CN102949716A - 利用生物反应器制备兽用狂犬病灭活疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用生物反应器制备兽用狂犬病灭活疫苗的方法，其是利用生物反应器和Cytodex-1微载体系统，用抗原性好的CTN-1株(aG株或PV株)狂犬病毒，对狂犬病毒CTN-1株(aG株或PV株)适应的高密度Vero细胞(或BHK细胞)进行病毒感染，使传统病毒收获期6-9天延长至11-15天，病毒滴度从10^5-7LD₅₀/ml提高到10^8-9LD₅₀/ml，病毒含量提高10～1000倍。将收获的病毒液灭活后，加入佐剂定量分装即可获得高质量的疫苗成品。制得的疫苗安全、有效，生产工艺稳定，质量可控。

Description

利用生物反应器制备兽用狂犬病灭活疫苗的方法

技术领域

本发明涉及一种疫苗的制备方法，具体地说，涉及一种利用生物反应器制备兽用狂犬病灭活疫苗的方法。

背景技术

狂犬病俗称“恐水症”，是由狂犬病毒引起的人兽共患中枢神经系统传染病，临床表现以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁等为主要特征，是迄今为止人类唯一病死率高达100％的急性传染病。《中华人民共和国传染病防治法》将狂犬病列为乙类传染病。

近年来我国犬、猫的饲养量快速增加，被犬、猫伤害的人数也不断增加。根据我国人用狂犬病疫苗的使用量，估计全国每年被动物伤害的人数超过4000万人。狂犬病死亡人数占过去三年传染病死亡人数的30％。

2008年1月18日，农业部和卫生部联合发文要求加强狂犬病疫苗免疫接种工作。在狂犬病疫苗品种的使用上，此前采用的是弱毒苗，在使用一段时期后，由于弱毒苗固有的弱点，其使用范围受到限制。

目前我国狂犬病弱毒苗的生产存在手工操作密集，病毒株受限，细胞维持时间短，密度及活性低等问题，限制了产品产量、质量的提高且不利于降低生产成本。利用生物反应器技术培养狂犬病毒，用于制备疫苗逐渐受到人们的重视，

发明内容

本发明旨在克服已有的兽用狂犬病灭活疫苗制备方法中存在的不足，提供一种新型的、安全、有效的兽用狂犬病灭活疫苗的制备方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种利用生物反应器制备兽用狂犬病灭活疫苗的方法，其是利用生物反应器和Cytodex-1微载体系统，用抗原性好的狂犬病毒株对密度为1～7×10⁶/ml的该狂犬病毒株适应的Vero细胞或BHK细胞(优选Vero细胞)进行病毒感染，培养条件为34±2℃，pH值7～8，收获病毒培养液上清至细胞完全脱落为止，然后对收获的病毒液进行超滤浓缩和病毒灭活；其中，所述抗原性好的狂犬病毒株为狂犬病毒CTN-1株、aG株或PV株，优选CTN-1株。

前述的方法，其中狂犬病毒CTN-1株、aG株或PV株对Vero细胞或BHK细胞进行病毒感染的接种比例为0.03～0.3M.O.I。

优选地，使用β-丙内酯灭活病毒，使用量为β-丙内酯∶病毒液(v∶v)＝0.1-2∶4000，更优选地，β-丙内酯∶病毒液(v∶v)＝1∶4000。

前述的方法，其还包括最后向病毒灭活液中加入氢氧化铝胶和硫柳汞的步骤。优选地，氢氧化铝胶和硫柳汞的终浓度分别为0.1-0.9mg/ml和0.1mg/ml。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明利用生物反应器和Cytodex-1微载体系统，用抗原性好的CTN-1株(aG株或PV株)狂犬病毒，对狂犬病毒CTN-1株(aG株或PV株)适应的高密度Vero细胞(或BHK细胞)进行病毒感染，收获病毒液，使传统病毒收获期6-9天延长至11-15天，病毒滴度从10^5-7LD₅₀/ml提高到10^8-9LD₅₀/ml，病毒含量提高10～1000倍。将收获的病毒液灭活后，加入佐剂定量分装即可获得高质量的疫苗成品。制得的疫苗安全、有效，生产工艺稳定，质量可控。另外，与传统生产工艺相比，本发明改进了培养系统的氧传递方式，减少了剪切力，降低有害代谢废物浓度，由于此培养方式可模拟空间中的微重力环境，使培养物的重力向量在旋转过程中产生随机化，导致一定程度的重力降低，使细胞处于一种模拟自由落体状态，以此模拟微重力环境。由于没有搅拌剪切力影响，细胞可以在相对温和的环境中进行三维生长，同时在动物细胞培养过程中，葡萄糖代谢和谷氨酰胺代谢密切相关。通过控制葡萄糖和谷氨酰胺浓度可控制乳酸和氨等有害代谢物的产生浓度，可有效控制细胞生长状况。大规模培养高密度宿主细胞，细胞密度可达7×10⁶/ml，这种成本低、易于操作的细胞能量代谢转移研究方法，为实现高密度、高产率的细胞培养优化工艺提供了广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明方法制得的狂犬病疫苗的动物学免疫实验结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中使用的非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)购自ATCC，Cytodex-1微载体购自Amersham公司，狂犬病毒CTN-1株购自中国药品生物制品检定所。

实施例1狂犬病毒CTN-1株适应的Vero细胞传代扩增培养

将狂犬病毒CTN-1株毒种按0.5％的比例接种于Vero细胞，置34.0±2.0℃培养，收获上清液，冻存，并按相同方法在Vero细胞上连续传代。采用小鼠脑内接种法测定病毒滴度达到10⁸LD₅₀/ml以上，说明CTN-1株病毒对Vero细胞敏感。

实施例2利用生物反应器和Cytodex-1微载体系统进行Vero细胞培养

生物反应器工作体积10L～500L，Cytodex-1微载体系统使用10g/L，细胞密度由5×10⁵递增到5～7×10⁶。

实施例3接种狂犬病毒CTN-1株对Vero细胞进行病毒感染

CTN-1株狂犬病毒感染Vero细胞后，根据测定培养基(含有1-5％牛血清的标准MEM培养基)中葡萄糖浓度、乳酸盐浓度、谷氨酰胺、耗氧速率以及pH值指标来控制Vero细胞的生长；病毒培养温度34.0±2.0℃，pH值7～8，溶氧10-100％，搅拌速度10～100转/分。

实施例4病毒液的超滤浓缩、灭活及疫苗成品的制备

接毒后开始收获含有狂犬病毒的培养液，采用100-300kDa超滤膜包进行超滤浓缩，按0.1-2ml/4000ml病毒液的量加入β-丙内酯进行灭活。然后，向病毒灭活液中加入终浓度为0.1-0.9mg/ml氢氧化铝胶和0.1mg/ml硫柳汞，充分摇匀，经灌装后即为狂犬病灭活疫苗成品。

实施例5本发明兽用狂犬病灭活疫苗的制备

1 病毒与细胞：

用于制备狂犬病灭活疫苗的病毒株为具有良好抗原性的CTN-1株，以对该病毒株具有良好敏感性的细胞系Vero细胞，作为制苗用细胞系，以感染并大量繁殖狂犬病毒。

2 毒种制备：

将制备疫苗用的细胞系Vero细胞接种到含10％新生牛血清的标准MEM培养基中，Cytodex 1微载体浓度为10g/L，在温度：37.0±2.0℃，pH值7-8，搅拌速度40转/分条件下培养。待微载体上的Vero细胞长成单层，弃去生长液，按0.5％的比例接种基础毒种，在34.0±2.0℃条件下进行培养，接种病毒后收获上清液。采用小鼠脑内接种法测定病毒滴度大于10^8.0LD₅₀/ml，表明病毒适应Vero细胞，按照上述方法进行病毒传代，病毒滴度均大于10^8.0LD₅₀/ml，即完成狂犬病毒适应Vero细胞的传代，可用于建立病毒基础毒种和生产毒种。

3 连续的细胞培养：

Vero细胞接种到装有浓度为10g/L的Cytodex 1微载体的生物反应器中，采用含有10％牛血清的标准MEM培养基培养7天，温度：37.0±2.0℃，pH值7-8，溶氧10-100％，搅拌速度10～100转/分。

4 连续收获感染病毒：

Vero细胞中接种0.5％比例的生产用毒种，采用含有2-5％牛血清的标准MEM培养基，于34.0±2.0℃，pH为7-8，溶氧10-100％，搅拌速度10～100转/分培养，连接程序控制软件，通过计算机在线监控。接种病毒后开始收获上清液，直至细胞完全脱落为止。收获液病毒含量可达10^8.0LD₅₀/ml以上。

5 病毒浓缩灭活：

每批收获病毒液澄清后，超滤浓缩，按1ml/4000ml病毒液的量加入β-丙内酯。在4℃下灭活病毒24小时，将灭活后的病毒置于37℃水解2h彻底降解β-丙内酯。

6 成品配置分装：

浓缩灭活后的狂犬病毒液，加入终浓度为0.1-0.9mg/ml氢氧化铝胶和0.1mg/ml硫柳汞，制备成液体疫苗成品。

制备的5批疫苗经过效力检定(NIH方法)，效价均大于2.0IU/头份，符合疫苗质量标准。

除了以上实施例中使用的狂犬病毒CTN-1株，还可使用狂犬病毒aG株或PV株作为制备狂犬病灭活疫苗的病毒株；除了Vero细胞，还可使用BHK细胞作为制苗用细胞系。

实施例6本发明兽用狂犬病灭活疫苗的安全性评价

共免疫不少于10000只犬进行安全性试验，免疫剂量为单剂量免疫(1ml/只)或超剂量免疫(2ml/只)，免疫程序为两针免疫(分别于0天、14天各免疫1次)和1针免疫，含4种大型犬，9种中型犬，9种小型犬，怀孕犬和泌乳犬；并设置阴性空白对照犬，不接种疫苗。试验犬为3～72月龄，使用5批疫苗进行免疫。

安全性试验结果为：1、5批疫苗免疫试验犬中有极个别犬出现轻度不良反应，主要现象多为出现注射部位轻微疼痛，稍稍发红，并且在免疫后1～2天内全部自行消失，没有影响犬的正常活动。没有发生重度以上不良反应；2、接种部位没有出现糜烂、硬结等不良反应；病理检查提示狂犬病灭活疫苗对试验犬脏器无明显病理性损伤作用。5批疫苗试验犬与阴性对照组犬安全性无明显差异。说明此疫苗安全可靠。

实施例7本发明兽用狂犬病灭活疫苗的动物学免疫实验

共免疫不少于10000只试验犬，分别在第0天和第14天免疫，每次免疫剂量为1ml/头份(1ml/只)，包含4种大型犬，9种中型犬，9种小型犬，怀孕犬和泌乳犬。试验犬为3～72月龄，免疫使用的疫苗为5批疫苗。

免疫效果(图1)：

1、免疫中试疫苗受试犬，免疫前抗体检测均为阴性。

2、抗体阴性受试犬，免疫疫苗后7天即可产生抗体，21天中和抗体水平均达到0.5IU/ml(WHO推荐的保护性中和抗体水平)以上，血清阳转率为100％；免疫后390天中和抗体结果为仍保持80％以上在保护性抗体水平以上。阴性对照犬狂犬病毒中和抗体一直为阴性。

以上结果表明各批次疫苗免疫犬抗体水平一致，批间差异小，且抗体水平均高于国际公认的保护性抗体水平(0.5IU/ml)。狂犬病灭活疫苗(CTN-1株)安全、有效，抗体产生期早，免疫有效保护率高，可达到80％以上。免疫期长，可达12个月以上。

工艺上使用β-丙内酯灭活，可降低灭活剂残留。使用铝胶作为佐剂，可降低副反应发生率，符合我国目前狂犬病疫苗的标准要求。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种利用生物反应器制备兽用狂犬病灭活疫苗的方法，其特征在于，其是利用生物反应器和Cytodex-1微载体系统，用抗原性好的狂犬病毒株对密度为1～7×10⁶/ml的该狂犬病毒株适应的Vero细胞或BHK细胞进行病毒感染，培养条件为34±2℃，pH值7～8，收获病毒培养液上清至细胞完全脱落为止，然后对收获的病毒液进行超滤浓缩和病毒灭活；

其中，所述抗原性好的狂犬病毒株为狂犬病毒CTN-1株、aG株或PV株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，狂犬病毒CTN-1株、aG株或PV株对Vero细胞或BHK细胞进行病毒感染的接种比例为0.03～0.3M.O.I。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其是利用生物反应器和Cytodex-1微载体系统，用狂犬病毒CTN-1株对密度为1～7×106/ml的狂犬病毒CTN-1株适应的Vero细胞进行病毒感染。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，病毒灭活使用的灭活剂为β-丙内酯，使用量为β-丙内酯∶病毒液(v∶v)＝0.1-2∶4000。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，β-丙内酯∶病毒液(v∶v)＝1∶4000。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其还包括向病毒灭活液中加入氢氧化铝胶和硫柳汞。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，氢氧化铝胶和硫柳汞的终浓度分别为0.1-0.9mg/ml和0.1mg/ml。

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