2)(核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)：
5＇-TGAGGATTTGAAACGGGAAGAACATAATACTACCACCCACCGA-3＇；
REP LF(核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)：
5＇-GGTCGGGCATTACCAGTTTC-3＇；
REP LB(核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)：
5＇-TCTTCTCAACGCTTGCAACAG-3＇。
优选地，所述引物的浓度比例F3/B3:LF/LB:FIP/BIP为1：2：6。
以上所述LAMP检测引物组在制备桑花叶型萎缩病、桑花叶型萎缩病病毒和/或桑花叶型萎缩病病毒REP基因检测试剂盒和/或检测桑花叶型萎缩病、桑花叶型萎缩病病毒和/或桑花叶型萎缩病病毒REP基因方面的应用。
一种桑花叶型萎缩病、桑花叶型萎缩病病毒和/或桑花叶型萎缩病病毒REP基因LAMP检测的试剂盒，包含以上所述引物组，可以对样品进行LAMP检测。
优选地，还包括LAMP检测所需试剂；所述LAMP检测是基于显色法、琼脂糖凝胶电泳法或实时荧光PCR法。
优选地，当所述试剂盒是基于显色法或琼脂糖凝胶电泳法时，所述LAMP检测所需试剂为2×反应缓冲液、阳性对照品、阴性对照品、显色液、Bst DNA聚合酶、密封液和无菌水；当所述试剂盒是基于实时荧光PCR法时，所述LAMP检测所需试剂为2×反应缓冲液、阳性对照品、阴性对照品、荧光染色液、Bst DNA聚合酶、密封液和无菌水。
优选地，所述2×反应缓冲液的组分如下：20mM Tris-HCl，pH8.8、10mM KCl、2mMMgSO4、20mM(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、2.8mM dNTPs、1M甜菜碱、25mM MgCl2。
优选地，所述阳性对照品为核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的DNA片段，或含有核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的DNA片段的重组质粒，
优选地，所述显色液为核苷酸胶体染料(Green-DNA Dye)或荧光指示剂1×SYBRGreen I。
优选地，所述密封液为石蜡油。
优选地，所述试剂盒的反应体系如下：
当检测结果的判定采用显色法或琼脂糖凝胶电泳法时，反应体系为：
2×反应缓冲液12.5μL，引物REP F3/REP B3、REP FIP/REP BIP和REP LF/REP LB混合液1μL，Bst DNA聚合酶8U/μL 1μL，模板DNA 2μL，ddH2O 8μL，显色液2μL；
当检测结果的判定采用实时荧光法时，反应体系为：
2×反应缓冲液12.5μL；引物REP F3/REP B3、REP FIP/REP BIP和REP LF/REP L混合液B 1μL；Bst DNA聚合酶8U/μL 1μL；荧光指示剂0.5μL；模板DNA 2μL；ddH2O 8μL；
其中，所述引物混合液中的引物REP F3/REP B3的浓度为5pmol/μL,引物REP FIP/REP BIP的浓度为40pmol/μL,引物REP LF/REP LB为20pmol/μL。
优选地，所述试剂盒的LAMP反应条件为：63℃恒温反应20～60min。
优选地，所述试剂盒的LAMP反应条件为：63℃恒温反应60min。
最优选地，所述试剂盒包括一对外侧引物REP F3/REP B3、一对内侧引物REP FIP/REP BIP和一对环引物REP LF/REP LB，所述引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～6所示；2×反应缓冲液，阳性对照品，阴性对照品，Bst DNApolymerase(8U/μL)，密封液，显色液(10000×SYBR Green I)，荧光指示剂(1×SYBR Green I)；灭菌ddH2O；
其中，REP F3(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)：
5＇-ACACATTTAGGAAAAGTGCTTTA-3＇；
REP B3(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)：
5＇-AATTTGTTACAGAAGGACTCC-3＇；
REP FIP(F1c+F2)(核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)：
5＇-CTCTCTTATCACGTTTTCCATTTCA AAGGGAAAAGAGCTCGGA-3＇；
REP BIP(B1c+B2)(核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)：
5＇-TGAGGATTTGAAACGGGAAGAACATAATACTACCACCCACCGA-3＇；
REP LF(核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)：
5＇-GGTCGGGCATTACCAGTTTC-3＇；
REP LB(核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)：
5＇-TCTTCTCAACGCTTGCAACAG-3＇。
其中，阳性对照品为含有核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的DNA片段，或含有核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的DNA片段的重组质粒；
阴性对照品为健康桑树基因组DNA。
所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1.提取待测样品的模板DNA；
S2.配置反应体系：按照下述反应体系进行配置，并不加入模板DNA；
当检测结果的判定采用显色法或琼脂糖凝胶电泳法时，所述试剂盒的反应体系为：
当检测结果的判定采用实时荧光法时，反应体系为：
其中，所述引物REP F3/REP B3的浓度为5pmol/μL，引物REP FIP/REP BIP的浓度为40pmol/μL，REP LF/REP LB的浓度为20pmol/μL。
其中，REP F3(SEQ ID NO：1所示)：
5＇-ACACATTTAGGAAAAGTGCTTTA-3＇；
REP B3(SEQ ID NO：2所示)：
5＇-AATTTGTTACAGAAGGACTCC-3＇；
REP FIP(F1c+F2)(SEQ ID NO：3所示)：
5＇-CTCTCTTATCACGTTTTCCATTTCA AAGGGAAAAGAGCTCGGA-3＇；
REP BIP(B1c+B2)(SEQ ID NO：4所示)：
5＇-TGAGGATTTGAAACGGGAAGAACATAATACTACCACCCACCGA-3＇；
REP LF(SEQ ID NO：5所示)：
5＇-GGTCGGGCATTACCAGTTTC-3＇；
REP LB(SEQ ID NO：6所示)：
5＇-TCTTCTCAACGCTTGCAACAG-3＇。
使用试剂盒时，对于N个样品，应配制(N+3)倍体积的反应体系(包括阴性对照、阳性对照各一个，以及分装耗费)，保证各反应管分装均匀。
S3.加样：反应体系分装后，分别依次向反应管加入2μL的ddH2O(空白对照)、各模板DNA、阳性对照品；然后加入20μL密封液，对于显色法判定结果，要在反应管管盖内侧加入1μL显色液，因为液体的张力，显色液液滴会吸附在管盖内侧上，轻轻将管盖盖紧；
S4.反应：对于显色法和琼脂糖凝胶电泳法判定结果的检测，将反应管置于恒温水浴箱或其他恒温设备中，63℃恒温放置20～60min，然后95℃，放置2min灭活；对于实时荧光法判定结果的检测，将反应管放入Deaou-308C恒温荧光检测仪或其他荧光检测仪中，63℃恒温放置20～60min观察结果；
S5.结果判读：结果判读可以有显色法(显色法)、琼脂糖凝胶电泳法和实时荧光法：
(1)显色法：反应时间结束后，将反应管上下摇晃，使得吸附于管盖内侧的显色液与反应产物混合；在自然光下通过肉眼观察颜色变化，反应产物颜色变为绿色,说明待测样品含有桑花叶型萎缩病；反应产物变为橙色，则不含有桑花叶型萎缩病。
(2)琼脂糖凝胶电泳法：取1μL反应后的产物，与1μL 6×loading buffer和8μLddH2O混合，于1％琼脂糖凝胶电泳；若出现大小不等的众多梯形条带,说明待测样品含有桑花叶型萎缩病；若无大小不等的众多梯形条带，说明待测样品不含有桑花叶型萎缩病。
(3)实时荧光法：若有“S”型扩增曲线且扩增值超过设定的阈值为阳性，若扩增曲线的扩增值未超过设定的阈值则为阴性。
其中，步骤S1所述待测样品，病叶DNA的制备方法(DINGGUO公司植物DNA提取试剂盒)：
(1)剪取桑花叶型萎缩病病叶病症部位，使用ddH2O将表面清洗干净；
(2)将清洗干净的病叶移至预冷的研钵中，液氮充分研磨(3次以上)；
(3)将研磨后的病叶放入1.5mL离心管中，加入400μL裂解缓冲液和4μL RNase A，涡旋混匀(400μL裂解缓冲液和4μL RNase A勿在使用前混合)；
(4)混匀后的溶液，65℃，孵育10min(期间上下颠倒试管2～3次)；
(5)加130μL缓冲液P3，混合后冰浴5min，然后14,000rpm，离心5min；
(6)吸取上清于过滤柱中，14,000rpm，离心2min；
(7)将离心管中上清液移至新的回收管(勿搅动出现的残渣)，加入1.5倍体积的缓冲液AW1，移液器混合；
(8)将650μL混合液移至硅胶吸附柱中，4,200rpm，离心1min，剩下的液体重复此步骤；
(9)将硅胶吸附柱放入新收集管中，加入500μL缓冲液AW，4,200rpm,离心1min，弃上清；
(10)再加入500μL缓冲液AW，14,000rpm，离心2min(保证收集管不接触到底部上清)；
(11)移吸附柱至1.5mL或2mL离心管中；
(12)加入40μL洗脱缓冲液AE,室温放置5min，4,200rpm，1min；
(13)重复步骤S12，-20℃冰箱保存备用。
一种桑花叶型萎缩病、桑花叶型萎缩病病毒和/或桑花叶型萎缩病病毒REP基因的LAMP检测方法，利用以上所述LAMP检测引物组对样品进行LAMP反应。
优选地，所述LAMP反应条件为：63℃恒温反应20～60min。
优选地，所述LAMP反应条件为：63℃恒温反应60min。
优选地，所述反应体系中引物的浓度比例F3/B3:LF/LB:FIP/BIP为1：2：6。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用该LAMP引物组进一步建立了桑花叶型萎缩病病毒的LAMP快速检测方法及试剂盒，以6条LAMP引物、LAMP试剂和显色液或荧光染色液等,构成检测反应体系，在63℃的恒温条件下，快速扩增模板DNA，能够检测浓度为5.0×10-4ng/μL的阳性重组质粒4q-pEASY-Bblunt，对桑花叶型萎缩病病毒的检测具有重要的意义。本发明的制备得到的引物及其试剂盒检测特异性和灵敏性都很优异，针对感染桑花叶型萎缩病病毒的桑叶所提的DNA都能够很特异清晰的检测出来，而且耗费时间较短，这对桑园桑树病害中桑花叶型萎缩病的快速检测具有重要意义。
附图说明
图1为PCR引物及本发明初选的三组LAMP引物组在病毒基因上的位置示意图和为本发明的6条LAMP引物在靶基因序列上的位置示意图。
图2为本发明桑花叶型萎缩病LAMP快速检测法检测引物不同浓度比例的结果(琼脂糖凝胶电泳法检测结果)；M：DL500DNA Marker；1：浓度比例1：2：6；2：浓度比例1：2：8；3：浓度比例1：2：10；4：ddH2O。
图3为本发明桑花叶型萎缩病LAMP快速检测法检测引物不同浓度比例的结果(显色法检测结果)；1：浓度比例1：2：6；2：浓度比例1：2：8；3：浓度比例1：2：10；4：ddH2O。
图4为本发明桑花叶型萎缩病LAMP快速检测法检测引物不同浓度比例的结果(实时荧光法检测结果)；A1：浓度比例1：2：6；A2：浓度比例1：2：8；A3：浓度比例1：2：10；A4：ddH2O。
图5为本发明桑花叶型萎缩病LAMP快速检测法检测11个地区病叶的结果(琼脂糖凝胶电泳法检测结果)；M：DL500DNA Marker；1-11：阳山，华农桑园，阳春，海南，罗定，化州，重庆，英德，广州，顺德，江苏；12：阳性质粒；13：健康桑叶；14：ddH2O。
图6为本发明桑花叶型萎缩病LAMP快速检测法检测11个地区病叶的结果(显色法检测结果)；1-11：阳山，华农桑园，阳春，海南，罗定，化州，重庆，英德，广州，顺德，江苏；12：阳性质粒；13：健康桑叶；14：ddH2O。
图7为本发明桑花叶型萎缩病LAMP快速检测法检测11个地区病叶的结果(实时荧光法检测结果)；A1-B3：阳山，华农桑园，阳春，海南，罗定，化州，重庆，英德，广州，顺德，江苏；B4：阳性质粒；B5：健康桑叶；B6：ddH2O。
图8为本发明桑花叶型萎缩病LAMP快速检测法检测桑花叶型萎缩病病毒灵敏度；M：DL1000DNA Marker；1-5：5*10-1ng/μL、5×10-2ng/μL、5×10-3ng/μL、5×10-4ng/μL、5×10-5ng/μL；6：ddH2O。(琼脂糖凝胶电泳法检测结果)
图9为本发明桑花叶型萎缩病LAMP快速检测法检测桑花叶型萎缩病病毒灵敏度(显色法检测结果)；M：DL1000DNA Marker；1-5：5*×10-1ng/μL、5×10-2ng/μL、5×10-3ng/μL、5×10-4ng/μL、5×10-5ng/μL；6：ddH2O。
图10为本发明桑花叶型萎缩病LAMP快速检测法检测桑花叶型萎缩病病毒灵敏度(实时荧光法检测结果)；M：DL1000DNA Marker；1-5：5×10-1ng/μL、5×10-2ng/μL、5×10- 3ng/μL、5×10-4ng/μL、5×10-5ng/μL；6：ddH2O。
图11为两条以Rep为靶基因的PCR引物检测桑花叶型萎缩病病毒灵敏度的电泳图，M：DL1000DNA Marker；1-5：5×10-1ng/μL、5×10-2ng/μL、5×10-3ng/μL、5×10-4ng/μL、5×10-5ng/μL；CK：ddH2O。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1引物设计
一、实验步骤
1、根据实验室通过全基因组测序方法并通过克隆测序方法验证的桑花叶型萎缩病病毒全长基因(Accession number:NC_026771.1)序列，通过BLAST软件进行同源性分析，本发明以本实验室经过克隆测序方法验证的NC_026771.1全长基因为靶基因设计了一组全长扩增PCR引物：引物4q2599F/4q2599R。从而构建阳性质粒4q-pEASY-Bblunt作为阳性对照。该阳性质粒包含REP基因。
引物4q2599F的序列为：
5＇-GAGCTCGTTCCTGCGGCAAATCA-3＇(SEQ ID NO：7所示)
引物4q2599R的序列为：
5＇-GAGCTCACTCCTCGGGCACCTAC-3＇(SEQ ID NO：8所示)
2、以REP基因为LAMP引物设计的靶基因，设计多组LAMP引物，根据LAMP引物的设计原则以及各组引物的扩增序列位置筛选出3组LAMP引物，即引物组Ⅰ、引物组Ⅱ和引物组Ⅲ。
(1)引物组Ⅰ6条引物序列为：
1F3：5＇-CAAACCAAAGAACCGGAAG-3＇；
1B3：5＇-TTGAGAACTTGAAACCGTTC-3＇；
1FIP：5’-ACAGCCTGACAATGTGATAAGAATTTTAATGGAATAAACATTAGGGGA-3＇；
1BIP：5＇-GGTCGGAACCGGTGTCTTTCTTCTTCACCATCGCTGTC-3＇；
1LF：5＇-GTGGAATGGTTCCTGGATTCC-3＇；
1LB：5＇-GGCCCAAGGTCGAGTTTGG-3＇。
(2)引物组Ⅱ6条引物序列为：
2F3：5＇-TGATTACCAGGAGCTCTGCT-3＇；
2B3：5＇-GTTTCACTGGGCCCAACG-3＇；
2FIP：5＇-GACTCGAACAGTCCTGGGCCTCTGAGATCAAGGCGGGGA-3＇；
2BIP：5＇-GGTTGCAAGTGCCATGCGAACGGCCGTCTCTTCCTTCTTG-3＇；
2LF：5＇-TGGGCCTCCGTGGAATG-3＇；
2LB：5＇-GAAGAGGCCCAAGGTCGA-3＇。
(3)引物组Ⅲ6条引物序列为：
REP F3(SEQ ID NO：1所示)：
5＇-ACACATTTAGGAAAAGTGCTTTA-3＇；
REP B3(SEQ ID NO：2所示)：
5＇-AATTTGTTACAGAAGGACTCC-3＇；
REP FIP(F1c+F2)(SEQ ID NO：3所示)：
5＇-CTCTCTTATCACGTTTTCCATTTCA AAGGGAAAAGAGCTCGGA-3＇；
REP BIP(B1c+B2)(SEQ ID NO：4所示)：
5＇-TGAGGATTTGAAACGGGAAGAACATAATACTACCACCCACCGA-3＇；
REP LF(SEQ ID NO：5所示)：
5＇-GGTCGGGCATTACCAGTTTC-3＇；
REP LB(SEQ ID NO：6所示)：
5＇-TCTTCTCAACGCTTGCAACAG-3＇。
二、实验结果
引物4q2599F/4q2599R的扩增产物经过测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
根据引物的有效性实验，又考虑了各种因素并结合实验结果的判断，进一步筛选出引物组Ⅲ的6条特异性引物作为LAMP检测用引物，该引物组在靶基因序列上的位置示意图如附图2所示。
实施例2一种检测叶病原桑花叶型萎缩病病毒的检测方法
检测步骤如下：
S1.提取待测样品的模板DNA；
S2.配置反应体系：按照下述反应体系进行配置，并不加入模板DNA；
当检测结果的判定采用显色法或琼脂糖凝胶电泳法时，所述试剂盒的反应体系为：
当检测结果的判定采用实时荧光法时,反应体系为:
其中，所述引物REP F3/REP B3的浓度为5pmol/μL,引物REP FIP/REP BIP的浓度为40pmol/μL，REP LF/REP LB的浓度为20pmol/μL。
其中，REP F3(SEQ ID NO：1所示)：
5＇-ACACATTTAGGAAAAGTGCTTTA-3＇；
REP B3(SEQ ID NO：2所示)：
5＇-AATTTGTTACAGAAGGACTCC-3＇；
REP FIP(F1c+F2)(SEQ ID NO：3所示)：
5＇-CTCTCTTATCACGTTTTCCATTTCA AAGGGAAAAGAGCTCGGA-3＇；
REP BIP(B1c+B2)(SEQ ID NO：4所示)：
5＇-TGAGGATTTGAAACGGGAAGAACATAATACTACCACCCACCGA-3＇；
REP LF(SEQ ID NO：5所示)：
5＇-GGTCGGGCATTACCAGTTTC-3＇；
REP LB(SEQ ID NO：6所示)：
5＇-TCTTCTCAACGCTTGCAACAG-3＇。
使用试剂盒时，对于N个样品，应配制(N+3)倍体积的反应体系(包括阴性对照、阳性对照各一个，以及分装耗费)，保证各反应管分装均匀。
S3.加样：反应体系分装后，分别依次向反应管加入2μL的ddH2O(空白对照)、各模板DNA、阳性对照品；然后加入20μL密封液,对于显色法判定结果，要在反应管管盖内侧加入1μL显色液，因为液体的张力，显色液液滴会吸附在管盖内侧上，轻轻将管盖盖紧；
S4.反应：对于显色法和琼脂糖凝胶电泳法判定结果的检测，将反应管置于恒温水浴箱或其他恒温设备中，63℃恒温放置20～60min，然后95℃，放置2min灭活；对于实时荧光法判定结果的检测，将反应管放入Deaou-308C恒温荧光检测仪或其他荧光检测仪中，63℃恒温放置20～60min观察结果；
S5.结果判读：结果判读可以有显色法(显色法)、琼脂糖凝胶电泳法和实时荧光法：
(1)显色法：反应时间结束后，将反应管上下摇晃，使得吸附于管盖内侧的显色液与反应产物混合；在自然光下通过肉眼观察颜色变化，反应产物颜色变为绿色,说明待测样品含有桑花叶型萎缩病；反应产物变为橙色，则不含有桑花叶型萎缩病。
(2)琼脂糖凝胶电泳法：取1μL反应后的产物，与1μL 6×loading buffer和8μLddH2O混合，于1％琼脂糖凝胶电泳；若出现大小不等的众多梯形条带,说明待测样品含有桑花叶型萎缩病；若无大小不等的众多梯形条带，说明待测样品不含有桑花叶型萎缩病。
(3)实时荧光法：若有“S”型扩增曲线且扩增值超过设定的阈值为阳性，若扩增曲线的扩增值未超过设定的阈值则为阴性。
其中，步骤S1所述待测样品，病叶DNA的制备方法(DINGGUO公司植物DNA提取试剂盒)：
(1)剪取桑花叶型萎缩病病叶病症部位，使用ddH2O将表面清洗干净；
(2)将清洗干净的病叶移至预冷的研钵中，液氮充分研磨(3次以上)；
(3)将研磨后的病叶放入1.5mL离心管中，加入400μL裂解缓冲液和4μLRNase A，涡旋混匀(400μL裂解缓冲液和4μL RNase A勿在使用前混合)；
(4)混匀后的溶液，65℃，孵育10min(期间上下颠倒试管2～3次)；
(5)加130μL缓冲液P3，混合后冰浴5min，然后14,000rpm，离心5min；
(6)吸取上清于过滤柱中，14000rpm，离心2min；
(7)将离心管中上清液移至新的回收管(勿搅动出现的残渣)，加入1.5倍体积的缓冲液AW1，移液器混合；
(8)将650μL混合液移至硅胶吸附柱中，4200rpm，离心1min，剩下的液体重复此步骤；
(9)将硅胶吸附柱放入新收集管中，加入500μL缓冲液AW，4,200rpm,离心1min，弃上清；
(10)再加入500μL缓冲液AW，14000rpm，离心2min(保证收集管不接触到底部上清)；
(11)移吸附柱至1.5mL或2mL离心管中；
(12)加入40μL洗脱缓冲液AE，室温放置5min，4200rpm，1min；
(13)重复步骤S12，-20℃冰箱保存备用。
实施例3一种检测叶病原桑花叶型萎缩病病毒试剂盒制备
一、制备阳性和阴性对照品
用上游引物4q2599F和下游引物4q2599R为反应引物，以桑花叶型萎缩病病毒DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物克隆入pMD-19T载体获得4q-pEASY-Bblunt质粒并作为检测的阳性对照品。
提取的健康桑叶DNA作为阴性对照品。
二、其他试剂
(1)2×反应缓冲液
组分如下：20mM Tris-HCl，pH8.8；10mM KCl；2mM MgSO4；20mM(NH4)2SO4；0.1％Triton X-100；2.8mM dNTPs；1M甜菜碱；25mM MgCl2。
(2)显色液核苷酸胶体染料(Green-DNA Dye)(或荧光指示剂1×SYBR Green I)、Bst DNA聚合酶、密封液石蜡油和无菌水。
三、试剂盒组成
按照一定的规格，将以下组分进行分装：用引物组REP F3/REP B3作为外部引物和REP FIP/REP BIP作为内部引物和REP LF/REP LB作为环引物(REP F3/REP B3的浓度为5pmol/μL，REP FIP/REP BIP的浓度为40pmol/μL，REP LF/REP LB的浓度为20pmol/uL)，2×反应缓冲液，阳性对照品，阴性对照品，Bst DNA polymerase(8U/μL)，密封液，显色液(10000×SYBR Green I)或荧光指示剂(1×SYBR Green I)；灭菌ddH2O。
其中，REP F3(SEQ ID NO：1所示)：
5＇-ACACATTTAGGAAAAGTGCTTTA-3＇；
REP B3(SEQ ID NO：2所示)：
5＇-AATTTGTTACAGAAGGACTCC-3＇；
REP FIP(F1c+F2)(SEQ ID NO：3所示)：
5＇-CTCTCTTATCACGTTTTCCATTTCA AAGGGAAAAGAGCTCGGA-3＇；
REP BIP(B1c+B2)(SEQ ID NO：4所示)：
5＇-TGAGGATTTGAAACGGGAAGAACATAATACTACCACCCACCGA-3＇；
REP LF(SEQ ID NO：5所示)：
5＇-GGTCGGGCATTACCAGTTTC-3＇；
REP LB(SEQ ID NO：6所示)：
5＇-TCTTCTCAACGCTTGCAACAG-3＇。
其中，阳性对照品为含有核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的DNA片段，或含有核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的DNA片段的重组质粒；
阴性对照品为健康桑树基因组DNA。
以上即为桑花叶型萎缩病的LAMP快速检测试剂盒的所有检测试剂。
四、试剂盒的使用方法同实施例2。
实施例4应用检测叶病原桑花叶型萎缩病病毒试剂盒检测桑叶病原桑花叶型萎缩病病毒
一、不同引物浓度比例阳性对照品检测
1、实验操作
利用实施例3制备得到的检测叶病原桑花叶型萎缩病病毒试剂盒，对不同浓度的阳性对照(实施例1制备得到的重组质粒4q-pEASY-Bblunt)进行检测，
2、实验结果
本发明的引物最佳浓度比例如附图2～4所示。图中，M为DL500 DNA Marker；1-3号管分别为1：2：6，1：2：8，1：2：10；4为ddH2O空白对照。
结果显示，本发明的引物及其试剂盒最佳的引物浓度F3/B3：LF/LB：FIP/BIP比例为1：2：6。
二、检测灵敏度
1、实验操作
(1)利用实施例3制备得到的检测叶病原桑花叶型萎缩病病毒试剂盒，对不同浓度的阳性对照(实施例1制备得到的重组质粒4q-pEASY-Bblunt)进行检测。并提供PCR引物检测结果作为对照。
(2)利用实施例3制备得到的检测叶病原桑花叶型萎缩病病毒试剂盒，对不同地区病叶进行检测。
2、实验结果
(1)对不同地区病叶进行检测，结果如附图5～7所示。图中，M为DL500 DNAMarker；1-11号管分别为不同地区病叶的DNA；12为实施例1制备得到的含有Rep基因重组质粒4q-pEASY-Bblunt；13为健康桑叶桑树DNA；14为ddH2O空白对照。
结果显示，本发明的引物及其试剂盒检测特异性和灵敏性都很优异，比以REP基因为靶基因的PCR检测方法灵敏度高一个数量级，针对感染桑花叶型萎缩病病毒的桑叶所提的DNA都能够很特异清晰的检测出来。
(2)不同浓度的阳性对照的检测结果如附图8～10所示。图中，M为DL500 DNAMarker；1-5分别为：5.0×100ng/μL、5.0×10-1ng/μL、5.0×10-2ng/μL、5.0×10-3ng/μL、5.0×10-4ng/μL、5.0×10-5ng/μL；6为ddH2O空白对照。
结果显示，本发明的引物及其试剂盒能够检测浓度为5.0×10-4ng/μL的包含实施例1制备得到的含有Rep基因重组质粒4q-pEASY-Bblunt。
综上所述，本发明的引物及其试剂盒对桑花叶型萎缩病的检测灵敏度较优异且耗费时间较短，这对桑园桑树病害中桑花叶型萎缩病的快速检测具有重要意义。
对比例PCR法检测叶病原桑花叶型萎缩病病毒
一、实验操作
根据实验室通过全基因组测序方法并通过克隆测序方法验证的桑花叶型萎缩病病毒全长基因(Accession number:NC_026771.1)序列，通过BLAST软件进行同源性分析，本发明以该Rep基因为靶基因设计了一组PCR引物：引物Rep F/Rep R。
引物Rep F的序列为：
5＇-CCA TTGACGACTT ACGAATAG-3＇(SEQ ID NO：9所示)
引物Rep R的序列为：
5＇-CTTACCGACGCAACAGAC-3＇(SEQ ID NO：10所示)
使用上述PCR引物Rep F/Rep R检测浓度梯度的阳性质粒，检测其PCR引物灵敏度。
二、实验结果
引物Rep F/Rep R(序列)检测浓度梯度的阳性质粒，检测结果如图11所示。图中，M为DL1000DNA Marke；1-5分别：5.0×100ng/μL、5.0×10-1ng/μL、5.0×10-2ng/μL、5.0×10- 3ng/μL、5.0×10-4ng/μL、5.0×10-5ng/μL；CK为ddH2O空白对照。
结果显示，PCR引物能够检测浓度为5.0×10-3ng/μL的包含实施例1制备得到的含有Rep基因重组质粒4q-pEASY-Bblunt。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一组桑花叶型萎缩病的LAMP检测引物及试剂盒
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acacatttag gaaaagtgct tta 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aatttgttac agaaggactc c 21
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctctcttatc acgttttcca tttcaaaggg aaaagagctc gga 43
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgaggatttg aaacgggaag aacataatac taccacccac cga 43
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtcgggcat taccagtttc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcttctcaac gcttgcaaca g 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gagctcgttc ctgcggcaaa tca 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gagctcactc ctcgggcacc tac 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccattgacga cttacgaata g 21
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cttaccgacg caacagac 18
<210> 11
<211> 2954
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gagctcgttc ctgcggcaaa tcaaagaaat taggatttct tgtttctaat tttttgtcca 60
attggacaat agcatgaaaa tgactattgt catctttatg tttttcttca gctacacagg 120
catacttgac tgtgtatgaa ttaagaattt ggagtaaatg ggacatgacc caagtaatag 180
attcgggaca ttgagggaat gtgaggaaaa catttttagc agccaacctg aagttagaat 240
ttgaagccat tttatagaag ggaaggagta ggaagccgta cgaagaaggg agagtaagga 300
ttcaataggg aaggagggat tggtggcagc ggcaaatgag cgagggggcc ttatataata 360
ttacagcccc ctcgcttagt ggcgccacgt ggcgcccgtg gattggcccc gaaggggccc 420
accattaatt gcgccgaagg cgcaatgtga acccgacaaa aggaggcggc cgacaaaaga 480
aaaagaaaaa gaaaaagaaa aaggaaaagg gaaaagttaa agcagattcg ccgacagttt 540
ttaaaagtgg gacccacgaa taattattaa agaggttgct tgcgcagcaa gtaaccgacg 600
agctataaat acccccccgg ccctataatt tttaaaatgt ctgagtattg cgaacttgcc 660
gaagacagta agtactgtac aacgatttta attgttcaat ttattgttat tgccctagcc 720
attctcagtt atgtctttgt ggagtaccaa attaggagag ttgcctcaga gcttgcaagg 780
ctgcgtaatt atgctagcct gcaagcaatt aatggcaatg gaagaccaaa tcctgagcca 840
gaaaatagac atgagaaccg agaccggatt cgagacttca gtggaccact tggtccacct 900
tactcagtgc cgtagacttt tgagactgat aagacgtttt tctagggtaa aggatcgtgc 960
tgcagttaat ggcgattacc aggagctctg ctctgagatc aaggcgggga tggaaccccg 1020
gaaccatccc acggaggccc agaactgctc gagtcacacg ggttgcaagt gttatgcgaa 1080
ccccgtggag aagaagaggc ccaaggtcga gtttggccag aaggaagaga cggcccataa 1140
acgcgttggg cccagtgaaa cgtggaacct ttggaattaa attagccagt ataaatcata 1200
ctggtggtaa tgggtatcat ttgacccatt ttgaccatgg ggatgacaca aaccaaagaa 1260
ccggaagaaa aataaaaatt aatggaatta atattagggg taaaatatat ctaaataatc 1320
ccaggactaa ttcgtatcat attgttaggt tgtggataat cagggatacc agaccgggct 1380
cggaaccggt gtcgttcagc tcgttcatgg acatgcacga caacgagccg atgacagcca 1440
tggtgaagaa ggactgggga gaacggtttc aagttctcaa ggatctgacc tttcatttag 1500
tgggagccaa tggtttatca ttcaacgaag acgtggtcga ggagtatttt aaatttaagg 1560
gatatgtttt gtataatcac gaggattccg gatccttggc caatgtactt gagaatggca 1620
tttttttgta tgcagcaacg tcgcatcctt ctgagaatgt gactctgact gctaattgtc 1680
gtgtgtattt ttatgacgca gaataagtaa taaagtttat aatttttttt tcagattaag 1740
ttgaatgttt tcaaggagaa aaaaagagaa aaaggatgcc ggagtctccc gacgattgga 1800
cgatcatacc tctggatggg agtccccaaa gtcaggagga tatgaatccg gatccgttgg 1860
atttaattat ggtacagatg gaagaagtaa ttcacaatct gagcttaata gaacagcgat 1920
tgaacgtgca gttagagctg ttatccctgt tactgggtcg ggagttttgt cccggccaga 1980
acagtgggaa agaggaaccc ccccaaggga agcagaagaa agacttaaag aaacgcagag 2040
gagattagat gaagaatttg aaaaggttgt tttttcatta atagttctaa tagaatttat 2100
caccagcaga catgtaataa actaatacat tatcatcgaa ccatggttta agtgtacttg 2160
ccatccgtac aacccaatcc atgtcttcat taactaatac aatacaagga ataccaccac 2220
taatacgaaa atccttcata tatttgccct taagaataat atctttttga gcacctagta 2280
atgatttaaa ccaagaagta ctaatctttt cgtactcaat atcatcaatt acattatata 2340
aagcaaaatc gtcataatct aaaaaactta aacttccggt aaaataatta tgtctcccta 2400
aagatctggc ccactgtgtc ttgccggatc tggttggtcc acagatgtag aggctgatgg 2460
gcctgtcggg cttggactcg ggctcctgtt gcacatatat tgttgaggaa cagttaagcc 2520
cacttcccac caaaaatcat catgacatct ataacacaaa acagaatcgg cccattgacg 2580
acttacgaat agaatattgt ccttggccca ttgcttaata ggttcaggta ggcccgggaa 2640
gtcagtccac cggggaaggt aaggaatact tcttcggcgg taatggtctc gagcgaaacc 2700
ggtaattgac ggccatcgga gaacgtagtc ctgtggtctt cgttctcgga caagggcgag 2760
gaaggactcc tcgtctgttg ccaaggtaag gatctctcca aagatcttct cagcgcttgc 2820
aacaggactt cgtcctcgtg tgttaaattc cccgtgttca atgaagtgac cctccttctg 2880
gatatatttt ctgacggccg ccggcgagga acatttctgg acgttcggat ggtaggtgcc 2940
cgaggagtga gctc 2954

Claims (10)

1.一组桑花叶型萎缩病的LAMP检测引物组，其特征在于，所述引物组包括一对外侧引物REP F3/REP B3、一对内侧引物REP FIP/REP BIP和一对环引物REP LF/REP LB，所述引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～6所示。
2.权利要求1所述LAMP检测引物组在检测桑花叶型萎缩病、桑花叶型萎缩病病毒和/或桑花叶型萎缩病病毒REP基因和/或制备桑花叶型萎缩病、桑花叶型萎缩病病毒和/或桑花叶型萎缩病病毒REP基因检测试剂盒方面的应用。
3.一种桑花叶型萎缩病的LAMP检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述引物组。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，还包括LAMP检测所需试剂；所述LAMP检测是基于显色法、琼脂糖凝胶电泳法或实时荧光PCR法。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，当所述试剂盒是基于显色法或琼脂糖凝胶电泳法时，所述LAMP检测所需试剂为2×反应缓冲液、阳性对照品、阴性对照品、显色液、BstDNA聚合酶、密封液和无菌水；当所述试剂盒是基于实时荧光PCR法时，所述LAMP检测所需试剂为2×反应缓冲液、阳性对照品、阴性对照品、荧光染色液、Bst DNA聚合酶、密封液和无菌水。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述2×反应缓冲液的组分如下：20mMTris-HCl，pH8.8、10mM KCl、2mM MgSO4、20mM(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、2.8mM dNTPs、1M甜菜碱、25mM MgCl2。
7.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有核苷酸序列如SEQID NO：11所示的DNA片段，或含有核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的DNA片段的重组质粒。
8.根据权利要求3～7任一所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的LAMP反应条件为：63℃恒温反应20～60min。
9.一种桑花叶型萎缩病的LAMP检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述LAMP检测引物组对样品进行LAMP反应。
10.根据权利要求9所述检测方法，其特征在于，所述LAMP反应条件为：63℃恒温反应60min。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114164301A (zh) * 2021-12-20 2022-03-11 中国农业科学院植物保护研究所 桑花叶型矮缩相关双生病毒的lamp检测引物组及其可视化检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104372081A (zh) * 2014-10-29 2015-02-25 华南农业大学 一组家蚕蚕卵微孢子虫的lamp检测引物及试剂盒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104372081A (zh) * 2014-10-29 2015-02-25 华南农业大学 一组家蚕蚕卵微孢子虫的lamp检测引物及试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU,J. AND YAN,Y.: "Nosema bombycis isolate GD1 septin 3 mRNA, partial cds", 《NCBI GENBANK》 *
MA,Y.等: "Mulberry mosaic dwarf associated virus isolate AK1-8, complete genome", 《GENBANK》 *
马宇欣: "桑花叶型萎缩病病原的鉴定", 《万方 中国学位论文全文数据库》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114164301A (zh) * 2021-12-20 2022-03-11 中国农业科学院植物保护研究所 桑花叶型矮缩相关双生病毒的lamp检测引物组及其可视化检测方法
CN114164301B (zh) * 2021-12-20 2024-04-30 中国农业科学院植物保护研究所 桑花叶型矮缩相关双生病毒的lamp检测引物组及其可视化检测方法

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