KR20130065665A - 항-fgfr2 항체 - Google Patents

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아베오 파마슈티컬즈, 인크.
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Abstract

사람 FGFR2에 결합하여 사람 FGFG2의 생물학적 활성을 억제하는 단일클론 항체들이 개시된다. 이 항체들은 FGFR2의 활성 또는 과발현과 관련된 암의 소정 형태들을 포함하는 세포 증식성 질병 및 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.

Description

항-FGFR2 항체{ANTI-FGFR2 ANTIBODIES}
관련 출원들의 상호 참조
본 출원은 2010년 5월 11일에 출원된 미국 가출원 제61/333,590호의 이익 및 우선권을 주장하고, 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 분야는 분자 생물학, 면역학 및 종양학이다. 더 구체적으로, 분야는 사람 FGFR2에 결합하는 항체들 에 관한 것이다.
BEK, BFR-1, CD332, CEK3, CFD1, ECT1, FLJ98662, JWS, KGFR(FGFR2(IIIB)로도 알려져 있음), K-SAM, TK14, 및 TK25로도 알려져 있는 섬유아세포 증식 인자 수용체 2(FGFR2)는 FGF들과 결합함으로써 섬유아세포 증식 인자(FGF) 신호전달을 매개하는 네 가지 고보존 수용체 티로신 키나제(FGFR1, FGFR2, FGFR3, 및 FGFR4) 중 하나이다. FGF 수용체는 둘 또는 셋의 세포외 면역글로불린 유사 도메인(IgD1, IgD2, 및 IgD3), 싱글-패스 경막 도메인, 및 세포질의 티로신 키나제 도메인을 특징으로 한다. FGF 리간드 결합은 FGF 수용체 이합체화 및 티로신 자기인산화를 유도하여, 세포 증식, 분화 및 이동이 일어난다(Turner et al . (2010) NATURE REVIEWS CANCER 10:116-129; Beenken et al . (2009) NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY 8:235-254; Gomez-Roman et al . (2005) CLIN. CANCER RES. 11:459-65; Chang et al . (2005) BLOOD 106:353-6; Eswarakumar et al . (2005) CYTOKINE GROWTH FACTOR REV. 16:139-49).
IgD3 도메인에서 선택적 스플라이싱(alternative splicing)은 FGFR1, FGFR2, 및 FGFR3의 IIIb 또는 IIIc 동형(isoform) 중 어느 하나를 생성한다. FGFR4 유전자는 IIIc 동형으로서만 발현된다. FGF 수용체들의 다른 동형들은 조직-특이적 발현을 나타내고, 이들은 18가지 포유동물의 FGF들의 다른 스펙트럼에 반응한다(Beenken et al ., supra). 헤파란 설페이트 프로테오글리칸이 존재할 때에 FGFR들에 대한 FGF들의 결합은 특이적 세포내 티로신 잔기들에서 FGFR들의 자기인산화를 유도한다. 이는 FGFR 기질 2α(FRS2α)와 같은 어댑터 분자들의 인산화를 야기하고, 이 인산화는 다른 단백질들을 보충하여 미토젠(mitogen)-활성 단백질 키나제(MAPK) 경로 및 포스포이노시티드(phosphoinositide) 3-키나제(PI3K)/Akt 경로를 포함한 다양한 신호전달 케스케이드들을 활성화한다(Beenken et al ., supra; Eswarakumar et al ., supra; Turner et al ., supra).
조절부전 FGF 신호전달은 암 세포들의 증식을 직접 구동할 수 있고, 암 줄기 세포들의 생존을 촉진할 수 있고, 종양 혈관생성을 지원할 수 있다고 제시되었다(Turner et al ., supra). FGFR2 신호전달은 암에 역할을 하는 것으로 나타난다. FGFR2 유전자에서 미스센스 돌연변이는 자궁내막암(Pollock et al., 2007, ONCOGENE 26:7158-7162; Dutt et al., 2008, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 105:8713-8717), 난소암, 유방암, 폐암(Greenman et al., 2007, Nature 446:153-158; Ding et al., 2008, NATURE 455:1069-1075; Davies et al., 2005, CANCER RES. 65:7591-7595), 및 위암(Jang et al., 2001, CANCER RES. 61:3541-3543)을 포함하는 다양한 암들에서 발생한다. 이들 활성화 변종들 중 일부는 또한 골격장애를 가진 환자들에서 보고되었다(Dutt et al., supra). 두 가지 독립적인 광범위 유전체 관련 연구들은 FGFR2 유전자에서 특이적 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphisms(SNPs))을 유방암에 대한 민감성의 증가에 관련시켰다(Easton et al., 2007, NATURE 447:1087-1093; Hunter et al., 2007, NAT. GENET. 39:870-874). 이들 암 관련 SNP들은 FGFR2 유전자 발현을 높이는 것으로 나타난다(Meyer et al., 2008, PLOS BIOL. 6:e108). 사람 염색체 10q26에 위치된 FGFR2 유전자는 유방암(Adnane et al., 1991, ONCOGENE 6:659-663; Turner et al., 2010, ONCOGENE 29:2013-2023) 및 위암(Hara et al., 1998, LAB. INVEST. 78:1143-1153; Mor et al., 1993, CANCER GENET. CYTOGENET. 65:111-114)의 부분집합에서 증폭된다.
자연적으로 발생하는 항체들은 4개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 다중결합 단백질이다(도 1). 폴리펩티드 쇄들 중 두 개는 면역글로불린 중쇄(H 쇄)로 지칭되고, 나머지 두 개는 면역글로불린 경쇄(L 쇄)로 지칭된다. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄들은 쇄간 디설피드 결합에 의해 연결된다. 면역글로불린 중쇄들은 쇄간 디설피드 결합들에 의해 연결된다. 경쇄는 하나의 가변 영역(도 1에서 VL)과 하나의 불변 영역(도 1에서 CL)으로 구성된다. 중쇄는 하나의 가변 영역(도 1에서 VH)과 적어도 세 개의 불변 영역들(도 1에서 CH1, CH2 및 CH3)로 구성된다. 가변 영역들은 항체의 특이성을 결정한다. 자연적으로 발생하는 항체들은 키메라 항체들 및 사람화 항체들과 같은 조작된 항체들을 위한 출발 물질로서 사용되어왔다.
각 가변 영역은 프레임워크 영역(FR)들로서 알려져 있는 네 개의 상대적으로 보존된 영역들 옆에 있는 상보성 결정 영역(CDR)들로 알려져 있는 세 개의 초가변 영역을 포함한다. CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 표시된 세 개의 CDR은 항체 결합 특이성에 기여한다.
사람 FGFR2에 대해 특이적인 억제 항체들은 마우스와 사람 FGFR2 사이의 높은 상동성 때문에 생성하기가 어려웠었다. 특히, 마우스 및 사람 FGFR2의 리간드 결합 도메인은 약 98% 서열 동일성을 공유한다(Wei et al ., 2006, HYBRIDOMA 25:115-124). 그러므로, 치료제로서 사용될 수 있는 개선된 FGFR2 항체들이 필요하다.
본 발명은 사람 FGFR2에 특이적으로 결합하는 항체 군의 발견에 근거한다. 항체들은 FGFR2에 특이적으로 결합하는 항체의 CDR들에 근거한 FGFR2 결합 부위들을 포함한다. 치료제로서 사용시, 항체들은 조작, 즉 사람 환자에 투여시 면역반응을 감소시키거나 없애기 위해 사람화된다.
본 발명의 항체들은 사람 FGFR2의 활성화를 예방 또는 억제(즉, 무력화)한다. 본 발명의 항체들은 생체외 또는 생체내 종양 세포들의 증식을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 사람 암환자(또는 동물 모델)에 투여시, 항체들은 사람 환자(또는 동물 모델)에서 종양 성장을 억제하거나 감소시킨다.
본 발명의 이들 및 기타 양태 및 장점들은 하기 도면들, 상세한 설명 및 청구항들에 의해 예시된다. 본원에서 사용된 것처럼, "포함하는(including)"은 제한이 없고, 언급된 실시예들이 비제한적이라는 것을 의미한다.
본 발명은 다음 도면들을 참조하여 더 완전하게 이해될 수 있다.
도 1(선행기술)은 전형적인 항체의 모식도이다.
도 2는 FGF2(●), FGF7(▽), FGF9(□) 및 FGF10(x)에 의한 FGFR2-IIIb-발현 FDCP-1 세포들의 증식의 자극을 측정한 실험으로부터 얻은 결과들을 요약한 그래프이다.
도 3는 FGF2(●), FGF7(▽), FGF9(□) 및 FGF10(x)에 의한 FGFR2-IIIc-발현 FDCP-1 세포들의 증식의 자극을 측정한 실험으로부터 얻은 결과들을 요약한 그래프이다.
도 4는 항체 4B9를 이용하는 치료에 의한 와일드 타입 FGFR2-IIIb(□), 와일드 타입 FGFR2-IIIc(▽), 또는 절형(truncated) FGFR2-IIIb(*)를 발현하는 FDCP-1 세포들의 증식의 억제를 측정한 실험으로부터 얻은 결과들을 요약한 그래프이다.
도 5는 항체 4B9 를 이용하는 치료에 의한 와일드 타입 FGFR2-IIIb(□), FGFR2-IIIb S252W(■), 또는 FGFR2-IIIb N550K(▲)를 발현하는 FDCP-1 세포들의 증식의 억제를 측정한 실험으로부터 얻은 결과들을 요약한 그래프이다.
도 6은 항체 4B9를 2 mg/kg(본원에서 "mpk"로도 지칭)(○), 5 mpk(△), 10 mpk(x) 또는 20 mpk(*)로, 음성 대조로서 mIgG 20 mpk(◆)를 이용하는 치료에 의한 SNU-16 이종이식 종양들의 성장 억제를 측정한 실험으로부터 얻은 결과들을 요약한 그래프이다.
도 7은 FGFR2-증폭된 유방암 세포주 MFM-223(쥐과 동물 IgG(◆)의 생체내 성장에 대한 항체 4B9(○)의 효과를 측정한 실험으로부터 얻은 결과들을 요약한 그래프이다.
도 8은 4B9(SEQ ID NO: 2)의 완전한 쥐과 동물 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 Hu4B9-65(SEQ ID NO: 35) 및 Hu4B9-82, -83(SEQ ID NO: 37)로 표시된 완전한 사람화 중쇄 가변 영역들의 아미노산 서열들을 나타낸 모식도이다. 각 중쇄 가변 영역들의 아미노산 서열들은 서로 정렬되고, 상보성 결정 서열(CDR)(Kabat 정의), CDR1, CDR2, 및 CDR3이 박스들로 구분된다. 박스가 없는 서열들은 프레임워크(FR) 서열들을 나타낸다.
도 9는 도 8에 나타낸 가변 영역 서열들 각각에 대한 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열(Kabat 정의)을 도시한 모식도이다.
도 10은 4B9(SEQ ID NO: 4)의 완전한 쥐과 동물 면역글로불린 경쇄 가변 영역 및 Hu4B9-65(SEQ ID NO: 40), Hu4B9-82(SEQ ID NO: 44), 및 Hu4B9-83(SEQ ID NO: 46)로 표시된 완전 사람화 경쇄 가변 영역들의 아미노산 서열을 도시한 모식도이다. 각 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열들은 서로 정렬되고, CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열들(Kabat 정의)은 박스들로 구분된다. 박스화되지 않은 서열들은 프레임워크(FR) 서열을 나타낸다.
도 11은 도 10에 나타낸 가변 영역 서열들 각각에 대한 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열(Kabat 정의)을 도시한 모식도이다.
도 12는 항체 4B9(□), Hu4B9-65 (▲), Hu4B9-82 (▼) 및 Hu4B9-83 (◆)를 이용하는 치료에 의한 와일드 타입 FGFR2-IIIb를 발현하는 FDCP-1 세포들의 증식 억제를 측정한 실험으로부터 얻은 결과들을 요약한 그래프이다.
본 발명의 FGFR2 항체들은 사람 FGFR2 폴리펩티드들의 생물학적 활성을 무력화시키는 것을 근거로 선택된 단일 클론 항체들의 항원 결합 부위들에 근거한다. 항체들은 사람 FGFR2를 위한 결합 부위를 정의하는 면역글로불린 가변 영역 CDR 서열들을 포함한다.
이들 항체들의 무력화 활성 때문에, 이들은 특정 암세포 및 종양의 성장 및/또는 증식 억제에 유용하다. 항체들은 사람 환자에 투여시 면역 반응을 최소화하거나 없애기 위해 조작될 수 있다. 본 발명의 다양한 특징들 및 양태들이 아래에서 더욱 상세히 논의된다.
본원에서 사용된 것처럼, 별도의 표시가 없으면, "항체"라는 용어는, 변형, 조작, 또는 화학적으로 공액화된 온전한 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 온전한 항체(예를 들어, 온전한 단일 클론 항체) 또는 항체의 항원-결합 단편(예를 들어, 단일 클론 항체의 항원-결합 단편)을 의미한다. 변형 또는 조작된 항체들의 예들은 키메라 항체, 사람화 항체, 및 다중특이 항체(예를 들어, 2중특이 항체)들이다. 항원-결합 단편들의 예들은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단쇄 항체 (예를 들어, scFv), 및 디아바디(diabodies)를 포함한다. 독소 모이어티에 공액화된 항체는 화학적으로 공액화된 항체의 예이다.
사람 FGFR2 에 결합하는 항체
본 발명의 항체는 (a) CDRH1-CDRH2-CDRH3 구조를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및 (b) CDRL1-CDRL2-CDRL3 구조를 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역과 상기 경쇄 가변 영역은 함께 사람 FGFR2에 결합하기 위한 단일 결합 부위를 정의한다.
본원에 개시된 것처럼, 항체는 (a) CDRH1-CDRH2-CDRH3 구조를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및 (b) 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 상기 중쇄 가변 영역과 상기 경쇄 가변 영역은 함께 사람 FGFR2에 결합하기 위한 단일 결합 부위를 정의한다. CDRH1은 SEQ ID NO: 5(4B9; Hu4B9 -65; Hu4B9 -82, -83), SEQ ID NO: 7(4B9; Hu4B9 -65), 및 SEQ ID NO: 47( Hu4B9 -82, -83)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; CDRH2는 SEQ ID NO: 6(4B9; Hu4B9 -65) 및 SEQ ID NO: 38(Hu4B9 -82, -83)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, CDRH3는 아미노산 서열 FDY(4B9; Hu4B9 -65; Hu4B9 -82, -83) 및 SEQ ID NO: 11(4B9; Hu4B9 -65; Hu4B9 -82, -83)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 명세서 전체에서, 특정 SEQ ID NO. 뒤에는 그 서열의 기원이었던 항체가 괄호로 표시된다. 예를 들어, "SEQ ID NO: 47( Hu4B9 -82, -83)"은 SEQ ID NO: 47이 Hu4B9-82, -83으로 표시된 항체 4B9로부터 나온다는 것을 의미한다.
일부 실시예들에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 7(4B9; Hu4B9-65; Hu4B9 -82, -83)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, SEQ ID NO: 6(4B9; Hu4B9-65)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 SEQ ID NO: 11(4B9; Hu4B9 -65; Hu4B9-82, -83)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함한다.
일부 실시예들에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5(4B9; Hu4B9 -65; Hu4B9 -82, -83) 또는 SEQ ID NO: 47( Hu4B9 -82, -83)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, SEQ ID NO: 38( Hu4B9 -82, -83)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 SEQ ID NO: 11(4B9; Hu4B9 -65; Hu4B9 -82, -83)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함한다.
바람직하게, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 서열은 사람 또는 사람화 면역글로불린 FR들 사이에 개재된다. 항체는 온전한 항체이거나 항원-결합 항체 단편일 수 있다.
다른 실시예들에서, 항체는 (a) CDRL1-CDRL2-CDRL3 구조를 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역, 및 (b) 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 IgG 경쇄 가변 영역과 상기 IgG 중쇄 가변 영역은 함께 사람 FGFR2에 결합하기 위한 단일 결합 부위를 정의한다. CDRL1은 SEQ ID NO: 12(4B9) 및 SEQ ID NO: 41( Hu4B9 -65; Hu4B9-82; Hu4B9 -83)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; CDRL2는 SEQ ID NO: 13(4B9) 및 SEQ ID NO: 42( Hu4B9 -65; Hu4B9 -82; Hu4B9 -83)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, CDRL3는 SEQ ID NO: 14(4B9; Hu4B9-65; Hu4B9 -82; Hu4B9 -83)의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예들에서, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12(4B9)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 및 SEQ ID NO: 13(4B9)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 SEQ ID NO: 14(4B9; Hu4B9 -65; Hu4B9 -82; Hu4B9 -83)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함한다.
일부 실시예들에서, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 41( Hu4B9 -65; Hu4B9 -82; Hu4B9 -83)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, SEQ ID NO: 42( Hu4B9 -65; Hu4B9 -82; Hu4B9 -83)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 SEQ ID NO: 14(4B9; Hu4B9 -65; Hu4B9 -82; Hu4B9 -83)의 아미노산 서열들을 포함하는 CDRL3을 포함한다.
바람직하게, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 서열은 사람 또는 사람화 면역글로불린 FR들 사이에 개재된다. 항체는 온전한 항체이거나 항원-결합 항체 단편일 수 있다.
일부 실시예들에서, 항체는 (a) CDRH1-CDRH2-CDRH3 구조를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및 (b) CDRL1-CDRL2-CDRL3 구조를 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역과 상기 경쇄 가변 영역은 함께 사람 FGFR2에 결합하기 위한 단일 결합 부위를 정의한다. CDRH1은 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 7(4B9; Hu4B9 -65; Hu4B9 -82, -83)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; CDRH2는 SEQ ID NO: 6(4B9; Hu4B9 -65) 및 SEQ ID NO: 38( Hu4B9 -82, -83)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열이고, CDRH3은 아미노산 서열 FDY 및 SEQ ID NO: 11(4B9; Hu4B9 -65; Hu4B9 -82, -83)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열이다. CDRL1은 SEQ ID NO: 12(4B9) 및 SEQ ID NO: 41( Hu4B9 -65; Hu4B9-82; Hu4B9 -83)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열이고; CDRL2는 SEQ ID NO: 13(4B9) 및 SEQ ID NO: 42( Hu4B9 -65; Hu4B9 -82; Hu4B9 -83)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열이고, CDRL3은 SEQ ID NO: 14(4B9; Hu4B9 -65; Hu4B9-82; Hu4B9 -83)의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시예에서, 항체는 SEQ ID NO: 2(4B9), SEQ ID NO: 35( Hu4B9 -65), 및 SEQ ID NO: 37( Hu4B9 -82, -83)로 구성되는 군으로부터 선택된 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO: 4(4B9), SEQ ID NO: 40( Hu4B9 -65), SEQ ID NO: 44(Hu4B9-82) 및 SEQ ID NO: 46( Hu4B9 -83)으로 구성되는 군으로부터 선택된 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시예에서, 항체는 SEQ ID NO: 2(4B9)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역과, SEQ ID NO: 4(4B9)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시예에서, 항체는 SEQ ID NO: 35( Hu4B9 -65)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역과, SEQ ID NO: 40( Hu4B9 -65)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시예에서, 항체는 SEQ ID NO: 37( Hu4B9 -82, -83)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역과, SEQ ID NO: 44( Hu4B9 -82)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시예에서, 항체는 SEQ ID NO: 37( Hu4B9 -82, -83)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역과, SEQ ID NO: 46( Hu4B9 -83)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 실시예에서, 항체는 (i) SEQ ID NO: 21(4B9), SEQ ID NO: 54( Hu4B9 -65), 및 SEQ ID NO: 56( Hu4B9 -82, -83)으로 구성되는 군으로부터 선택된 면역글로불린 중쇄, 및 (ii) SEQ ID NO: 23(4B9), SEQ ID NO: 58( Hu4B9 -65), SEQ ID NO: 60(Hu4B9-82) 및 SEQ ID NO: 62( Hu4B9 -83)로 구성되는 군으로부터 선택된 면역글로불린 경쇄를 포함한다.
임의의 실시예에서, 항체는 (i) SEQ ID NO: 21(4B9)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄, 및 (ii) SEQ ID NO: 23(4B9)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 포함한다.
임의의 실시예에서, 항체는 (i) SEQ ID NO: 54( Hu4B9 -65)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄, 및 (ii) SEQ ID NO: 58( Hu4B9 -65)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 포함한다.
임의의 실시예에서, 항체는 (i) SEQ ID NO: 56( Hu4B9 -82, -83)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄, 및 (ii) SEQ ID NO: 60( Hu4B9 -82)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 포함한다.
임의의 실시예에서, 항체는 (i) SEQ ID NO: 56( Hu4B9 -82, -83)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄, 및 (ii) SEQ ID NO: 62( Hu4B9 -83)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 포함한다.
다른 실시예에서, 사람 FGFR2에 결합하는 분리된 항체는 전체 가변 영역 또는 SEQ ID NO: 2(4B9), SEQ ID NO: 35( Hu4B9 -65), 및 SEQ ID NO: 37( Hu4B9 -82, -83)의 프레임워크 영역 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 실시예에서, 사람 FGFR2에 결합하는 분리된 항체는 전체 가변 영역 또는 SEQ ID NO: 4(4B9), SEQ ID NO: 40( Hu4B9 -65), SEQ ID NO: 44( Hu4B9 -82), 및 SEQ ID NO: 46( Hu4B9 -83)의 프레임워크 영역 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
상동성 또는 동일성은 이 분야의 기술에 속하는 다양한 방법들, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 대중적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 판단될 수 있다. Blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx 프로그램들(참고로 포함된 Karlin et al., (1990) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 87, 2264-2268; Altschul, (1993) J. MOL. EVOL. 36, 290-300; Altschul et al., (1997) NUCLEIC ACIDS RES. 25, 3389-3402)에 채용된 알고리즘을 이용한 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 분석이 서열 유사성 검색을 위해 조정된다. BLAST 프로그램에 사용된 접근법은 먼저 요청 서열과 데이터베이스 서열 간 유사한 단편들을 고려하고, 이 후 확인된 모든 서열들의 통계적 중요성을 평가하고, 마지막으로 미리 선택된 중요한 임계치를 만족시키는 서열들만을 요약하는 것이다. 서열 데이터베이스의 유사성 검색에서 기본 문제들의 논의를 위해, 전체가 참고로 포함된 Altschul et al., (1994) NATURE GENETICS 6, 119-129를 참조한다. 이 기술에서 통상의 지식을 가진 자들은 비교되는 서열들의 전장에 대해 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의 알고리즘들을 포함하는 정렬을 측정하기 위한 적합한 매개변수들을 판단할 수 있다. 히스토그램, 설명, 정렬, 기대(즉, 데이터베이스 서열에 대해 일치하는 서열을 보고하기 위한 통계적 중요 임계치), 컷오프, 매트릭스, 및 필터에 대한 검색 매개변수들은 디폴트 설정된다. Blastp, blastx, tblastn, 및 tblastx에 사용된 디폴트 스코어링 매트릭스는 BLOSUM62 매트릭스(전체가 참고로 포함된 Henikoff et al., (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89, 10915-10919)이다. 네 가지 blastn 매개변수들은 다음과 같이 조정될 수 있다: Q=10 (갭 생성 페널티); R=10 (갭 연장 페널티); 윙크(wink)=1 (쿼리(query)를 통하여 모든 winkth 위치에서 word hits를 생성); 및 gapw=16 (갭이 있는 정렬이 생성되는 윈도우 폭을 설정). 등가의 Blastp 매개변수 설정은 Q=9; R=2; wink=1; 그리고 gapw=32일 수 있다. 검색은 또한 NCBI(National Center for Biotechnology Information) BLAST Advanced Option 매개변수(예: -G, 갭[정수]을 열기 위한 비용: 디폴트=뉴클레오티드의 경우 5/ 단백질의 경우 11; -E, 갭[정수]을 확장하기 위한 비용: 디폴트 = 뉴클레오티드의 경우 2/ 단백질의 경우 1; -q, 뉴클레오티드 미스매치[Integer]에 대한 페널티: 디폴트= -3; -r, 뉴클레오티드 매치[Integer]에 대한 보상: 디폴트 = 1; -e, 기대치[실제]: 디폴트 = 10; -W, 워드사이즈[정수]: 디폴트 = 뉴클레오티드의 경우 11/ 메가블라스트의 경우 28/ 단백질의 경우 3; -y, 비트로 블라스트 연장의 경우 드롭오프 (X): 디폴트 = blastn의 경우 20/ 기타의 경우 7; -X, 갭이 있는 정렬의 경우 X 드롭오프 값 (비트): 디폴트 = blastn에 적용불가한 모든 프로그램의 경우 15; 그리고 -Z, 갭이 있는 정렬의 경우 최종 X 드롭오프 값 (비트): blastn의 경우 50, 기타의 경우 25)를 사용하여 수행될 수 있다. 쌍으로 단백질이 정렬하는 경우 ClustalW가 사용될 수도 있다(디폴트 매개변수들은, 예를 들어, Blosum62 매트릭스 및 갭 오프닝 페널티 = 10 및 갭 연장 페널티 = 0.1). GCG 패키지 버전 10.0에서 사용가능한 서열들 간 Bestifit 비교는 매개변수 GAP=50(갭 생성 페널티) 및 LEN=3(갭 연장 페널티)를 사용하고, 단백질 비교에서 등가의 설정은 GAP=8과 LEN=2이다.
전술한 실시예들 각각에서, 본원에서는 사람 FGFR2에 함께 결합하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열들 및/또는 경쇄 가변 영역 서열들이 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역들에서 아미노산 변동(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 10개의 아미노산 치환, 삭제, 또는 추가)을 포함할 수 있다고 생각된다.
일부 실시예에서, 분리된 항체는 사람 FGFR2와 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 950 pM, 900 pM, 850 pM, 800 pM, 750 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 550 pM, 500 pM, 450 pM, 400 pM, 350 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM, 100 pM, 50 pM이하의 KD를 갖고서 결합한다. 별도로 특정되지 않으면, KD 값들은, 예를 들어, 실시예 5와 9에서 설명된 조건들 하에서 표면 플라즈몬 공명 방법들에 의해 결정된다.
항체의 생산
본 발명의 항체들을 생산하는 방법들은 이 기술에서 알려져 있다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역들과 중쇄 가변 영역들을 인코딩하는 DNA 분자들은 본원에서 제공된 서열 정보를 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 합성 DNA 분자들은, 예를 들어 일정한 영역 코딩 서열들 및 발현 조절 서열들을 포함하는 기타 적절한 뉴클레오티드 서열에 묶여져서, 원하는 항체를 암호화하는 종래의 유전자 발현 구조체(construct)를 생산할 수 있다. 정의된 유전자 구조체들의 생산은 이 기술의 통상적인 범주에 속한다. 대안적으로, 본원에서 제시된 서열들은, 본원에서 제공된 서열 정보 또는 융합세포들에서 쥐과 동물 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자들에 관한 선행기술의 서열 정보에 기반한 서열을 가지는 합성 핵산 탐침을 사용하여, 종래의 혼성화 기술 또는 중합효소 연쇄반응(PCR) 기술에 의해 융합세포들로부터 복제될 수 있다.
원하는 항체들을 인코딩하는 핵산들은 종래의 형질주입 또는 형질전환 기술을 통해 숙주세포로 도입될 수 있는 발현 벡터에 결합(연결)될 수 있다. 예시적인 숙주 세포들은, IgG 단백질을 달리 생산하는 대장균(E. coli) 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 헬라 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 사람 간세포성 암종 세포(예: Hep G2), 및 골수종 세포이다. 형질전환된 숙주 세포들은, 숙주 세포들이 면역글로불린 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역을 인코팅하는 유전자들을 발현하도록 하는 조건들 하에서 성장될 수 있다.
특이적 발현 및 정제 조건들은 채용된 발현 시스템에 따라 변할 것이다. 예를 들어, 유전자가 대장균에서 발현되면, 적합한 세균성 촉진제, 예를 들어 Trp 또는 Tac, 및 원핵 신호 서열로부터 조작된 유전자를 하향 위치시킴으로써 유전자가 발현벡터로 먼저 복제된다. 발현되어 분비된 단백질은 굴절소체 또는 봉입체에 축적되고, 프렌치 프레스 또는 소리 생성(sonification)에 의해 세포들의 파괴 후 채취될 수 있다. 이후 굴절소체들은 가용화되고, 단백질들은 이 기술에서 공지된 방법들에 의해 접혀져서 절단된다.
조작된 유전자가 진핵 숙주 세포, 예를 들어 CHO 세포에서 발현되면, 이 구조체는 적합한 진핵 촉진제, 분비 신호, IgG 증폭자(enhancer), 및 다양한 비발현부위(intron)를 포함하는 발현 벡터로 먼저 삽입된다. 이 발현 벡터는 발현될 중쇄 또는 경쇄의 전체 또는 일부를 인에이블하는 불변 영역의 전부 또는 일부를 인코딩하는 서열들을 선택적으로 포함한다. 유전자 구조체는 종래의 기술들을 사용하여 진핵 숙주 세포들로 도입될 수 있다. 숙주 세포들은 VL 또는 VH 단편들, VL-VH 헤테로다이머, VH-VL 또는 VL-VH 단쇄 폴리펩티드, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 부분들을 발현하고, 상기 부분들의 각각은 다른 기능(예를 들어, 세포독성)을 갖는 모이어티에 부착될 수 있다. 일부 실시예들에서, 숙주 세포는 중쇄(예를 들어, 중쇄 가변 영역) 또는 경쇄(예를 들어, 경쇄 가변 영역)의 전부 또는 일부를 발현하는 폴리펩티드를 발현하는 단일 벡터로 형질주입된다. 다른 실시예들에서, 숙주 세포는 (a) 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드, 또는 (b) 전체 면역글로불린 중쇄 및 전체 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 단일 벡터로 형질주입된다. 또 다른 실시예들에서, 숙주 세포는 둘 이상의 발현 벡터(예를 들어, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 하나의 발현 벡터 및 경쇄 또는 경쇄 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 또 다른 발현 벡터)로 공동-형질주입(co-transfected)된다.
면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드는, 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건들 하에서, 이러한 가변 영역을 인코팅하는 발현벡터로 형질주입된 숙주 세포를 성장시킴으로써 생산될 수 있다. 발현 후, 폴리펩티드는, 이 분야에서 잘 알려져 있는 기술들, 예를 들어, 글루타티온-S-전달효소(GST)와 같은 친화성 태그들 및 히스티딘 태그들을 이용하여 채취되고 정제될 수 있다.
사람 FGFR2에 결합하는 단일클론 항체, 또는 항체의 항원-결합 단편은 (a) 완전한 또는 부분 면역글로불린 중쇄를 인코딩하는 발현 벡터 및 완전한 또는 부분 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 별도의 발현 벡터, 또는 (b) 양 쇄들(완전 또는 부분 중쇄 및 경쇄)의 발현을 허용하는 조건 하에서 양 쇄들을 인코딩하는 단일 발현 벡터로 형질주입된 숙주 세포를 성장시킴으로써 생산될 수 있다. 온전한 항체(또는 항원-결합 단편)는 이 분야에서 잘 알려져 있는 기술들, 예를 들어 단백질 A, 단백질 G, 글루타티온-S-전달효소(GST)와 같은 친화성 태그들 및 히스티딘 태그들을 이용하여 채취되고 정제될 수 있다. 단일 발현 벡터 또는 두 개의 분리된 발현 벡터들로부터 중쇄 및 경쇄를 발현하는 것은 이 분야의 통상의 기술에 속한다.
항체로의 변이
항체들 및 항체 조각들의 항원성을 감소 또는 제거하기 위한 방법들은 이 기술에 알려져 있다. 항체가 사람에게 투여될 때, 항체는 바람직하게는 "사람화"되어 사람의 항원성을 감소 또는 제거한다. 바람직하게는, 사람화 항체는 그것이 유래된 사람화되지 않은 마우스 항체와 항원에 대해 동일하거나 실질적으로 동일한 친화성을 가진다.
한 가지 사람화 접근에서, 키메라 단백질들이 생성되고, 이들 단백질에서 마우스 면역글로불린 불변 영역은 사람 면역글로불린 불변 영역으로 대체된다. 예를 들어, Morrison et al ., 1984, PROC. NAT. ACAD. SCI. 81:6851-6855, Neuberger et al., 1984, NATURE 312:604-608; 미국특허 제6,893,625호 (Robinson); 제5,500,362호 (Robinson); 및 제4,816,567호 (Cabilly)를 참조한다.
CDR 이식으로 알려져 있는 접근에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR들은 다른 종들로부터 프레임워크로 이식된다. 예를 들어, 쥐과 동물 CDR은 사람 FR에 이식될 수 있다. 본 발명의 일부 실시예들에서, 항-FGFR2 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 CDR들은 사람 FR 또는 공통 사람 FR으로 이식된다. 공통 사람 FR들을 생성하기 위해, 여러 개의 사람 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열들로부터 FR들은 공통 아미노산 서열을 구분하기 위해 정렬된다. CDR 이식은 미국특허 제7,022,500호 (Queen); 제6,982,321호 (Winter); 제6,180,370호 (Queen); 제6,054,297호 (Carter); 제5,693,762호 (Queen); 제5,859,205호 (Adair); 제5,693,761호 (Queen); 제5,565,332호 (Hoogenboom); 제5,585,089호 (Queen); 제5,530,101호 (Queen); Jones et al .(1986) NATURE 321: 522-525; Riechmann et al . (1988) NATURE 332: 323-327; Verhoeyen et al . (1988) SCIENCE 239: 1534-1536; 및 Winter (1998) FEBS LETT 430: 92-94에 설명된다.
"SUPERHUMANIZATIONTM"으로 지칭되는 접근에서, 사람 CDR 서열들은 사람화될 마우스 항체의 CDR과 사람 CDR의 구조적 유사성을 근거로, 사람 생식세포 유전자들로부터 선택된다. 예를 들어, 미국특허 제6,881,557호(Foote); 및 Tan et al., 2002, J. IMMUNOL 169:1119-1125를 참조한다.
면역원성을 감소시키기 위한 다른 방법들은 "재성형(reshaping)", "초키메라화(hyperchimerization)", "비니어링(veneering)/재표면화(resurfacing)"를 포함한다. Vaswami et al ., 1998, ANNALS OF ALLERGY, ASTHMA, & IMMUNOL. 81:105; Roguska et al ., 1996, PROT. ENGINEER 9:895-904; 및 미국특허 제6,072,035호(Hardman)를 참조한다. 비니어링/재표면화 접근에서, 쥐과 동물 항체의 표면 접근가능한 아미노산 잔기들은 사람 항체의 동일 위치들에서 더 빈번하게 발견되는 아미노산 잔기들로 대체된다. 이러한 유형의 항체 재표면화는, 예를 들어 미국특허 제5,639,641호(Pedersen)에 설명되어 있다.
마우스 항체를 사람에서의 의학적 용도에 적합한 형태로 변환시키기 위한 다른 접근은 ACTIVMABTM 기술(Vaccinex사, 뉴욕주의 로체스터)로 알려져 있고, 이 기술은 포유류 세포에서 항체들을 발현하는 우두(vaccinia) 바이러스계 벡터를 포함한다. IgG 중쇄 및 경쇄의 높은 레벨의 조합 다양성이 생성된다고 한다. 예를 들어, 미국특허 제6,706,477호 (Zauderer); 제6,800,442호 (Zauderer); 및 제6,872,518호(Zauderer)를 참조한다.
마우스 항체를 사람에서의 용도에 적합한 형태로 변환하기 위한 다른 접근은 KaloBios 제약회사(캘리포니아주의 팔로 알토)가 상업적으로 실시하는 기술이다. 이 기술은 항체 선택을 위한 "에피토프-집중" 라이브러리를 생산하는 전매 사람 "수용체(acceptor)"의 사용을 포함한다.
마우스 항체를 사람에서의 의학적 용도에 적합한 형태로 변이시키기 위한 다른 접근은 XOMA (US) LLC사가 상업적으로 실시하는 HUMAN ENGINEERINGTM 기술이다. 예를 들어, PCT 국제공개 제93/11794호 및 미국특허 제5,766,886호; 제5,770,196호; 제5,821,123호; 및 제5,869,619호를 참조한다.
위의 접근들을 포함하는 어떤 적합한 접근이라도 본원에서 개시된 항체의 사람 면역원성을 감소 또는 제거하기 위해 사용될 수 있다.
항체가 치료제로서 사용되면, 항체는 표준 생체외 접합 화학을 이용하여 저분자 독소 또는 방사선핵종과 같은 효과기 모이어티(effector moiety)에 공액화될 수 있다. 효과기 모이어티가 폴리펩티드이면, 항체는 효과기에 화학적으로 공액화될 수 있고, 혹은 융합 단백질로서 효과기에 결합될 수 있다. 융합 단백질들의 구성은 이 기술에서 통상의 기술 내에 있다.
항체들의 사용
본원에서 개시된 항체들은 다양한 형태의 암, 예를 들어, 유방암, 난소암, 전립선암, 자궁경부암, 결장암, 폐암, 췌장암, 위암, 및 두경부암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 암 세포들은, 암 세포들의 증식을 억제 또는 감소시키기 위해 치료적으로 효과적인 양의 항체에 노출된다. 일부 실시예들에서, 항체들은 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100%만큼 암세포 증식을 억제한다.
일부 실시예들에서, 개시된 항체들은 사람 환자에서 종양 성장을 억제하는 방법에 사용될 수 있다. 이 방법은 환자에게 치료적으로 효과적인 양의 항체를 투여하는 것을 포함한다. FGFR2 과다발현 및/또는 활성화와 관련된 암들은 유방암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 폐암, 뇌암의 일부 형태, 흑색종, 및 위장암(예: 결장암, 췌장암, 위암, 두경부암)을 포함한다.
본원에서 사용된 것처럼, 질병의 "치료(treating)"는 (a) 질병의 징후 감소; (b) 질병의 진행 억제; (c) 질병의 퇴보 야기; 또는 (d) 질병의 치유를 의미한다.
일반적으로, 치료적으로 효과적인 활성 성분의 유효량은 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 예를 들어 1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 1 mg/kg 내지 10 mg/kg 범위이다. 투여량은 치료될 질병 또는 징후의 종류 및 정도, 환자의 전반적인 건강 상태, 항체의 생체외 효능, 약제학적 제형, 및 투여 경로와 같은 변수들에 따른다. 초기 투여량은 원하는 혈중농도 또는 조직내 농도를 빠르게 이루기 위해 상위 농도를 넘어서 증가될 수 있다. 대안적으로, 초기 투여량은 최적량보다 작을 수 있고, 하루 투여량은 치료 과정동안 점진적으로 증가될 수 있다. 사람 투여량은, 예를 들어 0.5 mg/kg 내지 20 mg/kg을 투여하도록 설계된 종래의 제1상 임상시험 투여량 단계적 확대 시험에서 최적화될 수 있다. 투여 횟수는 투여 경로, 투여량 및 치료될 질병과 같은 인자들에 따라 변할 수 있다. 예시적인 투여 횟수는 하루 한 번, 주당 한 번, 및 2주당 한 번이다. 바람직한 투여 경로는 비경구적, 예를 들어 정맥내 주사이다. 단일클론 항체 기반 약물의 제형은 이 기술에서 통상의 기술 내에 속한다. 발명의 일부 실시예들에서, 단일클론 항체는 동결건조되어 투여시 완충식염액에서 복원된다.
치료적 사용을 위해, 항체는 바람직하게는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 결합된다. 여기에서 사용된 것처럼, "약제학적으로 허용 가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 과도한 독성, 염증, 알레르기 반응, 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 사람 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 허용 가능한 이익/위험 비와 잘 맞는 완충제, 담체, 및 부형제를 의미한다. 담체(들)는 제형의 다른 성분들과 양립할 수 있고 수용자에게 해롭지 않은 의미로 "타당해야(acceptable)" 한다. 약학적으로 허용 가능한 담체들은 약학적 투여법과 양립할 수 있는 완충제, 용매, 분산 매질, 코팅, 등장 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질들을 위한 이러한 매질 및 제형의 사용은 이 기술에 알려져 있다.
본 발명의 항체들을 포함하는 약제학적 조성물들은 투여 단위 형태로 제공될 수 있고 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 그의 의도된 투여 경로와 양립할 수 있도록 제형화되어야 한다. 투여 경로들의 예는 정맥내(IV) 투여, 피내 투여, 흡입 투여, 피부를 통한 투여, 국소적 투여, 경점막의 투여, 및 직장 투여이다. 단일클론 항체들을 위한 바람직한 투여 경로는 정맥내(IV) 주사이다. 유용한 제형들은 약제학적 기술분야에서 잘 알려져 있는 방법들에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(Mack Publishing Company, 1990)를 참조한다. 비경구적 투여에 적합한 제형 성분들은 주사용수, 염수, 고정유(fixed oils), 폴레에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매와 같은 살균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항세균제; 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨과 같은 항산화제; EDTA와 같은 킬레이트제; 아세트산염, 구연산염 또는 인산염과 같은 완충제; 및 염화나트륨 또는 덱스트로오스와 같은 독성 조절제를 포함한다.
정맥내 투여를 위해, 적합한 담체들은 생리식염수, 세균발육 저지수, 크레모포(Cremophor) ELTM(BASF, 뉴저지주의 파시파니,) 또는 인산 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 담체는 제조 및 저장 조건 하에서 안정적이어야 하고, 미생물에 대해 보호되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 이들의 적합한 혼합물들을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.
약제학적 제형은 바람직하게는 살균된 상태이다. 살균은, 예를 들어 살균 여과막을 통한 여과에 의해 이루어질 수 있다. 조성물이 동결건조되는 경우, 필터 살균은 동결건조 및 복원에 앞서 또는 뒤에 수행될 수 있다.
실시예
다음 실시예들은 단지 예시적이고 어떤 식으로든 본 발명의 범주 또는 내용을 제한하는 의도는 아니다.
실시예 1: 세포주 및 시약
KATO III, HEC-1-A, AN3 CA, SNU-16, 및 사람 폐암 세포주를 ATCC(American Type Culture Collection)(매릴랜드주의 록빌)로부터 획득하였다. GCMCC(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)로부터 FDCP-1 및 Ba/F3, MFM-223, MFE-296, MFE-280, MFE-319 및 ESS-1 세포들을 얻었다. 공급자들이 정한 지시에 따라 모든 사람 세포주들을 5% CO2를 포함하는 환경에서 37℃에서 배양하였다. 모든 FGF들을 R&D 시스템즈사(미네소타의 미네아폴리스)로부터 구매하였다.
기능적 FGFR2 항체들을 검사하기 위한 세포 기반 평가를 구축하기 위해, 먼저 와일드 타입 FGFR2 및 암-관련 돌연변이체들 또는 FGFR2의 변종들을 발현하는 Ba/F3 및 FDCP-1 세포들을 먼저 조작하였다. FGFR-구동 FDCP 세포들 및 Ba/F3 세포들을 다음 방법에 의해 얻었다. 암-관련 FGFR2-IIIb S252W, 또는 FGFR2-IIIb N550K 돌연변이체들뿐만 아니라 IIIb, IIIc 동형(isoform) 또는 사람 FGFR2의 C-말단 절형 변종을 인코딩하는 플라스미드들로 전기천공법에 의해 FDCP-1 세포를 형질주입하였다. G-418(600 μg/ml)로 선택 후, 단일 클론들을 분리하여 IL3 없이 MTT[3-(4, 5-디메틸티아졸-2-일)-2, 5-디페닐테트라졸륨 브로마이드] 분석(Sigma-Aldrich, 미주리주의 세인트루이스)에 의해 그들의 FGF1-의존성 증식을 검사하였다. 세포들에 MTT 시약(10 μl)을 첨가하였고 4시간 후 100 μl의 10% SDS로 2N HCL로 반응을 멈추었다. 다음 날 플레이트들을 분석하였다. 후속 연구를 위해 IL3 없을 때에 강력한 FGF-1 의존성 증식을 나타내었던 클론들을 사용하였다. FGFR2를 발현하는 레트로바이러스들을 생성하기 위해, 다양한 사람 FGFR2 변종들을 인코딩하는 cDNA들을 레트로바이러스의 벡터로 각각 삽입하였다. 리포펙타민 2000(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스바드)을 사용하여 포이닉스(Phoenix) 세포들을 형질주입함으로써 레트로바이러스들을 생산하였다. 8 μg/ml 의 폴리브렌(Sigma-Aldrich)의 존재 하에서, 2500 rpm으로 90분 동안 원심분리에 의해 Ba/F3 세포를 감염시키기 위해 레트로바이러스들을 포함하는 상청액들을 사용하였다. 희석을 제한함으로써 개개의 클론들을 분리하였고, 유동 세포 분석법으로 세포 표면 수용체 발현을 입증하였다.
FGFR 증식된 암세포주들을 다음과 같이 확인하였다. FGFR2 증식(유전자 복제 개수 > 7)에 대해 WTSI(Wellcome Trust Sanger Institute(www.sanger.ac.uk))에서 CGP 복제 개수 데이터베이스를 질의하였다. 잠재적인 FGFR2 증식을 가진 세포주들의 복제 개수를 FGFR2 특이적 프라이머들(5'-ACTTGGGCTGGAGTGATTTG-3' (SEQ ID NO: 24) 및 5'-AATCCCATCTGCACACTTCC-3' (SEQ ID NO: 25)) 및 기준 유전자(트랜스케토라제) 프라이머들(5'-CAAAAACATGGCTGAGCAGA-3'(SEQ ID NO: 26) 및 5'-GAAACAGGCCCCACTTTGTA-3'(SEQ ID NO: 27))을 사용한 정량적 PCR(qPCR)로 분석하였다. Toyokawa et al ., 2009, ONCOL. REP. 21:875-880에서 설명된 것처럼 FGFR2 유전자 복제 개수를 필수적으로 계산하였다.
FGFR 유전자 발현 분석을 다음과 같이 수행하였다. RNeasyTM 미니 키트(Qiagen, 캘리포니아주의 발렌시아)로 토털 RNA를 분리하였다. FGFR2, FGFR2-IIIb, FGFR2-IIIc, 및 HPRT에 대해 특이적인 프라이머들로 QuantiTectTM SYBR Green RT-PCR 키트(Qiagen)를 사용하여 정량적 RT_PCR(qRT-PCR)을 수행하였다. 발현 레벨을 HPRT로 정규화하였다.
이전 연구들은 쥐과 동물 프로-B Ba/F3 또는 골수 FDCP-1 세포들에서 FGFR들의 이소성 발현은 IL-3이 없을 때에 FGF1-의존성 증식을 부여한다고 입증하였다(Tannheimer et al ., 2000, BREAST CANCER RES. 2:311-320; Ornitz et al ., 1996, J. BIOL. CHEM. 271:15292-15297). 예상한대로, IL-3 및 FGF1이 없을 때에 와일드 타입 FGFR2를 안정적으로 발현하는 FDCP-1 세포들의 눈에 띄는 증식은 없었다. FGF1, 3, 7, 10, 및 22는 FGFR2-IIIb를 통해 신호들을 변환하고 FGFR2-IIIc는 FGF1, 2, 4, 6, 9, 16, 17, 18 및 20을 포함하는 리간드들의 더 넓은 패널에 응답하는 것으로 알려졌다(Tannheimer et al ., supra; Ornitz et al ., supra; Zhang et al., 2006, J. BIOL. CHEM. 281:15964-15700). FGF2 및 FGF9가 아니라 FGF7 및 FGF10에 의해 FGFR2의 동형을 발현하는 FDCP-1 세포의 증식이 활성화되었다(도 2). IIIc 동형을 발현하는 세포들의 증식은 FGF2 및 FGF9에 의해 특이적으로 향상되었다(도 3).
실시예 2: 항- FGFR2 단일클론 항체들의 생산
마우스들의 C-말단에서 사람 Fc 모이어티와 융합된 사람 FGFR2 IgD2-IgD3(IIIb) 및 사람 FGFR2 IgD2-IgD3(IIIc)의 1:1 혼합물로 마우스들을 면역시켰다. 마우스 면역화 및 세포 융합은 상업적 벤더(Precision Antibody, 매릴랜드주의 컬럼비아)에 의해 수행되었다.
1차 스크린에서, 혼성 상청액들을 스크리닝하여 ELISA 포맷으로 사람 FGFR2 IgD2-IgD3에 대한 결합을 검출하였다. 1차 스크린을 통과한 항체들을 실시예 3(아래)에서 설명된 세포 기반의 증식 분석인 2차 스크린하였다.
사람 FGFR2의 세포외 도메인으로 면역화된 마우스들의 지라 융합으로부터 생산된 쥐과 동물 혼성 클론들의 상청액들을 이용하여 1차 스크린을 수행하였다. 웰당 100 ng의 재조합 가용성 FGFR2 세포외 도메인으로 분석 플레이트들을 코팅하였고, 이후 상온, PBS에서 1시간 동안 5% 우유로 차단하였다. 이후, 50 μl의 혼성 상청액을 각 웰에 첨가하여 상온에서 1시간 동안 항체 결합을 허용하였다. 세정 완충액(0.1% Tween 20을 가진 PBS)으로 플레이트들을 3회 세정하였고 그 후 HRP-공액화된 염소 항-마우스 IgG 중쇄 및 경쇄 2차 항체로 배양하였다. TMB(테트라메틸벤젠)을 기질로서 사용하여 분석을 진전시켰고, 620 nm에서 흡수도를 기록하였다.
실시예 3: FGFR2 길항 항체들의 확인
FGFR2 길항 항체들을 검사하기 위해, FGFR2 항체를 포함하는 혼성 상청액들을 FGFR2의 5가지 형태들, 즉 (1) 와일드 타입 FGFR2-IIIb; (2) 와일드 타입 FGFR2-IIIc; (3) FGFR2-III(b) S252W; (4) FGFR2-III(b) N550K; 및 (5) C-말단 절형을 가진 FGFR2-III(b) 중 하나를 이소성적으로 발현하는 FDCP 세포들에 첨가하였다. 헤파린(5 μg/ml)±FGF1(8 ng/ml)이 포함된 바닥이 편평한 96-웰 플레이트(70,000 셀/웰)에서, FGFR2-발현하는 세포들에 상청액들을 1:1의 비율(용적)로 첨가하였다. 37℃에서 2일 동안 배양 후, 상술한 것처럼 MTT 분석을 수행하였다.
클론 4B9의 상청액은 FGFR2의 IIIb-동형에 의해 구동된 FDCP-1 증식의 강하고 선택적인 억제를 나타내었다. 클론 4B9에 의해 생산된 항체 4B9(항체 GP369로도 지칭)는 추가적인 특성화를 위해 종래의 기술로 정제되었다. 표면 플라즈몬 공명 분석은 항체 4B9가 사람 FGFR2-IIIb에 대한 강한 친화력을 나타내었고 사람 FGFR2-IIIc에 대한 검출가능한 결합을 보이지 않았다는 것을 나타낸다. 사람 FGFR1-IIIc 또는 FGFR3-IIIb에 대한 항체 4B9의 어떠한 결합도 검출되지 않았다.
실시예 4: 서열 분석
제조자의 지시(Roche Applied Science, 인디애나주의 인디애나폴리스)에 따라 IsoStripTM 마우스 단일클론 항체 이소타이핑 키트를 사용하여 실시예 1의 항체 4B9의 경쇄 동종(isotype) 및 중쇄 동종을 판단하였다. 항체를 카파 경쇄 및 IgG1 중쇄라고 판단하였다.
5' RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)를 사용하여 항체 4B9의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 염기서열을 결정하였다. 판매자(Qiagen, 캘리포니아주의 발렌시아)의 지시에 따라 RNeasyTM Miniprep 키트를 사용하여 4B9 단일클론 혼성 세포주로부터 토털 RNA를 추출하였다. 5' RACE에 대한 랜덤 프라이머를 사용하는 제조자의 지시에 따라 SMARTerTM RACE cDNA 증폭 키트(Clontech, 캘리포니아주의 팔로 알토)를 사용하여 5' 말단을 포함하는 전장 제1 가닥 cDNA를 생성하였다.
제조자의 지시에 따라 KOD Hot StartTM 폴리머라제(EMD Chemicals, 뉴저지주의 깁스타운)를 사용하여 카파쇄 및 IgG1 중쇄의 가변 영역들을 PCR로 증폭시켰다. SMARTerTM RACE cDNA 증폭 키트와 함께 5' cDNA 말단들의 증폭을 위해, 유니버설 프라이머 믹스 A 프라이머(Clontech), 5' TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3'(SEQ ID NO: 28) 및 5' CTAATACGACTCACTATAGGGC 3'(SEQ ID NO: 29)의 믹스를 5' 프라이머로서 사용하였다. 위의 5' 프라이머들 및 3' IgG1 불변 영역 특이적 프라이머, 5' TATGCAAGGCTTACAACCACA 3'(SEQ ID NO: 30)를 사용하여 중쇄 가변 영역을 증폭하였다. 위의 5' 프라이머들 및 3' 카파 불변 영역 특이적 프라이머, CGACTGAGGCACCTCCAGATGTT 3'(SEQ ID NO: 31)를 사용하여 카파쇄 불변 영역을 증폭하였다.
아가로스 겔 전기영동으로 개별적인 PCR 생성물들을 분리하였고, 제조자(Qiagen)의 지시에 따라 QiaquickTM 겔 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 그 후, 제조자(Invitrogen)의 지시에 따라 Zero Blunt TOPO®PCR 복제 키트를 사용하여 PCR 생성물들을 pCR4Blunt 플라스미드로 복제하여 표준 분자 생물학 기법을 통해 DH5-α 세균(Invitrogen)으로 형질전환하였다. 가변 영역 서열들의 서열을 확인하기 위한 표준 디데옥시 DNA 염기서열 결정 방법들을 사용하여, Beckman Genomics사(매사추세츠주의 댄버스)의 M13 포워드(5' GTAAAACGACGGCCAGT 3')(SEQ ID NO: 32) 및 M13 리버스 프라이머(5' CAGGAAACAGCTATGACC 3')(SEQ ID NO: 33)를 사용하여 형질전환된 세균의 클론으로부터 분리된 플라스미드 DNA의 염기서열을 결정하였다. 가변 영역 서열들을 식별하고 확인하는 Vector NTI 소프트웨어(Invitrogen) 및 IMGT/V-Quest 웹 서버를 사용하여 서열들을 분석하였다.
항체 4B9의 가변 영역들을 인코딩하는 핵산 서열 및 정의하는 단백질 서열들이 아래에 요약된다(아미노 말단 신호 펩티드 서열은 미도시). CDR 서열(Kabat 정의)은 아미노산 서열에서 굵게/밑줄쳐서 도시된다.
항체 4B9의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 1)
1 gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg
61 tcctgcaaga cttctggcta cacatttacc agctactgga tgcactgggt aaaacagagg
121 cctggacagg gtctggaatg gataggggct atttatcctg gaaatagtga tactgactac
181 agccagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagtca catccgccac cactgcctac
241 atggaactca gcagcctgac aaatgaggac tctgcggtct attactgttc aaagtttgac
301 tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca
항체 4B9의 중쇄 가변 영역을 정의하는 단백질 서열(SEQ ID NO: 2)
1 evqlqqsgtv larpgasvkm scktsgytft sywmhwvkqr pgqglewiga iypgnsdtdy
61 sqkfkgkatl tavtsattay melssltned savyycskfd ywgqgttltv ss
항체 4B9의 카파쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 3)
1 caaattgttc tcacccagtc tccagcactc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc
61 atgacctgca gtgccagctc aagtgtaaat tacatgtact ggtaccagca gaagccaaga
121 tcctccccca aaccctggat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc
181 ttcagtggca gggggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa
241 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cgtacacgtt cggagggggg
301 accaagctgg aaataaaa
항체 4B9의 카파쇄 가변 영역을 정의하는 단백질 서열(SEQ ID NO: 4)
1 qivltqspal msaspgekvt mtcsasssvn ymywyqqkpr sspkpwiylt snlasgvpar
61 fsgrgsgtsy sltissmeae daatyycqqw ssnpytfggg tkleik
표 1은 본 실시예에서 논의된 각 서열의 SEQ ID NO.를 도시한 색인표이다.
SEQ ID NO . 항체 4B9 핵산 또는 단백질
1 중쇄 가변 영역-핵산
2 중쇄 가변 영역-단백질
3 경(카파)쇄 가변 영역-핵산
4 경(카파)쇄 가변 영역-단백질
5 중쇄 CDR1(Kabat 정의)
6 중쇄 CDR2(Kabat 정의)
11 중쇄 CDR3(Kabat 정의)
12 경(카파)쇄 CDR1(Kabat 정의)
13 경(카파)쇄 CDR2(Kabat 정의)
14 경(카파)쇄 CDR3(Kabat 정의)
마우스 단일클론 항체 중쇄 CDR 서열들(Kabat, Chothia, 및 IMGT 정의)이 표 2에 도시되어 있다.
Kabat
CDR1 CDR2 CDR3
4B9
 SYWMH
(SEQ ID NO: 5)		 AIYPGNSDTDYSQKFKG
(SEQ ID NO: 6)		 FDY
Chothia
CDR1 CDR2 CDR3
4B9
 GYTFTSY
(SEQ ID NO: 7)		 YPGNSD
(SEQ ID NO: 8)		 FDY
IMGT
CDR1 CDR2 CDR3
4B9
 GYTFTSYW
(SEQ ID NO: 9)		 IYPGNSDT
(SEQ ID NO: 10)		 SKFDY
(SEQ ID NO: 11)
마우스 단일클론 항체 카파 경쇄 CDR 서열들(Kabat, Chothia, 및 IMGT 정의)이 표 3에 도시되어 있다.
Kabat/Chothia
CDR1 CDR2 CDR3
4B9
 SASSSVNYMY
(SEQ ID NO: 12)		 LTSNLAS
(SEQ ID NO: 13) 		QQWSSNPYT
(SEQ ID NO: 14)
IMGT
CDR1 CDR2 CDR3
4B9
 SSVNY
(SEQ ID NO: 15)		 LTS
 QQWSSNPYT
(SEQ ID NO: 14)
완전한 중쇄 및 카파쇄 항체 서열들을 생성하기 위해, 위의 각 가변 서열은 그 각각의 불변 영역과 결합된다. 예를 들어, 완전한 중쇄는 쥐과 동물 IgG1 중쇄 불변 서열 앞에 오는 중 가변 서열을 포함하고, 완전한 카파쇄는 쥐과 동물 카파 경쇄 불변 서열 앞에 오는 카파 가변 서열을 포함한다.
쥐과 동물 IgG1 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 16)
1 gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac
61 tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc
121 tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac
181 ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag ccagaccgtc
241 acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg
301 gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc
361 cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg
421 gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag
481 gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc
541 agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc
601 aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg
661 aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc
721 agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg
781 aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct
841 tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc
901 acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac
961 tctcctggta aa
쥐과 동물 IgG1 중쇄 불변 영역을 정의하는 단백질 서열(SEQ ID NO: 17)
1 akttppsvyp lapgsaaqtn smvtlgclvk gyfpepvtvt wnsgslssgv htfpavlqsd
61 lytlsssvtv psstwpsqtv tcnvahpass tkvdkkivpr dcgckpcict vpevssvfif
121 ppkpkdvlti tltpkvtcvv vdiskddpev qfswfvddve vhtaqtqpre eqfnstfrsv
181 selpimhqdw lngkefkcrv nsaafpapie ktisktkgrp kapqvytipp pkeqmakdkv
241 sltcmitdff peditvewqw ngqpaenykn tqpimdtdgs yfvysklnvq ksnweagntf
301 tcsvlheglh nhhtekslsh spgk
쥐과 동물 카파 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 18)
1 cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct
61 ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccagagacat caatgtcaag
121 tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggtgtcctga acagttggac tgatcaggac
181 agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacat tgaccaagga cgagtatgaa
241 cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag
301 agcttcaaca ggaatgagtg t
쥐과 동물 카파 경쇄 불변 영역을 정의하는 단백질 서열(SEQ ID NO: 19)
1 radaaptvsi fppsseqlts ggasvvcfln nfyprdinvk wkidgserqn gvlnswtdqd
61 skdstysmss tltltkdeye rhnsytceat hktstspivk sfnrnec
하기 서열들은 실시예에서 설명된 각 항체를 위한 실제적 또는 예상되는 전장 중쇄 및 경쇄 서열(즉, 가변 영역 서열 및 불변 영역 서열 모두를 포함)을 나타낸다. 항체들의 적절한 분비를 위한 신호 서열들은 DNA 서열의 5' 말단 또는 단백질 서열의 아미노 말단에서 포함된다. 가변 영역 서열들은 다른 불변 영역 서열들에 묶여져서 활성의 전장 IgG 중쇄 및 경쇄를 생산한다.
4B9의 전장 중쇄 서열( 중쇄 가변 영역 및 IgG1 불변 영역)을 인코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 20)
1 atggaatgta actggatact tccttttatt ctgtcggtaa cttcaggggt ctactcagag
61 gttcagctcc agcagtctgg gactgtgctg gcaaggcctg gggcttcagt gaagatgtcc
121 tgcaagactt ctggctacac atttaccagc tactggatgc actgggtaaa acagaggcct
181 ggacagggtc tggaatggat aggggctatt tatcctggaa atagtgatac tgactacagc
241 cagaagttca agggcaaggc cacactgact gcagtcacat ccgccaccac tgcctacatg
301 gaactcagca gcctgacaaa tgaggactct gcggtctatt actgttcaaa gtttgactac
361 tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat
421 ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc
481 aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg acctggaact ctggatccct gtccagcggt
541 gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact
601 gtcccctcca gcacctggcc cagccagacc gtcacctgca acgttgccca cccggccagc
661 agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt
721 acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc
781 attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag
841 gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg
901 gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac
961 tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc
1021 gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca
1081 cctcccaagg agcagatggc caaggataaa gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc
1141 ttccctgaag acattactgt ggagtggcag tggaatgggc agccagcgga gaactacaag
1201 aacactcagc ccatcatgga cacagatggc tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg
1261 cagaagagca actgggaggc aggaaatact ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg
1321 cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc cactctcctg gtaaa
4B9의 전장 중쇄 서열( 중쇄 가변 영역 및 IgG1 불변 영역)을 정의하는 단백질 서열(SEQ ID NO: 21)
1 mecnwilpfi lsvtsgvyse vqlqqsgtvl arpgasvkms cktsgytfts ywmhwvkqrp
61 gqglewigai ypgnsdtdys qkfkgkatlt avtsattaym elssltneds avyycskfdy
121 wgqgttltvs sakttppsvy plapgsaaqt nsmvtlgclv kgyfpepvtv twnsgslssg
181 vhtfpavlqs dlytlsssvt vpsstwpsqt vtcnvahpas stkvdkkivp rdcgckpcic
241 tvpevssvfi fppkpkdvlt itltpkvtcv vvdiskddpe vqfswfvddv evhtaqtqpr
301 eeqfnstfrs vselpimhqd wlngkefkcr vnsaafpapi ektisktkgr pkapqvytip
361 ppkeqmakdk vsltcmitdf fpeditvewq wngqpaenyk ntqpimdtdg syfvysklnv
421 qksnweagnt ftcsvlhegl hnhhteksls hspgk
4B9의 전장 경쇄 서열( 카파쇄 가변 영역 및 불변 영역)을 인코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 22)
1 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatga gtgcctcagt cataatgtcc
61 aggggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcactcatgt ctgcatctcc aggggagaag
121 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaaattaca tgtactggta ccagcagaag
181 ccaagatcct cccccaaacc ctggatttat ctcacatcca acctggcttc tggagtccct
241 gctcgcttca gtggcagggg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag
301 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccgta cacgttcgga
361 ggggggacca agctggaaat aaaacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca
421 ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc
481 taccccagag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggtgtc
541 ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc
601 acattgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag
661 acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgt
4B9의 전장 경쇄 서열( 카파쇄 가변 영역 및 불변 영역)을 정의하는 단백질 서열(SEQ ID NO: 23)
1 mdfqvqifsf llmsasvims rgqivltqsp almsaspgek vtmtcsasss vnymywyqqk
61 prsspkpwiy ltsnlasgvp arfsgrgsgt sysltissme aedaatyycq qwssnpytfg
121 ggtkleikra daaptvsifp psseqltsgg asvvcflnnf yprdinvkwk idgserqngv
181 lnswtdqdsk dstysmsstl tltkdeyerh nsytceathk tstspivksf nrnec
표 4는 서열 리스트에서 제시된 것들과 본 실시예에서 논의된 항체들의 전체길이 서열들 사이의 대응 관계를 보여준다.
SEQ ID NO. 항체 4B9 핵산 또는 단백질
20 중쇄가변 + IgG1 불변핵산
21 중쇄가변 + IgG1 불변단백질
22 카파 가변 + 불변핵산
23 카파 가변 + 불변단백질
실시예 5: 결합 친화성
다음 단백질들(R&D Systems사, 미네소타주의 미네아폴리스)에 대해 단일클론 항체 4B9의 결합 친화성 및 결합 동력학을 측정하였다:
재조합 사람 FGFR1 베타(IIIb)/Fc 키메라(rhFGFR1β-IIIc-Fc),
재조합 사람 FGFR2 베타(IIIb)/Fc 키메라(rhFGFR2β-IIIc-Fc),
재조합 사람 FGFR2 베타(IIIc)/Fc 키메라(rhFGFR2β-IIIc-Fc),
재조합 사람 FGFR3 베타(IIIb)/Fc 키메라(rhFGFR3β-IIIb-Fc), 및 재조합 사람 FGFR2 베타(IIIb)/Fc의 버전(여기서 Fc 영역을 효소로 제거하였음). Biacore T100 장비(GE Healthcare, 피스카타웨이, 뉴저지주)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명으로 결합 친화성 및 결합 동력학을 측정하였다.
판매자(GE Healthcare)의 지시에 따라 토끼 항-마우스 IgG들(GE Healthcare)을 표준 결합 프로토콜을 사용하여 아민 결합에 의해 카르복시메틸화 덱스트란 CM4 센서 칩들(GE Healthcare) 위에 고정하였다. 0.05% 계면활성제 P20(GE Healthcare)을 전기영동용 완충용액(running buffer)으로서 포함하는 PBS를 사용하여 25℃와 37℃에서 분석을 수행하였다.
항체들을 10 μl/분의 유속으로 개별적인 유동 세포(flow cell)들 내에 포획하였다. 30 RU와 60 RU 사이에서 Rmax를 얻도록 각 항체에 대해 주입 시간을 변화시켰다. 완충액 및 전기영동용 완충액에 희석된 FGFR 단백질들을 60 μl/분으로 240초 동안 기준표면(항체 포획 없음)과 활성표면(검사될 항체)에 대해 차례로 주입하였다. 900초까지 분리상을 관찰하였다. 이후, 10 mM 글리신-HCl(pH 1.7)을 60 μl/분의 유속으로 60초로 2회 주입하여 표면을 재생하였다. 검사된 FGFR 단백질 농도 범위는 50 내지 3.125 nM이었다(2배 희석).
이중 표준 공제(double reference subtraction)로 BIA평가 소프트웨어(GE Healthcare)의 운동함수를 사용하여 운동 변수들을 결정하였다. 각 항체에 대한 운동 변수들, ka(결합율 상수), kd(분리율 상수) 및 KD(평형 분리 상수)를 결정하였다. 25℃ 및 37℃에서 FGFR 단백질들에 대한 단일클론 항체들의 운동값들을 표 5에 요약하였다.
항체 표적 온도(℃) k a (M -1 s -1 ) k d (s -1 ) K D (M)
4B9 rhFGFR1-IIIb-Fc 25 결합 없음 결합 없음 결합 없음
4B9 rhFGFR2-IIIb-Fc 25 9.4E+04 4.6E-05 6.1E-10
4B9 rhFGFR2-IIIb-Fc 37 3.44E+04 3.16E-05 2.96E-09
4B9 rhFGFR2-IIIb-절단 25 5.5E+04 8.1E-05 4.2E-09
4B9 rhFGFR2-IIIb-절단 37 2.54E+05 2.23E-04 1.20E-09
4B9 rhFGFR2-IIIc-Fc 25 결합 없음 결합 없음 결합 없음
4B9 rhFGFR3-IIIb-Fc 25 결합 없음 결합 없음 결합 없음
표 5의 결과들은 항체 4B9가 약 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 750 pM, 650 pM, 610 pM 이하의 KD를 갖고서 rhFGFR2β-IIIb와 결합한다는 것을 나타낸다. 이 결과들은 또한 항체 4B9가 rhFGFR1β-IIIb, rhFGFR2β-IIIc, 및 rhFGFR3β-IIIb와 결합하지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 6: 항-증식성 활성
항체 4B9의 효능을 정량적으로 평가하기 위해, FGFR2-IIIb 또는 FGFR2-IIIc를 발현하는 FDCP-1 세포들을 사용하여 투여량-반응 연구들을 수행하였다. FGFR2-IIIb 또는 FGFR2-IIIc를 발현하는 FDCP-1 세포들을 IL-3이 없을 때에 96-웰 플레이트에 뿌렸다. 변화된 양의 FGF들 및 헤파린을 첨가하였다. 2~3일 후 MTT 분석을 수행하였다. FGF1 및 헤파린이 존재할 때에 항체 4B9를 함유하는 상청액들을 변화된 양으로 FGFR2-IIIb, FGFR2-IIIc, 또는 C-말단 절형 FGFR2-IIIb를 발현하는 FDCP-1 세포들에 첨가하였다. 2일 후 MTT 분석을 수행하였다. FGF1 및 헤파린이 존재할 때에 정제된 항체 4B9를 변화된 양으로 FGFR2-IIIb S252W 또는 FGFR2-IIIb N550K를 발현하는 FDCP-1 세포들에 첨가하였다. 2일 후 MTT 분석을 수행하였다.
항체 4B9는 투여량-의존 방식으로 FGFR2-IIIb에 의해 구동되는 FDCP-1 세포들의 FGF1-유도 증식을 강력하게 억제하였지만, 4B9는 FGFR2-IIIc를 발현하는 FDCP 세포들의 FGF1-유도 증식에 대해 상당한 효과를 갖지 못했다(도 4). FRS2 어댑터 분자의 구성 인산화 및 하향 신호전달의 활성화를 야기하는 C-말단 절형 FGFR2-IIIb는 위 및 유방암 세포주들에서 발견된다(Itoh et al., 1994, CANCER RES. 54:3237-3241; Moffa et al., 2004, MOL. CANCER RES. 2:643-652). 항체 4B9는 C-말단 절형 FGFR2-IIIb에 의해 구동된 FDCP-1 세포들의 증식을 강력하게 억제하였다(도 4).
FGFR2 돌연변이체들은 자궁내막 종양 샘플의 약 12%로 보고되었다(Pollock et al ., supra ; Dutt et al ., supra). FGFR2에서 체세포 활성화 돌연변이들은 IgD2 및 IgD3, 세포외 일측 인접막 도메인, 또는 키나제 도메인 사이의 링커 영역 내에 모인다. 자궁내막 종양에서 가장 흔한 돌연변이 중 두 가지는 S252W 돌연변이(리간드 특이성을 변경하고 리간드 결합의 친화성을 증진시킴) 및 키나제 도메인 내의 N550K 돌연변이(키나제 활성을 높임)이다. 정제된 항체 4B9는 각각 0.3 nM, 3.0 nM 및 8.1 nM의 IC50 값으로 FGFR2-IIIb S252W 및 FGFR2-IIIb N550K뿐만 아니라 와일드 타입 FGFR2-IIIb에 의해 구동되는 세포 증식을 강력하게 억제한다(도 5).
실시예 7: FGFR2 -활성화된 신호전달 경로들의 억제
FGFR2-활성화된 신호전달 경로들에 대한 항체 4B9의 효과를 조사하였다. FGFR2의 티로신 인산화에 대한 항체 4B9의 효과를 조사하기 위해, SNU-16 세포들을 5 ?/ml의 투여량으로 37℃에서 1시간 동안 항체들로 처리한 후, 헤파린 단독(20 μg/ml) 또는 헤파린+FGF7(30 μg/ml)로 15분 동안 자극하였다. 세포들은 1% NP-40, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, 10% 글리세롤, 2 mM EDTA를 포함하는 NP-40 세포용해 완충제에서 용해되어 프로테아제 억제제들(Roche Applied Science) 및 홀트(Halt) 포스파타아제 억제제들(Thermo Scientific)로 보충되었다.
용해물들을 항-FGFR (Y653/Y654) (R&D 시스템즈사, 미네소타주의 미네아폴리스), 항-FGFR2 (sc-122) (Santa Cruz Biotechnology, 캘리포니아주의 산타크루즈), 항-포스포-ERK1/2 및 항-ERK1/2 (Cell Signaling Technology, 매사추세츠주의 댄버스), 항-β-튜불린, 클론 AA2 (Millipore Corporation; 매사추세츠주의 빌러리카) 항체들과 함께 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 면역블롯들을 화학발광 기질(ECL PlusTM, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로 검출하였다. 제조자(R&D 시스템즈)의 지시에 따라 사람 포스포-RTK 및 MARK 키나제 어레이들(R&D 시스템즈)을 수행하였다. 포스포-RTK 어레이들의 경우, 세포들을 NP-40 세포용해 완충액에서 용해시켰다. 어레이 완충액 1에서 희석된 세포 용해물들의 첨가에 앞서 어레이들을 상온에서 1시간 동안 어레이 완충액 1로 덮었고, 이후 4℃에서 밤새 배양하였다. 화학발광으로 어레이들을 가시화하였다. 포스포-MAPK 어레이들의 경우, 세포들을 세포용해 완충액 6에서 용해시켰다. 희석된 세포 용해물들을 어레이들에 첨가하였다. 4℃에서 밤새 배양 후, 어레이들을 항-포스포-MAPK 항체와 상온에서 2시간 동안 혼합하였고 상술한 것처럼 가시화하였다.
FGF7은 FGFR2를 과발현하는 Ba/F3 세포들에서 그리고 FGFR2-증폭된 SNU-16 세포들에서 FGFR2의 티로신 인산화 및 세포외 신호-조절 키나제 1 및 2(ERK1/2)의 후속 활성화를 유도하였다. 항체 4B9는 이들 세포들에서 FGFR2의 리간드-유도 티로신 인산화 및 ERK1/2의 활성을 효과적으로 억제하였다. 게다가, 항체 4B9는 SNU-16 세포들에서 FGFR2 단백질 레벨을 하향 조절하였다. 항체에 노출 후 2시간만큼 빨리 FGFR2 단백질 레벨이 약간 감소하는 것이 관찰되었다. 6시간 시점에서 단백질 레벨의 극적인 감소를 보았다.
ERK들, c-Jun NH2-말단 키나제들(JNKs), p38 MAPK들, AKT들, 및 이들의 하향 효과기 분자들의 인산화를 측정하는 포스포-MAPK 어레이를 사용하여 이들 세포들에서 하향 신호전달 경로들의 활성화를 조사하였다. 리간드 자극이 없을 때에 ERK1/2의 인산화를 그다지 발견하지 못했다. FGF7로 SNU-16 세포들을 자극하여 ERK1/2의 인산화를 상당히 증가시켰다. 미토겐- 및 스트레스-활성화된 키나제 2(MSK2), p38α MAPK, 90-kD 리보솜 단백질 키나제 1(RSK1), Akt1, 및 p70S6 키나제(p70S6K)의 인산화의 증가를 관찰하였다. 항체 4B9는 FGF7에 의해 활성화된 모든 하향 신호전달 단백질들의 인산화를 효과적으로 차단하였다.
실시예 8: 종양 이종이식 성장의 억제
항체 4B9의 생체내 활성을 평가하기 위해, FGFR2 유전자 증폭의 온상이 되는 사람 암 이종이식편들의 성장에 대한 항체 4B9의 효과를 검사하였다. 검사한 네 개의 FGFR2-증폭된 세포주들 중에서, SNU-16 및 MFM-223만이 마우스들에서 종양을 생겨나게 하였다. 그러므로, SNU-16 및 MFM-223 이종이식 종양들에 대한 항체 4B9의 효능을 검사하였다.
사람 건강 및 실험실 동물들의 용도에 대한 OLAW 공중 건강 서비스 정책(Public Health Service Policy) 및 건강 및 실험실 동물들의 용도에 대한 ILAR 가이드에 따라 모든 마우스들을 치료하였다. AVEO 동물실험윤리위원회가 승인한 계획서에 따라 모든 생체내 연구들을 수행하였다. SNU-16 생체내 연구들의 경우, 생후 10주의 암컷 C.B-17 SCID 마우스들(Taconic, 뉴욕주의 저먼타운)의 5×106 세포들을 가진 우측 옆구리에 1:1 RPMI 1640 (Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스바드)/Matrigel(BD Biosciences, 캘리포니아주의 산호세)로 피하 접종하였다. 버니어 캘리퍼스를 사용하여 주당 2회 종양을 측정하였다. V=0.5×폭×폭×길이의 식을 사용하여 종양 용적을 계산하였다. 종양들의 용적이 200 mm3에 도달했을 때, 마우스들을 10마리씩 5개의 군으로 임의 추출하였다. 다음 날, 마우스들을 20 mg/kg mIgG (BioXCell; 뉴햄프셔주의 웨스트 레바논), 2 mg/kg 4B9, 5 mg/kg 4B9, 10 mg/kg 4B9, 또는 20 mg/kg 4B9로 복막내 주사로 치료하였다. 연구 기간 동안 마우스들은 주당 2회 투여받았다. 최종 투여 후 72시간에 종양 성장 억제의 계산을 위해 종양 용적을 다시 측정하였다. GraphPad PRISM(등록상표) 버전 4.00을 사용하여 모든 통계적 분석을 수행하였다. 변화의 일방 분석 및 터키 다중 비교 시험을 사용하여 최종 종양 용적들을 분석하였다.
SNU-16 이종이식 종양들을 대조 쥐과 동물 IgG 20 mg/kg 또는 항체 4B9 2, 5, 10 또는 20 mg/kg로 치료하였다. 도 6에 도시된 것처럼, 대조군이 이 연구에 남아 있는 마지막 날인 43일 째에, 각 4B9 치료 군은 mIgG 치료된 대조들(각각 70, 72, 77, 및 82%, p<0.001)에 비해 상당한 종양 성장 억제를 보여주었다. 상당한 체중 감소 없이 모든 치료들이 잘 용인되었다. 종양 용해물들도 분석하였다. FGFR2의 티로신 인산화의 억제와 수반되어, 항체 4B9는 종양들에서 FGFR2 단백질의 총량을 하향조절하였다. 연구 마지막에 채집된 종양들로부터 대조 IgG 또는 4B9로 치료된 종양 샘플들의 경우, 전체 ERK1/2 또는 포스포-ERK1/2에서 상당한 차이는 검출되지 않았다. 생체내 SNU-16 세포들의 포스포-수용체 티로신 키나제(RTK) 프로파일에 비해, SNU-16 이종이식편들의 RTK 어레이 분석은, FGFR2는 생체내 인산화된 티로신인 뚜렷한 RTK였으며, 4B9는 4B9-치료된 SNU-16 검사 종양들 중 두 개에서 FGFR2 티로신 인산화를 상당히 억제하였다는 것을 보여주었다. 생체내에서, SNU-16 세포들의 증식은 4B9의 치료에 민감하지 않았다. 생체내 SNU-16 세포들에서 FGFR2의 티로신 인산화는 활성화된 FGFR2 생체내 신호전달에 대한 SNU-16 이종이식편들의 의존성이 항체 4B9로의 치료에 대한 민감성을 설명한다는 것을 제시한다.
FGFR2-증폭된 유방암 세포주 MFM-223의 생체내 성장에 대한 항체 4B9의 효과도 조사하였다. 이들 연구를 위해, 생후 5주의 암컷 NCr 누드 마우스들(Taconic; 뉴욕주의 저먼타운)은 좌측 옆구리에 0.72 mg 90-일 방출 17-β 에스트라디올 펠릿들(Innovative Research; 플로리다주의 새러소타)을 피하 주입받았고, 10×106 MFM-223 세포들을 가진 우측 옆구리에 1:1 EMEM (ATCC; 버지니아주의 머내서스)/Matrigel을 피하로 접종받았다. 종양들의 용적이 200 mm3에 도달했을 때, 마우스들을 10마리씩 2개의 군으로 임의 추출하여 20 mg/kg mIgG (BioXCell; 뉴햄프셔주의 웨스트 레바논) 또는 20 mg/kg 4B9로 IP 치료하였다. 연구 기간 동안 마우스들은 주당 2회 투여받았다. GraphPad PRISM(등록상표) 버전 4.00을 사용하여 모든 통계적 분석을 수행하였다. 이 연구에서 두 개의 군만 있었기 때문에, 최종 종양 용적 및 체중(27일째, 최종 투여후 48시간)을 언페어드 2 테일드 t-테스트(unpaired two tailed t-test)로 분석하였다.
25일 째에, MFM-223 이종이식편들에서, mIgG-치료된 대조들에 비해, 4B9 치료된 마우스들에서 종양 용적(p=0.0015; 도 7) 및 최종 종양 무게(p=0.0188)가 66% 넘게 억제되었다. 상당한 체중 감소 없이 모든 치료들이 잘 용인되었다. SNU-16 이종이식편들에서 관찰된 것과 유사하게, 4B9는, FGFR2의 티로신 인산화의 억제와 수반되어, 종양들에서 총 FGFR2 단백질을 강하게 하향 조절하였다. 연구 마지막에 채집된 종양들로부터 대조 IgG 또는 4B9 중 어느 하나로 치료된 종양 샘플들의 경우, 전체 또는 포스포-ERK1/2에서 상당한 차이는 검출되지 않았다.
실시예 9: 항- FGFR2 항체들의 사람화
A. 사람화된 FGFR2 항체들의 구조
본 실시예는 4B9로 표시된 쥐과 동물 항체의 사람화 및 결과적으로 사람화된 항체들의 특성을 설명한다. 이 기술에서 공지된 방법들을 사용하여 사람화된 항-FGFR2 IIIb 항체들을 설계하였다. 설계된 아미노산 서열들은 코돈-최적화 DNA 서열들로 변환되었고 (다음 순서로) 5' HindIII 제한 부위, Kozak 공통 서열, 아미노 말단 신호 서열, 사람화된 가변 영역, 사람 IgG1 또는 카파 불변 영역, 정지 코돈, 및 3' EcoRI 제한 부위를 포함하도록 DNA2.0사에 의해 합성되었다.
사람화된 중쇄들은 In-FusionTM PCR 클로닝(Clontech, 캘리포니아주의 마운틴뷰)을 사용하여 HindIII 및 EcoRI 부위를 통해 pEE6.4(Lonza, 스위스의 바젤)로 서브복제되었다. 사람화된 카파 경쇄들은 In-FusionTM PCR 클로닝을 사용하여 HindIII 및 EcoRI 부위를 통해 pEE14.4(Lonza)로 서브복제되었다.
사람화된 항체 쇄들은 293T 세포들로 일시적으로 형질주입되어 항체를 생산하였다. 항체는 후속의 생체내 분석을 위해 정제되었다. 사람 FGFR2 IIIb에 대한 사람화 항체들의 결합을 아래에 설명된 것처럼 측정하였다. 결과들을 표 12와 13에 요약하였다.
사람화 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역들의 가능한 조합들 각각은 아래의 표 6에 기재되어 있다.
경쇄 가변 영역 중쇄 가변 영역
Hu4B9-65 카파(SEQ ID NO: 40) Hu4B9-65 중(SEQ ID NO: 35)
Hu4B9-65 카파(SEQ ID NO: 40) Hu4B9-82, -83 중(SEQ ID NO: 37)
Hu4B9-82 카파(SEQ ID NO: 44) Hu4B9-65 중(SEQ ID NO: 35)
Hu4B9-82 카파(SEQ ID NO: 44) Hu4B9-82, -83 중(SEQ ID NO: 37)
Hu4B9-83 카파(SEQ ID NO: 46) Hu4B9-65 중(SEQ ID NO: 35)
Hu4B9-83 카파(SEQ ID NO: 46) Hu4B9-82, -83 중(SEQ ID NO: 37)
사람화 4B9 항체들의 가변 영역들을 암호화하는 핵산 서열 및 정의하는 단백질 서열들이 아래에 요약된다(아미노 말단 신호 펩티드 서열은 미도시). CDR 서열(Kabat 정의)은 아미노산 서열에서 굵게/밑줄쳐서 도시된다.
Hu4B9 -65 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 34)
1 caagtgcagc tcgtccaatc gggagccgaa gtgaagaagc ctggttcctc ggtaaaagta
61 agctgtaagg cgtccggtta cacgtttacc tcatattgga tgcactgggt cagacaggca
121 cccggacagg gactcgagtg gatgggagcg atctacccgg gcaattcgga cactgattac
181 agccagaaat tcaaggggag ggtcacgatc acggcagatg agagcacatc aacagcctat
241 atggagctgt cgtcgcttcg gagcgaggac acggcggtct actactgctc caaattcgac
301 tattgggggc aggggacctt ggtgaccgtg tcatcc
Hu4B9 -65 중쇄 가변 영역을 정의하는 단백질 서열(SEQ ID NO: 35)
1 qvqlvqsgae vkkpgssvkv sckasgytft sywmh wvrqa pgqglewmg a iypgnsdtdy
61 sqkfkg rvti tadeststay melsslrsed tavyycsk fd y wgqgtlvtv ss
Hu4B9 -82, -83 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 36)
1 caagtgcagc tcgtccaatc gggagccgaa gtgaagaagc ctggttcctc ggtaaaagta
61 agctgtaagg cgtccggtta cacgttttcc tcatattgga tgcactgggt cagacaggca
121 cccggacagg gactcgagtg gatgggagcg atctacccgg gcaattcgga cactgattac
181 agccagaaat tccaggggag ggtcacgatc acggcagatg agagcacatc aacagcctat
241 atggagctgt cgtcgcttcg gagcgaggac acggcggtct actactgctc caaattcgac
301 tattgggggc aggggacctt ggtgaccgtg tcatcc
Hu4B9 -82, -83 중쇄 가변 영역을 정의하는 단백질 서열(SEQ ID NO: 37)
1 qvqlvqsgae vkkpgssvkv sckasgytfs sywmh wvrqa pgqglewmg a iypgnsdtdy
61 sqkfqg rvti tadeststay melsslrsed tavyycsk fd y wgqgtlvtv ss
Hu4B9 -65 카파쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 39)
1 gaaattgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctga gcccgggcga acgcgcgacc
61 ctgagctgcc gcgcgagcag cagcgtgaac tatatgtatt ggtatcagca gaaaccgggc
121 caggcgccgc gcccgtggat ttatctgacc agcaaccgcg cgaccggcgt gccggcgcgc
181 tttagcggca gcggcagcgg caccgattat accctgacca ttagcagcct ggaaccggaa
241 gattttgcgg tgtattattg ccagcagtgg agcagcaacc cgtatacctt tggccagggc
301 accaaactgg aaattaaa
Hu4B9 -65 카파쇄 가변 영역을 정의하는 단백질 서열(SEQ ID NO: 40)
1 eivltqspat lslspgerat lsc rasssvn ymy wyqqkpg qaprpwiy lt snrat gvpar
61 fsgsgsgtdy tltisslepe dfavyyc qqw ssnpyt fgqg tkleik
Hu4B9 -82 카파쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 43)
1 gaaatcgtac ttactcagag ccctgccaca ttgtcattgt cacccgggga acgcgccaca
61 ctgtcgtgcc gggcttcatc gagcgtgaac tacatgtatt ggtatcaaca gaaaccaggc
121 caagcaccgc gaccttggat ctacttgacg agcaatcgag ccacgggtat ccccgcgagg
181 ttctccggtt cggggtcggg aactgattac acactgacaa tttcctcgct ggagcccgag
241 gacttcgcgg tgtactattg tcagcagtgg tcatccaacc cgtacacgtt tggacagggg
301 acgaagctcg agatcaag
Hu4B9 -82 카파쇄 가변 영역을 정의하는 단백질 서열(SEQ ID NO: 44)
1 eivltqspat lslspgerat lsc rasssvn ymy wyqqkpg qaprpwiy lt snrat gipar
61 fsgsgsgtdy tltisslepe dfavyyc qqw ssnpyt fgqg tkleik
Hu4B9 -83 카파쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 45)
1 gaaatcgtac ttactcagag ccctgccaca ttgtcattgt cacccgggga acgcgccaca
61 ctgtcgtgcc gggcttcatc gagcgtgaac tacatgtatt ggtatcaaca gaaaccaggc
121 caagcaccgc gaccttggat ctacttgacg agcaatcgag ccacgggtat ccccgcgagg
181 ttctccggtt cggggtcggg aactgatttc acactgacaa tttcctcgct ggagcccgag
241 gacttcgcgg tgtactattg tcagcagtgg tcatccaacc cgtacacgtt tggacagggg
301 acgaagctcg agatcaag
Hu4B9 -83 카파쇄 가변 영역을 정의하는 단백질 서열(SEQ ID NO: 46)
1 eivltqspat lslspgerat lsc rasssvn ymy wyqqkpg qaprpwiy lt snrat gipar
61 fsgsgsgtdf tltisslepe dfavyyc qqw ssnpyt fgqg tkleik
실시예 9에서 생산된 항체들을 위한 면역글로불린 중쇄 가변 영역들을 정의하는 아미노산 서열들은 도 8에 정렬되어 있다. (적절한 발현/분비를 위한) 아미노 말단 신호 펩티드 서열들은 도시되지 않는다. CDR1, CDR2, 및 CDR3(Kabat 정의)은 박스로 구분된다(도 9 참조).
실시예 9의 항체들을 위한 면역글로불린 경쇄 가변 영역들을 정의하는 아미노산 서열들은 도 10에 정렬되어 있다. (적절한 발현/분비를 위한) 아미노 말단 신호 펩티드 서열들은 도시되지 않는다. CDR1, CDR2, 및 CDR3(Kabat 정의)은 박스로 구분된다(도 11 참조).
표 7은 본 실시예에서 논의된 각 서열의 SEQ ID NO.를 도시한 색인표이다.
SEQ ID NO. 핵산 또는 단백질
34 Hu4B9-65 중쇄 가변 영역-핵산
35 Hu4B9-65 중쇄 가변 영역-단백질
5 Hu4B9-65 중쇄 CDR1(Kabat 정의)
6 Hu4B9-65 중쇄 CDR2(Kabat 정의)
11 Hu4B9-65 중쇄 CDR3(Kabat 정의)
36 Hu4B9-82, -83 중쇄 가변 영역-핵산
37 Hu4B9-82, -83 중쇄 가변 영역-단백질
5 Hu4B9-82, -83 중쇄 CDR1(Kabat 정의)
38 Hu4B9-82, -83 중쇄 CDR2(Kabat 정의)
11 Hu4B9-82, -83 중쇄 CDR3(Kabat 정의)
39 Hu4B9-65 경(카파)쇄 가변 영역-핵산
40 Hu4B9-65 경(카파)쇄 가변 영역-단백질
41 Hu4B9-65 경(카파)쇄 CDR1(Kabat 정의)
42 Hu4B9-65 경(카파)쇄 CDR2(Kabat 정의)
14 Hu4B9-65 경(카파)쇄 CDR3(Kabat 정의)
43 Hu4B9-82 경(카파)쇄 가변 영역-핵산
44 Hu4B9-82 경(카파)쇄 가변 영역-단백질
41 Hu4B9-82 경(카파)쇄 CDR1(Kabat 정의)
42 Hu4B9-82 경(카파)쇄 CDR2(Kabat 정의)
14 Hu4B9-82 경(카파)쇄 CDR3(Kabat 정의)
45 Hu4B9-83 경(카파)쇄 가변 영역-핵산
46 Hu4B9-83 경(카파)쇄 가변 영역-단백질
41 Hu4B9-83 경(카파)쇄 CDR1(Kabat 정의)
42 Hu4B9-83 경(카파)쇄 CDR2(Kabat 정의)
14 Hu4B9-83 경(카파)쇄 CDR3(Kabat 정의)
쥐과 동물 및 사람화 단일클론 항체 중쇄 CDR 서열들(Kabat, Chothia, 및 IMGT 정의)이 표 8에 도시되어 있다.
Kabat
CDR1 CDR2 CDR3
4B9
 SYWMH
(SEQ ID NO: 5)		 AIYPGNSDTDYSQKFKG
(SEQ ID NO: 6)		 FDY
Hu4B9-65 SYWMH
(SEQ ID NO: 5)		 AIYPGNSDTDYSQKFKG
(SEQ ID NO: 6)		 FDY
Hu4B9-82, -83 SYWMH
(SEQ ID NO: 5)		 AIYPGNSDTDYSQKFQG
(SEQ ID NO: 38)		 FDY
CHOTHIA
CDR1 CDR2 CDR3
4B9 GYTFTSY
(SEQ ID NO: 7)		 YPGNSD
(SEQ ID NO: 8)		 FDY
Hu4B9-65 GYTFTSY
(SEQ ID NO: 7)		 YPGNSD
(SEQ ID NO: 8)		 FDY
Hu4B9-82, -83 GYTFSSY
(SEQ ID NO: 47)		 YPGNSD
(SEQ ID NO: 8)		 FDY
IMGT
CDR1 CDR2 CDR3
4B9 GYTFTSYW
(SEQ ID NO: 9)		 IYPGNSDT
(SEQ ID NO: 10)		 SKFDY
(SEQ ID NO: 11)
Hu4B9-65 GYTFTSYW
(SEQ ID NO: 9)		 IYPGNSDT
(SEQ ID NO: 10)		 SKFDY
(SEQ ID NO: 11)
Hu4B9-82, -83 GYTFSSYW
(SEQ ID NO: 48)		 IYPGNSDT
(SEQ ID NO: 10)		 SKFDY
(SEQ ID NO: 11)
쥐과 동물 및 사람화 단일클론 항체 카파 경쇄 CDR 서열들(Kabat, Chothia, 및 IMGT 정의)이 표 9에 도시되어 있다.
Kabat/Chothia
CDR1 CDR2 CDR3
4B9 SASSSVNYMY
(SEQ ID NO: 12)		 LTSNLAS
(SEQ ID NO: 13)		 QQWSSNPYT
(SEQ ID NO: 14)
Hu4B9-65 RASSSVNYMY
(SEQ ID NO: 41)		 LTSNRAT
(SEQ ID NO: 42)		 QQWSSNPYT
(SEQ ID NO: 14)
Hu4B9-82 RASSSVNYMY
(SEQ ID NO: 41)		 LTSNRAT
(SEQ ID NO: 42)		 QQWSSNPYT
(SEQ ID NO: 14)
Hu4B9-83 RASSSVNYMY
(SEQ ID NO: 41)		 LTSNRAT
(SEQ ID NO: 42)		 QQWSSNPYT
(SEQ ID NO: 14)
IGMT
CDR1 CDR2 CDR3
4B9 SSVNY
(SEQ ID NO: 15)		 LTS QQWSSNPYT
(SEQ ID NO: 14)
Hu4B9-65 SSVNY
(SEQ ID NO: 15)		 LTS QQWSSNPYT
(SEQ ID NO: 14)
Hu4B9-82 SSVNY
(SEQ ID NO: 15)		 LTS QQWSSNPYT
(SEQ ID NO: 14)
Hu4B9-83 SSVNY
(SEQ ID NO: 15)		 LTS QQWSSNPYT
(SEQ ID NO: 14)
완전한 사람화 중쇄 또는 카파쇄 항체 서열들을 생성하기 위해, 위의 각 가변 서열은 그 각각의 사람 불변 영역과 결합된다. 예를 들어, 완전한 중쇄는 사람 IgG1 중쇄 불변 서열 앞에 중 가변 서열을 포함한다. 완전한 카파쇄는 사람 카파 경쇄 불변 서열 앞에 카파 가변 서열을 포함한다.
사람 IgG1 중쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 49)
1 gcctcaacaa aaggaccaag tgtgttccca ctcgccccta gcagcaagag tacatccggg
61 ggcactgcag cactcggctg cctcgtcaag gattattttc cagagccagt aaccgtgagc
121 tggaacagtg gagcactcac ttctggtgtc catacttttc ctgctgtcct gcaaagctct
181 ggcctgtact cactcagctc cgtcgtgacc gtgccatctt catctctggg cactcagacc
241 tacatctgta atgtaaacca caagcctagc aatactaagg tcgataagcg ggtggaaccc
301 aagagctgcg acaagactca cacttgtccc ccatgccctg cccctgaact tctgggcggt
361 cccagcgtct ttttgttccc accaaagcct aaagatactc tgatgataag tagaacaccc
421 gaggtgacat gtgttgttgt agacgtttcc cacgaggacc cagaggttaa gttcaactgg
481 tacgttgatg gagtcgaagt acataatgct aagaccaagc ctagagagga gcagtataat
541 agtacatacc gtgtagtcag tgttctcaca gtgctgcacc aagactggct caacggcaaa
601 gaatacaaat gcaaagtgtc caacaaagca ctcccagccc ctatcgagaa gactattagt
661 aaggcaaagg ggcagcctcg tgaaccacag gtgtacactc tgccacccag tagagaggaa
721 atgacaaaga accaagtctc attgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc
781 gccgttgagt gggagagtaa cggtcagcct gagaacaatt acaagacaac ccccccagtg
841 ctggatagtg acgggtcttt ctttctgtac agtaagctga ctgtggacaa gtcccgctgg
901 cagcagggta acgtcttcag ctgttccgtg atgcacgagg cattgcacaa ccactacacc
961 cagaagtcac tgagcctgag cccagggaag
사람 IgG1 중쇄 불변 영역을 정의하는 단백질 서열(SEQ ID NO: 50)
1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss
61 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg
121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn
181 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree
241 mtknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw
301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk
사람 카파 경쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 51)
1 cgcacagttg ctgcccccag cgtgttcatt ttcccaccta gcgatgagca gctgaaaagc
61 ggtactgcct ctgtcgtatg cttgctcaac aacttttacc cacgtgaggc taaggtgcag
121 tggaaagtgg ataatgcact tcaatctgga aacagtcaag agtccgtgac agaacaggac
181 agcaaagact caacttattc actctcttcc accctgactc tgtccaaggc agactatgaa
241 aaacacaagg tatacgcctg cgaggttaca caccagggtt tgtctagtcc tgtcaccaag
301 tccttcaata ggggcgaatg t
사람 카파 경쇄 불변 영역을 정의하는 단백질 서열(SEQ ID NO: 52)
1 rtvaapsvfi fppsdeqlks gtasvvclln nfypreakvq wkvdnalqsg nsqesvteqd
61 skdstyslss tltlskadye khkvyacevt hqglsspvtk sfnrgec
하기 서열들은 실시예에서 설명된 각 항체를 위한 실제적 또는 예상되는 전장 중쇄 및 경쇄 서열(즉, 가변 영역 서열 및 불변 영역 서열 모두를 포함)을 나타낸다. 항체들의 적절한 분비를 위한 신호 서열들은 DNA 서열의 5' 말단 또는 단백질 서열의 아미노 말단에서 포함된다. 본원에서 가변 영역 서열들은 다른 불변 영역 서열들에 묶여져서 활성의 전장 IgG 중쇄 및 경쇄를 생산할 수 있다고도 생각된다.
전장 사람화 Hu4B9 -65 중쇄( 사람화 중쇄 가변 영역 및 사람 IgG1 불변 영역)를 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 53)
1 atggacatga gagttcctgc tcagctgctc gggttgctgt tgctttggct ccggggtgct
61 aggtgccaag tgcagctcgt ccaatcggga gccgaagtga agaagcctgg ttcctcggta
121 aaagtaagct gtaaggcgtc cggttacacg tttacctcat attggatgca ctgggtcaga
181 caggcacccg gacagggact cgagtggatg ggagcgatct acccgggcaa ttcggacact
241 gattacagcc agaaattcaa ggggagggtc acgatcacgg cagatgagag cacatcaaca
301 gcctatatgg agctgtcgtc gcttcggagc gaggacacgg cggtctacta ctgctccaaa
361 ttcgactatt gggggcaggg gaccttggtg accgtgtcat ccgcctcaac aaaaggacca
421 agtgtgttcc cactcgcccc tagcagcaag agtacatccg ggggcactgc agcactcggc
481 tgcctcgtca aggattattt tccagagcca gtaaccgtga gctggaacag tggagcactc
541 acttctggtg tccatacttt tcctgctgtc ctgcaaagct ctggcctgta ctcactcagc
601 tccgtcgtga ccgtgccatc ttcatctctg ggcactcaga cctacatctg taatgtaaac
661 cacaagccta gcaatactaa ggtcgataag cgggtggaac ccaagagctg cgacaagact
721 cacacttgtc ccccatgccc tgcccctgaa cttctgggcg gtcccagcgt ctttttgttc
781 ccaccaaagc ctaaagatac tctgatgata agtagaacac ccgaggtgac atgtgttgtt
841 gtagacgttt cccacgagga cccagaggtt aagttcaact ggtacgttga tggagtcgaa
901 gtacataatg ctaagaccaa gcctagagag gagcagtata atagtacata ccgtgtagtc
961 agtgttctca cagtgctgca ccaagactgg ctcaacggca aagaatacaa atgcaaagtg
1021 tccaacaaag cactcccagc ccctatcgag aagactatta gtaaggcaaa ggggcagcct
1081 cgtgaaccac aggtgtacac tctgccaccc agtagagagg aaatgacaaa gaaccaagtc
1141 tcattgacct gcctggtgaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgttga gtgggagagt
1201 aacggtcagc ctgagaacaa ttacaagaca acccccccag tgctggatag tgacgggtct
1261 ttctttctgt acagtaagct gactgtggac aagtcccgct ggcagcaggg taacgtcttc
1321 agctgttccg tgatgcacga ggcattgcac aaccactaca cccagaagtc actgagcctg
1381 agcccaggga ag
전장 사람화 Hu4B9 -65 중쇄( 사람화 중쇄 가변 영역 및 사람 IgG1 불변 영역)를 정의하는 단백질 서열(SEQ ID NO: 54)
1 mdmrvpaqll gllllwlrga rcqvqlvqsg aevkkpgssv kvsckasgyt ftsywmhwvr
61 qapgqglewm gaiypgnsdt dysqkfkgrv titadestst aymelsslrs edtavyycsk
121 fdywgqgtlv tvssastkgp svfplapssk stsggtaalg clvkdyfpep vtvswnsgal
181 tsgvhtfpav lqssglysls svvtvpsssl gtqtyicnvn hkpsntkvdk rvepkscdkt
241 htcppcpape llggpsvflf ppkpkdtlmi srtpevtcvv vdvshedpev kfnwyvdgve
301 vhnaktkpre eqynstyrvv svltvlhqdw lngkeykckv snkalpapie ktiskakgqp
361 repqvytlpp sreemtknqv sltclvkgfy psdiavewes ngqpennykt tppvldsdgs
421 fflyskltvd ksrwqqgnvf scsvmhealh nhytqkslsl spgk
전장 사람화 Hu4B9 -82, -83 중쇄( 사람화 중쇄 가변 영역 및 사람 IgG1 불변 영역)를 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 55)
1 atggacatga gagttcctgc tcagctgctc gggttgctgt tgctttggct ccggggtgct
61 aggtgccaag tgcagctcgt ccaatcggga gccgaagtga agaagcctgg ttcctcggta
121 aaagtaagct gtaaggcgtc cggttacacg ttttcctcat attggatgca ctgggtcaga
181 caggcacccg gacagggact cgagtggatg ggagcgatct acccgggcaa ttcggacact
241 gattacagcc agaaattcca ggggagggtc acgatcacgg cagatgagag cacatcaaca
301 gcctatatgg agctgtcgtc gcttcggagc gaggacacgg cggtctacta ctgctccaaa
361 ttcgactatt gggggcaggg gaccttggtg accgtgtcat ccgcctcaac aaaaggacca
421 agtgtgttcc cactcgcccc tagcagcaag agtacatccg ggggcactgc agcactcggc
481 tgcctcgtca aggattattt tccagagcca gtaaccgtga gctggaacag tggagcactc
541 acttctggtg tccatacttt tcctgctgtc ctgcaaagct ctggcctgta ctcactcagc
601 tccgtcgtga ccgtgccatc ttcatctctg ggcactcaga cctacatctg taatgtaaac
661 cacaagccta gcaatactaa ggtcgataag cgggtggaac ccaagagctg cgacaagact
721 cacacttgtc ccccatgccc tgcccctgaa cttctgggcg gtcccagcgt ctttttgttc
781 ccaccaaagc ctaaagatac tctgatgata agtagaacac ccgaggtgac atgtgttgtt
841 gtagacgttt cccacgagga cccagaggtt aagttcaact ggtacgttga tggagtcgaa
901 gtacataatg ctaagaccaa gcctagagag gagcagtata atagtacata ccgtgtagtc
961 agtgttctca cagtgctgca ccaagactgg ctcaacggca aagaatacaa atgcaaagtg
1021 tccaacaaag cactcccagc ccctatcgag aagactatta gtaaggcaaa ggggcagcct
1081 cgtgaaccac aggtgtacac tctgccaccc agtagagagg aaatgacaaa gaaccaagtc
1141 tcattgacct gcctggtgaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgttga gtgggagagt
1201 aacggtcagc ctgagaacaa ttacaagaca acccccccag tgctggatag tgacgggtct
1261 ttctttctgt acagtaagct gactgtggac aagtcccgct ggcagcaggg taacgtcttc
1321 agctgttccg tgatgcacga ggcattgcac aaccactaca cccagaagtc actgagcctg
1381 agcccaggga ag
전장 사람화 Hu4B9 -82, -83 중쇄( 사람화 중쇄 가변 영역 및 사람 IgG1 불변 영역)를 정의하는 단백질 서열(SEQ ID NO: 56)
1 mdmrvpaqll gllllwlrga rcqvqlvqsg aevkkpgssv kvsckasgyt fssywmhwvr
61 qapgqglewm gaiypgnsdt dysqkfqgrv titadestst aymelsslrs edtavyycsk
121 fdywgqgtlv tvssastkgp svfplapssk stsggtaalg clvkdyfpep vtvswnsgal
181 tsgvhtfpav lqssglysls svvtvpsssl gtqtyicnvn hkpsntkvdk rvepkscdkt
241 htcppcpape llggpsvflf ppkpkdtlmi srtpevtcvv vdvshedpev kfnwyvdgve
301 vhnaktkpre eqynstyrvv svltvlhqdw lngkeykckv snkalpapie ktiskakgqp
361 repqvytlpp sreemtknqv sltclvkgfy psdiavewes ngqpennykt tppvldsdgs
421 fflyskltvd ksrwqqgnvf scsvmhealh nhytqkslsl spgk
전장 사람화 Hu4B9 -65 경쇄( 사람화 카파쇄 가변 영역 및 사람 불변 영역)를 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 57)
1 atggacatga gggtgcccgc tcaactgctg gggctgctgc tgctgtggct gagaggagct
61 cgttgcgaaa ttgtgctgac ccagagcccg gcgaccctga gcctgagccc gggcgaacgc
121 gcgaccctga gctgccgcgc gagcagcagc gtgaactata tgtattggta tcagcagaaa
181 ccgggccagg cgccgcgccc gtggatttat ctgaccagca accgcgcgac cggcgtgccg
241 gcgcgcttta gcggcagcgg cagcggcacc gattataccc tgaccattag cagcctggaa
301 ccggaagatt ttgcggtgta ttattgccag cagtggagca gcaacccgta tacctttggc
361 cagggcacca aactggaaat taaacgcaca gttgctgccc ccagcgtgtt cattttccca
421 cctagcgatg agcagctgaa aagcggtact gcctctgtcg tatgcttgct caacaacttt
481 tacccacgtg aggctaaggt gcagtggaaa gtggataatg cacttcaatc tggaaacagt
541 caagagtccg tgacagaaca ggacagcaaa gactcaactt attcactctc ttccaccctg
601 actctgtcca aggcagacta tgaaaaacac aaggtatacg cctgcgaggt tacacaccag
661 ggtttgtcta gtcctgtcac caagtccttc aataggggcg aatgt
전장 사람화 Hu4B9 -65 경쇄( 사람화 카파쇄 가변 영역 및 사람 불변 영역)를 정의하는 단백질 서열(SEQ ID NO: 58)
1 mdmrvpaqll gllllwlrga rceivltqsp atlslspger atlscrasss vnymywyqqk
61 pgqaprpwiy ltsnratgvp arfsgsgsgt dytltissle pedfavyycq qwssnpytfg
121 qgtkleikrt vaapsvfifp psdeqlksgt asvvcllnnf ypreakvqwk vdnalqsgns
181 qesvteqdsk dstyslsstl tlskadyekh kvyacevthq glsspvtksf nrgec
전장 사람화 Hu4B9 -82 경쇄( 사람화 카파쇄 가변 영역 및 사람 불변 영역)를 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 59)
1 atggacatga gggtgcccgc tcaactgctg gggctgctgc tgctgtggct gagaggagct
61 cgttgcgaaa tcgtacttac tcagagccct gccacattgt cattgtcacc cggggaacgc
121 gccacactgt cgtgccgggc ttcatcgagc gtgaactaca tgtattggta tcaacagaaa
181 ccaggccaag caccgcgacc ttggatctac ttgacgagca atcgagccac gggtatcccc
241 gcgaggttct ccggttcggg gtcgggaact gattacacac tgacaatttc ctcgctggag
301 cccgaggact tcgcggtgta ctattgtcag cagtggtcat ccaacccgta cacgtttgga
361 caggggacga agctcgagat caagcgcaca gttgctgccc ccagcgtgtt cattttccca
421 cctagcgatg agcagctgaa aagcggtact gcctctgtcg tatgcttgct caacaacttt
481 tacccacgtg aggctaaggt gcagtggaaa gtggataatg cacttcaatc tggaaacagt
541 caagagtccg tgacagaaca ggacagcaaa gactcaactt attcactctc ttccaccctg
601 actctgtcca aggcagacta tgaaaaacac aaggtatacg cctgcgaggt tacacaccag
661 ggtttgtcta gtcctgtcac caagtccttc aataggggcg aatgt
전장 사람화 Hu4B9 -82 경쇄( 사람화 카파쇄 가변 영역 및 사람 불변 영역)를 정의하는 단백질 서열(SEQ ID NO: 60)
1 mdmrvpaqll gllllwlrga rceivltqsp atlslspger atlscrasss vnymywyqqk
61 pgqaprpwiy ltsnratgip arfsgsgsgt dytltissle pedfavyycq qwssnpytfg
121 qgtkleikrt vaapsvfifp psdeqlksgt asvvcllnnf ypreakvqwk vdnalqsgns
181 qesvteqdsk dstyslsstl tlskadyekh kvyacevthq glsspvtksf nrgec
전장 사람화 Hu4B9 -83 경쇄( 사람화 카파쇄 가변 영역 및 사람 불변 영역)를 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 61)
1 atggacatga gggtgcccgc tcaactgctg gggctgctgc tgctgtggct gagaggagct
61 cgttgcgaaa tcgtacttac tcagagccct gccacattgt cattgtcacc cggggaacgc
121 gccacactgt cgtgccgggc ttcatcgagc gtgaactaca tgtattggta tcaacagaaa
181 ccaggccaag caccgcgacc ttggatctac ttgacgagca atcgagccac gggtatcccc
241 gcgaggttct ccggttcggg gtcgggaact gatttcacac tgacaatttc ctcgctggag
301 cccgaggact tcgcggtgta ctattgtcag cagtggtcat ccaacccgta cacgtttgga
361 caggggacga agctcgagat caagcgcaca gttgctgccc ccagcgtgtt cattttccca
421 cctagcgatg agcagctgaa aagcggtact gcctctgtcg tatgcttgct caacaacttt
481 tacccacgtg aggctaaggt gcagtggaaa gtggataatg cacttcaatc tggaaacagt
541 caagagtccg tgacagaaca ggacagcaaa gactcaactt attcactctc ttccaccctg
601 actctgtcca aggcagacta tgaaaaacac aaggtatacg cctgcgaggt tacacaccag
661 ggtttgtcta gtcctgtcac caagtccttc aataggggcg aatgt
전장 사람화 Hu4B9 -83 경쇄( 사람화 카파쇄 가변 영역 및 사람 불변 영역)를 정의하는 단백질 서열(SEQ ID NO: 62)
1 mdmrvpaqll gllllwlrga rceivltqsp atlslspger atlscrasss vnymywyqqk
61 pgqaprpwiy ltsnratgip arfsgsgsgt dftltissle pedfavyycq qwssnpytfg
121 qgtkleikrt vaapsvfifp psdeqlksgt asvvcllnnf ypreakvqwk vdnalqsgns
181 qesvteqdsk dstyslsstl tlskadyekh kvyacevthq glsspvtksf nrgec
편의상, 표 10은 본 실시예에서 논의된 각 서열의 SEQ ID NO.를 도시한 색인표를 제공한다.
SEQ ID NO . 핵산 또는 단백질
49 사람 IgG1 불변-핵산
50 사람 IgG1 불변-단백질
51 사람 카파 불변-핵산
52 사람 카파 불변-단백질
53 사람화 Hu4B9-65 중 사람 가변 + 사람 IgG1 불변핵산
54 사람화 Hu4B9-65 중 사람 가변 + 사람 IgG1 불변단백질
55 사람화 Hu4B9-82, -83 중 사람 가변 + 사람 IgG1 불변핵산
56 사람화 Hu4B9-82, -83 중 사람 가변 + 사람 IgG1 불변단백질
57 사람화 Hu4B9-65 사람 가변 + 사람 카파 불변핵산
58 사람화 Hu4B9-65 사람 가변 + 사람 카파 불변단백질
59 사람화 Hu4B9-82 사람 가변 + 사람 카파 불변핵산
60 사람화 Hu4B9-82 사람 가변 + 사람 카파 불변단백질
61 사람화 Hu4B9-83 사람 가변 + 사람 카파 불변핵산
62 사람화 Hu4B9-83 사람 가변 + 사람 카파 불변단백질
아래의 표 11은 전장 사람화 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가능한 조합들의 각각을 포함하는 항체들을 보여준다.
항체명 경쇄 중쇄
Hu4B9-65 Hu4B9-65 카파
(SEQ ID NO: 58)		 Hu4B9-65 중
(SEQ ID NO: 54)
Hu4B9-84 Hu4B9-65 카파
(SEQ ID NO: 58)		 Hu4B9-82, -83 중
(SEQ ID NO: 56)
Hu4B9-85 Hu4B9-82 카파
(SEQ ID NO: 60)		 Hu4B9-65 중
(SEQ ID NO: 54)
Hu4B9-82 Hu4B9-82 카파
(SEQ ID NO: 60)		 Hu4B9-82, -83 중
(SEQ ID NO: 56)
Hu4B9-86 Hu4B9-83 카파
(SEQ ID NO: 62)		 Hu4B9-65 중
(SEQ ID NO: 54)
Hu4B9-83 Hu4B9-83 카파
(SEQ ID NO: 62)		 Hu4B9-82, -83 중
(SEQ ID NO: 56)
사람화 가변 영역들을 포함하는 전장 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 포함하는 가능한 항체 구조체들 중 3개는 하기와 같이 표시된다:
Hu4B9 -65 = 사람화 Hu4B9-65 중쇄 가변 영역 및 사람IgG1 불변 영역(SEQ ID NO: 54) + Hu4B9-65 경쇄 가변 영역 및 사람 카파 불변 영역(SEQ ID NO: 58)
Hu4B9 -82 = 사람화 Hu4B9-82, -83 중쇄 가변 영역 및 사람IgG1 불변 영역(SEQ ID NO: 56) + Hu4B9-82 경쇄 가변 영역 및 사람 카파 불변 영역(SEQ ID NO: 60)
Hu4B9 -83 = 사람화 Hu4B9-82, -83 중쇄 가변 영역 및 사람IgG1 불변 영역(SEQ ID NO: 56) + Hu4B9-83 경쇄 가변 영역 및 사람 카파 불변 영역(SEQ ID NO: 62)
B. 사람화 항- FGFR2 단일클론 항체들의 결합 친화성
단량체의 재조합 사람 FGFR2 베타 IIIb(rhFGFR2β-IIIb-절단됨)에 대해 실시예 9에서 생산된 단일클론 항체들의 결합 친화성 및 상호작용의 동력학을 Biacore T100 (Biacore(GE Healthcare), 뉴저지주의 피스카타웨이) 장비를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정하였다.
판매자의 지시에 따라 염소 항-사람 IgG Fc(Jackson ImmunoResearch, Catalog No. 109-005-098)을 표준 결합 프로토콜을 사용하여 아민 결합(Biacore)에 의해 카르복시메틸화 덱스트란 CM4 센서 칩들(Biacore) 위에 고정하였다. 0.05% 계면활성제 P20(Biacore)을 전기영동용 완충용액(running buffer)으로서 포함하는 PBS(Invitrogen)를 사용하여 25℃와 37℃에서 분석을 수행하였다.
정제된 항체들을 10 μl/분의 유속으로 개별적인 유동 세포(flow cell)들 내에 포획하였다. 30 RU와 90 RU 사이에서 Rmax를 얻도록 각 항체에 대해 주입 시간을 변화시켰다. 완충액 또는 전기영동용 완충액에 희석된 절단된 rhFGFR2β-IIIb를 60 μl/분으로 240초 동안 기준표면(항체 포획 없음)과 활성표면(검사될 항체)에 대해 차례로 주입하였다. 900초까지 분리상을 관찰하였다. 이후, 글리신 pH 2.25(글리신 pH 2.0 (Biacore) 및 pH 2.5 (Biacore)로 제조됨)로 30 μl/분으로 60초로 2회 주입하여 표면을 재생하였다. 20 nM과 1.25 nM(2배 시리얼 희석) 사이의 절단된 rhFGFR2β-IIIb의 농축물들을 사용하여 실험을 수행하였다.
이중 표준 공제(double reference subtraction)와 함께 BIA평가 소프트웨어(Biacore)의 운동함수를 사용하여 운동 변수들을 결정하였다. 각 항체에 대한 운동 변수들, ka(결합율 상수), kd(분리율 상수) 및 KD (평형 분리 상수)를 결정하였다. 25℃에서 절단된 rhFGFR2β-IIIb에 대한 소정의 정제된 단일클론 항체들(즉, Hu4B9-65, Hu4B9-82, 및 Hu4B9-83)의 운동 값들을 표 12에 요약하였다.
항체 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) n
hu4B9-65 2.4E+05 6.5E-05 2.6E-10 4
hu4B9-82 1.9E+05 9.4E-05 4.9E-10 2
hu4B9-83 2.6E+05 8.9E-05 3.5E-10 3
표 12의 결과들은 25℃에서 검사시 정제된 항체들이 약 260 pM 내지 약 490 pM 범위의 친화성을 가진다는 것을 나타낸다.
37℃에서 절단된 rhFGFR2β-IIIb에 대한 소정의 정제된 단일클론 항체들(즉, Hu4B9-65, Hu4B9-82, 및 Hu4B9-83)의 운동 값들을 표 13에 요약하였다.
항체 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) n
hu4B9-65 3.7E+05 2.8E-04 8.9E-10 7
hu4B9-82 4.0E+05 3.6E-04 9.3E-10 3
hu4B9-83 3.2E+05 2.9E-04 9.2E-10 3
표 13의 결과들은 37℃에서 검사시 정제된 항체들이 약 890 pM 내지 약 930 pM 범위의 친화성을 가진다는 것을 나타낸다.
실시예 10: 사람화된 항- FGFR2 단일클론 항체들의 항-증식성 활성
세포 기반의 증식 분석에서 사람화 항-FGFR2 항체들의 효능을 평가하였다. FGFR2-IIIb를 발현하는 FDCP-1 세포들을 8 ng/ml의 FGF1 및 5 μg/ml의 헤파린을 포함하는 IL-3이 없는 배지에서 96-웰 플레이트에 뿌렸다. 항체들의 순차 희석물들을 제조하여 플레이트에 첨가하였다. 2일 배양 후, 실시예 1에서 상술한 것처럼 MTT 분석으로 세포 증식을 검사하였다.
도 12에 도시된 것처럼, 사람화된 항체들(Hu4B9-65, Hu4B9-82, 및 Hu4B9-83)은 FGF1-유도 FDCP-FGFR2-IIIb 세포 증식의 투여량-의존형 억제를 나타내었다. 세 가지 독립적인 실험들로부터 4B9, Hu4B9-65, Hu4B9-82 및 Hu4B9-83의 평균 IC50들은 각각 1.4, 4.9, 5.7, 및 4.7 nM이다.
참조로 포함
본원에서 언급된 특허 문서들 및 과학 논문들 각각의 전체 개시는 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
등가물
본 발명은 본 발명의 사상 또는 필수적 특징들로부터 벗어나지 않고서 다른 특정 형태로 실시될 수 있다. 그러므로, 전술한 실시예들은 모든 점에서 본원에 기재된 발명을 제한하기 보다는 오히려 예시적인 것으로 간주된다. 이처럼, 본 발명의 범위는 전술한 설명에 의해서라기보다는 오히려 첨부된 청구항들에 의해 나타나고, 청구항들의 등가의 의미와 범위 내에 있는 모든 변화들은 거기에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> AVEO PHARMACEUTICALS, INC. <120> ANTI-FGFR2 ANTIBODIES <130> AVO-016PC <140> PCTUS1136085 <141> 2011-05-11 <150> 61/333,590 <151> 2010-05-11 <160> 62 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaaga cttctggcta cacatttacc agctactgga tgcactgggt aaaacagagg 120 cctggacagg gtctggaatg gataggggct atttatcctg gaaatagtga tactgactac 180 agccagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagtca catccgccac cactgcctac 240 atggaactca gcagcctgac aaatgaggac tctgcggtct attactgttc aaagtttgac 300 tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca 336 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 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tgatgtggag 480 gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 540 agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600 aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660 aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 720 agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780 aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 840 tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 900 acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 960 tctcctggta aa 972 <210> 17 <211> 324 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 17 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu 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Gln 260 265 270 Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn 275 280 285 Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val 290 295 300 Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His 305 310 315 320 Ser Pro Gly Lys <210> 18 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 18 cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct 60 ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccagagacat caatgtcaag 120 tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggtgtcctga acagttggac tgatcaggac 180 agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacat tgaccaagga cgagtatgaa 240 cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag 300 agcttcaaca ggaatgagtg t 321 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 19 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Gln Leu Thr 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tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat 420 ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc 480 aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg acctggaact ctggatccct gtccagcggt 540 gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact 600 gtcccctcca gcacctggcc cagccagacc gtcacctgca acgttgccca cccggccagc 660 agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt 720 acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc 780 attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag 840 gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg 900 gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac 960 tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc 1020 gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca 1080 cctcccaagg agcagatggc caaggataaa gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc 1140 ttccctgaag acattactgt ggagtggcag tggaatgggc agccagcgga gaactacaag 1200 aacactcagc ccatcatgga cacagatggc tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg 1260 cagaagagca actgggaggc aggaaatact ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg 1320 cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc cactctcctg gtaaa 1365 <210> 21 <211> 455 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 21 Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 Val Tyr Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Asp Tyr Ser 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Thr 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ser Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 115 120 125 Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro 130 135 140 Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr 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Glu Gln Met Ala Lys 355 360 365 Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp 370 375 380 Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser 405 410 415 Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr 420 425 430 Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser 435 440 445 Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 22 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 22 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatga gtgcctcagt cataatgtcc 60 aggggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcactcatgt ctgcatctcc aggggagaag 120 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaaattaca tgtactggta ccagcagaag 180 ccaagatcct cccccaaacc ctggatttat ctcacatcca acctggcttc tggagtccct 240 gctcgcttca gtggcagggg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 300 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccgta cacgttcgga 360 ggggggacca agctggaaat aaaacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca 420 ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 480 taccccagag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggtgtc 540 ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 600 acattgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 660 acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgt 705 <210> 23 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 23 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Met Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu 20 25 30 Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Asn Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser 50 55 60 Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 110 Ser Ser Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 130 135 140 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 165 170 175 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 195 200 205 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 210 215 220 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 24 acttgggctg gagtgatttg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 25 aatcccatct gcacacttcc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 26 caaaaacatg gctgagcaga 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 27 gaaacaggcc ccactttgta 20 <210> 28 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 28 ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 29 ctaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 30 tatgcaaggc ttacaaccac a 21 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 31 cgactgaggc acctccagat gtt 23 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 32 gtaaaacgac ggccagt 17 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 33 caggaaacag ctatgacc 18 <210> 34 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 34 caagtgcagc tcgtccaatc gggagccgaa gtgaagaagc ctggttcctc ggtaaaagta 60 agctgtaagg cgtccggtta cacgtttacc tcatattgga tgcactgggt cagacaggca 120 cccggacagg gactcgagtg gatgggagcg atctacccgg gcaattcgga cactgattac 180 agccagaaat tcaaggggag ggtcacgatc acggcagatg agagcacatc aacagcctat 240 atggagctgt cgtcgcttcg gagcgaggac acggcggtct actactgctc caaattcgac 300 tattgggggc aggggacctt ggtgaccgtg tcatcc 336 <210> 35 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 35 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 37 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Asp Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Asp Tyr Ser Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 39 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 39 gaaattgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctga gcccgggcga acgcgcgacc 60 ctgagctgcc gcgcgagcag cagcgtgaac tatatgtatt ggtatcagca gaaaccgggc 120 caggcgccgc gcccgtggat ttatctgacc agcaaccgcg cgaccggcgt gccggcgcgc 180 tttagcggca gcggcagcgg caccgattat accctgacca ttagcagcct ggaaccggaa 240 gattttgcgg tgtattattg ccagcagtgg agcagcaacc cgtatacctt tggccagggc 300 accaaactgg aaattaaa 318 <210> 40 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 40 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Leu Thr Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 43 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 43 gaaatcgtac ttactcagag ccctgccaca ttgtcattgt cacccgggga acgcgccaca 60 ctgtcgtgcc gggcttcatc gagcgtgaac tacatgtatt ggtatcaaca gaaaccaggc 120 caagcaccgc gaccttggat ctacttgacg agcaatcgag ccacgggtat ccccgcgagg 180 ttctccggtt cggggtcggg aactgattac acactgacaa tttcctcgct ggagcccgag 240 gacttcgcgg tgtactattg tcagcagtgg tcatccaacc cgtacacgtt tggacagggg 300 acgaagctcg agatcaag 318 <210> 44 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 44 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 46 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 1 5 <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp 1 5 <210> 49 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 49 gcctcaacaa aaggaccaag tgtgttccca ctcgccccta gcagcaagag tacatccggg 60 ggcactgcag cactcggctg cctcgtcaag gattattttc cagagccagt aaccgtgagc 120 tggaacagtg gagcactcac ttctggtgtc catacttttc ctgctgtcct gcaaagctct 180 ggcctgtact cactcagctc cgtcgtgacc gtgccatctt catctctggg cactcagacc 240 tacatctgta atgtaaacca caagcctagc aatactaagg tcgataagcg ggtggaaccc 300 aagagctgcg acaagactca cacttgtccc ccatgccctg cccctgaact tctgggcggt 360 cccagcgtct ttttgttccc accaaagcct aaagatactc tgatgataag tagaacaccc 420 gaggtgacat gtgttgttgt agacgtttcc cacgaggacc cagaggttaa gttcaactgg 480 tacgttgatg gagtcgaagt acataatgct aagaccaagc ctagagagga gcagtataat 540 agtacatacc gtgtagtcag tgttctcaca gtgctgcacc aagactggct caacggcaaa 600 gaatacaaat gcaaagtgtc caacaaagca ctcccagccc ctatcgagaa gactattagt 660 aaggcaaagg ggcagcctcg tgaaccacag gtgtacactc tgccacccag tagagaggaa 720 atgacaaaga accaagtctc attgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc 780 gccgttgagt gggagagtaa cggtcagcct gagaacaatt acaagacaac ccccccagtg 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polynucleotide <400> 51 cgcacagttg ctgcccccag cgtgttcatt ttcccaccta gcgatgagca gctgaaaagc 60 ggtactgcct ctgtcgtatg cttgctcaac aacttttacc cacgtgaggc taaggtgcag 120 tggaaagtgg ataatgcact tcaatctgga aacagtcaag agtccgtgac agaacaggac 180 agcaaagact caacttattc actctcttcc accctgactc tgtccaaggc agactatgaa 240 aaacacaagg tatacgcctg cgaggttaca caccagggtt tgtctagtcc tgtcaccaag 300 tccttcaata ggggcgaatg t 321 <210> 52 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 52 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe 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720 cacacttgtc ccccatgccc tgcccctgaa cttctgggcg gtcccagcgt ctttttgttc 780 ccaccaaagc ctaaagatac tctgatgata agtagaacac ccgaggtgac atgtgttgtt 840 gtagacgttt cccacgagga cccagaggtt aagttcaact ggtacgttga tggagtcgaa 900 gtacataatg ctaagaccaa gcctagagag gagcagtata atagtacata ccgtgtagtc 960 agtgttctca cagtgctgca ccaagactgg ctcaacggca aagaatacaa atgcaaagtg 1020 tccaacaaag cactcccagc ccctatcgag aagactatta gtaaggcaaa ggggcagcct 1080 cgtgaaccac aggtgtacac tctgccaccc agtagagagg aaatgacaaa gaaccaagtc 1140 tcattgacct gcctggtgaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgttga gtgggagagt 1200 aacggtcagc ctgagaacaa ttacaagaca acccccccag tgctggatag tgacgggtct 1260 ttctttctgt acagtaagct gactgtggac aagtcccgct ggcagcaggg taacgtcttc 1320 agctgttccg tgatgcacga ggcattgcac aaccactaca cccagaagtc actgagcctg 1380 agcccaggga ag 1392 <210> 54 <211> 464 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 54 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 20 25 30 Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 35 40 45 Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 50 55 60 Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr 65 70 75 80 Asp Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu 85 90 95 Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 100 105 110 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 210 215 220 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 225 230 235 240 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 245 250 255 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 260 265 270 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 275 280 285 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 290 295 300 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 305 310 315 320 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 325 330 335 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 340 345 350 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 355 360 365 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 370 375 380 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 385 390 395 400 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 405 410 415 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 420 425 430 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 435 440 445 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 55 <211> 1392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 55 atggacatga gagttcctgc tcagctgctc gggttgctgt tgctttggct ccggggtgct 60 aggtgccaag tgcagctcgt ccaatcggga gccgaagtga agaagcctgg ttcctcggta 120 aaagtaagct gtaaggcgtc cggttacacg ttttcctcat attggatgca ctgggtcaga 180 caggcacccg gacagggact cgagtggatg ggagcgatct acccgggcaa ttcggacact 240 gattacagcc agaaattcca ggggagggtc acgatcacgg cagatgagag cacatcaaca 300 gcctatatgg agctgtcgtc gcttcggagc gaggacacgg cggtctacta ctgctccaaa 360 ttcgactatt gggggcaggg gaccttggtg accgtgtcat ccgcctcaac aaaaggacca 420 agtgtgttcc cactcgcccc tagcagcaag agtacatccg ggggcactgc agcactcggc 480 tgcctcgtca aggattattt tccagagcca gtaaccgtga gctggaacag tggagcactc 540 acttctggtg tccatacttt tcctgctgtc ctgcaaagct ctggcctgta ctcactcagc 600 tccgtcgtga ccgtgccatc ttcatctctg ggcactcaga cctacatctg taatgtaaac 660 cacaagccta gcaatactaa ggtcgataag cgggtggaac ccaagagctg cgacaagact 720 cacacttgtc ccccatgccc tgcccctgaa cttctgggcg gtcccagcgt ctttttgttc 780 ccaccaaagc ctaaagatac tctgatgata agtagaacac ccgaggtgac atgtgttgtt 840 gtagacgttt cccacgagga cccagaggtt aagttcaact ggtacgttga tggagtcgaa 900 gtacataatg ctaagaccaa gcctagagag gagcagtata atagtacata ccgtgtagtc 960 agtgttctca cagtgctgca ccaagactgg ctcaacggca aagaatacaa atgcaaagtg 1020 tccaacaaag cactcccagc ccctatcgag aagactatta gtaaggcaaa ggggcagcct 1080 cgtgaaccac aggtgtacac tctgccaccc agtagagagg aaatgacaaa gaaccaagtc 1140 tcattgacct gcctggtgaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgttga gtgggagagt 1200 aacggtcagc ctgagaacaa ttacaagaca acccccccag tgctggatag tgacgggtct 1260 ttctttctgt acagtaagct gactgtggac aagtcccgct ggcagcaggg taacgtcttc 1320 agctgttccg tgatgcacga ggcattgcac aaccactaca cccagaagtc actgagcctg 1380 agcccaggga ag 1392 <210> 56 <211> 464 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 56 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 20 25 30 Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 35 40 45 Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 50 55 60 Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr 65 70 75 80 Asp Tyr Ser Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu 85 90 95 Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 100 105 110 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 210 215 220 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 225 230 235 240 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 245 250 255 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 260 265 270 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 275 280 285 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 290 295 300 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 305 310 315 320 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 325 330 335 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 340 345 350 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 355 360 365 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 370 375 380 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 385 390 395 400 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 405 410 415 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 420 425 430 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 435 440 445 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 57 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 57 atggacatga gggtgcccgc tcaactgctg gggctgctgc tgctgtggct gagaggagct 60 cgttgcgaaa ttgtgctgac ccagagcccg gcgaccctga gcctgagccc gggcgaacgc 120 gcgaccctga gctgccgcgc gagcagcagc gtgaactata tgtattggta tcagcagaaa 180 ccgggccagg cgccgcgccc gtggatttat ctgaccagca accgcgcgac cggcgtgccg 240 gcgcgcttta gcggcagcgg cagcggcacc gattataccc tgaccattag cagcctggaa 300 ccggaagatt ttgcggtgta ttattgccag cagtggagca gcaacccgta tacctttggc 360 cagggcacca aactggaaat taaacgcaca gttgctgccc ccagcgtgtt cattttccca 420 cctagcgatg agcagctgaa aagcggtact gcctctgtcg tatgcttgct caacaacttt 480 tacccacgtg aggctaaggt gcagtggaaa gtggataatg cacttcaatc tggaaacagt 540 caagagtccg tgacagaaca ggacagcaaa gactcaactt attcactctc ttccaccctg 600 actctgtcca aggcagacta tgaaaaacac aaggtatacg cctgcgaggt tacacaccag 660 ggtttgtcta gtcctgtcac caagtccttc aataggggcg aatgt 705 <210> 58 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 58 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr 20 25 30 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Asn Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Pro Trp Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Val Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 110 Ser Ser Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 59 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 59 atggacatga gggtgcccgc tcaactgctg gggctgctgc tgctgtggct gagaggagct 60 cgttgcgaaa tcgtacttac tcagagccct gccacattgt cattgtcacc cggggaacgc 120 gccacactgt cgtgccgggc ttcatcgagc gtgaactaca tgtattggta tcaacagaaa 180 ccaggccaag caccgcgacc ttggatctac ttgacgagca atcgagccac gggtatcccc 240 gcgaggttct ccggttcggg gtcgggaact gattacacac tgacaatttc ctcgctggag 300 cccgaggact tcgcggtgta ctattgtcag cagtggtcat ccaacccgta cacgtttgga 360 caggggacga agctcgagat caagcgcaca gttgctgccc ccagcgtgtt cattttccca 420 cctagcgatg agcagctgaa aagcggtact gcctctgtcg tatgcttgct caacaacttt 480 tacccacgtg aggctaaggt gcagtggaaa gtggataatg cacttcaatc tggaaacagt 540 caagagtccg tgacagaaca ggacagcaaa gactcaactt attcactctc ttccaccctg 600 actctgtcca aggcagacta tgaaaaacac aaggtatacg cctgcgaggt tacacaccag 660 ggtttgtcta gtcctgtcac caagtccttc aataggggcg aatgt 705 <210> 60 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 60 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr 20 25 30 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Asn Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Pro Trp Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 110 Ser Ser Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 61 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 61 atggacatga gggtgcccgc tcaactgctg gggctgctgc tgctgtggct gagaggagct 60 cgttgcgaaa tcgtacttac tcagagccct gccacattgt cattgtcacc cggggaacgc 120 gccacactgt cgtgccgggc ttcatcgagc gtgaactaca tgtattggta tcaacagaaa 180 ccaggccaag caccgcgacc ttggatctac ttgacgagca atcgagccac gggtatcccc 240 gcgaggttct ccggttcggg gtcgggaact gatttcacac tgacaatttc ctcgctggag 300 cccgaggact tcgcggtgta ctattgtcag cagtggtcat ccaacccgta cacgtttgga 360 caggggacga agctcgagat caagcgcaca gttgctgccc ccagcgtgtt cattttccca 420 cctagcgatg agcagctgaa aagcggtact gcctctgtcg tatgcttgct caacaacttt 480 tacccacgtg aggctaaggt gcagtggaaa gtggataatg cacttcaatc tggaaacagt 540 caagagtccg tgacagaaca ggacagcaaa gactcaactt attcactctc ttccaccctg 600 actctgtcca aggcagacta tgaaaaacac aaggtatacg cctgcgaggt tacacaccag 660 ggtttgtcta gtcctgtcac caagtccttc aataggggcg aatgt 705 <210> 62 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 62 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr 20 25 30 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Asn Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Pro Trp Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 110 Ser Ser Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

Claims (43)

  1. 하기 군으로부터 선택되는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 사람 FGFR2에 결합하는 분리된 항체:
    (a) (i) SEQ ID NO: 5(4B9; Hu4B9 -65; Hu4B9 -82, -83) 및 SEQ ID NO: 7(4B9; Hu4B9-65)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, SEQ ID NO: 6(4B9; Hu4B9 -65)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 SEQ ID NO: 11(4B9; Hu4B9-65; Hu4B9 -82, -83)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및
    (ii) SEQ ID NO: 12(4B9)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, SEQ ID NO: 13(4B9)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 SEQ ID NO: 14(4B9; Hu4B9 -65; Hu4B9-82; Hu4B9 -83)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역;
    (b) (i) SEQ ID NO: 5(4B9; Hu4B9 -65; Hu4B9 -82, -83) 및 SEQ ID NO: 7(4B9; Hu4B9-65)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, SEQ ID NO: 6(4B9; Hu4B9 -65)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 SEQ ID NO: 11(4B9; Hu4B9-65; Hu4B9 -82, -83)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및
    (ii) SEQ ID NO: 41( Hu4B9 -65; Hu4B9 -82; Hu4B9 -83)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, SEQ ID NO: 42( Hu4B9 -65; Hu4B9 -82; Hu4B9 -83)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 SEQ ID NO: 14(4B9; Hu4B9 -65; Hu4B9 -82; Hu4B9 -83)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역; 및
    (c) (i) SEQ ID NO: 5(4B9; Hu4B9 -65; Hu4B9 -82, -83) 및 SEQ ID NO: 47(Hu4B9-82, -83)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, SEQ ID NO: 38( Hu4B9 -82, -83)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 SEQ ID NO: 11(4B9; Hu4B9 -65; Hu4B9 -82, -83)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및
    (ii) SEQ ID NO: 41( Hu4B9 -65; Hu4B9 -82; Hu4B9 -83)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, SEQ ID NO: 42( Hu4B9 -65; Hu4B9 -82; Hu4B9 -83)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 SEQ ID NO: 14(4B9; Hu4B9 -65; Hu4B9 -82; Hu4B9 -83)의 아미노산 서열들을 포함하는 CDRL3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 CDR 서열들은 사람 프레임워크 서열과 사람화 프레임워크 서열 사이에 개재되는 항체.
  3. 제1항의 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  4. 제1항의 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  5. 제3항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  6. 제4항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  7. 제6항에 있어서,
    제5항의 핵산을 더 포함하는 발현 벡터.
  8. 제5항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  9. 제6항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  10. 제7항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  11. 제9항에 있어서,
    제5항의 발현 벡터를 더 포함하는 숙주 세포.
  12. 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법으로서,
    (a) 숙주 세포가 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 발현하도록 하는 조건들 하에서 제8항 또는 제9항의 숙주 세포를 성장시키는 단계; 및
    (b) 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 사람 FGFR2에 결합하는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편을 생산하는 방법으로서,
    (a) 숙주 세포가 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및/또는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 발현하도록 하는 조건들 하에서 제10항 또는 제11항의 숙주 세포를 성장시켜서 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편을 생산하는 단계; 및
    (b) 상기 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편을 정제하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 하기 군으로부터 선택되는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 사람 FGFR2에 결합하는 분리된 항체:
    (a) SEQ ID NO: 2(4B9)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO: 4(4B9)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역;
    (b) SEQ ID NO: 35( Hu4B9 -65)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO: 40( Hu4B9 -65)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역;
    (c) SEQ ID NO: 37( Hu4B9 -82, -83)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO: 44( Hu4B9 -82)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역; 및
    (d) SEQ ID NO: 37( Hu4B9 -82, -83)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO: 46( Hu4B9 -83)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
  15. 제14항의 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  16. 제14항의 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  17. 제15항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  18. 제16항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  19. 제18항에 있어서,
    제15항의 핵산을 더 포함하는 발현 벡터.
  20. 제17항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  21. 제18항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  22. 제19항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  23. 제21항에 있어서, 제17항의 발현 벡터를 더 포함하는 숙주 세포.
  24. 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법으로서,
    (a) 숙주 세포가 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 발현하도록 하는 조건들 하에서 제20항 또는 제21항의 숙주 세포를 성장시키는 단계; 및
    (b) 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함하는 방법.
  25. 사람 FGFR2에 결합하는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편을 생산하는 방법으로서,
    (a) 숙주 세포가 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및/또는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 발현하도록 하는 조건들 하에서 제22항 또는 제23항의 숙주 세포를 성장시켜서 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편을 생산하는 단계; 및
    (b) 상기 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편을 정제하는 단계를 포함하는 방법.
  26. 하기 군으로부터 선택되는 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하는 사람 FGFR2에 결합하는 분리된 항체:
    (a) SEQ ID NO: 21(4B9)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄, 및 SEQ ID NO: 23(4B9)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄;
    (b) SEQ ID NO: 54( Hu4B9 -65)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄, 및 SEQ ID NO: 58( Hu4B9 -65)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄;
    (c) SEQ ID NO: 56( Hu4B9 -82, -83)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄, 및 SEQ ID NO: 60( Hu4B9 -82)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄; 및
    (d) SEQ ID NO: 56( Hu4B9 -82, -83)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄, 및 SEQ ID NO: 62( Hu4B9 -83)의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄.
  27. 제26항의 면역글로불린 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  28. 제26항의 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  29. 제27항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  30. 제28항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  31. 제30항에 있어서,
    제27항의 핵산을 더 포함하는 발현 벡터.
  32. 제29항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  33. 제30항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  34. 제31항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  35. 제33항에 있어서,
    제29항의 발현 벡터를 더 포함하는 숙주 세포.
  36. 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법으로서,
    (a) 숙주 세포가 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 발현하도록 하는 조건들 하에서 제32항 또는 제33항의 숙주 세포를 성장시키는 단계; 및
    (b) 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함하는 방법.
  37. 사람 FGFR2에 결합하는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편을 생산하는 방법으로서,
    (a) 숙주 세포가 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및/또는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 발현하도록 하는 조건들 하에서 제34항 또는 제35항의 숙주 세포를 성장시켜서 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편을 생산하는 단계; 및
    (b) 상기 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편을 정제하는 단계를 포함하는 방법.
  38. 제1항, 제14항, 또는 제26항에 있어서,
    상기 항체는 표면 플라즈몬 공명으로 측정시 500 pM 이하의 KD를 갖는 항체.
  39. 종양 세포의 증식을 억제 또는 감소시키는 방법으로서, 상기 세포를 제1항, 제14항, 또는 제26항의 항체의 유효량에 노출시켜 상기 종양 세포의 증식을 억제 또는 감소시키는 것을 포함하는 방법.
  40. 포유동물에서 종양의 성장을 억제 또는 감소시키는 방법으로서, 상기 포유동물을 제1항, 제14항, 또는 제26항의 항체의 유효량에 노출시켜 상기 종양의 증식을 억제 또는 감소시키는 것을 포함하는 방법.
  41. 포유동물에서 암을 치료하는 방법으로서, 제1항, 제14항 또는 제26항의 항체의 유효량을 그의 필요시 상기 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 결장암, 폐암, 췌장암, 위암, 및 두경부암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  43. 제41항에 있어서,
    상기 포유동물은 사람인 방법.
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