发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有的升高白细胞的西药无法有效地修复反复受损的骨髓造血微循环,而中药对重度骨髓抑制的疗效有限的缺陷,提供了一种可升高白细胞,有效促进造血功能恢复的中药组合物及其制备工艺和应用。本发明的中药组合物通过促进脾细胞表达GM-CSF蛋白,增加内源性GM-CSF生成,升高GM-CSF活性,进而促进白细胞和骨髓细胞的分化增殖,可升高放化疗患者的白细胞,防治放化疗患者的骨髓抑制,改善和提高癌症患者中医症候和生活质量;对于气虚患者,通过益气养阴,提高免疫力促进气虚患者的恢复;且无毒副反应。
本发明提供了一种升高白细胞的中药组合物,其活性成分由下述原料中药材制得:黄芪和黄精(Polygonatum sibiricum Red.),其中黄芪与黄精的重量比为1∶1-2∶1。
本发明中所述的黄芪可选用各种品种的黄芪,例如荚膜黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge)和/或蒙古黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)。
本发明中,所述的中药组合物可为本领域中药制剂的各种常规剂型,较佳地为散剂、口服液体制剂、颗粒剂、滴丸剂、片剂、胶囊剂(包括硬胶囊或软胶囊)、脂质体、缓释制剂、控释制剂或注射剂(包括小针、输液或冻干粉),更佳地为口服液体制剂、颗粒剂、滴丸剂、片剂、胶囊剂或注射剂。
本发明中,可通过将所述活性成分与制备所述剂型时相应的赋形剂相结合,采用本领域常规方法制得各种剂型。
本发明还提供了所述中药组合物的制备工艺,其包括下述步骤:采用下述方案中的任一种制备所述活性成分:
方案一:按照所述中药组合物中原料中药材的重量比,将黄芪和黄精干燥后粉碎成细粉,得活性成分细粉;
方案二:按照所述中药组合物中原料中药材的重量比,将黄芪和黄精加水煎煮,过滤,取滤液并离心分离去除固体物质,取上清液浓缩成清膏,得活性成分清膏;
方案三:按照方案二制备活性成分清膏,再进行干燥和粉碎,得活性成分细粉。
在方案二或方案三中,加水煎煮时,每次加水的量为本领域制备清膏时的常规用量,较佳地为所述原料中药材总重量的8-16倍,煎煮的温度较佳地为使煎煮液沸腾的温度。每次煎煮的时间为本领域常规的煎煮时间,较佳地为2-4小时。煎煮的次数较佳地为1-4次。当所述煎煮次数为2次以上时,每次煎煮后都进行所述过滤,将每次过滤后的滤液合并,再进行所述离心去除固体物质。所述浓缩的方法采用本领域常规的清膏浓缩方法进行,浓缩的程度较佳地为使所述活性成分清膏在60℃时的相对密度为0.8-1.5。
在本发明一较佳的实施方式中,所述的制备工艺还可包括下述步骤:将所述活性成分与赋型剂按本领域常规方法制成各种药学剂型,如散剂、口服液体制剂、颗粒剂、滴丸剂、片剂、胶囊剂(包括硬胶囊或软胶囊)、脂质体、缓释制剂或注射剂(包括小针、输液或冻干粉)等,较佳地为口服液体制剂、颗粒剂、滴丸剂、片剂、胶囊剂或注射剂。其中,所述的赋型剂根据不同的剂型,按本领域常规知识选择。
在本发明一更佳的实施方式中,所述口服液体制剂的制备工艺按下述步骤进行:将所述活性成分清膏与甜味剂和山梨酸钾混合,与水混合搅拌,调pH值至6-7,过滤,灌装,灭菌,即得口服液体制剂。其中,所述甜味剂、山梨酸钾和水的用量皆为本领域中进行口服液体制剂制备时的常规用量。所述pH值较佳地采用NaOH水溶液进行调节。该口服液体制剂剂型的优点是起效迅速,生物利用度高。
在本发明一更佳的实施方式中,所述颗粒剂的制备工艺按下述步骤进行:将所述活性成分清膏与糊精和甜味剂混合,干燥,制粒,整粒,即得颗粒剂。其中,所述糊精与所述活性成分清膏的重量比较佳地为1∶1-1∶2,所述甜味剂的用量可为本领域中进行颗粒制剂制备时的常规用量,一般为所述颗粒剂重量的10%以下。
在本发明一更佳的实施方式中,所述胶囊剂的制备工艺按下述步骤进行:将所述活性成分清膏与淀粉混匀,制粒,过筛,干燥,整粒,灌装,即得胶囊剂。其中,所述淀粉的用量为本领域中进行胶囊剂制备时的常规用量。
在本发明一更佳的实施方式中,所述片剂的制备工艺按下述步骤进行:将所述活性成分清膏干燥,粉碎,制粒,压制成片,即得片剂;或者将所述活性成分细粉制粒,压制成片,即得片剂。
本发明还提供了一种升高白细胞的中药组合物,其活性成分为黄芪提取物和黄精提取物,其中所述的黄芪提取物至少为黄芪多糖提取物,所述的黄精提取物至少为黄精多糖提取物;所述黄芪多糖提取物与所述黄精多糖提取物的重量比为1∶1-3∶1。
本发明中,所述的黄芪提取物较佳地还包括黄芪皂苷提取物和/或黄芪总黄酮提取物,所述黄芪多糖提取物和黄芪皂苷提取物的重量比较佳地为30∶1,所述黄芪多糖提取物和黄芪总黄酮提取物的重量比较佳地为100∶1。
本发明中,所述的黄精提取物较佳地还包括黄精总皂苷提取物,所述黄精多糖提取物和所述黄精总皂苷提取物的重量比较佳地为20∶1。
在本发明一较佳的实施方式中,所述的黄芪提取物为黄芪多糖提取物,所述的黄精提取物为黄精多糖提取物。其中,所述黄芪多糖提取物与所述黄精多糖提取物的重量比较佳地为1∶1-3∶1。
在本发明另一较佳的实施方式中,所述的黄芪提取物为黄芪多糖提取物和黄芪皂苷提取物,所述的黄精提取物为黄精多糖提取物。其中,所述黄芪多糖提取物:所述黄芪皂苷提取物:所述黄精多糖提取物的重量比较佳地为300∶10∶300。
在本发明另一较佳的实施方式中,所述的黄芪提取物为黄芪多糖提取物和黄芪皂苷提取物,所述的黄精提取物为黄精多糖提取物和黄精总皂苷提取物。其中,所述黄芪多糖提取物:所述黄芪皂苷提取物:所述黄精多糖提取物:所述黄精总皂苷提取物的重量比较佳地为300∶10∶100∶5。
在本发明一更佳的实施方式中,所述的黄芪提取物为黄芪多糖提取物、黄芪皂苷提取物和黄芪黄酮提取物,所述的黄精提取物为黄精多糖提取物。其中,所述黄芪多糖提取物:所述黄芪皂苷提取物:所述黄芪总黄酮提取物:所述黄精多糖提取物的重量比较佳地为300∶10∶3∶150。
在本发明另一更佳的实施方式中,所述的黄芪提取物为黄芪多糖提取物、黄芪皂苷提取物和黄芪总黄酮提取物,所述的黄精提取物为黄精多糖提取物和黄精总皂苷提取物。其中,所述黄芪多糖提取物:所述黄芪皂苷提取物:所述黄芪总黄酮提取物:所述黄精多糖提取物:所述黄精总皂苷的重量比较佳地为300∶10∶3∶300∶15。
本发明中,所述的中药组合物可为本领域中药制剂的各种常规剂型,较佳地为散剂、口服液体制剂、颗粒剂、滴丸剂、片剂、胶囊剂(包括硬胶囊和软胶囊)、脂质体、缓释制剂、控释制剂或注射剂(包括小针、输液和冻干粉),更佳地为口服液体制剂、颗粒剂、滴丸剂、片剂、胶囊剂或注射剂。
本发明中,可通过将所述黄芪提取物、黄精提取物与制备所述剂型时相应的赋形剂相结合,采用本领域常规方法制得各种剂型。
本发明还提供了所述中药组合物的制备工艺,其包括下述步骤:将所述黄芪提取物和所述黄精提取物混合即可。
在本发明一较佳的实施方式中,所述的制备工艺还可包括下述步骤:将混合后的物料与赋型剂按本领域常规方法制成各种药学剂型,如散剂、口服液体制剂、颗粒剂、滴丸剂、片剂、胶囊剂(包括硬胶囊或软胶囊)、脂质体、缓释制剂或注射剂(包括小针、输液或冻干粉)等,较佳地为口服液体制剂、颗粒剂、滴丸剂、片剂、胶囊剂或注射剂。其中,所述的赋型剂根据不同的剂型,按本领域常规知识选择。
在本发明一更佳的实施方式中,所述口服液体制剂的制备工艺按下述步骤进行:将所述混合后的物料与甜味剂和山梨酸钾混合,与水混合搅拌,调pH值至6-7,过滤,灌装,灭菌,即得口服液体制剂。其中,所述甜味剂、山梨酸钾和水的用量皆为本领域中进行口服液体制剂制备时的常规用量。所述pH值较佳地采用NaOH水溶液进行调节。其中,所述混合后的物料为黄芪多糖提取物、黄芪皂苷提取物和黄精多糖提取物;黄芪多糖提取物、黄芪皂苷提取物和黄精多糖提取物的重量比较佳地为30∶1∶30。该口服液体制剂剂型的优点是起效迅速,生物利用度高。
在本发明一更佳的实施方式中,所述颗粒剂的制备工艺按下述步骤进行:将所述混合后的物料与糊精和甜味剂混合,干燥,制粒,整粒,即得颗粒剂。其中,所述混合后的物料为黄芪多糖提取物、黄芪皂苷提取物、黄芪总黄酮提取物、黄精多糖提取物和黄精总皂苷提取物;黄芪多糖提取物、黄芪皂苷提取物、黄芪总黄酮提取物、黄精多糖提取物和黄精总皂苷提取物的重量比较佳地为300∶10∶3∶300∶15。所述糊精和甜味剂的用量可为本领域中进行颗粒制剂制备时的常规用量。
在本发明一更佳的实施方式中,所述胶囊剂的制备工艺按下述步骤进行:将所述混合后的物料与淀粉混匀,制粒,过筛,干燥,整粒,灌装,即得胶囊剂。其中,所述混合后的物料为黄芪多糖提取物、黄芪皂苷提取物、黄精多糖提取物和黄精总皂苷提取物;黄芪多糖提取物、黄芪皂苷提取物、黄精多糖提取物和黄精总皂苷提取物的重量比较佳地为300∶10∶100∶5。所述淀粉的用量为本领域中进行胶囊剂制备时的常规用量。
在本发明一更佳的实施方式中,所述片剂的制备工艺按下述步骤进行:将所述混合后的物料混匀,制粒,压制成片,即得片剂。其中,所述混合后的物料为黄芪多糖提取物、黄芪皂苷提取物、黄芪总黄酮提取物和黄精多糖提取物;黄芪多糖提取物、黄芪皂苷提取物、黄芪总黄酮提取物和黄精多糖提取物的重量比较佳地为300∶10∶3∶150。
本发明所用试剂及原料均市售可得,黄芪多糖提取物、黄芪皂苷提取物与黄精皂苷提取物为西安林禾生物技术有限公司生产;黄精多糖提取物为宁波德康生物制品有限公司生产;黄芪总黄酮提取物是上海中医药大学中药研究所提供。
本发明的中药组合物的治疗剂量可为:成人每日服用量相当于0.7-1.5克活性成分/kg体重。
本发明还提供了所述的中药组合物在用于制备治疗白细胞减少症,提高机体免疫功能,促进骨髓造血干/祖细胞增殖,保护造血微环境,修复放射线对骨髓造血组织的损坏和损伤,防治放、化疗的骨髓抑制,促进粒-单系造血祖细胞集落形成,或改善和提高癌症患者中医症候和生活质量的药物中的应用。
本发明中,上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合,即得本发明各较佳实施例。
本发明的积极进步效果在于:经临床及动物试验研究发现,本发明的中药组合物能够升高癌症患者白细胞,防治癌症患者较重的骨髓抑制,提高机体免疫功能,促进骨髓造血干/祖细胞增殖,保护造血微环境,修复放射线对骨髓造血组织的损坏和损伤,防治放化疗的骨髓抑制,促进粒-单系造血祖细胞集落形成,改善和提高癌症患者中医症候和生活质量。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
黄芪多糖提取物、黄芪皂苷提取物与黄精皂苷提取物为西安林禾生物技术有限公司提供。
黄精多糖为宁波德康生物制品有限公司提供,黄芪总黄酮是上海中医药大学中药研究所提取。
实施例1口服液体制剂的制备
1、称取原料中药材:黄芪30Kg,黄精30Kg。
2、将上述药材加15倍质量的水煎煮,时间3小时,过滤,将滤渣加水重复煎煮一次,过滤,合并两次的滤液,离心分离去除固体物质,取上清液浓缩制得清膏(相对密度0.8,温度59℃)。
3、加入1kg甜味素,2kg山梨酸钾,搅拌加水30L,10wt%NaOH水溶液调pH值至6-7,滤过,灌装,灭菌。
实施例2颗粒剂的制备
称取黄芪多糖提取物30Kg,黄精多糖提取物30Kg,黄芪总黄酮提取物0.3Kg,黄芪皂苷提取物1Kg,黄精皂苷提取1.5Kg,混匀后加入等质量的糊精和占颗粒剂5wt%的甜味素,再经过干燥、制粒、整粒,即可。
实施例3胶囊制剂的制备
将黄芪多糖提取物30Kg、黄芪皂苷提取物1Kg、黄精多糖提取物10Kg、黄精总皂苷提取物0.5Kg混合,再与淀粉混匀,制粒,过筛,干燥,整粒,灌装,即得胶囊剂。
实施例4片剂的制备
将黄芪多糖提取物30Kg、黄芪皂苷提取物1Kg、黄芪总黄酮提取物0.3Kg和黄精多糖提取物15Kg混匀,制粒,压制成片,即得片剂。
实施例5口服液体制剂的制备
称取黄芪多糖提取物30Kg、黄芪皂苷提取物1Kg和黄精多糖提取物30Kg,混匀,加入3kg甜味素,6kg山梨酸钾,搅拌加水60L,10wt%NaOH水溶液调pH值至6-7,滤过,灌装,灭菌。
效果实施例1动物实验研究
采用实施例1的口服液体制剂作为主方。
1、实验动物及分组及给药方法:取Balb/C小鼠随机分为7组,每组22只。除正常对照组外,其余小鼠造模后随机分入模型组、阳性对照利可君组、主方高、中、低剂量组。分组后连续给药9天,利可君、主方(中剂量)组剂量相当于成人临床有效剂量的9倍,主方高、低剂量各为临床用量的18、4.5倍。正常组和模型组给予等体积的生理盐水。分别为:
正常组:生理盐水20mL·kg-1·d-1;
模型组:生理盐水20mL·kg-1·d-1;
利可君组:20mg·kg-1·d-1;
主方高剂量组:36g·kg-1·d-1;
主方中剂量组:18g·kg-1·d-1;
主方低剂量组:9g·kg-1·d-1。
上述剂量皆每kg体重每天摄入的活性成分的量。
2、实验方法:
1.1样本的采集
1.1.1外周血采集
分别于造模后给药第4、7、10日,尾静脉取血20μl,与1.5%EDTA抗凝,以待上样血细胞分析仪检测。
1.1.2血清分离
给药第10天,摘眼球取血采集于EP管内,静置2h,3000转/分,15分钟,离心分离血清,-80℃备用。
1.1.3骨髓单细胞悬液的制备
脱臼处死小鼠,在75%酒精中浸泡3分钟,从股骨大转子至髌骨处完整取出一侧股骨,剔去肌肉,用注射器吸取无菌处理的PBS冲出骨髓细胞,通过4号针头过滤,制成单细胞悬液。取少量进行细胞计数和骨髓细胞集落培养,一部分液氮中保存。
1.1.4病理标本的制备
给药第10天,脱臼处死,取一侧股骨,剔除软组织后,于4%多聚甲醛溶液中固定48h后,于脱钙液内继续脱钙固定。
1.2指标检测
1.2.1外周血白细胞检测
分别于造模后第4,7,10日,尾静脉取血20μl,血细胞分析仪上进行外周血白细胞数量测定。
1.2.2骨髓有核细胞计数
给药第10日,称重后脱臼处死,取右侧完整股骨,用PBS冲出全部骨髓,形成单细胞悬液,显微镜下进行计数。
1.2.3骨髓病理观察
给药第10天,脱臼处死,取左侧股骨于4%多聚甲醛溶液中固定,经常规脱钙、脱水、石蜡包埋、切片、H-Giemsa-E染色,显微镜下观察骨髓造血组织病理变化。
骨髓造血组织损伤程度的划分标准参照浦权[35]等方法进行改良:在一个高倍视野下(10×40),血窦数量10个以上,计1分,脂肪细胞面积1/3以下,计1分;血窦数量5-10个,计2分,脂肪细胞面积在1/3~1/2之间,计2分;血窦数量5个以下,计3分,脂肪细胞面积大于1/2,计3分,每个样本的2种分值相加得出1个总分,用总分来描述小鼠骨髓造血组织损伤程度。
1.2.4粒-单系祖细胞集落(CFU-GM)产率的检测
给药第7天,脱臼处死小鼠每组3只,按1.8.3法制备各组小鼠BMNC单细胞悬液。参考文献(徐有恒,王绮如.造血生理学和造血细胞检测技术.湖南:湖南科学技术出版社,1997:11)中记载的粒-单系造血祖细胞培养方法,1×10-4mol/ml 2-巯基乙醇0.2ml,3%L-谷氨酰胺0.03ml,马血清0.5ml,25ng/ml rmGM-CSF 0.3ml,BMNC浓度调整至1×105/ml,IMDM培养基补足体积至1.8ml,3%Agar 0.2ml,混匀,各培养体系总体积为2ml,于24孔板中培养,每孔0.5ml,平行4孔。在37℃、5%CO2培养箱中培养7天,在倒置显微镜下观察,以多于40个细胞的克隆单位为一个集落。
1.2.5骨髓CD34+细胞比例检测
按照文献(Morel F,Szilvassy SJ,Travis M,et al.Primitive hematopoieticcells in murine bone marrow express the CD34 antigen.Blood,1988,(10):3774-3784)中记载的方法进行检测。
分别于给药第4、7、10天,取Balb/C小鼠每组6只,按1.8.3法制成单细胞悬液,充分混匀。于每管加入2ml溶血素以破坏红细胞,2000rpm离心15min,弃上清后重悬,取1×106个细胞加入30μl正常小鼠血清以封闭非特异结合位点,加入10μl FITC标记的大鼠抗小鼠CD34抗体,4℃避光反应30min,加入2ml红细胞裂解液,作用4min,用PBS洗细胞2次(1500rpm,10min),加入终浓度为3μg/ml的碘化丙啶(PI)染液,上流式细胞仪检测。
1.2.6骨髓细胞周期检测
按照文献(Patton WF.A thousand points of light:the application offluorescence detection technologies to two-dimensional gel electrophoresis andproteomics.Electrophoresis,2000,21(6):1123-44)中记载的方法进行检测。
给药第7天,取Balb/C小鼠每组6只,按1.8.3法制成单细胞悬液,充分混匀。于每管加入2ml溶血素以破坏红细胞,2000rpm离心15min,弃上清,加入1ml PBS重悬,再加入2ml无水乙醇,混匀,放置4℃冰箱固定过夜。
检测前,用PBS洗涤除去乙醇后,加RNase 50μg/ml,37℃温育后冰浴中止酶的作用。加100μl PBS混匀,再加入50μl含0.1%Triton-100的PI染液(50μg/ml)进行染色,室温避光放置60min,加入500μlPBS重悬,上流式细胞仪检测骨髓细胞DNA含量并分析细胞周期。如有成团细胞,用500目尼龙网滤过后再上机检测。
1.2.7Elisa法检测小鼠血清中粒-单核巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)含量
给药第10日,摘眼球取血,离心,分离血清,用双抗体夹心Elisa法测定血清中GM-CSF含量。具体程序如下:
(1)检测程序:
1)建立标准曲线:设标准孔8孔,每孔中加入样品稀释液100μl,第一孔加标准品100μl,混匀后加用加样器吸出100μl,移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔,最后,从第七孔中吸出100μl弃去,使之体积均为100μl。第八孔为空白对照。
2)加样:待测品孔每孔各加入待测品100μl。
3)将反应板充分混匀后置37℃120分钟。
4)洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。
5)每孔中加入第一抗体工作液50μl。
6)将反应板置37℃60分钟。
7)洗板:同前。
8)每孔加酶标抗体工作液100μl。
9)将反应板置37℃60分钟。
10)洗板:同前。
11)每孔加入底物工作液100μl,置37℃暗处反应5-10分钟。
12)每孔加入50μl终止液混匀。
13)在492nm处测吸光度。
(2)结果计算与判断
1)所有OD值都应减除空白值后在进行计算。
2)以标准品1000、500、250、125、62.5、32、16、0ng/ml之OD值在半对数纸上做图,画出标准曲线。
3)根据样品OD值在该曲线上查出相应的GM-CSF含量。
1.2.8RT-PCR检测骨髓抑制小鼠骨髓GM-CSF mRNA表达
1.2.8.1标本来源
给药第10日,取Balb/c小鼠每组8只,按1.8.3法制成单细胞悬液冻存于液氮罐中。
1.2.8.2引物序列设计
引物由上海生物化工有限公司合成,见下表。
1.2.8.3Trizol法总RNA抽提
按照Trizol
Reagant试剂说明书进行总RNA提取实验,步骤如下:
(1)液相分离:取出冻存的小鼠骨髓细胞悬液转移到EP管中,加入1mlTrizol液,充分混匀。将上述悬液在室温下静置5min,加入200μl氯仿,来回颠倒混匀15sec,再室温静置2-3min后,4℃,12000转/分,离心15min。则可见悬液分为三层:上层水样无色,所含RNA约占体积的60%,中层为蛋白,下层呈红色,为酚氯仿。
(2)RNA沉淀:小心将上层水相移至RNase-free 1.5ml EP管内,按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀,室温静置10min。4℃,12000转/分,离心10min,可见管底白色沉淀为RNA。
(3)RNA洗涤:弃去上清,按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇,温和振荡EP管洗下沉淀。4℃,7500转/分,离心5min。
(4)RNA再溶解:弃上清,自然干燥5-10min(避免过于干燥),加入DEPC水30μl溶解。
(5)RNA浓度测定:采用分光光度仪检测A260/A280比值,以检验样品RNA的纯度;并按公式计算RNA浓度,C(μg/μl)=(A260/A280)×稀释倍数/25。
1.2.8.4cDNA第一链合成
20μl RT反应体系内加入以下试剂:
总RNA 2μl
Oligo(dT)18Primer 1μl
DEPC-H2O(10mM) 8μl
将上述样品混匀,70℃反应5min,然后立即转至冰上2-3min。室温高速离心5sec,将所有溶液收集到管底,按次序分别加入下列试剂,使RT反应体系总量至20μl:
5×First-Strand Buffer 4μl
Ribonuclease inhibitor 0.5μl
dNTP mix(10mM) 4μl
AMV Reverse Transcriptase 1μl
将上述RT反应体系混匀,37℃保温1小时。70℃加热10min灭活,冰上冷却。将所得cDNA第一链产物置-20℃保存,待作PCR。
1.2.8.5PCR扩增
参照试剂和说明,结合实验条件,20ulPCR反应体系如下:
PCR循环条件:β-actin 95℃预变性5min,接以26次循环数扩增(95℃5min,95℃30s,60℃40s,72℃1min),最后72℃延伸10min,冰上冷却;GM-CSF 95℃预变性5min,接以26次循环数扩增(95℃5min,95℃30s,58℃40s,72℃1min),最后72℃延伸10min,冰上冷却。
1.2.8.6PCR产物分析
PCR产物加样于含1%EB的1.5%琼脂糖凝胶上电泳,电压150v,电泳30分钟。在紫外光凝胶分析系统下摄片,运用灰度扫描软件检测以上电泳条带的荧光强度。在同一反应体系中扩增目的基因和管家基因β-actin,并以两者的荧光比值来衡量各目的基因的相对量进行分析统计。
1.2.9免疫组织化学法检测小鼠骨髓细胞GM-CSF及GM-CSFRα蛋白表达
给药第10日,每组取8只小鼠,取左侧完整股骨,置于4%多聚甲醛溶液中固定48小时,10%EDTA脱钙后,常规石蜡包埋、切片。
免疫组化SP法:
(1)石蜡切片常规脱蜡至水。
(2)3%H2O2室温孵育5-10min,以消除内源性过氧化物酶的活性,蒸馏水冲洗,PBS浸泡5min。
(3)蒸馏水洗3次,每次1min,进行抗原的修复:将切片放入盛有0.01M枸橼酸盐缓冲液的容器中,置微波炉内加热至沸腾后断电,间隔5-10分钟后,反复1-2次。冷却后PBS洗涤3次,每次5分钟。
(4)5%BSA封闭液室温孵育30min。倾去血清,不洗。
(5)滴加适当比例稀释的一抗(GM-CSF:1∶100;GM-CSFRα:1∶150),4℃过夜。PBS冲洗3次,每次5min。同时以PBS液代替一抗进行阴性对照。
(6)滴加二抗(生物素化山羊抗小鼠IgG工作液),37℃孵育30min。PBS洗3次,每次3min。
(7)滴加SP混合液,20-37℃下放置30min,PBS洗4次,每次5min。
(8)DAB显色8-12分钟,镜下观察控制时间。
(9)蒸馏水充分冲洗,苏木素轻度复染(60-90秒),脱水,透明,封片。
(10)阳性结果判定:GM-CSF和GM-CSFα阳性表现均为细胞浆着色呈棕黄色。分别采用Image pro6.0图像分析系统测定400倍镜下阳性面积。每组选取切片6张,每张选取细胞分布均匀的三个视野进行分析。
1.3统计学方法
各组实验数据以均数±标准差
表示,整理后导入SPSS16.0统计软件进行数据分析。以方差分析检验各组均数间的差异性,若方差不齐用Games-Howell校正检验。P<0.05为差异显著,具有统计学意义。
2、结果:
2.1对骨髓抑制小鼠外周血白细胞、骨髓有核细胞数量的影响
2.1.1对骨髓抑制小鼠给药第4、7、10天外周血白细胞的影响
将小鼠给药第4、7、10天的外周血白细胞数据进行重复测量的方差分析,球形检验P值<0.01,如表1所示,表明各组小鼠给药第4、7、10天的外周WBC存在高度相关性。
表1各组小鼠给药第4、7、10天重复测量外周血WBC的球形检验
2.1.1.1时间、组别因素对各组小鼠外周血白细胞的影响
表2所示,时间和时间*组别交互项的P值均<0.05,提示时间因素以及时间-分组因素的交互作用有统计学意义,说明各组小鼠WBC有随时间逐渐升高的趋势。并且时间因素的作用也随不同组别而不同,不同组别间存在显著差异(P<0.01),如表3所示。提示不同给药对各组小鼠第4、7、10天所检测的WBC有不同影响。
表2不同时间点各组小鼠外周血WBC差别效应的检验
来源 |
|
Ⅲ型平方和 |
均方 |
F |
P值 |
时间 |
Greenhouse-Geisser |
134.612 |
74.031 |
446.281 |
0.000 |
时间*组别 |
Greenhouse-Geisser |
35.052 |
3.213 |
19.368 |
0.000 |
误差 |
Greenhouse-Geisser |
19.003 |
0.166 |
|
|
表3不同组别间小鼠外周血WBC差别效应的检验
来源 |
Ⅲ型平方和 |
自由度 |
均方 |
F |
P值 |
截距 |
1632.430 |
1 |
1632.430 |
2302.062 |
0.000 |
组别 |
241.099 |
6 |
40.183 |
56.667 |
0.000 |
误差 |
44.674 |
63 |
0.709 |
- |
- |
2.1.1.2不同组别对骨髓抑制小鼠外周血白细胞的影响
如表4、图1和图2所示,模型组小鼠在各时段外周血WBC较正常组均明显减少,与正常组有显著差异(P<0.01),说明射线联合CTX注射可以明显降低小鼠的外周血WBC,提示造模成功。小鼠外周血WBC的低点出现于造模后1~4日,后逐渐回升,但第10日仍明显低于正常组(P<0.01)。各给药组小鼠在不同时间点的WBC数较模型组均有不同程度的升高,给药第7日,利可君组、主方高、中剂量组小鼠的外周血WBC与模型组比较有显著差异(P<0.01),且主方高剂量组优于利可君组(P<0.05)。至第10日,各组小鼠外周血WBC继续回升,利可君组、主方高、中剂量组小鼠的外周血WBC与模型组比较有显著差异(P<0.01),且主方高、中剂量组均优于利可君组(P<0.01),主方(中剂量)组与全方组无明显差异(P>0.05),说明主方具有提升骨髓抑制小鼠外周血白细胞的作用。
表4主方对小鼠外周血WBC及BMNC的影响(
n=10)
与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与正常对照组比较,#P<0.05,##P<0.01;与阳性对照利可君组比较,△P<0.05,△△P<0.01。
2.1.2主方对骨髓抑制小鼠骨髓有核细胞的影响
如图2所述,137Se辐照联合CTX腹腔注射可使小鼠BMNC明显下降,与正常组比较差异有显著性(P<0.01)。各给药组均可显著促进骨髓抑制小鼠BMNC的增殖(P<0.01),主方高剂量组明显优于阳性对照利可君组(P<0.01)。
2.2主方对骨髓造血组织病理变化的影响
光镜下观察,正常组小鼠骨髓组织中细胞增生活跃,可见各阶段分化细胞,血窦丰富,脂肪细胞无明显增生,未见灶性纤维组织增生。模型组小鼠骨髓组织中细胞增生低下,血窦数量减少,脂肪细胞增生明显,各阶段红细胞均可见,但粒细胞系受抑,巨核细胞不见。给药第10天,各给药组小鼠骨髓细胞的增生活跃程度不同,血窦丰富,损伤减轻,尤以全方组及主方高剂量组情况为好。
由骨髓造血组织损伤分值统计显示,模型组骨髓造血组织损伤严重,与正常组比较有显著差异(P<0.01),主方各组骨髓造血组织恢复情况良好,与模型组比较有显著性(P<0.01),表明主方对骨髓造血组织具有保护作用,结果表5可见差异。
分组 |
剂量/g·kg-1 |
动物数(只) |
损伤分值 |
正常组 |
- |
8 |
2.38±0.52** |
模型组 |
- |
8 |
5.13±0.83## |
利可君组 |
0.02 |
8 |
3.38±1.19** |
主方(高) |
36 |
8 |
2.63±0.74** |
主方(中) |
18 |
8 |
3.13±0.99** |
主方(低) |
9 |
8 |
3.25±0.89** |
与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与正常对照组比较,#P<0.05,##P<0.01。
2.3主方对骨髓抑制小鼠粒系造血祖细胞集落产率的影响
从表6和图3可见,与正常组比较,模型组粒系CFU-GM明显减少(P<0.01)。主方中剂量组和阳性对照利可君组形成的粒系造血祖细胞集落数明显高于模型组(P<0.01),说明主方(中)组对粒系CFU-GM形成有明显的促进作用,且主方高剂量组优于利可君组(P<0.01),主方(中)组与阳性对照利可君药无明显差异(P>0.05)。
分组 |
剂量/g·kg-1 |
CFU-GM(个/105BMC-1) |
正常组 |
- |
83.33±2.93** |
模型组 |
- |
30.92±4.12## |
利可君组 |
0.02 |
44.08±4.01** |
主方(高)组 |
36 |
65.33±4.19**△△ |
主方(中)组 |
18 |
46.83±4.34** |
主方(低)组 |
9 |
33.17±3.88 |
2.4主方对骨髓抑制小鼠骨髓CD34+细胞比例的影响
骨髓抑制造模可使小鼠骨髓CD34+细胞比率下降,与正常组比较有显著性差异(P<0.01)。如表7和图4可见,随给药时间的持续,小鼠骨髓中CD34+细胞比率逐渐升高;给药第4、7日,利可君组、主方高、中剂量组均可明显升高模型小鼠骨髓CD34+细胞比率,与模型组比较有显著性差异(P<0.01);提示各组药物可促进骨髓中CD34+细胞成熟后释放入外周血中,这可以解释给药第10天各组外周血WBC水平均不同程度明显升高的现象。给药第10日,各给药组均可明显升高模型小鼠骨髓CD34+细胞比例,与模型组比较差异有显著性(P<0.01);主方高、中剂量组均明显优于利可君组(P<0.01)。
比较给药第4、7、10天主方高、中、低剂量组提升骨髓抑制小鼠骨髓CD34+细胞比率的作用强度:在各时间点,主方高剂量组均明显优于中剂量组(P<0.01),中剂量组明显优于低剂量组(P<0.01);随主方剂量的增加,骨髓CD34+细胞比率不断增加,提示可能存在一定的量-效关系。
表7药物对骨髓抑制小鼠骨髓CD34+细胞的影响(
n=6)
与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与正常对照组比较,#P<0.05,##P<0.01;与阳性对照利可君组比较,△P<0.05,△△P<0.01。
2.5主方对骨髓抑制小鼠骨髓细胞周期的影响
细胞周期分布显示,由表8可见,各组小鼠骨髓细胞主要处于G0/G1期,与模型组相比,各给药组G0/G1期细胞比例均有明显减少(P<0.01)。模型组小鼠骨髓细胞在G2/M期阻滞,主方高、中、低剂量组与模型组比较,在G2/M期的细胞比例均有显著升高(P<0.01),在S期比例也均有不同程度的升高。根据细胞增殖指数(PI)显示,利可君组、主方高、中、低剂量组较模型组均有不同程度的增高,具有显著差异(P<0.01);主方高、中剂量组小鼠骨髓细胞的增殖指数均明显高于利可君组(P<0.01),说明模型组骨髓细胞DNA合成减少,细胞分裂明显受限,主方能促进骨髓细胞由G0/G1期进入S期,促进骨髓细胞DNA的合成,并促进细胞由S期向G2/M期转化,从而有利于骨髓细胞的增殖。
比较主方高、中、低剂量组骨髓细胞增殖指数(PI)的大小:主方高剂量组明显优于中剂量组(P<0.01),中剂量组明显优于低剂量组(P<0.01);随主方剂量的增加,骨髓细胞增殖指数(PI)升高,有利于骨髓细胞的增殖;提示可能存在一定的量-效关系。
表8主方对骨髓抑制小鼠骨髓细胞周期的影响(
n=6)
分组 |
G0/1(%) |
S(%) |
G2/M(%) |
PI(%) |
正常组 |
76.63±2.44** |
17.13±2.80 |
6.24±1.04** |
23.37±2.44** |
模型组 |
82.09±2.51## |
15.87±2.33 |
2.04±0.50## |
17.91±2.51## |
利可君组 |
73.48±1.47** |
20.27±1.34** |
6.26±0.89 |
26.52±1.47** |
主方(高) |
64.76±2.87**△△ |
26.37±3.06**△△ |
8.87±0.93**△△ |
35.25±2.87**△△ |
主方(中) |
69.33±2.96**△△ |
22.27±2.82** |
8.41±0.76**△△ |
30.67±2.96**△△ |
主方(低) |
74.84±3.00** |
19.15±3.18* |
6.00±0.88** |
25.16±3.01** |
*P<0.05,**P<0.01;与正常对照组比较,#P<0.05,##P<0.01;与阳性对照利可君组比较,△P<0.05,△△P<0.01。
2.6主方对骨髓抑制小鼠血清粒细胞-单核巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)含量的影响
由表9和图5可见:经辐射联合CTX注射复合造模后,小鼠血清GM-CSF含量增加,与正常组比较有显著性差异(P<0.01)。这可能与造模导致骨髓造血组织受损,粒细胞生成减少,从而促使小鼠自身体内反馈性地激发GM-CSF的生成有关。各给药组均能不同程度地提升骨髓抑制小鼠血清GM-CSF的含量,与模型组比较有显著差异(P<0.01),且主方高、中、低各剂量组均明显优于利可君组(P<0.01),提示主方具有促GM-CSF生成的作用。图
分组 |
剂量/g·kg-1 |
动物数(只) |
GM-CSF(ng·L-1) |
正常组 |
- |
8 |
23.20±1.39** |
模型组 |
- |
8 |
33.51±1.51## |
利可君组 |
0.02 |
8 |
64.59±2.22** |
主方(高) |
36 |
8 |
88.78±2.07**△△ |
主方(中) |
18 |
8 |
70.49±1.45**△△ |
主方(低) |
9 |
8 |
44.51±1.76**△△ |
2.7主方对骨髓抑制小鼠骨髓GM-CSF mRNA表达的影响
2.7.1总RNA的鉴定
实验中所抽提的总RNA的吸光度A260与A280的比值在1.76和2.10之间,细胞提取总RNA量为10μg~20μg。凝胶电泳可见清晰的28S、18S条带,荧光强度比值约为2∶1,见图6。图6中自左向右依次为:正常组、模型组、利可君组、主方高、中、低剂量组。
2.7.2PCR检测结果
由表10和图7所示,小鼠骨髓GM-CSF mRNA正常组骨髓GM-CSFmRNA表达较低,模型组与正常组比较,骨髓GM-CSF表达明显增强(P<0.05),提示可能与造模损伤后,体内自身应激骨髓造血的重建有关;利可君组、主方高、中剂量组则使小鼠骨髓GM-CSF mRNA表达进一步上调,与模型组比较均有显著性差异(P<0.01或P<0.05)。表明其主方具有促进调动体内骨髓贮存,促进骨髓损伤修复,加强骨髓造血重建的作用。
表10主方对小鼠骨髓GM-CSFmRNA表达的影响
与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
2.8主方对骨髓抑制小鼠骨髓GM-CSF和GM-CSFRα蛋白表达的影响
GM-CSF和GM-CSFRα蛋白定位于细胞质,阳性产物为棕黄色颗粒。正常组骨髓组织中有少量细胞表达GM-CSF蛋白,模型小鼠骨髓内可见明显的GM-CSF阳性染色区域(P<0.01);主方高、中、低剂量组与模型组比较,GM-CSF蛋白表达进一步显著增强(P<0.01或P<0.05);且全方组及主方高剂量组均优于利可君组(P<0.01)。
与正常组比较,模型组小鼠骨髓细胞GM-CSFRα蛋白的表达量明显减少(P<0.01),提示小鼠外周血WBC减少等骨髓抑制的表现可能与辐照联合CTX化疗直接损伤骨髓细胞表面的GM-CSFR有关。主方高、中剂量组能不同程度地上调小鼠骨髓GM-CSFRα蛋白的表达(P<0.01)。结果详见表11。
表11主方对骨髓GM-CSF、GM-CSFRα蛋白表达的影响
效果实施例2动物实验研究
1、实验动物。
参照寿旗扬等(两种方法注射环磷酰胺致小鼠白细胞减少症模型的比较.实验动物与比较医学,2008,28(4):266-268)的造模方法,采用SPF级BALB/c小鼠,20g左右,除正常组外,其余各组均腹腔注射CTX,剂量为100mg/kg/d,连续3日,以外周血白细胞降至4×109·L-1以下为造模成功。
1.1.1实验分组及给药
取SPF级Balb/C小鼠70只,随机分为7组,每组10只。除正常对照组外,其余小鼠造模后随机分入模型组、治疗1组、治疗2组、治疗3组、治疗4组。分组后连续给药7天,剂量相当于成人临床有效剂量的9倍,正常组和模型组给予等体积的生理盐水。
正常组:生理盐水20mL·kg-1·d-1;
模型组:生理盐水20mL·kg-1·d-1;
治疗1组:用实施例2的制剂,剂量6.6g·kg-1·d-1。
治疗2组:用实施例3的制剂,剂量6.5g·kg-1·d-1。
治疗3组:用实施例4的制剂,剂量6.5g·kg-1·d-1。
治疗4组:用实施例5的制剂,剂量6.5g·kg-1·d-1。
1.1.2检测指标
1.1.1.1外周血白细胞数
造模后第4、7、10天,尾静脉取血,全自动血球分析仪测定外周血WBC。
1.1.1.2骨髓有核细胞计数
造模后第10天(即给药第7日后),称重后脱臼处死,取右侧完整股骨,用PBS冲出全部骨髓,形成单细胞悬液,显微镜下进行计数。
1.2统计学方法
各组实验数据以均数±标准差
表示,整理后导入SPSS18.0统计软件进行数据分析。以方差分析检验各组均数间的差异性,若方差不齐用Dunnett’s T3校正检验。P<0.05为差异显著,具有统计学意义。
2.结果
2.1小鼠骨髓抑制模型的建立
小鼠CTX腹腔注射造模后,外周血WBC明显降低,与正常对照组比较差异显著(P<0.01),说明小鼠骨髓抑制造模成功,见表12。造模后各组小鼠均表现为,对外界的反应性明显降低,少动喜扎堆,进食、饮水量减少,消瘦,毛色不光泽,毛发散乱,竖起脱落。给药7天后,模型组小鼠对外界刺激的反应仍较迟钝,扎堆,进食量较少,皮毛晦暗少光泽;模型小鼠活动能力和皮毛润泽度的降低,似乎与祖国医学虚损证候的表现相符。其他各给药组小鼠的活动度均有不同程度的改善,进食量增加,各治疗组小鼠对外界刺激的反应性较敏捷,皮毛有光泽;提示各治疗组小鼠的整体生活状态优于模型组。各治疗组能改善模型小鼠虚损的证候状态。
2.2组分治疗组对骨髓抑制小鼠外周血白细胞及骨髓有核细胞数量的影响
模型组小鼠在各时段外周血WBC较正常组均明显减少,与正常组有显著差异(P<0.01),说明CTX注射可以明显降低小鼠的外周血WBC,提示造模成功。小鼠外周血WBC的低点出现于造模后第4~5日,后逐渐回升,但第10日仍明显低于正常组(P<0.01)。给药后骨髓抑制小鼠外周血白细胞(WBC)均有不同程度的恢复,并且与时间有明显相关性。各给药组可明显升高骨髓抑制模型小鼠WBC数量,与模型组比较差异明显(P<0.01或P<0.05);结果见表12。
所有给药组骨髓有核细胞(BMNC)数与模型组比较均明显升高(P<0.01),结果见表12。
表12主要组分配伍对小鼠外周血WBC及BMNC的影响
注:与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与正常对照组比较,#P<0.05,##P<0.01。
结论:本发明的中药组合物可明显升高模型小鼠的白细胞(WBC);可升高模型小鼠的骨髓有核细胞计数并促进骨髓细胞增殖;可升高脾结节计数,提高粒单系集落形成单位产率,提高骨髓CD34+细胞比例,对造血干/祖细胞增殖具有促进作用;具有保护模型小鼠骨髓造血微环境作用;可升高模型动物胸腺指数,具有一定的免疫增强作用。