CN102905723A - 抗fgfr2抗体 - Google Patents

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Abstract

披露了结合并且抑制人类FGFR2的生物活性的单克隆抗体。这些抗体可以用以治疗细胞增殖性疾病和紊乱，包括某些形式的与FGFR2的激活或者过表达相关的癌症。

Description

抗FGFR2抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2010年5月11日提交的美国临时申请序列号61/333,590的权益和优先权，其内容以其全文结合在此。
发明领域
本发明的领域涉及分子生物学、免疫学以及肿瘤学。更具体地，该领域是结合人类FGFR2的抗体。
背景
成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2），也称为BEK、BFR-1、CD332、CEK3、CFD1、ECT1、FLJ98662、JWS、KGFR（还称为FGFR2(IIIb)）、K-SAM、TK14、以及TK25，是四种高度保守的受体酪氨酸激酶（FGFR1、FGFR2、FGFR3以及FGFR4）之一，通过结合FGF介导成纤维细胞生长因子（FGF）信号。该FGF受体的特征是具有两个或者三个胞外免疫球蛋白样结构域（IgD1、IgD2以及IgD3）、一个单跨膜结构域以及一个胞质酪氨酸激酶结构域。FGF配体结合诱导FGF受体二聚作用和酪氨酸自磷酸化作用，导致细胞增殖、分化并迁移（Turner（特纳）等人，(2010)，NATURE REVIEWS CANCER（癌症自然评论），10:116-129；Beenken（宾肯）等人，(2009)，NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY（自然评论：药物发现），8:235-254；Gomez(戈麦斯)-Roman(罗曼)等人，(2005)，CLIN.CANCER RES.（临床癌症研究），11:459-65；Chang（常）等人，(2005)，BLOOD（血液），106:353-6；Eswarakumar（埃斯瓦拉库马）等人，(2005)，CYTOKINEGROWTHFACTOR REV.（细胞因子和生长因子评论），16:139-49）。
在IgD3结构域中的可变剪接产生FGFR1、FGFR2以及FGFR3的IIIb亦或IIIc同型物。该FGFR4基因仅表达为IIIc同型物。FGF受体的不同的同型物显示出组织特异性表达，并且它们响应于18哺乳动物FGF的不同的谱（Beenken（宾肯）等人，如以上）。在硫酸乙酰肝素肝素蛋白聚糖的存在下，结合FGF到FGFR上诱导在特异性的胞内酪氨酸残基上的FGFR的自磷酸化作用。这致使适配子分子，例如FGFR底物2α（FRS2α）的磷酸化作用，该磷酸化作用募集其他的蛋白，从而激活不同的信号级联放大，包括该丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路以及该磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）/Akt通路（Beenken（宾肯）等人，如以上；Eswarakumar（埃斯瓦拉库马）等人，如以上；Turner（特纳）等人，如以上）。
已经提出，失调的信号可以直接驱动癌症细胞的增殖，促进癌症干细胞的生存，并支持肿瘤血管生成（Turner（特纳）等人，如以上）。FGFR2信号在癌症中似乎发挥着作用。在FGFR2基因上的错义突变发生在不同的癌症中，包括子宫内膜癌（Pollock（波洛克）等人，2007，ONCOGENE（癌基因），26:7158-7162；Dutt（杜特）等人，2008，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA（美国科学院院刊），105:8713-8717）；、卵巢癌、乳癌、肺癌（Greenman（格林曼）等人，2007，Nature（自然），446:153-158；Ding（丁）等人，2008，NATURE（自然），455:1069-1075；Davies（戴维斯）等人，2005，CANCER RES.（癌症研究），65:7591-7595）以及胃癌（Jang（蒋）等人，2001，CANCER RES.（癌症研究），61:3541-3543）。这些激活突变中的一些在骨骼机能紊乱的患者中也有报道（Dutt（杜特）等人，如以上）。两项独立的全基因组关联研究已经将在该FGFR2基因中的特异性单核苷酸多态性（SNPs）与乳癌的易感性的增加结合起来（Easton(伊斯顿)等人，2007，NATURE(自然),447:1087-1093；Hunter(亨特)等人，2007，NAT.GENET.（自然遗传学），39:870-874）。这些癌症相关的SNPs显示出了提升的FGFR2基因表达（Meyer（迈耶）等人，2008，PLOS BIOL.（科学公共图书馆-生物），6:e108）。位于人类染色体10q26上的FGFR2基因，在乳癌的一个亚群中被扩增（Adnane（阿达尼）等人，1991，ONCOGENE（癌基因），6:659-663；Turner（特纳）等人，2010，ONCOGENE（癌基因），29:2013-2023）以及胃癌（Hara（哈拉）等人，1998，LAB.INVEST.(实验室研究),78:1143-1153；Mor(摩尔)等人，1993，CANCER GENET.CYTOGENET.（癌症遗传学和细胞遗传学），65:111-114）。
天然发生的抗体是包含四个多肽链的多亚基蛋白（图1）。多肽链的其中两条称作免疫球蛋白重链（H链），并且多肽链的其中两条称作免疫球蛋白轻链（L链）。这些免疫球蛋白重和轻链是通过一个链间二硫键而被连接的。这些免疫球蛋白重链是通过链间二硫键而被连接的。轻链由一个可变区（图1中的VL）以及一个恒定区（图1中的CL）构成。重链由一个可变区（图1中的VH）以及至少三个恒定区（图1中的CH1、CH2以及CH3）构成。这些可变区决定该抗体的特异性。天然发生的抗体已经被用作用于工程抗体的起始材料，例如嵌合抗体与人源化抗体。
每一可变区包含三个高可变区，这些高可变区已知为互补决定区（CDR），两侧有四个已知为骨架区（FR）的相对保守区域。这三个CDR（称作CDR1、CDR2以及CDR3）构成抗体结合特异性。
鼠因为小鼠与人类FGFR2之间的高度同源性，所以已经难于产生特异性针对人类FGFR2的抑制性抗体。具体地，鼠小鼠与人类FGFR2的配体结合结构域共享约98%的序列一致性（Wei（魏）等人，2006，HYBRIDOMA(杂交瘤),25:115-124）。因此，对于可以用作治疗剂的改进de FGFR2抗体存在需要。
发明概述
本发明基于一个特异性结合人类FGFR2的抗体家族的发现。这些抗体包含基于特异性结合FGFR2的抗体的多个CDR的FGFR2结合位点。当用作治疗剂时，这些抗体是经工程化的（例如，人源化的）以降低或消除给药于人类患者时的免疫反应。
本发明的这些抗体阻止或抑制人类FGFR2的激活（即，中和）。本发明的这些抗体可以用以体外地或体内地抑制肿瘤细胞的增殖。当给药于人类癌症患者（或动物模型）时，这些抗体抑制或降低人类患者（或动物模型）中的肿瘤生长。
本发明的这些和其他方面以及优势通过以下的图、详细描述以及权利要求来进行说明。如在此使用的，“包括”是指没有限制，并且引用的实例是非限制性的。
附图说明
参考以下附图可以更完全地理解本发明。
图1（现有技术）是一个典型抗体的示意性图示。
图2是一个图表，总结了通过FGF2(●)、FGF7
Figure BDA00002377645200041
FGF9(□)以及FGF10(x)，来自用来测量表达FGFR2-IIIb的FDCP-1细胞的增殖刺激的实验的结果。
图3是一个图表，总结了通过FGF2(●)、FGF7
Figure BDA00002377645200042
FGF9(□)以及FGF10(x)，来自用来测量表达FGFR2-IIIc的FDCP-1细胞的增殖刺激的实验的结果。
图4是一个图表，总结了通过用抗体4B9处理，来自用来测量表达野生型FGFR2-IIIb(□)、野生型FGFR2-IIIc
Figure BDA00002377645200043
或者截短的FGFR2-IIIb
Figure BDA00002377645200044
的FDCP-1细胞的增殖抑制的实验的结果。
图5是一个图表，总结了通过用抗体4B9处理，来自用来测量表达野生型FGFR2-IIIb(□)、FGFR2-IIIb S252W(■)、或者FGFR2-IIIb N550K(▲)的FDCP-1细胞的增殖抑制的实验的结果。
图6是一个图表，总结了，通过用2mg/kg（在此也称为“mpk”）(○)、5mpk(Δ)、10mpk(x)或者20mpk(*)的抗体4B9处理，来自用来测量SNU-16异种移植肿瘤的生长抑制的实验的结果，其中20mpk(◆)的mIgG用作阴性对照。
图7是一个图表，总结了来自用来测量抗体4B9(○)对FGFR2扩增的乳癌细胞系MFM（鼠的IgG(◆)）的体内生长的影响的实验的结果。
图8是一个示意图，展示了完整鼠4B9(SEQ ID号：2)的免疫球蛋白重链可变区的以及表示为Hu4B9-65(SEQ ID号：35)和Hu4B9-82,-83(SEQ ID号：37)的完整人源化重链可变区的氨基酸序列。每一重链可变区的氨基酸序列针对彼此进行比对，并且互补决定序列（CDR）（Kabat定义）、CDR1、CDR2以及CDR3在方框中得以鉴别。未加以方框的序列表示骨架（FR）序列。
图9是一个示意图，展示了针对示于图8中的每一可变区域序列的CDR1、CDR2以及CDR3序列（Kabat定义）。
图10是一个示意图，展示了完整鼠4B9(SEQ ID号：4)的免疫球蛋白轻链可变区的以及表示为Hu4B9-65(SEQ ID号：40)、Hu4B9-82,-83(SEQ ID号：44)和Hu4B9-83(SEQ ID NO:46)的完整人源化轻链可变区的氨基酸序列。对于每一氢链可变区的氨基酸序列针对彼此进行比对，并且CDR1、CDR2以及CDR3序列（Kabat定义）在方框中得以鉴别。未加以方框的序列表示骨架（FR）序列。
图11是一个示意图，展示了针对示于图10中的每一可变区域序列的CDR1、CDR2以及CDR3序列（Kabat定义）。
图12是一个图表，总结了通过用抗体4B9(□)、Hu4B9-65(▲)、Hu4B9-82
Figure BDA00002377645200051
以及Hu4B9-83(◆)处理，来自用来测量表达野生型FGFR2-IIIb的FDCP-1细胞的增殖抑制的实验的结果。
详细描述
本发明的这些FGFR2抗体是基于一个单克隆抗体的抗原结合位点，这个单克隆抗体基于它们中和人类FGFR2多肽的生物活性而被选择。这些抗体包含免疫球蛋白可变区CDR序列，这些序列限定一个针对人类FGFR2的结合位点。
由于这些抗体的中和活性，它们对于抑制某些癌症细胞以及肿瘤的生长和/或增殖是有用的。这些抗体可以工程化以最小化或消除当给药于人类患者时的免疫反应。在下面更详细讨论本发明的不同的特征和方面。
如在此使用的，除非另有指明，术语“抗体”意为一个完整的抗体（例如：一个完整的单克隆抗体）或一个抗体的抗原结合片段（例如，一个单克隆抗体的抗原结合片段），包括已经过修饰、工程化或化学接合的完整抗体或抗原结合片段。已经过修饰或工程化的抗体的实例是嵌合抗体、人源化抗体以及多特异性抗体（例如双特异性抗体）。抗原结合片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链抗体（例如，scFv）以及双体抗体（diabodies）。一个接合至毒素部分的抗体是化学接合抗体的一个实例。
结合人类FGFR2的抗体
本发明的抗体包括：(a)一个包括CDRH1-CDRH2-CDRH3结构的免疫球蛋白重链可变区以及(b)一个包括CDRL1-CDRL2-CDRL3结构的免疫球蛋白轻链可变区，其中该重链可变区和该轻链可变区一起限定一个用于结合人类FGFR2的单结合位点。
如在此披露的，一个抗体可以包括：(a)一个包括CDRH1-CDRH2-CDRH3结构的免疫球蛋白重链可变区以及(b)免疫球蛋白轻链可变区，其中该重链可变区和该轻链可变区一起限定一个用于结合人类FGFR2的单结合位点。一个包括选自下组的一个氨基酸序列的CDRH1，该组由以下各项组成：SEQ ID号：5(4B9;Hu4B9-65;Hu4B9-82,-83)、SEQ ID号：7(4B9;Hu4B9-65)、与SEQ ID号：47(Hu4B9-82,-83)；一个包括选自下组的一个氨基酸序列的CDRH2，该组由以下各项组成：SEQ ID号：6(4B9;Hu4B9-65)与SEQ ID号：38(Hu4B9-82,-83)；以及一个包括选自下组的一个氨基酸序列的CDRH3，该组由以下各项氨基酸序列组成：FDY(4B9;Hu4B9-65;Hu4B9-82,-83)与SEQ ID号：11(4B9;Hu4B9-65;Hu4B9-82,-83)。贯穿该说明书，一个具体的SEQ ID号后跟的括号里是为那一序列起源的抗体。例如，“SEQ ID号：47(Hu4B9-82,-83)”意为SEQ ID号：47来自名称是Hu4B9-82,-83的人源化抗体4B9。
在一些实施方案中，该重链可变区包括：一个包括SEQ ID号：5或SEQID号：7(4B9;Hu4B9-65;Hu4B9-82,-83)的氨基酸序列的CDRH1，一个包括SEQ ID号：6(4B9;Hu4B9-65)的氨基酸序列的CDRH2，以及一个包括SEQID号：11(4B9;Hu4B9-65;Hu4B9-82,-83)的氨基酸序列的CDRH3。
在一些实施方案中，该重链可变区包括：一个包括SEQ ID号：5（4B9;Hu4B9-65;Hu4B9-82,-83）或SEQ ID号：47(Hu4B9-82,-83)的氨基酸序列的CDRH1，一个包括SEQ ID号：38(Hu4B9-82,-83)的氨基酸序列的CDRH2，以及一个包括SEQ ID号：11(4B9;Hu4B9-65;Hu4B9-82,-83)的氨基酸序列的CDRH3。
优选地，这些CDRH1、CDRH2以及CDRH3序列插入在多个人类或人源化免疫球蛋白FR之间。该抗体可以是一个完整的抗体或一个抗原结合抗体片段。
在其他的实施方案中，该抗体包括(a)一个包括CDRL1-CDRL2-CDRL3结构的免疫球蛋白轻链可变区以及(b)一个免疫球蛋白重链可变区，其中该IgG轻链可变区和该IgG重链可变区一起限定一个用于结合人类FGFR2的单结合位点。一个包括选自下组的一个氨基酸序列的CDRL1，该组由以下各项组成：SEQ ID号：12(4B9)与SEQ ID号：41(Hu4B9-65;Hu4B9-82;Hu4B9-83)；一个包括选自下组的一个氨基酸序列的CDRL2，该组由以下各项组成：SEQ ID号：13(4B9)与SEQ ID号：42(Hu4B9-65;Hu4B9-82;Hu4B9-83)；以及一个包括选自下组的一个氨基酸序列的CDRL3，该组由以下各项组成：SEQ ID号：14(4B9;Hu4B9-65;Hu4B9-82;Hu4B9-83)。
在一些实施方案中，该轻链可变区包括一个包括SEQ ID号：12(4B9)的氨基酸序列的CDRL1；一个包括SEQ ID号：13(4B9)的氨基酸序列的CDRL2；以及一个包括SEQ ID号：14(4B9;Hu4B9-65;Hu4B9-82;Hu4B9-83)的氨基酸序列的CDRL3。
在一些实施方案中，该轻链可变区包括：一个包括SEQ ID号：41(Hu4B9-65;Hu4B9-82;Hu4B9-83)的氨基酸序列的CDRL1；一个包括SEQ ID号：42(Hu4B9-65;Hu4B9-82;Hu4B9-83)的氨基酸序列的CDRL2；以及一个包括SEQ ID号：14(4B9;Hu4B9-65;Hu4B9-82;Hu4B9-83)的氨基酸序列的CDRL3。
优选地，这些CDRL1、CDRL2以及CDRL3序列是插入在多个人类或人源化免疫球蛋白FR之间。该抗体可以是一个完整的抗体或一个抗原结合抗体片段。
在一些实施方案中，该抗体包括：(a)一个包括CDRH1-CDRH2-CDRH3结构的免疫球蛋白重链可变区以及(b)一个包括CDRL1-CDRL2-CD RL3结构的免疫球蛋白轻链可变区，其中该重链可变区和该轻链可变区一起限定一个结合人类FGFR2的单结合位点。该CDRH1是一个选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID号：5或者SEQ ID号：7(4B9;Hu4B9-65;Hu4B9-82,-83)；该CDRH2是一个选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID号：6(4B9;Hu4B9-65)与SEQ ID号：38(Hu4B9-82,-83)；并且该CDRH3是一个选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项氨基酸序列组成：FDY与SEQ ID号：11(4B9;Hu4B9-65;Hu4B9-82,-83)。该CDRL1是一个选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID号：12(4B9)与SEQ ID号：41(Hu4B9-65;Hu4B9-82;Hu4B9-83)；该CDRL2是一个选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID号：13(4B9)与SEQ ID号：42(Hu4B9-65;Hu4B9-82;Hu4B9-83)；并且该CDRL3包括SEQ ID号：14(4B9;Hu4B9-65;Hu4B9-82;Hu4B9-83)的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，该抗体包括：一个选自下组的免疫球蛋白重链可变区，该组由以下各项组成：SEQ ID号：2(4B9)、SEQ ID号：35(Hu4B9-65)、与SEQ ID号：37(Hu4B9-82,-83)；以及一个选自下组的免疫球蛋白轻链可变区，该组由以下各项组成：SEQ ID号:4(4B9)、SEQ ID号：40(Hu4B9-65)、SEQ ID号：44(Hu4B9-82)以及SEQ ID号：46(Hu4B9-83)。
在一些实施方案中，该抗体包括：一个包括SEQ ID号：2(4B9)的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区，以及一个包括SEQ ID号：4(4B9)的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体包括：一个包括SEQ ID号：35(Hu4B9-65)的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区，以及一个包括SEQ ID号：40(Hu4B9-65)的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体包括：一个包括SEQ ID号：37(Hu4B9-82,-83)的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区，以及一个包括SEQ ID号：44(Hu4B9-82)的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体包括：一个包括SEQ ID号：37(Hu4B9-82,-83)的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区，以及一个包括SEQ ID号：46(Hu4B9-83)的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区。
在其他的实施方案中，该抗体包括(i)一个选自下组的免疫球蛋白重链，该组由以下各项组成：SEQ ID号：21(4B9)、SEQ ID号：54(Hu4B9-65)、与SEQ ID号：56(Hu4B9-82,-83)；以及(ii)一个选自下组的免疫球蛋白轻链，该组由以下各项组成：SEQ ID号：23(4B9)、SEQ ID号：58(Hu4B9-65)、SEQ ID号：60(Hu4B9-82)与SEQ ID号：62(Hu4B9-83)。
在某些实施方案中，该抗体包括(i)一个包括SEQ ID号：21(4B9)的氨基酸序列的免疫球蛋白重链，以及(ii)一个包括SEQ ID号：23(4B9)的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。
在某些实施方案中，该抗体包括(i)一个包括SEQ ID号：54(Hu4B9-65)的氨基酸序列的免疫球蛋白重链，以及(ii)一个包括SEQ ID号：58(Hu4B9-65)的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。
在某些实施方案中，该抗体包括(i)一个包括SEQ ID号：56(Hu4B9-82,-83)的氨基酸序列的免疫球蛋白重链，以及(ii)一个包括SEQ ID号：60(Hu4B9-82)的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。
在某些实施方案中，该抗体包括(i)一个包括SEQ ID号：56(Hu4B9-82,-83)的氨基酸序列的免疫球蛋白重链，以及(ii)一个包括SEQ ID号：62(Hu4B9-83)的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。
在其他的实施方案中，一个结合人类FGFR2的分离的抗体包括一个免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包括一个与SEQ ID号：2(4B9)、SEQ ID号：35(Hu4B9-65)、以及SEQ ID号：37(Hu4B9-82,-83)的整个可变区或骨架区序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99%一致性的氨基酸序列。
在其他的实施方案中，一个结合人类FGFR2的分离的抗体包括一个免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包括一个与SEQ ID号：4(4B9)、SEQ ID号：40(Hu4B9-65)、SEQ ID号：44(Hu4B9-82,-83)、以及SEQ ID号：46(Hu4B9-83)的整个可变区或骨架区序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99%一致性的氨基酸序列。
在本领域的技术之内，可以用不同的方式来确定同源性或一致性，例如，使用公开可用的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或者Megalign(DNASTAR)软件。BLAST（基本局部比对搜索工具（Basic LocalAlignment Search Tool））分析，该分析使用由程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx所采用的算法（Karlin（卡尔林）等人，(1990)，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA（美国科学院院刊），（87,2264-2268）；Altschul（阿尔丘尔），(1993),J.MOL.EVOL.(分子进化学杂志),36,290-300；Altschul（阿尔丘尔）等人，(1997),NUCLEIC ACIDS RES.(核酸研究),25,3389-3402，通过引用结合），该分析是为序列相似性搜索专门定制的。由BLAST程序所使用的方法是首先考虑一个查询序列与数据库序列之间的类似片段，然后评估所有被识别的匹配的统计显著性，并且最后只总结那些满足预选阈值的显著性的匹配。关于在序列数据库的相似性搜索中的基本问题的讨论，参见Altschul（阿尔丘尔）等人，(1994)，NATURE GENETICS（自然遗传学），（6,119-129，通过引用将其完全结合。本领域的那些技术人员能够确定用于测量比对的适当的参数，包括被比较的序列在整个长度上以达到最大比对所需要的任何算法。用于直方图、说明书、比对、期望（即，用于报告针对数据库序列的匹配的统计显著性阈值）、截断、矩阵以及过滤的搜索参数是处于默认设置的。由Blastp、blastx、tblastn、以及tblastx所使用的默认的打分矩阵是BLOSUM62矩阵（Henikoff（赫尼科夫）等人，(1992)，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA（美国科学院院刊），89,10915-10919，通过引用全部结合）。可以对四种比对参数进行如下调整：Q=10（缺口产生罚分）；R=10（缺口延伸罚分）；wink=1（生成字，沿着查询在每个wink.sup.th位置点击）；并且gapw=16（在生成的缺口比对之内设置窗口的宽度）。该等效的Blastp参数设定可以为Q=9；R=2；wink=1；并且gapw=32。还可以使用NCBI（美国国家生物技术信息中心）BLAST高级选项参数进行检索（例如：-G，缺口打开成本[整数]:默认=5（用于核苷酸）/11（用于蛋白）；-E，缺口延伸成本[整数]:默认=2（用于核苷酸）/1（用于蛋白）；-q，核苷酸错配罚分[整数]:默认=-3；-r，核苷酸匹配加分[整数]:默认=1;-e，期望值[实数]:默认=10；-W，字号[整数]:默认=11（用于核苷酸）/28（用于megablast）/3（用于蛋白）；-y，跌落（dropoff）(X)，以bit为单位的blast延长:默认=20（用于比对）/7（用于其他的）；-X，X跌落值，用于缺口比对（以bit为单位）:默认=15（用于所有的程序，不适用于blastn）；并且-Z，最终用于缺口比对(以bit为单位)的X跌落值:50用于比对，25用于其他的）。对于成对的蛋白比对还可以使用ClustalW（默认参数可以包括，例如，Blosum62矩阵并且缺口打开罚分=10并且缺口延伸罚分=0.1）。序列之间的Bestfit比较，可以在GCG软件包的版本10.0中获得，使用DNA参数GAP=50（缺口产生罚分）和LEN=3（缺口延伸罚分），并且在蛋白对比中的等效设置是GAP=8和LEN=2。
在每一前述实施方案中，在此考虑到，一起结合人类FGFR2的免疫球蛋白重链可变区序列和/或轻链可变区序列在该重和/或轻链可变区的骨架区中可以包含氨基酸改变（例如，至少1、2、3、4、5、或10个氨基酸置换、缺失或添加）。
在某些实施方案中，一个分离的抗体与具有5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、950pM、900pM、850pM、800pM、750pM、700pM、650pM、600pM、550pM、500pM、450pM、400pM、350pM、300pM、250pM、200pM、150pM、100pM、50pM或者更低的KD的人类FGFR2结合。除非另外说明，通过在例如实例5和9中描述的条件下的表面等离子体共振方法确定KD值。
抗体的产生
本发明的生产抗体的方法是本领域内已知的。例如，编码轻链可变区与重链可变区的DNA分子可以使用在此提供的序列信息进行化学合成。合成的DNA分子可以连接至其他适当的核苷酸序列（包括，例如恒定区编码序列以及表达控制序列），以产生编码所希望的抗体的常规的基因表达构建体。所定义的基因构建体的产生是在本领域内的惯常技术之内。可替代地，在此提供的序列可以使用合成核酸探针，通过常规杂交技术或聚合酶链式反应（PCR）技术来从杂交瘤中进行克隆，这些合成核酸探针的序列是基于在此提供的序列信息，或有关编码杂交瘤细胞中的鼠抗体的重和轻链的基因的现有技术序列信息。
编码所希望的抗体的核酸可以合并（连接）进入表达载体，这些表达载体可以通过常规转染或转化技术引入宿主细胞。示例性宿主细胞是大肠杆菌（E.coli）细胞、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、海拉（HeLa）细胞、幼仑鼠肾（BHK）细胞、猴肾（COS）细胞、人肝癌细胞细胞（例如，Hep G2）以及不另外地产生IgG蛋白的骨髓瘤细胞。经转化的宿主细胞可以在允许这些宿主细胞表达编码这些免疫球蛋白轻或者重链可变区的基因的条件下进行生长。
具体的表达与纯化条件将取决于所采用的表达系统而变化。例如，如果一个基因有待于在大肠杆菌中表达，则首先通过将该工程化的基因定位于一个合适的细菌启动子（例如，Trp或Tac）以及一个原核生物信号序列的下游而将它克隆进入一个表达载体。这一表达的分泌蛋白以折射体或包涵体形式积累，并且可以在利用弗氏细胞压碎器或声处理的破裂之后进行收集。然后将这些折射体溶解，并且通过本领域内已知的方法将这些蛋白重折叠并且切割。
如果这种工程基因有待于在真核生物宿主细胞（例如，CHO细胞）中表达，则首先将它插入一个包含合适的真核生物启动子、分泌信号、IgG增强子以及不同内含子的表达载体之中。该表达载体可任选地包含编码一个恒定区的所有或部分的序列，使一个重或轻链的全部或一部分能够得以表达。该基因构建体可以使用公约技术引入真核生物宿主细胞中。这些宿主细胞表达VL或VH片段、VL-VH异二聚体、VH-VL或VL-VH单链多肽、完整的重或轻免疫球蛋白链、或其部分，它们中的每一个都可以被附接至一个具有另外的功能（例如，细胞毒性）的部分。在一些实施方案中，用表达一个多肽的单载体（single vector）转染宿主细胞，该多肽表达一个重链（例如一个重链可变区）或一个轻链（例如一个轻链可变区）的全部或部分。在其他实施方案中，用编码(a)包括一个重链可变区的多肽和包括一个轻链可变区的多肽，或(b)一个整个的免疫球蛋白重链和一个整个免疫球蛋白轻链的单载体转染宿主细胞。仍在其他实施方案中，用多于一个的表达载体（例如，一个表达包括一个重链或重链可变区的全部或部分的一个多肽的表达载体，以及另一表达包括一个轻链或轻链可变区的全部或部分的一个多肽的表达载体）共转染宿主细胞。
一个包含一个免疫球蛋白重链可变区或一个轻链可变区的多肽可以在允许该多肽表达的条件下，通过生长用一个编码此类可变区的表达载体转染的宿主细胞生产。表达后，可以使用本领域内已熟知的技术（即，亲和标签例如谷胱甘肽-S-转移酶（GST）标签与组氨酸标签）收集并且纯化该多肽。
结合人类FGFR2的一个单克隆抗体或该抗体的一个抗原结合片段可以通过生长经以下项转染的宿主细胞生产：(a)一个编码完整或部分免疫球蛋白重链的表达载体，以及一个编码完整或部分轻链的分开的表达载体；或(b)一个编码两种链（例如，完整或部分的重链和轻链）的单一的表达载体，在允许两种链表达的条件下。可以使用本领域内已熟知技术（例如，蛋白A（Protein A）、蛋白G（Protein G）、亲和标签例如谷胱甘肽-S-转移酶（GST）标签与组氨酸标签）收集并且纯化该完整抗体（或该抗体的抗原结合片段）。从一个单一的表达载体或从两种分开的表达载体表达该重链与该轻链是在本领域内的普通技术之内的。
对抗体的修饰
用于降低或消除抗体与抗体片段的抗原性的方法在本领域内是已知的。当这些抗体是有待给药于人类时，这些抗体优选地是“人源化的”以降低或消除在人类中的抗原性。优选地，一个人源化抗体具有与其衍生自非人源化小鼠抗体相同的或实质上相同的抗原亲和力。
在一个人源化方法中，产生嵌合蛋白，其中用人类免疫球蛋白恒定区替代小鼠免疫球蛋白恒定区。参见例如Morrison（莫里森）等人，1984，PROC.NAT.ACAD.SCI.（美国科学院院刊），81:6851-6855；Neuberger（纽伯格）等人，1984，NATURE（自然），312:604-608；美国专利号6,893,625（Robinson（罗宾逊）），5,500,362（Robinson（罗宾逊））以及4,816,567（Cabilly（卡比利））。
在一个已知为CDR移植的方法中，这些轻或重链可变区的CDR是移植进入来自另外物种的骨架序列之中的。例如，可以移植鼠CDR进入人类FR。在本发明的一些实施方案中，抗FGFR2抗体的轻和重链可变区的CDR可以被移植到人类FR或共有人类FR（consensus human FRs）上。为了产生共有人类FR，将从若干人类重链或轻链氨基酸序列而来的FR进行比对以鉴定共有氨基酸序列。CDR移植描述于美国专利号7,022,500（Queen（昆））；6,982,321（Winter（温特））；6,180,370（Queen（昆））；6,054,297（Carter（卡特））；5,693,762（Queen（昆））；5,859,205（Adair（阿戴尔））；5,693,761（Queen（昆））；5,565,332（Hoogenboom（胡根布姆））；5,585,089（Queen（昆））；5,530,101（Queen（昆））；Jones（琼斯）等人，（1986），NATURE（自然），321:522-525；Riechmann（里艾克曼）等人，（1988），NATURE（自然），332:323-327；Verhoeyen（沃尔霍因）等人，（1988），SCIENCE（科学），239:1534-1536；以及Winter（温特）（1998），FEBS LETT（欧洲生化学会联合会快报），430:92-94中。
在一个称作“SUPERHUMANIZATIONTM”的方法中，人类CDR序列是基于这些人类CDR与那些有待于人源化的鼠抗体的结构相似性，从人类生殖细胞基因中选择的。参见例如美国专利申请号6,881,557（Foote(富特)）；以及Tan（谭）等人，2002，J.IMMUNOL（免疫学杂志），169:1119-1125。
降低免疫原性的其他方法包括“重塑（reshaping）”、“超嵌合（hyperchimerization）”以及“镶面/表面重修（veneering/resurfacing）”。参见例如Vaswami（瓦斯瓦米）等人，1998，ANNALS OF ALLERGY,ASTHMA,&IMMUNOL.（过敏、哮喘及免疫学年鉴），81：105；Roguska等人，1996，《蛋白工程》（PROT.ENGINEER 9:895-904）；以及美国专利号6,072,035（Hardman（哈德曼））。在该镶面/表面重修方法中，该鼠抗体中的易接近表面的氨基酸残基被在人类抗体中的相同位置更常发现的氨基酸残基替代。这种类型的抗体表面重修描述于例如美国专利号5,639,641（Pedersen（佩德森））中。
用于将小鼠抗体转化成一个适合人类医学用途的形式的另一方法已知为ACTIVMABTM技术（Vaccinex公司，纽约州，罗彻斯特（Vaccinex,Inc.,Rochester,NY）），该技术涉及一个牛痘病毒基载体，用来在哺乳动物细胞中表达抗体。据说要产生IgG重和轻链的高水平的组合多样性。参见例如美国专利号6,706,477（Zauderer（扎尔德尔））；6,800,442（Zauderer（扎尔德尔））；以及6,872,518（Zauderer（扎尔德尔））。
用于将小鼠抗体转化成一个适合在人类中使用的形式的另一方法是由KaloBios制药公司（KaloBios Pharmaceuticals,Inc.）（加利福尼亚州，帕洛阿尔托）（Palo Alto,CA）商业化运作的技术。这种技术涉及使用一个专利性的人类“受体”文库来产生一个用于抗体选择的“表位聚焦”文库。
用于将小鼠抗体修饰成一个适合人类医学用途的形式的另一方法是由HUMAN ENGINEERINGTM技术，该技术由XOMA(US)公司（XOMA(US)LLC）商业化运作。参见，例如，PCT公开号WO 93/11794以及美国专利号5,766,886；5,770,196；5,821,123；以及5,869,619。
任何适合的方法（包括任何以上的方法）可以用以降低或消除在此披露的抗体的人免疫原性。
如果该抗体用于用作治疗剂，可以使用标准的体外接合化学剂（conjugation chemistries）将该抗体接合至一个效应物部分（例如一个小分子毒素或一个放射性核素）。如果该效应物部分是一个多肽，则该抗体可以化学接合至该效应物或连接至该效应物作为一个融合蛋白。融合蛋白的构建是在本领域普通技术内的。
抗体的用途
在此披露的抗体可以用以治疗不同形式的癌症，例如乳癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、以及头颈癌。这些癌细胞被暴露于一个治疗有效量的该抗体，以抑制或降低该癌细胞的增殖。在一些实施方案中，这些抗体抑制癌细胞增殖至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%。
在一些实施方案中，所披露的抗体可以在一个抑制人类患者中的肿瘤生长的方法中使用。该方法包括将一个治疗有效量的该抗体给药于该患者。与FGFR2过表达和/或激活相关的癌症包括乳癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、肺癌、一些形式的脑癌、黑素瘤、以及肠胃癌（例如，结直肠癌、胰腺癌、胃癌、头颈癌）。
如在此使用的，“治疗”一个疾病是指：（a）减轻该疾病的症状；（b）抑制该疾病的进展；（c）致使该疾病的复原；或者（d）治愈该疾病。
一般地，一个治疗有效量的活性组分是在0.1mg/kg至100mg/kg的范围内，例如，1mg/kg至100mg/kg，1mg/kg至10mg/kg。给药量将取决于各种变量，例如疾病的类型与程度或有待治疗的征候、该患者的总体健康、该抗体的体内效能、药物配方以及给药途径。可以增加初始计量超出以上的水平以快速达到所希望的血液水平或组织水平。可替代地，该初始剂量可以比该最适宜的更低，并且可以在治疗过程中渐进地增加每日剂量。在例如设计以从0.5mg/kg至20mg/kg进行的常规性阶段I剂量逐步提高研究中，人类剂量可以被最优化。取决于各种因素（例如给药途径、剂量以及在治疗的疾病），给药频率可以变化。示例性的给药频率是每天一次，每周一次或每两周一次。优选的给药途径是肠胃外给药，例如静脉输注。基于单克隆抗体的药物的配制品在本领域的普通技术内。在本发明的一些实施方案中，该单克隆抗体被低压冻干并且在给药时，在缓冲盐水中复原。
对于治疗用途，抗体优选结合一个药学上可接受的载体。如在此所用的，“药学上可接受的载体”意为适合用于和人类以及动物的组织相接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症的缓冲液、载体以及赋形剂，与合理的获益/风险比相称。在与该配制品的其他成分相容的意义上，这一个或多种载体应该是“可接受的”，并且不会对它的接受者有害。药学上可接受的载体包括与药学给药相容的缓冲液、溶剂、分散介质、涂层、等渗剂和吸收延迟剂、以及类似物。针对药学活性物质的此类介质与试剂的用途在本领域是已知的。
包含本发明的抗体的药物组合物可以按剂量单位形式存在，并且可以通过任何合适的方法来制备。药物组合物应该配制以与其预期的给药途径相容。给药途径的实例是静脉（IV）、皮内、吸入、经皮、局部、经粘膜以及直肠给药。单克隆抗体的优选给药途径是IV输注。有用的配制品可以通过制药领域内熟知的方法来制备。例如，参见Remington′s PharmaceuticalSciences （雷明顿的药物科学），第18版，Mack Publishing Company（Mack出版公司），1990。适合用于肠胃外给药的配制品组分包括无菌稀释液，例如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如EDTA；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于张力调整的用剂，例如氯化钠或右旋糖。
对于静脉给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM（BASF，新泽西州派西派尼市（Parsippany，NJ））或磷酸盐缓冲盐水（PBS）。该载体应该在制造和储存的条件下是稳定的，并且应该抗微生物保存。该载体可以是一个溶剂或分散介质，它包含例如：水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇、以及液体聚乙二醇），以及它们的适合的混合物。
药物配制品优选是无菌的。灭菌可以例如通过经由无菌滤膜的过滤来完成。在该组合物被低压冻干的情况下，过滤灭菌可以在低压冻干与复原之前或之后进行。
实例
以下实例仅是说明性的，并且不意在以任何方式限制本发明的范围或内容。
实例1：细胞系和试剂
从美国种质保存中心（马里兰州，罗克维尔市（Rockville,MD））获得KATO III、HEC-1-A、AN3 CA、SNU-16以及人类肺癌细胞系。从德国微生物保藏和细胞培养中心获得FDCP-1与Ba/F3、MFM-223、MFE-296、MFE-280、MFE-319以及ESS-1细胞。根据由供应商规定的说明，在37°C下，包含5%的CO2的气氛中，培养所有的人类细胞系。所有的FGF均购买自R&DSystems公司（R&D Systems,Inc.）(明尼苏达州，明尼阿波利斯)（Minneapolis,MN）。
为建立基于细胞的分析，从而筛选功能的FGFR2抗体，我们首先工程化Ba/F3和FDCP-1细胞，以表达野生型FGFR2以及FGFR2的癌症相关的突变体或者变体。通过下列方法获得FGFR-驱动的FDCP细胞以及Ba/F3细胞。FDCP-1细胞是通过电穿孔，用编码人类FGFR2的IIIb、IIIc同型物或C-末端截短变体的，以及与癌症相关的FGFR2-IIIb S252W，或FGFR2-IIIb N550K突变体的质粒转染的。用G418(600μg/ml)选择之后，将单克隆分离并且在没有IL3的条件下，通过MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑鎓溴化物]（西格玛奥德里奇公司，密苏里州，圣路易斯（Sigma-Aldrich,St.Louis,MO））分析来检测它们的FGF1-依赖性增殖。将MTT试剂（10μl）加入到该细胞中，并且在4小时后，将该反应用100μl的与2N HCL一起的10%SDS终止。次日，分析这些板。在没有IL3的条件下表现出鲁棒的FGF-1-依赖性增殖的克隆被用于后续研究。为产生表达FGFR2的逆转录病毒，这些编码不同的人类FGFR2变体的cDNA每个被插入到一个逆转录病毒载体。通过用脂质体2000（Lipofectamine 2000）（Invitrogen公司，加利福尼亚州，卡尔斯巴德（Invitrogen,Carlsbad,CA）转染Phoenix细胞来生产逆转录病毒。在8μg/ml的聚凝胺（西格玛奥德里奇公司（Sigma-Aldrich））的存在下，使用包含该逆转录病毒的上清液，通过在2500rpm离心90分钟来感染Ba/F3细胞。通过有限稀释法来分离单个克隆，并且用流式细胞术对细胞表面受体表达进行了验证。
具有FGFR扩增的癌症细胞系被鉴定为如下。在桑格研究所（WellcomeTrust Sanger Institute，www.sanger.ac.uk）的CGP拷贝数数据库中查询FGFR2扩增（基因拷贝数>7）。使用FGFR2特异引物（5’-ACTTGGGCTGGAGTGATTTG-3’(SEQ  ID  号：24)与5’-AATCCCATCTGCACACTTCC-3’(SEQ ID号：25))以及参考基因（转酮醇酶）引物(5’-CAAAAACATGGCTGAGCAGA-3’(SEQ ID号：26)与5’-GAAACAGGCCCCACTTTGTA-3’(SEQ ID号：27))，通过定量PCR（qPCR）分析具有潜在的FGFR2扩增的细胞系的拷贝数）。上述FGFR2基因的拷贝数基本上如Toyokawa（丰川）等人，2009，ONCOL.REP.（肿瘤学报告），21:875-880中所述进行计算。
如下进行FGFR基因的表达分析。通过RNeasyTM微型试剂盒（Qiagen公司，加利福尼亚州，巴伦西亚）（Qiagen,Valencia,CA）分离总RNA。使用一个QuantiTectTM的SYBR Green RT-PCR试剂盒（Qiagen公司）以及FGFR2、FGFR2-IIIb、FGFR2-IIIc、和HPRT的特异性引物进行定量RT-PCR（qRT-PCR）。将表达水平归一化为HPRT。
先前的研究已经表明，在没有IL-3的条件下，异位表达鼠B前体Ba/F3或者骨髓FDCP-1细胞中的FGFR赋予FGF1-依赖性增殖（Tannheimer（坦海姆）等人，2000，BREAST CANCER RES.（乳癌研究），2:311-320；Ornitz（奥尼茨）等人，1996，J.BIOL.CHEM.（生物化学杂志），271:15292-15297）。正如预期的那样，在没有IL-3和FGF1的条件下，稳定表达野生型FGFR2的FDCP-1细胞没有明显的增殖。已知FGF1、3、7、10和22转导信号经过FGFR2-IIIb，并且FGFR2-IIIc响应于更广泛的配体组，包括FGF1、2、4、6、9、16、17、18和20（Tannheimer（坦海姆）等人，如以上；Ornitz（奥尼茨）等人，如以上；Zhang（张）等人，2006，J.BIOL.CHEM.（生物化学杂志），281:15964-15700）。表达FGFR2的IIIb同型物的FDCP-1细胞的增殖是由FGF7和FGF10，而不是由FGF2和FGF9刺激的（图2）。表达该IIIc同型物的细胞的增殖由FGF2和FGF9特异性增强。（图3）
实例2：抗FGFR2单克隆抗体的产生
用在它们的C末端与人类的Fc部分一起融合的人类FGFR2IgD2-IgD3(IIIb)和人类FGFR2IgD2-IgD3(IIIc)的1:1的混合物使小鼠免疫。使用一个商业供应商（精密抗体公司，马里兰州，哥伦比亚（Precision Antibody,Columbia,MD））进行小鼠免疫和细胞融合。
在初级筛选中，使用一个ELISA格式筛选杂交瘤上清液以检测结合至人类FGFR2IgD2-IgD3。将通过初筛选的抗体进行第二次筛选，该第二次筛选是一个在实例3（见下文）中所描述的基于细胞的增殖测定。
使用鼠杂交瘤克隆的上清液进行初筛选，该杂交瘤克隆产生自使用人类FGFR2的胞外域免疫的小鼠的脾脏融合。在测定板上涂上100ng/孔的重组可溶性FGFR2胞外域，并且然后于室温下用PBS中的5%牛奶封闭1小时。然后向每个孔中加入50μl的杂交瘤上清液，以允许抗体于室温下结合1小时。将这些板用洗涤缓冲液（具有0.1%Tween 20的PBS）洗涤3次，接着用一个HRP接合的山羊抗小鼠IgG重链和轻链第二抗体进行孵化。该测定用TMB（四甲基苯）作为一个底物进行，并且在620nm下读出吸光度。
实例3：FGFR2拮抗剂抗体的鉴定
为了对FGFR2拮抗剂抗体进行筛选，将包含FGFR2抗体的杂交瘤上清液添加到异位表达FGFR2的下列5种形式之一的FDCP细胞中：(1)野生型FGFR2-IIIb；(2)野生型FGFR2-IIIc；(3)FGFR2-III(b)S252W；(4)FGFR2-III(b)N550K；以及(5)具有C-端截短的FGFR2-III(b)。将该上清液以1:1的比率（体积）加入到具有肝素（5μg/ml）±FGF1(8ng/ml)的平底96-孔板（70,000细胞/孔）中的FGFR2-表达细胞中。在37°C下孵化两天后，进行如在上文中描述的MTT测定。
克隆4B9的上清液证明了了对由FGFR2的IIIb-同型物驱动的FDCP-1增殖的有效的并且选择性的抑制。由克隆4B9产生的抗体4B9（也称作抗体GP369）通过常规的技术进行纯化，用于进一步的表征。表面等离子体共振分析表明，抗体4B9对人类FGFR2-IIIb显示出了强烈的亲和力，并且未表现出可检出的至人类FGFR2-IIIc的结合。未检测出抗体4B9至人类FGFR2-IIIc或者FGFR2-IIIb的结合。
实例4：序列分析
根据制造商的说明（罗氏应用科学公司，印第安纳州，印第安纳波利斯（Roche Applied Science,Indianapolis,IN）），使用IsoStripTM小鼠单克隆抗体同种型试剂盒，对实例1中的抗体4B9的轻链同种型与重链同种型进行确定。抗体被确定为Kappa轻链以及IgG1重链。
使用5’RACE（cDNA末端快速扩增）对抗体4B9的重与轻链可变区进行测序。根据供应商的说明（Qiagen公司，加利福尼亚州，巴伦西亚）（Qiagen,Valencia,CA），使用
Figure BDA00002377645200221
小量制备试剂盒从4B9单克隆杂交瘤细胞系提取总RNA。根据制造商的说明，使用用于5’RACE的随机引物，使用SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒（Clontech公司，加利福尼亚州，帕洛阿尔托）（Clontech,Palo Alto,CA），产生包含5’末端的全长第一链cDNA。
根据制造商的说明，使用KOD Hot StartTM聚合酶（EMD化学药品公司，新泽西州，吉布斯镇）（EMD Chemicals,Gibbstown,NJ），通过PCR扩增该kappa和重IgG1链的可变区。为了结合SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒扩增5’cDNA末端，使用通用引物混合物A（Universal Primer MixA）引物（Clontech公司）（5’CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT3’（SEQ ID号：28）和5’CTAATACGACTCACTATAGGGC 3’（SEQ ID号：29）的混合物）作为5’引物。使用以上5’引物和3’IgG1恒定区特异引物（5’TATGCAAGGCTTACAACCACA 3’（SEQ ID号：30）扩增重链可变区。用以上5’引物和3’kappa  恒定区特异引物（CGACTGAGGCACCTCCAGATGTT 3’（SEQ ID号：31）扩增kappa链可变区。
通过琼脂糖凝胶电泳来分离单个PCR产物，并且使用QiaquickTM凝胶纯化试剂盒（QiaquickTM Gel Purification kit），根据制造商的说明（Qiagen公司）进行纯化。使用Zero PCR克隆试剂盒（Zero
Figure BDA00002377645200224
Figure BDA00002377645200225
PCR Cloning Kit），根据制造商（Invitrogen公司）的说明，将这些PCR产物相继地克隆进入pCR4Blunt质粒，并且通过标准的分子生物学技术转化进入DH5-α细菌（Invitrogen公司）。由Beckman Genomics公司（马萨诸塞州，丹弗斯）（Danvers,MA），使用M13正向（5’GTAAAACGACGGCCAGT 3’）（SEQ ID号：32）和M13反向（5’CAGGAAACAGCTATGACC 3’）（SEQ ID号：33）引物，使用标准的双脱氧DNA测序法对从转化细菌克隆中分离而来的质粒DNA进行测序，以鉴定这些可变区序列的序列。使用Vector NTI软件（Invitrogen公司）以及IMGT/V-Quest网络服务器对这些序列进行分析，以鉴定并且确定可变区序列。
编码该抗体4B9的可变区的核酸序列与定义该抗体4B9的可变区的蛋白序列总结于下（氨基末端信号肽序列未展示）。CDR序列（Kabat定义）以这些氨基酸序列中的粗体/下划线来展示。
编码抗体4B9的重链可变区的核酸序列（SEQ ID号：1）
1   gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg
61  tcctgcaaga cttctggcta cacatttacc agctactgga tgcactgggt aaaacagagg
121 cctggacagg gtctggaatg gataggggct atttatcctg gaaatagtga tactgactac
181 agccagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagtca catccgccac cactgcctac
241 atggaactca gcagcctgac aaatgaggac tctgcggtct attactgttc aaagtttgac
301 tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca
定义抗体4B9的重链可变区的蛋白序列（SEQ ID号：2）
1  evqlqqsgtv larpgasvkm scktsgytft sywmhwvkqr pgqglewiga iypgnsdtdy
61 sqkfkgkatl tavtsattay melssltned savyycskfd ywgqgttltv ss
编码抗体4B9的Kappa链可变区的核酸序列（SEQ ID号：3）
1   caaattgttc tcacccagtc tccagcactc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc
61  atgacctgca gtgccagctc aagtgtaaat tacatgtact ggtaccagca gaagccaaga
121 tcctccccca aaccctggat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc
181 ttcagtggca gggggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa
241 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cgtacacgtt cggagggggg
301 accaagctgg aaataaaa
定义抗体4B9的Kappa链可变区的蛋白序列（SEQ ID号：4）
1  qivltqspal msaspgekvt mtcsasssvn ymywyqqkpr sspkpwiylt snlasgvpar
61 fsgrgsgtsy sltissmeae daatyycqqw ssnpytfggg tkleik
表1是一个索引表，展示了在该实例中所讨论的每一序列的SEQ ID号。
表1
  SEQ ID号 抗体4B9核酸或者蛋白
  1 重链可变区—核酸
  2 重链可变区—蛋白
  3 轻（kappa）链可变区—核酸
  4 轻（kappa）链可变区—蛋白
  5 重链CDR1(Kabat定义)
  6 重链CDR2(Kabat定义)
  11 重链CDR3(IGMT定义)
  12 轻（kappa）链CDR1(Kabat定义)
  13 轻（kappa）链CDR2(Kabat定义)
  14 轻（kappa）链CDR3(Kabat定义)
小鼠单克隆抗体重链CDR序列（Kabat、Chothia以及IMGT定义）展示在表2中。
表2
Figure BDA00002377645200241
小鼠单克隆抗体Kappa轻链CDR序列（Kabat、Chothia以及IMGT定义）展示在表3中。
表3
Figure BDA00002377645200251
为了产生最完整重或kappa链抗体序列，以上的每一可变序列都结合其对应的恒定区。例如，完整重链包括一个随后是鼠IgG1重链恒定区序列的重可变序列，并且完整kappa链包括一个随后是鼠kappa轻链恒定区序列的kappa可变序列。
编码鼠IgG1重链恒定区的核酸序列（SEQ ID号：16）
1   gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac
61  tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc
121 tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac
181 ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag ccagaccgtc
241 acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg
301 gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc
361 cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg
421 gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag
481 gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc
541 agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc
601 aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg
661 aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc
721 agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg
781 aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct
841 tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc
901 acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac
961 tctcctggta aa
定义鼠IgG1重链恒定区的蛋白蛋白蛋白序列（SEQ ID号：17）
1   akttppsvyp lapgsaaqtn smvtlgclvk gyfpepvtvt wnsgslssgv htfpavlqsd
61  lytlsssvtv psstwpsqtv tcnvahpass tkvdkkivpr dcgckpcict vpevssvfif
121 ppkpkdvlti tltpkvtcvv vdiskddpev qfswfvddve vhtaqtqpre eqfnstfrsv
181 selpimhqdw lngkefkcrv nsaafpapie ktisktkgrp kapqvytipp pkeqmakdkv
241 sltcmitdff peditvewqw ngqpaenykn tqpimdtdgs yfvysklnvq ksnweagntf
301 tcsvlheglh nhhtekslsh spgk
编码鼠Kappa轻链恒定区的核酸序列（SEQ ID号：18）
1   cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct
61  ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccagagacat caatgtcaag
121 tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggtgtcctga acagttggac tgatcaggac
181 agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacat tgaccaagga cgagtatgaa
241 cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag
301 agcttcaaca ggaatgagtg t
定义鼠Kappa轻链恒定区的蛋白蛋白蛋白序列（SEQ ID号：19）
1  radaaptvsi fppsseqlts ggasvvcfln nfyprdinvk wkidgserqn gvlnswtdqd
61 skdstysmss tltltkdeye rhnsytceat hktstspivk sfnrnec
以下序列表示在该实例中描述的每一抗体的实际的或互补的全长重链或轻链序列（即，包含可变区与恒定区序列这二者）。用于这些抗体适当分泌的信号序列还被包括在这些DNA序列5’末端或这些蛋白序列的氨基末端。这些可变区序列可以连接至其他恒定区序列，以产生活性的全长IgG重链与轻链。
编码4B9的全长重链序列（重链可变区和IgG1恒定区）的核酸序列
（SEQ ID号：20）
1    atggaatgta actggatact tccttttatt ctgtcggtaa cttcaggggt ctactcagag
61   gttcagctcc agcagtctgg gactgtgctg gcaaggcctg gggcttcagt gaagatgtcc
121  tgcaagactt ctggctacac atttaccagc tactggatgc actgggtaaa acagaggcct
181  ggacagggtc tggaatggat aggggctatt tatcctggaa atagtgatac tgactacagc
241  cagaagttca agggcaaggc cacactgact gcagtcacat ccgccaccac tgcctacatg
301  gaactcagca gcctgacaaa tgaggactct gcggtctatt actgttcaaa gtttgactac
361  tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat
421  ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc
481  aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg acctggaact ctggatccct gtccagcggt
541  gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact
601  gtcccctcca gcacctggcc cagccagacc gtcacctgca acgttgccca cccggccagc
661  agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt
721  acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc
781  attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag
841  gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg
901  gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac
961  tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc
1021 gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca
1081 cctcccaagg agcagatggc caaggataaa gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc
1141 ttccctgaag acattactgt ggagtggcag tggaatgggc agccagcgga gaactacaag
1201 aacactcagc ccatcatgga cacagatggc tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg
1261 cagaagagca actgggaggc aggaaatact ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg
1321 cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc cactctcctg gtaaa
定义4B9的全长重链序列（重链可变区和IgG1恒定区）的蛋白序列（SEQ ID号：21）
1  mecnwilpfi lsvtsgvyse vqlqqsgtvl arpgasvkms cktsgytfts ywmhwvkqrp
61 gqglewigai ypgnsdtdys qkfkgkatlt avtsattaym elssltneds avyycskfdy
121 wgqgttltvs sakttppsvy plapgsaaqt nsmvtlgclv kgyfpepvtv twnsgslssg
181 vhtfpavlqs dlytlsssvt vpsstwpsqt vtcnvahpas stkvdkkivp rdcgckpcic
241 tvpevssvfi fppkpkdvlt itltpkvtcv vvdiskddpe vqfswfvddv evhtaqtqpr
301 eeqfnstfrs vselpimhqd wlngkefkcr vnsaafpapi ektisktkgr pkapqvytip
361 ppkeqmakdk vsltcmitdf fpeditvewq wngqpaenyk ntqpimdtdg syfvysklnv
421 qksnweagnt ftcsvlhegl hnhhteksls hspgk
编码4B9的全长轻链序列（Kappa链可变区和恒定区）的核酸序列（SEQ ID号：22）
1   atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatga gtgcctcagt cataatgtcc
61  aggggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcactcatgt ctgcatctcc aggggagaag
121 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaaattaca tgtactggta ccagcagaag
181 ccaagatcct cccccaaacc ctggatttat ctcacatcca acctggcttc tggagtccct
241 gctcgcttca gtggcagggg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag
301 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccgta cacgttcgga
361 ggggggacca agctggaaat aaaacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca
421 ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc
481 taccccagag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggtgtc
541 ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc
601 acattgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag
661 acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgt
定义4B9的全长轻链序列（Kappa链可变区和恒定区）的蛋白蛋白蛋白 序列（SEQ ID号：23）
1   mdfqvqifsf llmsasvims rgqivltqsp almsaspgek vtmtcsasss vnymywyqqk
61  prsspkpwiy ltsnlasgvp arfsgrgsgt sysltissme aedaatyycq qwssnpytfg
121 ggtkleikra daaptvsifp psseqltsgg asvvcflnnf yprdinvkwk idgserqngv
181 lnswtdqdsk dstysmsstl tltkdeyerh nsytceathk tstspivksf nrnec
表4展示了在具有序列表中呈现的那些的实例中，所讨论的抗体的全长序列之间的对应性。
表4
  SEQ ID号  抗体4B9核酸或者蛋白
  20  重可变+IgG1恒定—核酸
  21  重可变+IgG1恒定—蛋白
  22  Kappa可变+恒定—核酸
  23  Kappa可变+恒定—蛋白
实例5：结合亲和性
单克隆抗体4B9的结合亲和性以及结合运力学相对于下列蛋白进行测量（R&D Systems公司，明尼苏达州，明尼阿波利斯）（R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN）：
重组人类FGFR1β(IIIb)/Fc嵌合体(rhFGFR1β-IIIc-Fc),
重组人类FGFR2β(IIIb)/Fc嵌合体(rhFGFR2β-IIIb-Fc),
重组人类FGFR2β(IIIc)/Fc嵌合体(rhFGFR2β-IIIc-Fc),
重组人类FGFR3β(IIIb)/Fc嵌合体(rhFGFR3β-IIIb-Fc),以及重组人类FGFR2β(IIIb)/Fc（其中Fc区被酶去除）的版本。使用Biacore T100仪器（GE医疗保健公司，新泽西州，皮斯卡特维）（GE Healthcare,Piscataway,NJ），通过表面等离子体共振对结合亲和性与结合动力学进行测量。
根据供应商的说明（GE医疗保健公司），使用一个标准的偶联方案，通过胺偶合法，将兔抗小鼠IgG（GE医疗保健公司）固定在羧甲基化葡聚糖CM4传感片（GE医疗保健公司）上。使用包含0.05%表面活性剂P20（GE医疗保健公司）的PBS作为运行缓冲液，在25°C以及37°C下进行这些分析。
在10μl/min的流速下，在单个流动细胞中捕获这些抗体。每一抗体的注射时间不同，以产生一个30与60RU之间的Rmax。以60μl/min持续240秒，将稀释在运行缓冲液中的缓冲液和FGFR蛋白在参考表面（无捕获的抗体）以及活性表面（有待检测试的抗体）上连续地注射。持续监测该解离相达900秒。然后以60μl/分钟的流速，用两个60秒的10mM甘氨酸-HCl(pH1.7)注射来再生这些表面。该FGFR蛋白的测试浓度范围是50至3.125nM（双倍稀释）。
使用减去两倍参考的BIAevaluation软件（GE医疗保健公司）的动力学函数确定多个动力学参数。。确定每一抗体的动力学参数（ka（结合速率常数），kd（解离速率常数以及KD（平衡解离常数）））。这些单克隆抗体在25°C和37°C下对FGFR蛋白的动力学值总结于表5中。
表5
  抗体  目标  温度(°C)   ka(M-1s-1)   kd(s-1)   KD(M)
  4B9  rhFGFR1β-IIIb-Fc   25   未结合   未结合   未结合
  4B9  rhFGFR2β-IIIb-Fc   25   9.4E+04   4.6E-05   6.1E-10
  4B9  rhFGFR2β-IIIb-Fc   37   3.44E+04   3.16E-05   2.96E-09
  4B9  rhFGFR2β-IIIb-经切割的   25   5.5E+04   8.1E-05   4.2E-09
  4B9  rhFGFR2β-IIIb-经切割的   37   2.54E+05   2.23E-04   1.20E-09
  4B9  rhFGFR2β-IIIc-Fc   25   未结合   未结合   未结合
  4B9  rhFGFR3β-IIIb-Fc   25   未结合   未结合   未结合
表5中的结果证明，抗体4B9结合rhFGFR2β-IIIb，其KD为约5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、750pM、650pM、610pM或者更低。这些结果还证明，抗体4B9不结合rhFGFR1β-IIIb、rhFGFR2β-IIIc、以及rhFGFR3β-IIIb。
实例6：抗增殖活性
为评估抗体4B9的效能，我们使用表达FGFR2-IIIb或者FGFR2-IIIc的FDCP-1细胞进行了剂量反应研究。在没有IL3的条件下，将表达FGFR2-IIIb或者FGFR2-IIIc的FDCP-1细胞接种在96孔板中。加入不同量值的FGF和肝素。2至3天后，进行MTT测定。在FGF1以及肝素的存在下，将不同量值的包含上清液的抗体4B9加入到表达FGFR2-IIIb、FGFR2-IIIc或者C-末端截短的FGFR2-IIIb的FDCP-1细胞中。2天后，进行MTT测定。在FGF1以及肝素存在下，将不同量值的纯化的抗体4B9加入到表达FGFR2-IIIb S252W或者FGFR2-IIIb N550K的FDCP-1细胞中。2天后，进行MTT测定。
抗体4B9以剂量依赖性方式，有效抑制了由FGF1-诱导的、FGFR2-IIIb驱动的FDCP-1细胞的增殖，然而，4B9对FGF1-诱导的、表达FGFR2-IIIc的FDCP细胞的增殖无显著影响（图4）。在胃癌和乳癌细胞系中发现，引起FRS2适配子分子的组成型磷酸化以及下游信号激活的C-末端截短的FGFR2-IIIb（Itoh（伊藤）等人，1994，CANCER RES.（癌症研究），54:3237-3241）；Moffa（莫法）等人，2004，MOL.CANCER RES.（分子癌症研究），2:643-652）。抗体4B9有效地抑制了由C-末端截短的FGFR2-IIIb驱动的FDCP-1细胞的增殖（图4）。
已经在约12%的子宫内膜癌样本中报道了FGFR2突变（Pollock（波洛克）等人，如以上；Dutt（杜特）等人，如以上）。在IgD2和IgD3之间的连接区、胞外近膜结构域或者激酶结构域之内的在FGFR2簇内的体细胞激活突变。在子宫内膜肿瘤中的两个最常见的突变是S252W突变（它改变了配体特异性并增加了配体结合的亲和性）和在激酶结构域中的N550K突变（它增强了激酶活性）。纯化的抗体4B9有效地抑制了由野生型FGFR2-IIIb，连同FGFR2-IIIb S252W和FGFR2-IIIb N550K驱动的细胞的增殖，其中，它们的IC50值分别是0.3nM、3.0nM和8.1nM（图5）。
实例7：FGFR2-激活的信号传导通路的抑制
我们研究了抗体4B9对FGFR2-激活的信号传导通路的影响。为了检测抗体4B9对FGFR2的酪氨酸磷酸化的影响，在37°C下，以5μg/ml的剂量持续用抗体处理SNU-16细胞1小时，接着仅用肝素（20μg/ml）或者用肝素加FGF7（30ng/ml）刺激15分钟。将这些细胞在包含1%NP-40、20mM Tris-HCl(pH 8.0)、137mM NaCl、10% glycerol、2mM EDTA的NP-40裂解缓冲液中裂解，并且补充蛋白酶抑制剂（罗氏应用科学公司（Roche AppliedScience））以及Halt磷酸酶抑制剂（赛墨科技公司（Thermo Scientific））。
用抗-FGFR(Y653/Y654)（R&D Systems公司，明尼苏达州，明尼阿波利斯）（R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN）、抗-FGFR2(sc-122)（圣克鲁斯生物技术公司，加利福尼亚州，圣克鲁斯）（Santa Cruz Biotechnology,SantaCruz,CA）、抗-磷酸化-ERK1/2以及抗-ERK1/2（细胞信号科技公司，马萨诸塞州，丹弗斯）（Cell Signaling Technology,Danvers,MA）、抗-β-微管蛋白、克隆AA2（密理博公司，马萨诸塞州，比尔里卡）（MilliporeCorporation;Billerica,MA）抗体，通过蛋白印迹分析裂解液。通过化学发光基质（ECL PlusTM，安玛西亚法玛西亚生物技术公司，新泽西州，皮斯卡特维）（ECL PlusTM,Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ）来检测该免疫印迹。根据生产厂商的说明（R&D systems公司），进行人类磷酸化-RTK以及MAPK激酶测定（R&D systems）。为进行磷酸化-RTK测定，在NP-40裂解缓冲液中裂解细胞。在加入稀释在测定缓冲液1中的细胞裂解液之前，将在该测定缓冲液1中的测定于室温下封闭一小时，然后于4°C下孵化过夜。将该测定通过化学发光法可视化。为进行磷酸-MAPK测定，在裂解缓冲液6中裂解细胞。加入稀释的细胞裂解液，从而进行测定。于4°C下孵化过夜后，在室温下将该测定与抗-磷酸化-MAPK抗体混合2小时，并且如上所述可视化。
在过表达FGFR2的Ba/F3细胞中，以及在FGFR2-扩增的（amplifed）SNU-16细胞中，FGF7诱导FGFR2的酪氨酸磷酸化以及随后的胞外信号调节激酶1和2（ERK1/2）的激活。在这些细胞中，抗体4B9有效地抑制了配体诱导的FGFR2的酪氨酸磷酸化以及ERK1/2的激活。此外，抗体4B9下调了在SNU-16细胞中的FGFR2蛋白水平。早在暴露于该抗体2小时之后，就观察到了FGFR2蛋白水平的略微下降。在6小时的时间点上，看到了上述蛋白水平的显著减少。
使用磷酸化-MAPK测定，我们研究了在这些细胞系中的下游信号通路的激活，该研究测量了ERK、c-Jun NH2-末端激酶(JNK)、p38 MAPK、AKT、以及它们的下游效应物分子的磷酸化。我们发现，在没有配体刺激的条件下，ERK1/2的磷酸化几乎没有。用FGF7刺激SNU-16细胞显著地增加了ERK1/2的磷酸化。我们观察到了促分裂原-和压力-激活的激酶2(MSK2)、p38αMAPK、90-kD核糖体蛋白激酶1(RSK1)、Akt1、以及p70S6激酶(p70S6K)的磷酸化的增加。抗体4B9有效地阻断了所有由FGF7激活的下游信号蛋白的磷酸化。
实例8：肿瘤异种移植生长的抑制
为了评估体内的抗体4B9的活性，我们试验了抗体4B9对容纳FGFR2基因的扩增的人类癌症异种移植生长的影响。在我们所试验的4种FGFR2扩增细胞系中，只有SNU-16和MFM-223在小鼠中形成了肿瘤。因此，我们试验了抗体4B9针对SNU-16和MFM-223异种移植肿瘤的功效。
根据OLAW实验动物人道关怀和使用的公共健康服务政策以及ILAR实验动物护理和使用指南，我们对所有的小鼠进行了处理。我们实施的所有的体内研究遵循由AVEO实验动物护理和使用委员会认可的科学试验计划。对于SNU-16在体内的研究，将1:1的RPMI 1640（Invitrogen公司，加利福尼亚州，卡尔斯巴德）（Invitrogen,Carlsbad,CA）/基质胶（BD Biosciences公司，加利福尼亚州，圣何塞）（BD Biosciences,San Jose CA）中的5×106个细胞以皮下接种进入10周龄雌性C.B-17SCID小鼠（Taconic公司，纽约，德国镇）（Taconic,Germantown,NY）的右肋部。每周两次使用游标卡尺对肿瘤进行测量。用下式对肿瘤体积进行计算：V=0.5x宽×宽×长。当肿瘤体积接近200mm3时，将小鼠随机分为5组，每组10只动物。次日，使用20mg/kg mIgG（BioXCell公司，新罕布什尔州，西黎巴嫩）（BioXCell;West Lebanon,NH）、2mg/kg 4B9、5mg/kg 4B9、10mg/kg 4B9、或者20mg/kg 4B9，通过腹腔内注射，对小鼠进行处理。在本研究期间，每周两次对小鼠给药。在最终给药七十二小时后，再次测量肿瘤的体积，用于肿瘤生长抑制的计算。使用GraphPad
Figure BDA00002377645200331
4.00版完成所有的统计分析。使用有单向方差分析法以及Tukey多重比较检验分析最终的肿瘤的体积。
用20mg/kg的小鼠IgG或者2、5、10或者20mg/kg的抗体4B9的对照处理SNU-16异种移植肿瘤。如图6中所示，在43天（为在本研究中对照组保留的最后一天）时，与mIgG处理的对照相比较，每个4B9处理组均显示出了显著的肿瘤生长抑制（分别是70%、72%、77%和82%，p<0.001）。所有的处理都是耐受良好的，没有显著的体重减轻。还对这些肿瘤裂解液进行了分析。与FGFR2的酪氨酸磷酸化的抑制一致，抗体4B9下调了在肿瘤中的FGFR2蛋白的总量。在来自在研究结束时收集的肿瘤，用对照IgG或4B9处理的肿瘤样品中，未检测到总ERK1/2或者磷酸化-ERK1/2的显著性差异。与在体外的SNU-16细胞的磷酸化-受体酪氨酸激酶（RTK）曲线相比，SNU-16异种移植的RTK测定分析表明，FGFR2是在体内的主要的经酪氨酸磷酸化的RTK，并且4B9显著抑制了在用4B9处理过的SNU-16肿瘤试验中的两组中的FGFR2酪氨酸磷酸化。在体外，SNU-16细胞的增殖对4B9的处理不敏感。在体内的SNU-16细胞中的FGFR2的酪氨酸磷酸化提示，SNU-16异种移植对体内的激活的FGFR2信号的依赖性解释了他们对用抗体4B9处理的敏感性。
还研究了抗体4B9对体内FGFR2-扩增的乳癌细胞系MFM-223的生长的影响。对于这些研究，将0.72mg 90天释放的17-β雌二醇颗粒（创新研究公司，佛罗里达州，萨拉索塔）(Innovative Research;Sarasota,FL)皮下植入到5周龄雌性NCr裸鼠（Taconic公司，纽约州，德国镇）（Taconic,Germantown,NY）的左肋部，并且将1:1的EMEM（ATCC（美国模式培养物保藏所），弗吉尼亚州，马纳萨斯）（ATCC;Manassas,VA）/基质胶中的10x 106个MFM-223细胞皮下接种进入右肋部。当肿瘤体积接近200mm3时，将小鼠随机分为2组，每组10只动物，并且用20mg/gmIgG（BioXCell公司，新罕布什尔州，西黎巴嫩）（BioXCell;West Lebanon,NH）或者20mg/kg 4B9处理IP。在本研究期间，每周两次对小鼠给药。使用GraphPad
Figure BDA00002377645200341
4.00版完成所有的统计分析。由于在此研究中仅有两个组，最终的体积和重量（第27天，最终给药48小时后）用非配对的双尾t-检验进行分析。
在第25天，在MFM-223异种移植中，与mIgG-处理的对照相比，在4B9处理的小鼠中，肿瘤体积（p=0.0015；图7）与最终肿瘤重量（p=0.0188）的抑制大于66%。所有的处理都是耐受良好的，没有显著的体重减轻。与在SNU-16异种移植中所观察到的类似，于FGFR2的酪氨酸磷酸化的抑制一致，4B9强烈地下调了在肿瘤中的总FGFR2蛋白。来自在研究结束时收集的肿瘤，用对照IgG亦或4B9处理的肿瘤样品的中，未检测到总的或者磷酸化-ERK1/2的显著性差异。
实例9：抗FGFR2抗体的人源化
A.人源化FGFR2抗体的构建
该实例描述了指定为4B9的鼠抗体的人源化，以及生成的人源化抗体的表征。用本领域中熟知的方法设计人源化的抗FGFR2 IIIb抗体。将设计的氨基酸序列转换成密码子最佳化的DNA序列，并且由DNA2.0,Inc.公司进行合成以包括（以如下次序）：5’HindIII限制性酶切位点、Kozak共有序列、氨基末端信号序列、人源化可变区、人类IgG1或Kappa恒定区、终止密码子以及3’EcoRI限制性酶切位点。
使用In-FusionTM PCR克隆（Clontech公司，加利福尼亚州，山景城）（Clontech,Mountain View,CA），经由HindIII和EcoRI位点将这些人源化的重链亚克隆进入pEE6.4（Lonza Biologics公司，瑞士，巴塞尔）（Lonza,Basel,Switzerland）。使用In-FusionTM PCR克隆，经由HindIII以及EcoRI位点，将这些人源化的Kappa轻链亚克隆进入pEE14.4（Lonza公司）。
将人源化抗体链瞬时转染进入293T细胞以产生抗体。纯化抗体以用于后续的体外分析。如以下描述测量人源化的抗体对人类FGFR2 IIIb的结合。这些结果总结于表12与表13中。
这些人源化免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链可变区的每一可能组合列于以下表6中。
表6
  轻链可变区   重链可变区
  Hu4B9-65Kappa(SEQ ID号：40)   Hu4B9-65重(SEQ ID号：35)
  Hu4B9-65Kappa(SEQ ID号：40)   Hu4B9-82,-83重(SEQ ID号：37)
  Hu4B9-82Kappa(SEQ ID号：44)   Hu4B9-65重(SEQ ID号：35)
  Hu4B9-82Kappa(SEQ ID号：44)   Hu4B9-82,-83重(SEQ ID号：37)
  Hu4B9-83Kappa(SEQ ID号：46)   Hu4B9-65重(SEQ ID号：35)
  Hu4B9-83Kappa(SEQ ID号：46)   Hu4B9-82,-83重(SEQ ID号：37)
编码这些人源化4B9抗体的可变区的核酸序列与定义这些人源化4B9抗体的可变区的蛋白序列总结于下（氨基末端信号肽序列未展示）。这些氨基酸序列中的CDR序列（Kabat定义）以粗体显示并且下划线。
编码Hu4B9-65重链可变区的核酸序列（SEQ ID号：34）
1   caagtgcagc tcgtccaatc gggagccgaa gtgaagaagc ctggttcctc ggtaaaagta
61  agctgtaagg cgtccggtta cacgtttacc tcatattgga tgcactgggt cagacaggca
121 cccggacagg gactcgagtg gatgggagcg atctacccgg gcaattcgga cactgattac
181 agccagaaat tcaaggggag ggtcacgatc acggcagatg agagcacatc aacagcctat
241 atggagctgt cgtcgcttcg gagcgaggac acggcggtct actactgctc caaattcgac
301 tattgggggc aggggacctt ggtgaccgtg tcatcc
定义Hu4B9-65重链可变区的蛋白序列（SEQ ID号：35）
1  qvqlvqsgae vkkpgssvkv sckasgytft sywmhwvrqa pgqglewmga iypgnsdtdy
61 sqkfkgrvti tadeststay melsslrsed tavyycskfd ywgqgtlvtv ss
编码Hu4B9-82,-83重链可变区的核酸序列（SEQ ID号：36）
1   caagtgcagc tcgtccaatc gggagccgaa gtgaagaagc ctggttcctc ggtaaaagta
61  agctgtaagg cgtccggtta cacgttttcc tcatattgga tgcactgggt cagacaggca
121 cccggacagg gactcgagtg gatgggagcg atctacccgg gcaattcgga cactgattac
181 agccagaaat tccaggggag ggtcacgatc acggcagatg agagcacatc aacagcctat
241 atggagctgt cgtcgcttcg gagcgaggac acggcggtct actactgctc caaattcgac
301 tattgggggc aggggacctt ggtgaccgtg tcatcc
定义Hu4B9-82,-83重链可变区的蛋白序列（SEQ ID号：37）
1  qvqlvqsgae vkkpgssvkv sckasgytfs sywmhwvrqa pgqglewmga iypgnsdtdy
61 sqkfqgrvti tadeststay melsslrsed tavyycskfd ywgqgtlvtv ss
编码Hu4B9-65Kappa链可变区的核酸序列（SEQ ID号：39）
1   gaaattgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctga gcccgggcga acgcgcgacc
61  ctgagctgcc gcgcgagcag cagcgtgaac tatatgtatt ggtatcagca gaaaccgggc
121 caggcgccgc gcccgtggat ttatctgacc agcaaccgcg cgaccggcgt gccggcgcgc
181 tttagcggca gcggcagcgg caccgattat accctgacca ttagcagcct ggaaccggaa
241 gattttgcgg tgtattattg ccagcagtgg agcagcaacc cgtatacctt tggccagggc
301 accaaactgg aaattaaa
定义Hu4B9-65Kappa链可变区的蛋白序列（SEQ ID号：40）
1  eivltqspat lslspgerat lscrasssvn ymywyqqkpg qaprpwiylt snratgvpar
61 fsgsgsgtdy tltisslepe dfavyycqqw ssnpytfgqg tkleik
编码Hu4B9-82Kappa链可变区的核酸序列（SEQ ID号：43）
1   gaaatcgtac ttactcagag ccctgccaca ttgtcattgt cacccgggga acgcgccaca
61  ctgtcgtgcc gggcttcatc gagcgtgaac tacatgtatt ggtatcaaca gaaaccaggc
121 caagcaccgc gaccttggat ctacttgacg agcaatcgag ccacgggtat ccccgcgagg
181 ttctccggtt cggggtcggg aactgattac acactgacaa tttcctcgct ggagcccgag
241 gacttcgcgg tgtactattg tcagcagtgg tcatccaacc cgtacacgtt tggacagggg
301 acgaagctcg agatcaag
定义Hu4B9-82Kappa链可变区的蛋白序列（SEQ ID号：44）
1  eivltqspat lslspgerat lscrasssvn ymywyqqkpg qaprpwiylt snratgipar
61 fsgsgsgtdy tltisslepe dfavyycqqw ssnpytfgqg tkleik
编码Hu4B9-83Kappa链可变区的核酸序列（SEQ ID号：45）
1   gaaatcgtac ttactcagag ccctgccaca ttgtcattgt cacccgggga acgcgccaca
61  ctgtcgtgcc gggcttcatc gagcgtgaac tacatgtatt ggtatcaaca gaaaccaggc
121 caagcaccgc gaccttggat ctacttgacg agcaatcgag ccacgggtat ccccgcgagg
181 ttctccggtt cggggtcggg aactgatttc acactgacaa tttcctcgct ggagcccgag
241 gacttcgcgg tgtactattg tcagcagtgg tcatccaacc cgtacacgtt tggacagggg
301 acgaagctcg agatcaag
定义Hu4B9-83Kappa链可变区的蛋白序列（SEQ ID号：46）
1  eivltqspat lslspgerat lscrasssvn ymywyqqkpg qaprpwiylt snratgipar
61 fsgsgsgtdf tltisslepe dfavyycqqw ssnpytfgqg tkleik
定义实例9中产生的这些抗体的免疫球蛋白重链可变区的氨基酸序列在图8中进行了比对。氨基末端信号肽序列（用于适当的表达/分泌）没有展示出。CDR1、CDR2以及CDR3（Kabat定义）通过方框来鉴别（见图9）。
定义实例9中的这些抗体的免疫球蛋白轻链可变区的氨基酸序列在图10中进行了比对。氨基末端信号肽序列（用于适当的表达/分泌）没有展示出。CDR1、CDR2以及CDR3（Kabat定义）通过方框来鉴别（见图11）。
表7是一个索引表，展示了在该实例中所讨论的每一序列的SEQ ID号。
表7
  SEQ.ID号   核酸或者蛋白
  34   Hu4B9-65重链可变区—核酸
  35   Hu4B9-65重链可变区—蛋白
  5   Hu4B9-65重链CDR1(Kabat定义)
  6   Hu4B9-65重链CDR2(Kabat定义)
  11   Hu4B9-65重链CDR3(IGMT定义)
  36   Hu4B9-82,-83重链可变区—核酸
  37   Hu4B9-82,-83重链可变区—蛋白
  5   Hu4B9-82,-83重链CDR1(Kabat定义)
  38   Hu4B9-82,-83重链CDR2(Kabat定义)
  11   Hu4B9-82,-83重链CDR3(IGMT定义)
  39   Hu4B9-65轻(kappa)链可变区—核酸
  40   Hu4B9-65轻(kappa)链可变区—蛋白
  41   Hu4B9-65轻(kappa)链CDR1(Kabat定义)
  42   Hu4B9-65轻(kappa)链CDR2(Kabat定义)
  14   Hu4B9-65轻(kappa)链CDR3(Kabat定义)
  43   Hu4B9-82轻(kappa)链可变区—核酸
  44   Hu4B9-82轻(kappa)链可变区—蛋白
  41   Hu4B9-82轻(kappa)链CDR1(Kabat定义)
  42   Hu4B9-82轻(kappa)链CDR2(Kabat定义)
  14   Hu4B9-82轻(kappa)链CDR3(Kabat定义)
  SEQ.ID号   核酸或者蛋白
  45   Hu4B9-83轻(kappa)链可变区—核酸
  46   Hu4B9-83轻(kappa)链可变区—蛋白
  41   Hu4B9-83轻(kappa)链CDR1(Kabat定义)
  42   Hu4B9-83轻(kappa)链CDR2(Kabat定义)
  14   Hu4B9-83轻(kappa)链CDR3(Kabat定义)
鼠以及人源化单克隆抗体重链CDR序列（Kabat、Chothia以及IMGT定义）展示在表8中。
表8
Figure BDA00002377645200391
鼠以及人源化单克隆抗体轻链CDR序列（Kabat、Chothia以及IMGT定义）展示在表9中。
表9
Figure BDA00002377645200401
为了产生最完整的人源化重链或kappa链抗体序列，以上的每一可变序列都结合其对应的人类恒定区。例如，完整的重链包括一个随后是人类IgG1重链恒定序列的重可变序列。完整的kappa链包括一个随后是人类kappa轻链恒定序列的kappa可变序列。
编码人IgG1重链恒定区的核酸序列（SEQ ID号：49）
1   gcctcaacaa aaggaccaag tgtgttccca ctcgccccta gcagcaagag tacatccggg
61  ggcactgcag cactcggctg cctcgtcaag gattattttc cagagccagt aaccgtgagc
121 tggaacagtg gagcactcac ttctggtgtc catacttttc ctgctgtcct gcaaagctct
181 ggcctgtact cactcagctc cgtcgtgacc gtgccatctt catctctggg cactcagacc
241 tacatctgta atgtaaacca caagcctagc aatactaagg tcgataagcg ggtggaaccc
301 aagagctgcg acaagactca cacttgtccc ccatgccctg cccctgaact tctgggcggt
361 cccagcgtct ttttgttccc accaaagcct aaagatactc tgatgataag tagaacaccc
421 gaggtgacat gtgttgttgt agacgtttcc cacgaggacc cagaggttaa gttcaactgg
481 tacgttgatg gagtcgaagt acataatgct aagaccaagc ctagagagga gcagtataat
541 agtacatacc gtgtagtcag tgttctcaca gtgctgcacc aagactggct caacggcaaa
601 gaatacaaat gcaaagtgtc caacaaagca ctcccagccc ctatcgagaa gactattagt
661 aaggcaaagg ggcagcctcg tgaaccacag gtgtacactc tgccacccag tagagaggaa
721 atgacaaaga accaagtctc attgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc
781 gccgttgagt gggagagtaa cggtcagcct gagaacaatt acaagacaac ccccccagtg
841 ctggatagtg acgggtcttt ctttctgtac agtaagctga ctgtggacaa gtcccgctgg
901 cagcagggta acgtcttcag ctgttccgtg atgcacgagg cattgcacaa ccactacacc
961 cagaagtcac tgagcctgag cccagggaag
定义人IgG1重链恒定区的蛋白序列（SEQ ID号：50）
1   astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss
61  glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg
121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn
181 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree
241 mtknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw
301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk
编码人Kappa轻链恒定区的核酸序列（SEQ ID号：51）
1   cgcacagttg ctgcccccag cgtgttcatt ttcccaccta gcgatgagca gctgaaaagc
61  ggtactgcct ctgtcgtatg cttgctcaac aacttttacc cacgtgaggc taaggtgcag
121 tggaaagtgg ataatgcact tcaatctgga aacagtcaag agtccgtgac agaacaggac
181 agcaaagact caacttattc actctcttcc accctgactc tgtccaaggc agactatgaa
241 aaacacaagg tatacgcctg cgaggttaca caccagggtt tgtctagtcc tgtcaccaag
301 tccttcaata ggggcgaatg t
定义人Kappa轻链恒定区的蛋白序列（SEQ ID号：52）
1 rtvaapsvfi fppsdeqlks gtasvvclln nfypreakvq wkvdnalqsg nsqesvteqd
61 skdstyslss tltlskadye khkvyacevt hqglsspvtk sfnrgec
以下序列表示在该实例中描述的每一抗体的实际的或互补的全长重链或轻链序列（即，包含可变区与恒定区序列这二者）。用于这些抗体适当分泌的信号序列还被包括在这些DNA序列5’末端或这些蛋白序列的氨基末端。在此还考虑到，这些可变区序列可以连接至其他恒定区序列，以产生活性的全长IgG重链与轻链。
编码全长人源化Hu4B9-65重链（人源化重链可变区和人IgG1恒定区） 的核酸序列（SEQ ID号：53）
1    atggacatga gagttcctgc tcagctgctc gggttgctgt tgctttggct ccggggtgct
61   aggtgccaag tgcagctcgt ccaatcggga gccgaagtga agaagcctgg ttcctcggta
121  aaagtaagct gtaaggcgtc cggttacacg tttacctcat attggatgca ctgggtcaga
181  caggcacccg gacagggact cgagtggatg ggagcgatct acccgggcaa ttcggacact
241  gattacagcc agaaattcaa ggggagggtc acgatcacgg cagatgagag cacatcaaca
301  gcctatatgg agctgtcgtc gcttcggagc gaggacacgg cggtctacta ctgctccaaa
361  ttcgactatt gggggcaggg gaccttggtg accgtgtcat ccgcctcaac aaaaggacca
421  agtgtgttcc cactcgcccc tagcagcaag agtacatccg ggggcactgc agcactcggc
481  tgcctcgtca aggattattt tccagagcca gtaaccgtga gctggaacag tggagcactc
541  acttctggtg tccatacttt tcctgctgtc ctgcaaagct ctggcctgta ctcactcagc
601  tccgtcgtga ccgtgccatc ttcatctctg ggcactcaga cctacatctg taatgtaaac
661  cacaagccta gcaatactaa ggtcgataag cgggtggaac ccaagagctg cgacaagact
721  cacacttgtc ccccatgccc tgcccctgaa cttctgggcg gtcccagcgt ctttttgttc
781  ccaccaaagc ctaaagatac tctgatgata agtagaacac ccgaggtgac atgtgttgtt
841  gtagacgttt cccacgagga cccagaggtt aagttcaact ggtacgttga tggagtcgaa
901  gtacataatg ctaagaccaa gcctagagag gagcagtata atagtacata ccgtgtagtc
961  agtgttctca cagtgctgca ccaagactgg ctcaacggca aagaatacaa atgcaaagtg
1021 tccaacaaag cactcccagc ccctatcgag aagactatta gtaaggcaaa ggggcagcct
1081 cgtgaaccac aggtgtacac tctgccaccc agtagagagg aaatgacaaa gaaccaagtc
1141 tcattgacct gcctggtgaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgttga gtgggagagt
1201 aacggtcagc ctgagaacaa ttacaagaca acccccccag tgctggatag tgacgggtct
1261 ttctttctgt acagtaagct gactgtggac aagtcccgct ggcagcaggg taacgtcttc
1321 agctgttccg tgatgcacga ggcattgcac aaccactaca cccagaagtc actgagcctg
1381 agcccaggga ag
定义全长人源化Hu4B9-65重链（人源化重链可变区和人IgG1恒定区） 的蛋白序列（SEQ ID号：54）
1   mdmrvpaqll gllllwlrga rcqvqlvqsg aevkkpgssv kvsckasgyt ftsywmhwvr
61  qapgqglewm gaiypgnsdt dysqkfkgrv titadestst aymelsslrs edtavyycsk
121 fdywgqgtlv tvssastkgp svfplapssk stsggtaalg clvkdyfpep vtvswnsgal
181 tsgvhtfpav lqssglysls svvtvpsssl gtqtyicnvn hkpsntkvdk rvepkscdkt
241 htcppcpape llggpsvflf ppkpkdtlmi srtpevtcvv vdvshedpev kfnwyvdgve
301 vhnaktkpre eqynstyrvv svltvlhqdw lngkeykckv snkalpapie ktiskakgqp
361 repqvytlpp sreemtknqv sltclvkgfy psdiavewes ngqpennykt tppvldsdgs
421 fflyskltvd ksrwqqgnvf scsvmhealh nhytqkslsl spgk
编码全长人源化Hu4B9-82,-83重链（人源化重链可变区和人IgG1恒定 区）的核酸序列（SEQ ID号：55）
1   atggacatga gagttcctgc tcagctgctc gggttgctgt tgctttggct ccggggtgct
61  aggtgccaag tgcagctcgt ccaatcggga gccgaagtga agaagcctgg ttcctcggta
121 aaagtaagct gtaaggcgtc cggttacacg ttttcctcat attggatgca ctgggtcaga
181 caggcacccg gacagggact cgagtggatg ggagcgatct acccgggcaa ttcggacact
241 gattacagcc agaaattcca ggggagggtc acgatcacgg cagatgagag cacatcaaca
301 gcctatatgg agctgtcgtc gcttcggagc gaggacacgg cggtctacta ctgctccaaa
361 ttcgactatt gggggcaggg gaccttggtg accgtgtcat ccgcctcaac aaaaggacca
421 agtgtgttcc cactcgcccc tagcagcaag agtacatccg ggggcactgc agcactcggc
481 tgcctcgtca aggattattt tccagagcca gtaaccgtga gctggaacag tggagcactc
541 acttctggtg tccatacttt tcctgctgtc ctgcaaagct ctggcctgta ctcactcagc
601 tccgtcgtga ccgtgccatc ttcatctctg ggcactcaga cctacatctg taatgtaaac
661 cacaagccta gcaatactaa ggtcgataag cgggtggaac ccaagagctg cgacaagact
721 cacacttgtc ccccatgccc tgcccctgaa cttctgggcg gtcccagcgt ctttttgttc
781  ccaccaaagc ctaaagatac tctgatgata agtagaacac ccgaggtgac atgtgttgtt
841  gtagacgttt cccacgagga cccagaggtt aagttcaact ggtacgttga tggagtcgaa
901  gtacataatg ctaagaccaa gcctagagag gagcagtata atagtacata ccgtgtagtc
961  agtgttctca cagtgctgca ccaagactgg ctcaacggca aagaatacaa atgcaaagtg
1021 tccaacaaag cactcccagc ccctatcgag aagactatta gtaaggcaaa ggggcagcct
1081 cgtgaaccac aggtgtacac tctgccaccc agtagagagg aaatgacaaa gaaccaagtc
1141 tcattgacct gcctggtgaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgttga gtgggagagt
1201 aacggtcagc ctgagaacaa ttacaagaca acccccccag tgctggatag tgacgggtct
1261 ttctttctgt acagtaagct gactgtggac aagtcccgct ggcagcaggg taacgtcttc
1321 agctgttccg tgatgcacga ggcattgcac aaccactaca cccagaagtc actgagcctg
1381 agcccaggga ag
定义全长人源化Hu4B9-82,-83重链（人源化重链可变区和人IgG1恒定 区）的蛋白序列（SEQ ID号：56）
1   mdmrvpaqll gllllwlrga rcqvqlvqsg aevkkpgssv kvsckasgyt fssywmhwvr
61  qapgqglewm gaiypgnsdt dysqkfqgrv titadestst aymelsslrs edtavyycsk
121 fdywgqgtlv tvssastkgp svfplapssk stsggtaalg clvkdyfpep vtvswnsgal
181 tsgvhtfpav lqssglysls svvtvpsssl gtqtyicnvn hkpsntkvdk rvepkscdkt
241 htcppcpape llggpsvflf ppkpkdtlmi srtpevtcvv vdvshedpev kfnwyvdgve
301 vhnaktkpre eqynstyrvv svltvlhqdw lngkeykckv snkalpapie ktiskakgqp
361 repqvytlpp sreemtknqv sltclvkgfy psdiavewes ngqpennykt tppvldsdgs
421 fflyskltvd ksrwqqgnvf scsvmhealh nhytqkslsl spgk
编码全长人源化Hu4B9-65轻链（人源化Kappa链可变区和人恒定区） 的核酸序列（SEQ ID号：57）
1   atggacatga gggtgcccgc tcaactgctg gggctgctgc tgctgtggct gagaggagct
61  cgttgcgaaa ttgtgctgac ccagagcccg gcgaccctga gcctgagccc gggcgaacgc
121 gcgaccctga gctgccgcgc gagcagcagc gtgaactata tgtattggta tcagcagaaa
181 ccgggccagg cgccgcgccc gtggatttat ctgaccagca accgcgcgac cggcgtgccg
241 gcgcgcttta gcggcagcgg cagcggcacc gattataccc tgaccattag cagcctggaa
301 ccggaagatt ttgcggtgta ttattgccag cagtggagca gcaacccgta tacctttggc
361 cagggcacca aactggaaat taaacgcaca gttgctgccc ccagcgtgtt cattttccca
421 cctagcgatg agcagctgaa aagcggtact gcctctgtcg tatgcttgct caacaacttt
481 tacccacgtg aggctaaggt gcagtggaaa gtggataatg cacttcaatc tggaaacagt
541 caagagtccg tgacagaaca ggacagcaaa gactcaactt attcactctc ttccaccctg
601 actctgtcca aggcagacta tgaaaaacac aaggtatacg cctgcgaggt tacacaccag
661 ggtttgtcta gtcctgtcac caagtccttc aataggggcg aatgt
定义全长人源化Hu4B9-65轻链（人源化Kappa链可变区和人恒定区） 的蛋白序列（SEQ ID号：58）
1   mdmrvpaqll gllllwlrga rceivltqsp atlslspger atlscrasss vnymywyqqk
61  pgqaprpwiy ltsnratgvp arfsgsgsgt dytltissle pedfavyycq qwssnpytfg
121 qgtkleikrt vaapsvfifp psdeqlksgt asvvcllnnf ypreakvqwk vdnalqsgns
181 qesvteqdsk dstyslsstl tlskadyekh kvyacevthq glsspvtksf nrgec
编码全长人源化Hu4B9-82轻链（人源化Kappa链可变区和人恒定区） 的核酸序列（SEQ ID号：59）
1   atggacatga gggtgcccgc tcaactgctg gggctgctgc tgctgtggct gagaggagct
61  cgttgcgaaa tcgtacttac tcagagccct gccacattgt cattgtcacc cggggaacgc
121 gccacactgt cgtgccgggc ttcatcgagc gtgaactaca tgtattggta tcaacagaaa
181 ccaggccaag caccgcgacc ttggatctac ttgacgagca atcgagccac gggtatcccc
241 gcgaggttct ccggttcggg gtcgggaact gattacacac tgacaatttc ctcgctggag
301 cccgaggact tcgcggtgta ctattgtcag cagtggtcat ccaacccgta cacgtttgga
361 caggggacga agctcgagat caagcgcaca gttgctgccc ccagcgtgtt cattttccca
421 cctagcgatg agcagctgaa aagcggtact gcctctgtcg tatgcttgct caacaacttt
481 tacccacgtg aggctaaggt gcagtggaaa gtggataatg cacttcaatc tggaaacagt
541 caagagtccg tgacagaaca ggacagcaaa gactcaactt attcactctc ttccaccctg
601 actctgtcca aggcagacta tgaaaaacac aaggtatacg cctgcgaggt tacacaccag
661 ggtttgtcta gtcctgtcac caagtccttc aataggggcg aatgt
定义全长人源化Hu4B9-82轻链（人源化Kappa链可变区和人恒定区） 的蛋白序列（SEQ ID号：60）
1   mdmrvpaqll gllllwlrga rceivltqsp atlslspger atlscrasss vnymywyqqk
61  pgqaprpwiy ltsnratgip arfsgsgsgt dytltissle pedfavyycq qwssnpytfg
121 qgtkleikrt vaapsvfifp psdeqlksgt asvvcllnnf ypreakvqwk vdnalqsgns
181 qesvteqdsk dstyslsstl tlskadyekh kvyacevthq glsspvtksf nrgec
编码全长人源化Hu4B9-83轻链（人源化Kappa链可变区和人恒定区） 的核酸序列（SEQ ID号：61）
1   atggacatga gggtgcccgc tcaactgctg gggctgctgc tgctgtggct gagaggagct
61  cgttgcgaaa tcgtacttac tcagagccct gccacattgt cattgtcacc cggggaacgc
121 gccacactgt cgtgccgggc ttcatcgagc gtgaactaca tgtattggta tcaacagaaa
181 ccaggccaag caccgcgacc ttggatctac ttgacgagca atcgagccac gggtatcccc
241 gcgaggttct ccggttcggg gtcgggaact gatttcacac tgacaatttc ctcgctggag
301 cccgaggact tcgcggtgta ctattgtcag cagtggtcat ccaacccgta cacgtttgga
361 caggggacga agctcgagat caagcgcaca gttgctgccc ccagcgtgtt cattttccca
421 cctagcgatg agcagctgaa aagcggtact gcctctgtcg tatgcttgct caacaacttt
481 tacccacgtg aggctaaggt gcagtggaaa gtggataatg cacttcaatc tggaaacagt
541 caagagtccg tgacagaaca ggacagcaaa gactcaactt attcactctc ttccaccctg
601 actctgtcca aggcagacta tgaaaaacac aaggtatacg cctgcgaggt tacacaccag
661 ggtttgtcta gtcctgtcac caagtccttc aataggggcg aatgt
定义全长人源化Hu4B9-83轻链（人源化Kappa链可变区和人恒定区） 的蛋白序列（SEQ ID号：62）
1   mdmrvpaqll gllllwlrga rceivltqsp atlslspger atlscrasss vnymywyqqk
61  pgqaprpwiy ltsnratgip arfsgsgsgt dfltissle pedfavyycq qwssnpytfg
121 qgtkleikrt vaapsvfifp psdeqlksgt asvvcllnnf ypreakvqwk vdnalqsgns
181 qesvteqdsk dstyslsstl tlskadyekh kvyacevthq glsspvtksf nrgec
为了方便，表10提供了一个索引表，展示了在这一实例中所讨论的每一序列的SEQ ID号。
表10
Figure BDA00002377645200471
下表11展示了多种抗体，这些抗体包含全长人源化免疫球蛋白重和轻链的每一个可能组合。
表11
包含这些包含人源化可变区的全长免疫球蛋白重和轻链的三种可能的抗体构建体设计于下：
Hu4B9-65=人源化Hu4B9-65重链可变区以及人类IgG1恒定区(SEQ ID号：54)加上Hu4B9-65轻链可变区以及人类Kappa恒定区(SEQ ID号：58)
Hu4B9-82=人源化Hu4B9-82,-83重链可变区以及人类IgG1恒定区(SEQ ID号：56)加上Hu4B9-82轻链可变区以及人类Kappa恒定区(SEQ ID号：60)Hu4B9-83=人源化Hu4B9-82,-83重链可变区以及人类IgG1恒定区(SEQ ID号：56)加上Hu4B9-83轻链可变区以及人类Kappa恒定区(SEQ ID号：62)
B.人源化的抗FGFR2单克隆抗体的结合亲和性
使用Biacore T100（Biacore（GE医疗保健公司），新泽西州，皮斯卡特维）仪器，通过表面等离子体共振对实例9中产生的单克隆抗体与重组人类FGFR2βIIIb（经切割的rhFGFR2β-IIIb）的相互作用的结合亲和性与动力学进行测量。
根据供应商的说明，使用一个标准的偶联方案，通过胺偶合法（Biacore公司），将山羊抗人IgG Fc（Jackson ImmunoResearch公司，目录编号109-005-098）固定在羧甲基化葡聚糖CM4传感片（Biacore公司）上。使用包含0.05%表面活性剂P20（Biacore公司）的PBS（Invitrogen公司）作为运行缓冲液，在25°C以及37°C下进行这些分析。
在10μl/分钟的流速下，在单个流动细胞中捕获这些纯化的抗体。每一抗体的注射时间不一，以产生一个30与90RU之间的Rmax。以60μl/分钟持续240秒，将缓冲液或稀释在运行缓冲液中的经切割的rhFGFR2β-IIIb连续地注射在参考表面（无捕获的抗体）以及活性表面（有待检测试的抗体）上。持续监测该解离相达900秒。然后在30μl/分钟下，用pH 2.25（从甘氨酸pH 2.0制作（Biacore公司））和pH 2.5（Biacore公司）的甘氨酸的两个60秒的注射来再生该表面。用20与1.25nM（双倍连续稀释）之间的经切割的rhFGFR2β-IIIb浓度实施这些实验。
使用减去两倍参考的BIAevaluation软件（Biacore）的动力学函数确定多个动力学参数。确定每一抗体的动力学参数（ka（结合速率常数），kd（解离速率常数以及KD（平衡解离常数）））。某些纯化的单克隆抗体（即，Hu4B9-65、Hu4B9-82和Hu4B9-83）在25°C下对经切割的rhFGFR2β-IIIb的动力学值总结于表12中。
表12
  抗体   ka(1/Ms)   kd(1/s)   KD(M)   n
  hu4B9-65   2.4E+05   6.5E-05   2.6E-10   4
  hu4B9-82   1.9E+05   9.4E-05   4.9E-10   2
  hu4B9-83   2.6E+05   8.9E-05   3.5E-10   3
表12中的结果证明，当在25°C下进行测试时，这些纯化的抗体具有范围从约260pM至约490nM的亲和力。
某些纯化的单克隆抗体（即，Hu4B9-65、Hu4B9-82和Hu4B9-83）在37°C下对经切割的rhFGFR2β-IIIb的动力学值总结于表13中。
表13
  抗体   ka(1/Ms)   kd(1/s)   KD(M)   n
  hu4B9-65   3.7E+05   2.8E-04   8.9E-10   7
  hu4B9-82   4.0E+05   3.6E-04   9.3E-10   3
  hu4B9-83   3.2E+05   2.9E-04   9.2E-10   3
表13中的结果证明，当在37°C下进行测试时，这些纯化的抗体具有范围从约890pM至约930nM的亲和力。
实例10：人源化抗FGFR2单克隆抗体的抗增殖活性
在基于细胞的增殖测定中，对人源化抗FGFR2抗体的效能进行了评估。将表达FGFR2-IIIb的FDCP-1细胞接种在96孔板中的含有8ng/ml的FGF1以及5μg/ml的肝素的无IL-3培养基中。制备这些抗体的连续稀释并且加入到该板中。孵化2天后，如在实例1中所述，通过MTT测定检测细胞的增殖。
如图12中所示，人源化抗体（Hu4B9-65、Hu4B9-82和Hu4B9-83）证明，FGF1诱导的FDCP-FGFR2-IIIb细胞增殖的剂量依赖性抑制。来自三个独立的实验的4B9、Hu4B9-65、Hu4B9-82和Hu4B9-83的IC50的平均值分别是1.4、4.9、5.7和4.7nM。
通过引用进行结合
出于所有的目的，在此所提到的专利文件和科学论文中的每一篇的完整披露内容均通过引用结合在此。
等效物
可以用其他的具体形式实施本发明而不背离本发明的精神或本质特征。因此，上述的实施方案必须被认为在所有方面是用作说明的而不是对在此所说明的本发明进行限制。因此，本发明的范围是由所附的权利要求书而不是通过上述的说明来指明的，并且在该权利要求书的等效性的含义和范围之内的所有变化均旨在涵盖于其中。
权利要求书

Claims (43)

1.一个分离的结合人类FGFR2的抗体，包括选自以下组的一个免疫球蛋白重链可变区和一个免疫球蛋白轻链可变区，该组由以下项组成：
(a)(i)一个免疫球蛋白重链可变区，该重链可变区包括：一个包括选自由SEQ ID号：5(4B9；Hu4B9-65；Hu4B9-82,-83)与SEQ ID号：7(4B9；Hu4B9-65)组成的组的氨基酸序列的CDRH1，一个包括SEQ ID号：6(4B9；Hu4B9-65)的氨基酸序列的CDRH2，以及一个包括SEQ ID号：11(4B9；Hu4B9-65；Hu4B9-82,-83)的氨基酸序列的CDRH3；以及
(ii)一个免疫球蛋白轻链可变区，该轻链可变区包括：一个包括SEQ ID号：12(4B9)的氨基酸序列的CDRL1，一个包括SEQ ID号：13(4B9)的氨基酸序列的CDRL2，以及一个包括SEQ ID号：14(4B9；Hu4B9-65；Hu4B9-82；Hu4B9-83)的氨基酸序列的CDRL3；
(b)(i)一个免疫球蛋白重链可变区，该重链可变区包括：一个包括选自由SEQ ID号：5(4B9；Hu4B9-65；Hu4B9-82,-83)与SEQ ID号：7(4B9；Hu4B9-65)组成的组的氨基酸序列的CDRH1，一个包括SEQ ID号：6(4B9；Hu4B9-65)的氨基酸序列的CDRH2，以及一个包括SEQ ID号：11(4B9；Hu4B9-65；Hu4B9-82,-83)的氨基酸序列的CDRH3；以及
(ii)一个免疫球蛋白轻链可变区，该轻链可变区包括：一个包括SEQ ID号：41(Hu4B9-65；Hu4B9-82；Hu4B9-83)的氨基酸序列的CDRL1，一个包括SEQ ID号：42(Hu4B9-65；Hu4B9-82；Hu4B9-83)的氨基酸序列的CDRL2，以及一个包括SEQ ID号：14(4B9；Hu4B9-65；Hu4B9-82；Hu4B9-83)的氨基酸序列的CDRL3；以及
(c)(i)一个免疫球蛋白重链可变区，该重链可变区包括：一个包括选自由SEQ ID号：5(4B9；Hu4B9-65；Hu4B9-82,-83)与SEQ ID号：47(Hu4B9-82,-83)组成的组的氨基酸序列的CDRH1，一个包括SEQ ID号：38(Hu4B9-82,-83)的氨基酸序列的CDRH2，以及一个包括SEQ ID号：11(4B9；Hu4B9-65；Hu4B9-82,-83)的氨基酸序列的CDRH3；以及
(ii)一个免疫球蛋白轻链可变区，该轻链可变区包括：一个包括SEQ ID号：41(Hu4B9-65；Hu4B9-82；Hu4B9-83)的氨基酸序列的CDRL1，一个包括SEQ ID号：42(Hu4B9-65；Hu4B9-82；Hu4B9-83)的氨基酸序列的CDRL2，以及一个包括SEQ ID号：14(4B9；Hu4B9-65；Hu4B9-82；Hu4B9-83)的氨基酸序列的CDRL3。
2.如权利要求1所述的抗体，其中这些CDR序列被插入在人类与人源化框架序列之间。
3.一个分离的核酸，包括编码权利要求1所述的免疫球蛋白重链可变区的一个核苷酸序列。
4.一个分离的核酸，包括编码权利要求1所述的免疫球蛋白轻链可变区的一个核苷酸序列。
5.一个表达载体，包含权利要求3所述的核酸。
6.一个表达载体，包含权利要求4所述的核酸。
7.如权利要求6所述的表达载体，进一步地包括权利要求5所述的核酸。
8.一个宿主细胞，包括权利要求5所述的表达载体。
9.一个宿主细胞，包括权利要求6所述的表达载体。
10.一个宿主细胞，包括权利要求7所述的表达载体。
11.如权利要求9所述的宿主细胞，进一步地包括权利要求5所述的表达载体。
12.一个一个生产包含一个免疫球蛋白重链可变区或一个免疫球蛋白轻链可变区的一个多肽的一个方法，该方法包括：
(a)在多种条件下生长权利要求8或9所述的宿主细胞，以使得该宿主细胞表达包括该免疫球蛋白重链可变区或该免疫球蛋白轻链可变区的多肽；并且
(b)纯化包括该免疫球蛋白重链可变区或该免疫球蛋白轻链可变区的多肽。
13.生产结合人类FGFR2的一个抗体或该抗体的一个抗原结合片段的一个方法，该方法包括：
(a)在多种条件下生长权利要求10或11所述的宿主细胞，以使得该宿主细胞表达包含该免疫球蛋白重链可变区和/或该免疫球蛋白轻链可变区的多肽，从而生产该抗体或该抗体的抗原结合片段；并且
(b)纯化该抗体或该抗体的抗原结合片段。
14.一个分离的结合人类FGFR2的抗体，包括选自以下组的一个免疫球蛋白重链可变区和一个免疫球蛋白轻链可变区，该组由以下项组成：
一个包括SEQ ID号：2(4B9)的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区，以及一个包括SEQ ID号：4(4B9)的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区；
(b)一个包括SEQ ID号：35(Hu4B9-65)的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区，以及一个包括SEQ ID号：40(Hu4B9-65)的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区；
(c)一个包括SEQ ID号：37(Hu4B9-82,-83)的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区，以及一个包括SEQ ID号：44(Hu4B9-82)的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区；
(d)一个包括SEQ ID号：37(Hu4B9-82,-83)的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区，以及一个包括SEQ ID号：46(Hu4B9-83)的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区。
15.一个分离的核酸，包括编码权利要求14所述的免疫球蛋白重链可变区的一个核苷酸序列。
16.一个分离的核酸，包括编码权利要求14所述的免疫球蛋白轻链可变区的一个核苷酸序列。
17.一个表达载体，包含权利要求15所述的核酸。
18.一个表达载体，包含权利要求16所述的核酸。
19.如权利要求18所述的表达载体，进一步地包括权利要求15所述的核酸。
20.一个宿主细胞，包括权利要求17所述的表达载体。
21.一个宿主细胞，包括权利要求18所述的表达载体。
22.一个宿主细胞，包括权利要求19所述的表达载体。
23.如权利要求21所述的宿主细胞，进一步地包括权利要求17所述的表达载体。
24.一个一个生产包含一个免疫球蛋白重链可变区或一个疫球蛋白轻链可变区的一个多肽的一个方法，该方法包括：
(a)在多种条件下生长权利要求20或21所述的宿主细胞，以使得该宿主细胞表达包括该免疫球蛋白重链可变区或该免疫球蛋白轻链可变区的多肽；并且
(b)纯化包括该免疫球蛋白重链可变区或该免疫球蛋白轻链可变区的多肽。
25.生产结合人类FGFR2的一个抗体或该抗体的一个抗原结合片段的一个方法，该方法包括：
(a)在多种条件下生长权利要求22或23所述的宿主细胞，以使得该宿主细胞表达包含该免疫球蛋白重链可变区和/或该免疫球蛋白轻链可变区的多肽，从而生产该抗体或该抗体的抗原结合片段；并且
(b)纯化该抗体或该抗体的抗原结合片段。
26.一个分离的结合人类FGFR2的抗体，包括选自以下组的一个免疫球蛋白重链和一个免疫球蛋白轻链，该组由以下项组成：
(a)一个包括SEQ ID号：21(4B9)的氨基酸序列的免疫球蛋白重链，和一个包括SEQ ID号：23(4B9)的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链；
(b)一个包括SEQ ID号：54(Hu4B9-65)的氨基酸序列的免疫球蛋白重链，和一个包括SEQ ID号：58(Hu4B9-65)的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链；
(c)一个包括SEQ ID号：56(Hu4B9-82,-83)的氨基酸序列的免疫球蛋白重链，和一个包括SEQ ID号：60(Hu4B9-82)的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链；以及
(d)一个包括SEQ ID号：56(Hu4B9-82,-83)的氨基酸序列的免疫球蛋白重链，和一个包括SEQ ID号：62(Hu4B9-83)的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。
27.一个分离的核酸，包括编码权利要求26所述的免疫球蛋白重链的一个核苷酸序列。
28.一个分离的核酸，包括编码权利要求26所述的免疫球蛋白轻链的一个核苷酸序列。
29.一个表达载体，包含权利要求27所述的核酸。
30.一个表达载体，包含权利要求28所述的核酸。
31.如权利要求30所述的表达载体，进一步地包括权利要求27所述的核酸。
32.一个宿主细胞，包括权利要求29所述的表达载体。
33.一个宿主细胞，包括权利要求30所述的表达载体。
34.一个宿主细胞，包括权利要求31所述的表达载体。
35.如权利要求33所述的宿主细胞，进一步地包括权利要求29所述的表达载体。
36.生产包含一个免疫球蛋白重链可变区或一个免疫球蛋白轻链可变区的一个多肽的一个方法，该方法包括：
(a)在多种条件下生长权利要求32或33所述的宿主细胞，以使得该宿主细胞表达包括该免疫球蛋白重链可变区或该免疫球蛋白轻链可变区的多肽；并且
(b)纯化包括该免疫球蛋白重链可变区或该免疫球蛋白轻链可变区的多肽。
37.生产结合人类FGFR2的一个抗体或该抗体的一个抗原结合片段的一个方法，该方法包括：
(a)在多种条件下生长权利要求34或35所述的宿主细胞，以使得该宿主细胞表达包含该免疫球蛋白重链可变区和/或该免疫球蛋白轻链可变区的多肽，从而生产该抗体或该抗体的抗原结合片段；并且
(b)纯化该抗体或该抗体的抗原结合片段。
38.如权利要求1、14、或26中所述的抗体，其中该抗体具有如通过表面等离子体共振测量的500pM或更低的KD。
39.一个抑制或降低肿瘤细胞增殖的方法，包括将该细胞暴露于有效量的权利要求1、14、或26中所述的抗体，以抑制或降低该肿瘤细胞增殖。
40.一个抑制或降低哺乳动物中的肿瘤细胞生长的方法，该方法包括将该哺乳动物暴露于有效量的权利要求1、14、或26中所述的抗体，以抑制或或降低该肿瘤增殖。
41.一个治疗哺乳动物中的癌症的方法，该方法包括将有效量的权利要求1、14、或26中所述的抗体给予需要其的哺乳动物。
42.权利要求41所述的方法，其中该癌症是选自下组，该组由以下项组成：乳癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌以及头颈癌。
43.权利要求41所述的方法，其中该哺乳动物是人类。
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