CN102863469B - 一种高纯度蛋黄卵磷脂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高纯度蛋黄卵磷脂的制备方法，涉及食品、药品配料生产领域。将新鲜鸡蛋经拣蛋、洗蛋、消毒处理后，进行蛋清和蛋黄的分离，得到蛋黄液；经一定量纯水稀释后加入到超声波提取罐中，以80%～95%乙醇为溶剂，采用脉冲超声波进行1～5次重复浸提，后经浓缩干燥制备得到PC粗提物；之后将PC粗提物置入亚临界萃取釜中，以液化丙烷或丁烷为溶媒，进行1～5次亚临界逆流浸提，萃取时间10～120min，料液比1:1～6，萃取温度10～90℃，萃取压力0.2～1.0MPa，之后进行减压脱溶，得到无油PC复合物；最后采用磁性纳米颗粒进一步精制，获得高纯度蛋黄PC。采用上述方法制备得到的蛋黄PC不仅得率大大提高，纯度也高达98%以上。
Description
技术领域
本发明涉及食品、药品配料生产领域，特指一种以蛋黄为原料，采用脉冲超声波提取技术、亚临界流体萃取技术以及磁性纳米分离技术生产高纯度蛋黄卵磷脂的方法。
背景技术
卵磷脂（PC）是目前全世界医学界唯一公认有健脑、健智及增强记忆力、提高抵抗力的保健产品，享有“血管清道夫”的美誉，其来源主要有蛋黄、脑髓、内脏、血液及油料作物的种子，其中以大豆和蛋黄为主。相比于大豆PC，蛋黄PC乳化性强、氧化稳定性好，在生物亲和性和安全性等方面明显优于植物来源的大豆PC，因此，近年来西方发达国家的人们更钟情于蛋黄PC。综上，蛋黄PC将会成为日后PC产品研究与开发的热点。
国内外蛋黄PC的提取方法主要包括有机溶剂萃取法、超临界CO2萃取法等，高纯PC的精制方法主要以柱层析法为主。
其中有机溶剂萃取法研究应用最多，CN201110090211.5、CN97118167.5、CN02160786.9、CN200510060250.2、CN200910181427.5、CN201010291041.2等公开了蛋黄磷脂的有机溶剂萃取法，此法虽然产量大，但有机溶剂耗量大、工艺时间长、提取率低，且所采用的有机溶剂多数不符合环保要求，部分有机溶剂残留于磷脂中会造成食品安全隐患。为了提高该法的萃取率，消除可能产生的食品安全隐患，研究人员采用食品上允许使用的乙醇作为溶媒，采用超声等手段辅助提取蛋黄磷脂，如肖虹等（超声辅助提取鸡蛋卵磷脂的工艺研究，食品工业科技，2010）、CN99808033.0、CN200610123974.4公开的蛋黄卵磷脂的超声-乙醇辅助提取法；然而单频超声波强度较强，容易造成蛋黄蛋白质的严重变性。
针对上述有机溶剂萃取法存在的技术关键问题，本发明引进脉冲超声波辅助乙醇提取技术，脉冲超声波技术与传统恒定声强的超声波技术相比，对细胞壁的破坏作用更强，提取效率高，同时萃取温度更低，对PC和蛋黄蛋白质的变性程度影响也较小。
此外，采用超临界CO2萃取法制备PC也备受关注，CN02149172.0、CN99124381.1、CN02150144.0、CN02160786.9、CN03140389.1、CN94102372.9、CN96120082.0、CN200710067279.5、CN200910136630.0公开了蛋黄卵磷脂的超临界流体萃取技术，然而超临界CO2萃取法始终存在着处理量小、设备投入大、产品成本较高等问题，制约了其在磷脂生产工艺中的大规模推广。
亚临界流体萃取技术是一项新型萃取与分离技术，具有无毒、环保，非热加工、保留提取物的活性成分不破坏、产能大、可进行工业化大规模生产，节能、运行成本低等优点，为蛋黄中蛋黄油的萃取提供了新思路。张民等人报道了亚临界丙烷萃取蛋黄粉中蛋黄油的研究，该法采用淋洗工艺、所需溶剂易得、蛋黄油得率较高。但是它的不足点为：(1)萃取效率较低、提取时间较长；(2)溶剂消耗量大、因而耗能高，且易残留。而本发明选择丙烷或丁烷为萃取溶剂，采用搅拌浸提式工艺进行蛋黄油的逆流重复提取，大大提高萃取效率，缩短了提取时间。
制备高纯蛋黄卵磷脂的另一关键技术就是后续精制步骤，目前，对PC纯化研究较多、且获得产业化的方法主要是柱层析法，如王卫芬（蛋黄油脱酸及蛋黄卵磷脂纯化工艺研究，江南大学硕士论文，2008）、CN200510060501.X、CN200510060250.5通过硅胶或氧化铝柱层析纯化蛋黄磷脂，有效提高了终产物蛋黄卵磷脂的纯度。柱层析法虽然可以得到含量90%左右的高纯度PC，但处理量小，周期长，且需引入部分有毒溶剂是此法突出的缺点。
采用无机盐复合沉淀法，也可实现PC的纯化。日本专利报道用95%乙醇与粗蛋黄磷脂混合，然后用ZnCl2沉淀离心分离后，收集 ZnCl2磷脂复合物，再加入冷却的丙酮，在氮气保护下搅拌过滤后蒸脱溶剂，可得到纯度达 99.6%的卵磷脂。无机盐复合沉淀法利用无机盐对磷脂分子的选择性，虽然可以大大提高卵磷脂的含量，但会在操作中引入金属离子，影响产品质量，造成金属离子污染。
磁性纳米分离技术是以磁性纳米载体为依托的高新分离技术，当颗粒的粒径小于30 nm时，则具有超顺磁性，称为超顺磁性纳米颗粒；超顺磁性纳米颗粒具有较强的磁响应性，在外加磁场的作用下，磁性颗粒可以快速富集、定位，当外加磁场消失后，颗粒的磁性也随即快速消失，目前已在生物医药、生物技术、化学、环境治理等领域得到了广泛的应用，成为当今最富有发展前景的新型分离技术之一。目前磁性纳米分离技术在高纯蛋黄PC的制备工艺中未见报道。本发明采用特定金属离子对超顺磁性Fe3O4纳米颗粒进行表面功能化修饰，赋予其特异性分离目标组分的功能，且制备所得的磁性纳米载体可实现重复利用，大大降低了工业化生产成本。
发明内容
本发明提供一种高纯度蛋黄PC的制备技术，通过脉冲超声波辅助乙醇提取蛋黄PC粗提物；再将亚临界流体萃取技术应用于蛋黄PC粗提物中的蛋黄油的高效分离；最后以磁性纳米技术实现蛋黄PC的精制，制备得到高纯度的蛋黄PC。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：首先新鲜鸡蛋检查消毒后进行蛋清、蛋黄分离，将蛋黄液置于提取罐中并加入乙醇溶剂以脉冲超声波辅助提取，醇提取液经浓缩后得到蛋黄磷脂粗提物，然后采用亚临界流体萃取技术分离出蛋黄油，最后以磁性纳米分离技术进一步纯化，制备得到高纯度蛋黄卵磷脂。
本发明的方法具体按照下述步骤进行：
（1）蛋黄、蛋清分离：首先对新鲜鸡蛋检查消毒，破壳后将蛋黄、蛋清分离，蛋黄搅拌均匀后，得到新鲜蛋黄液；其中消毒条件为95～100 ℃的沸水中，浸泡5～7 s。
（2）中性脂质的提取：将新鲜蛋黄液与水按重量比1:1～1:3稀释并搅拌均匀后加入到超声波提取罐中，并向提取罐中加入1～9倍体积的质量分数为80～95%乙醇溶液，随后采用脉冲超声波进行辅助提取，提取0.1～1 h后将混合物经离心或过滤分离，反复提取1～5次，合并醇提取液即为蛋黄中性脂质提取液（内含蛋黄PC），其中脉冲超声波频率20～200 KHz，优选20～80 KHz；提取温度20～70 ℃，其中优选45～60 ℃；提取时间10～60 min，脉冲间隔1～5 s。
（3）浓缩，干燥：将（2）中所得的蛋黄中性脂质提取液于40～50 ℃下减压浓缩至稠膏状，回收溶剂，将所得稠膏状物于50～65 ℃下真空干燥，即得浅黄色蛋黄卵磷脂粗提物。
（4）亚临界流体脱除蛋黄油：将经步骤（3）获得的蛋黄卵磷脂粗提物装入萃取釜，将萃取釜抽真空，利用压力差将溶剂罐内亚临界溶剂（丙烷或丁烷）注入萃取釜内进行搅拌式逆流浸提，整个萃取过程在完全封闭的工艺条件下完成，其中萃取条件为：浸提次数1～5次，料液比1:1～1:6，萃取时间10～120 min，搅拌速度35～100 r/min，萃取温度10～90 ℃，其中优选40～60 ℃，压力0.2～1.0 Mpa；经脱除蛋黄油后的卵磷脂记作蛋黄卵磷脂复合物。
（5）蛋黄卵磷脂复合物脱溶：首先采用蒸汽（或热水）对萃取釜进行加热，并搅拌，加热温度10～110 ℃，搅拌速度30～100 r/min，待萃取釜压力降到0.01 MPa，启用真空泵进行负压蒸发，直至压力降至–0.09 MPa以下；打开萃取釜，排出低温脱油蛋黄卵磷脂；气化后的丁烷经压缩、冷凝液化后，回到溶剂储罐中循环使用；
（6）磁性纳米载体的制备：采用化学共沉淀法：将可溶性的七水硫酸亚铁和六水氯化铁溶解于水溶液中，二者摩尔比为1:2～2:1，总铁离子浓度为0.01～0.5 mol/L；机械搅拌转数为200～800 r/min；然后加入聚乙二醇6000（PEG 6000），其中加入量为总铁质量的1/10；控制温度为40～70 ℃，除氧30 min；之后在机械搅拌状态下，快速加入25%氨水或氢氧化钠碱溶液，使反应溶液的pH >10，搅拌反应10 min后在剧烈搅拌状态下缓慢加入质量浓度为5 %的羧甲基壳聚糖（CM-CTS）溶液，，CM-CTS溶液的加入量为总反应溶液体积的1/10，加样完毕后将温度迅速升高到70～90 ℃反应30～120 min；反应结束后，在外加磁场的作用下快速分离出磁性颗粒，用去离子水清洗数次以去除未反应完全的化学物质，直至最后溶液的pH在7左右；最后收集黑色的磁性羧甲基壳聚糖纳米颗粒（简写为Fe3O4 (PEG+CM-CTS)），并进行冷冻干燥处理;然后采用Ca2+对Fe3O4 (PEG+CM-CTS)表面进一步修饰，工艺条件如下：1 mg/mL Fe3O4 (PEG+CM-CTS)纳米颗粒分别与2 mg/mL的Ca2+溶液混合，调节混合溶液的pH值到5.0～8.0，并于200～800 r/min的持续搅拌状态下，于25～50 ℃的恒温条件下动态吸附30～120 min，使其达到吸附平衡，制备得到Ca2+修饰的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒，简写为Fe3O4 (PEG+CM-CTS) Ca2+，其中提供Ca2+的可能是氯化钙、碳酸钙、磷酸钙、草酸钙、醋酸钙中的一种或者两种的组合。
（7）PC分离纯化：采用质量分数为80～95%乙醇溶液溶解步骤（5）所得的脱溶蛋黄磷脂复合物，之后加入Fe3O4 (PEG+CM-CTS) Ca2+磁性纳米颗粒，在0～37 ℃搅拌反应10～180 min，使溶液中的PE特定地吸附在Fe3O4 (PEG+CM-CTS) Ca (II)磁性纳米颗粒表面，在外加磁场的作用下将吸附有PE的磁性纳米颗粒从反应溶液中分离出来，收集吸附液，采用高效液相色谱一蒸发光散射测定法测定PC含量和纯度；
（8） PC脱色：对高纯蛋黄卵磷脂进行中性活性炭脱色处理，脱色温度 25～45 ℃、加样量 2.0～5.0%、脱色时间为30～90 min。
本发明的优点：
（1）本发明进行蛋黄PC提取时，以对人体无害的食用酒精为溶媒，采用脉冲超声波辅助乙醇提取，加快了蛋黄磷脂溶出速度，缩短了生产周期，同时又可降低提取过程中蛋黄蛋白质的变性程度。
（2）本发明采用亚临界流体萃取技术脱除蛋黄油，相对于超临界萃取技术而言，设备制造成本低，缩短了生产周期，萃取过程均是在完全封闭的工艺条件下完成，实现了零排放，生产中无“三废污染”，不会对环境造成污染。
（3）本发明采用磁性纳米分离技术对蛋黄PC进行精制处理，操作简单，分离周期较短，PE的特异性吸附好，反应条件温和，不会引起PC的变性，且能进行工业化连续生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步阐述。
实施例1
将100.0 kg新鲜鸡蛋经拣蛋、洗蛋后经消毒（95～100℃的沸水中，浸泡5～7 s），风干，破壳后以蛋清、蛋黄分离设备将蛋清和蛋黄分离，得到28.0 kg蛋黄液。蛋黄液中加入28 L水稀释并搅拌均匀后，将该蛋黄稀释液加入提取罐中，随后加入56 L的质量分数为80%乙醇溶液，在20 KHz 、45 ℃下浸提10 min，脉冲间隔1 s，提取后浸提液进行过滤，滤液于室温下静置过夜弃去沉淀得到蛋黄中性脂肪浸提液（内含蛋黄卵磷脂），并于45 ℃下减压浓缩至稠膏状，回收溶剂，将所得稠膏状物于55 ℃下真空干燥，得到浅黄色的蛋黄卵磷脂粗提物4.1 kg。
将4.1 kg蛋黄卵磷脂粗提物置于亚临界萃取釜中，将萃取釜抽真空，利用压力差将4.1 L溶剂罐内亚临界丁烷注入萃取釜内；萃取过程在完全封闭的工艺条件下完成，搅拌速度为35 r/min，萃取温度40 ℃，压力控制在0.2 Mpa，萃取120 min后，混合油进入蒸发罐，在减压状态下，50 ℃热水加热脱溶，气化的丁烷经压缩机压缩后，在冷凝器中液化后回到溶剂罐中；最后对萃取釜中的蛋黄卵磷脂进行减压蒸发脱溶：向夹套和搅拌叶片中通入蒸汽加热、并搅拌脱溶，搅拌速度30 r/min，脱溶温度控制在50 ℃，至萃取釜中压力–0.09 MPa以下，气化的丁烷压缩冷凝液化循环使用；最终得到蛋黄磷脂复合物1.1 kg。
随后进行载体制备，采用化学共沉淀法：将9.3 g七水硫酸亚铁和18 g六水氯化铁溶解于10 L水溶液中；机械搅拌转数为800 r/min；然后加入2.73 g PEG 6000，控制温度为40 ℃，除氧30 min；之后在机械搅拌状态下，快速加入25%氨水溶液，使反应溶液的pH >10，搅拌反应10 min后在剧烈搅拌状态下缓慢加入1L浓度为5%的CM-CTS，加样完毕后将温度迅速升高到70 ℃反应30 min；反应结束后，在外加磁场的作用下快速分离出磁性颗粒，用去离子水清洗数次以去除未反应完全的化学物质，直至最后溶液的pH在7左右；最后收集黑色的磁性羧甲基壳聚糖纳米颗粒（简写为Fe3O4 (PEG+CM-CTS)），并进行冷冻干燥处理。然后采用Ca2+对Fe3O4 (PEG+CM-CTS)表面进一步修饰，工艺条件如下：1mg/mL Fe3O4 (PEG+CM-CTS)纳米颗粒与2 mg/mL氯化钙金属离子溶液充分混合，调节金属离子溶液的pH值到5.0，并于200 r/min的持续搅拌状态下，于25 ℃的恒温条件下动态吸附30 min，使其达到吸附平衡，制备得到Ca2+修饰的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒，简写为Fe3O4 (PEG+CM-CTS) Ca2+；最后将得到的蛋黄磷脂进一步采用Fe3O4 (PEG+CM-CTS) Ca (II)磁性纳米颗粒进行分离纯化，并以中性活性炭进行脱色处理（脱色温度 25℃、加样量 2.0%、脱色时间为 30 min），最终得到高纯PC 0.7 kg，PC纯度>95%。
实施例2
将100.0 kg新鲜鸡蛋经拣蛋、洗蛋后经消毒（95～100 ℃的沸水中，浸泡5～7 s），风干，破壳后以蛋清、蛋黄分离设备将蛋清和蛋黄分离，得到28.0 kg蛋黄液。所得蛋黄液中加入28 L水稀释并搅拌均匀后，将该蛋黄稀释液加入提取罐中，随后加入504 L质量分数为95 %乙醇溶液，在80 KHz 、60 ℃下浸提5次，每次60 min，脉冲间隔5 s，提取后浸提液进行过滤，滤液于室温下静置过夜弃去沉淀得到蛋黄中性脂肪浸提液（内含蛋黄卵磷脂），并于50 ℃下减压浓缩至稠膏状，回收溶剂，将所得稠膏状物于65 ℃下真空干燥，得到浅黄色的蛋黄卵磷脂粗提物8.1 kg。
将8.1 kg蛋黄卵磷脂粗提物置于亚临界萃取釜中，将萃取釜抽真空，利用压力差将48.6 L溶剂罐内亚临界丙烷注入萃取釜内；萃取过程在完全封闭的工艺条件下完成，搅拌速度为100 r/min，萃取温度60 ℃，压力控制在1 Mpa，重复浸提5次，每次10 min，萃取结束后，混合油进入蒸发罐，在减压状态下，70 ℃热水加热脱溶，气化的丙烷经压缩机压缩后，在冷凝器中液化后回到溶剂罐中；最后对萃取釜中的蛋黄卵磷脂进行减压蒸发脱溶：向夹套和搅拌叶片中通入蒸汽加热、并搅拌脱溶，搅拌速度35 r/min，脱溶温度控制在70 ℃，至萃取釜中压力–0.09MPa以下，气化的丙烷压缩冷凝液化循环使用；最终得到蛋黄磷脂复合物2.1 kg。
随后进行载体制备，采用化学共沉淀法：将926.7 g水硫酸亚铁和450 g六水氯化铁溶解于10L水溶液中；机械搅拌转数为200 r/min；然后加入137.67 g PEG 6000，控制温度为70 ℃，除氧30 min；之后在机械搅拌状态下，快速加入25%氨水溶液，使反应溶液的pH >10，搅拌反应10 min后在剧烈搅拌状态下缓慢加入1L浓度为5%的CM-CTS，加样完毕后将温度迅速升高到90 ℃反应120 min；反应结束后，在外加磁场的作用下快速分离出磁性颗粒，用去离子水清洗数次以去除未反应完全的化学物质，直至最后溶液的pH在7左右；最后收集黑色的磁性羧甲基壳聚糖纳米颗粒（简写为Fe3O4 (PEG+CM-CTS)），并进行冷冻干燥处理。然后采用Ca2+对Fe3O4 (PEG+CM-CTS)表面进一步修饰，工艺条件如下：1mg/mL Fe3O4 (PEG+CM-CTS)纳米颗粒与2 mg/mL氯化钙金属离子溶液充分混合，调节金属离子溶液的pH值到8.0，并于800 r/min的持续搅拌状态下，于50 ℃的恒温条件下动态吸附120 min，使其达到吸附平衡，制备得到Ca2+修饰的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒，简写为Fe3O4 (PEG+CM-CTS) Ca2+。最后将得到的蛋黄磷脂进一步采用Fe3O4 (PEG+CM-CTS) Ca (II)磁性纳米颗粒进行分离纯化，并以中性活性炭进行脱色处理（脱色温度 45℃、加样量 5.0%、脱色时间为 90min），最终得到高纯PC 1.4 kg，PC纯度≥95%。
实施例3
将100.0 kg新鲜鸡蛋经拣蛋、洗蛋后经消毒（95～100℃的沸水中，浸泡5～7 s），风干，破壳后以蛋清、蛋黄分离设备将蛋清和蛋黄分离，得到28.0 kg蛋黄液。所得蛋黄液中加入56 L水稀释并搅拌均匀后，将该蛋黄稀释液加入超声波提取罐中，随后加入126 L质量分数90%乙醇溶液，在40 KHz 、55 ℃下浸提2次，每次30 min，脉冲间隔2 s，提取后浸提液进行过滤，滤液于室温下静置过夜弃去沉淀得到蛋黄中性脂肪浸提液（内含蛋黄卵磷脂），并于50 ℃下减压浓缩至稠膏状，回收溶剂，将所得稠膏状物于55 ℃下真空干燥，得到浅黄色的蛋黄卵磷脂粗提物7.5 kg。
将7.5 kg蛋黄卵磷脂粗提物置于亚临界萃取釜中，将萃取釜抽真空，利用压力差将15 L溶剂罐内亚临界丁烷注入萃取釜内；萃取过程在完全封闭的工艺条件下完成，搅拌速度为80 r/min，萃取温度40 ℃，压力控制在0.3 Mpa，重复浸提3次，每次萃取40 min，萃取结束后，混合油进入蒸发罐，在减压状态下，60 ℃热水加热脱溶，气化的丁烷经压缩机压缩后，在冷凝器中液化后回到溶剂罐中；最后对萃取釜中的蛋黄卵磷脂进行减压蒸发脱溶：向夹套和搅拌叶片中通入蒸汽加热、并搅拌脱溶，搅拌速度60 r/min，脱溶温度控制在60 ℃，至萃取釜中压力–0.09 MPa以下，气化的丁烷压缩冷凝液化循环使用；最终得到蛋黄磷脂复合物1.8 kg。
随后进行载体制备，采用化学共沉淀法：将111.2 g七水硫酸亚铁和162 g六水氯化铁溶解于10 L水溶液中，机械搅拌转数为800 r/min；然后加入27.3 g PEG 6000，控制温度为60 ℃，除氧30 min；之后在机械搅拌状态下，快速加入氢氧化钠溶液，使反应溶液的pH >10，搅拌反应10 min后在剧烈搅拌状态下缓慢加入1L浓度为5%的CM-CTS，加样完毕后将温度迅速升高到80 ℃反应60 min；反应结束后，在外加磁场的作用下快速分离出磁性颗粒，用去离子水清洗数次以去除未反应完全的化学物质，直至最后溶液的pH在7左右；最后收集黑色的磁性羧甲基壳聚糖纳米颗粒（简写为Fe3O4 (PEG+CM-CTS)），并进行冷冻干燥处理。然后采用Ca2+对Fe3O4 (PEG+CM-CTS)表面进一步修饰，工艺条件如下：1mg/mL Fe3O4 (PEG+CM-CTS)纳米颗粒与2 mg/mL氯化钙金属离子溶液充分混合，调节金属离子溶液的pH值到6.0，并于400 r/min的持续搅拌状态下，于37 ℃的恒温条件下动态吸附90 min，使其达到吸附平衡，制备得到Ca2+修饰的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒，简写为Fe3O4 (PEG+CM-CTS) Ca2+；最后将得到的蛋黄磷脂进一步采用Fe3O4 (PEG+CM-CTS) Ca (II)磁性纳米颗粒进行分离纯化，并以中性活性炭进行脱色处理（脱色温度 35℃、加样量 4.0%、脱色时间为 60 min），最终得到高纯PC 1.2 kg，PC纯度>95%。
Claims (2)
1.一种高纯度蛋黄卵磷脂的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：
（1）蛋黄、蛋清分离：首先对新鲜鸡蛋检查消毒，破壳后将蛋黄、蛋清分离，蛋黄搅拌均匀后，得到新鲜蛋黄液；其中消毒条件为95～100 ℃的沸水中，浸泡5～7 s；
（2）中性脂质的提取：将新鲜蛋黄液与水按重量比1:1～1:3稀释并搅拌均匀后加入到超声波提取罐中，并向提取罐中加入1～9倍体积的质量分数为80～95%乙醇溶液，随后采用脉冲超声波进行辅助提取，提取0.1～1 h后将混合物经离心或过滤分离，反复提取1～5次，合并醇提取液即为蛋黄中性脂质提取液，其中脉冲超声波频率20～200 KHz，提取温度20～70 ℃，提取时间10～60 min，脉冲间隔1～5 s；
（3）浓缩，干燥：将（2）中所得的蛋黄中性脂质提取液于40～50 ℃下减压浓缩至稠膏状，回收溶剂，将所得稠膏状物于50～65 ℃下真空干燥，即得浅黄色蛋黄卵磷脂粗提物；
（4）亚临界流体脱除蛋黄油：将经步骤（3）获得的蛋黄卵磷脂粗提物装入萃取釜，将萃取釜抽真空，利用压力差将溶剂罐内亚临界丙烷或亚临界丁烷注入萃取釜内进行搅拌式逆流浸提，整个萃取过程在完全封闭的工艺条件下完成；其中萃取条件为：浸提次数1～5次，料液比1:1～1:6kg/L，萃取时间10～120 min，搅拌速度35～100 r/min，萃取温度10～90 ℃，压力0.2～1.0 Mpa；经脱除蛋黄油后的卵磷脂记作蛋黄卵磷脂复合物；
（5）蛋黄卵磷脂复合物脱溶：首先采用蒸汽或热水对萃取釜进行加热，并搅拌，加热温度10～110 ℃，搅拌速度30～100 r/min，待萃取釜压力降到0.01 MPa，启用真空泵进行负压蒸发，直至压力降至–0.09 MPa以下；打开萃取釜，排出低温脱油蛋黄卵磷脂；气化后的丁烷经压缩、冷凝液化后，回到溶剂储罐中循环使用；
（6）磁性纳米载体的制备：采用化学共沉淀法：将可溶性的七水硫酸亚铁和六水氯化铁溶解于水溶液中，二者摩尔比为1:2～2:1，总铁离子浓度为0.01～0.5 mol/L；机械搅拌转数为200～800 r/min；然后加入聚乙二醇6000，其中加入量为总铁质量的1/10；控制温度为40～70 ℃，除氧30 min；之后在机械搅拌状态下，快速加入质量浓度为25%氨水或氢氧化钠碱溶液，使反应溶液的pH >10，搅拌反应10 min后在剧烈搅拌状态下缓慢加入质量浓度为5 %的羧甲基壳聚糖溶液，CM-CTS溶液的加入量为总反应溶液体积的1/10，加样完毕后将温度迅速升高到70～90 ℃反应30～120 min；反应结束后，在外加磁场的作用下快速分离出磁性颗粒，用去离子水清洗数次以去除未反应完全的化学物质，直至最后溶液的pH在7左右；最后收集黑色的磁性羧甲基壳聚糖纳米颗粒，并进行冷冻干燥处理;然后采用Ca2+对磁性羧甲基壳聚糖纳米颗粒表面进一步修饰，工艺条件如下：1 mg/mL 磁性羧甲基壳聚糖纳米颗粒分别与2 mg/mL的Ca2+溶液混合，调节混合溶液的pH值到5.0～8.0，并于200～800 r/min的持续搅拌状态下，于25～50 ℃的恒温条件下动态吸附30～120 min，使其达到吸附平衡，制备得到Ca2+修饰的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒，其中提供Ca2+的是氯化钙、碳酸钙、磷酸钙、草酸钙、醋酸钙中的一种或者两种的组合；
（7）PC分离纯化：采用质量分数为80～95%乙醇溶液溶解步骤（5）所得的脱溶蛋黄磷脂复合物，之后加入Ca2+修饰的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒，在0～37 ℃搅拌反应10～180 min，使溶液中的PE特定地吸附在Ca2+修饰的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒表面，在外加磁场的作用下将吸附有PE的磁性纳米颗粒从反应溶液中分离出来，收集吸附液，采用高效液相色谱一蒸发光散射测定法测定PC含量和纯度；
（8） PC脱色：对高纯蛋黄卵磷脂进行中性活性炭脱色处理，脱色温度 25～45 ℃、加样量 2.0～5.0%、脱色时间为30～90 min。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度蛋黄卵磷脂的制备方法，其特征在于步骤（2）中脉冲超声波频率20～80 KHz；提取温度45～60 ℃；提取时间10～60 min，步骤（4）中萃取温度40～60 ℃。
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