CN102858367B - 抗原或药物递送复合物 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供抗原递送复合物或药物递送复合物,其特征是安全性和效价高,可以大规模生产和保存,并具有细胞或器官趋向性。本发明提供了抗原或药物递送复合物,其特征是含有抗原或药物与阳离子型分子的复合物以及包合所述复合物的阴离子型分子,并具有细胞或器官趋向性。本发明的抗原或药物递送复合物可用作向特定细胞或器官递送各种抗原或药物的药物递送系统的主要组分。
Description
技术领域
本发明涉及新型抗原递送复合物、疫苗、药物递送复合物等。
技术背景
近年来,针对新发性和再发性感染性疾病,开发了失活疫苗和低毒性疫苗,获得了高的预防效果。但是,日本对感染病疫苗的开发晚得多。为了扑灭发展中国家中的特定感染性疾病或者应对大流行病,需要研发能够大量生产和长期保存,并且具有更高安全性和更强效价的疫苗。其中,DNA疫苗可以廉价地大量生产,其有效性受到期待,但从安全性或效价的观点来看则尚未达到成功。此外,需要研发适用于激活全身免疫的静脉注射、皮下/皮内注射的制剂,适用于粘膜免疫的经口、吸入或滴鼻给药的制剂。
此外,针对人乳头瘤病毒的疫苗作为宫颈癌疫苗已得到认可,据报道表现出较高的效果。但是,针对癌症抗原的疫苗疗法在世界范围内尚未确立。虽然有使用多种多样的抗原或DNA的疫苗的报道,但尚未获得充分的免疫诱导效果,不能在临床上应用。特别地,DNA疫苗可选择性活化与癌症相关的细胞免疫,期待其可增强抗癌免疫。此外,虽然由于可廉价地大规模生产而令人注目,但从安全性和效价的观点来看还没有成功的例子。
DNA药物根据碱基的组合变化,表现出不同的药理作用,可以廉价的大量生产,因此其作为有效的医药制品受人期待。迄今为止,已开发了各种作为基因递送载体的纳米构建体,报道了它们的器官特异性或细胞特异性。但是,由于安全性和效率低下,还不能在临床上应用。由于多数使用合成材料,尚未确定其安全性,而且医疗成本的负担也大。需要开发安全性高、具有普遍适用性的器官特异性载体。
使载体具有器官趋向性有多种方法,一种方法是使用易于在目标器官中积累的特定分子,还有使用其他抗体、适体等具有特异性结合能力的分子的方法。
本发明人通过前者的方法,应用药物递送复合物(专利文献1)的技术,进一步简单地加入生物可降解的脂类,成功地构建了对脾和肺具有选择性的新型靶向化系统。具体地,只需向包合有DNA的阳离子型核中加入磷脂酰丝氨酸(带负电),就可以提高纳米颗粒的安全性,向小鼠静脉注射后,实现仅在脾脏中的选择性的基因表达。脾脏富含免疫细胞,借助向脾脏的选择性基因表达,可以开发DNA疫苗。进一步地,通过添加N-月桂酰肌氨酸(带负电)代替磷脂酰丝氨酸,同样可以提高纳米颗粒的安全性,向小鼠静脉注射后,实现仅在肺中的选择性基因表达(非专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:特开2010-059064号
非专利文献
非专利文献1:Journal of Controlled Release,136,213-219(2009)
发明概述
发明要解决的技术问题
本发明的技术问题是提供安全、高效价,可以大量生产、保存的抗原递送复合物、疫苗、药物递送复合物等。特别地,本发明的技术问题是提供以具有对细胞或器官的趋向性为特征的抗原或药物递送复合物。
解决技术问题的手段
本发明人为了解决上述技术问题进行了深入的研究,结果发现,通过将疟疾抗原DNA与阳离子型分子的复合物用γ-聚谷氨酸、硫酸软骨素、海藻酸中的任一种阴离子型分子包被而形成实质上不带电荷或者具有负的表面电荷的复合物,细胞毒性低,不会引起红细胞凝集,在各种细胞中表现出高的转染效率,进一步通过在体内全身给药,能够高效地将抗原DNA递送至脾脏。
此外发现,通过多次给药可以产生对疟疾特异性的抗体,由此可以抑制疟疾感染。进一步发现,在使用编码作为癌抗原的恶性黑色素瘤表面抗原的pDNA的情况下,可以诱导对恶性黑色素瘤特异性的细胞免疫,抑制恶性黑色素瘤的增殖和转移。
此外,本发明人将失活病毒或癌抗原与阳离子型分子的复合物用γ-聚谷氨酸、硫酸软骨素、海藻酸中的任一种阴离子型分子包被,成功地制备了实质上不带电荷的、或者具有负的表面电荷的复合物。进一步发现,所获得的疫苗能够顺利地被递送到树突状细胞内,在对实验动物给药时表现出高的免疫诱导效果。
此外,本发明人应用专利文献1记载的技术,成功的构建了使得细胞或器官特异性递送成为可能的新型靶向化系统。具体地说,成功的开发了具有下述特征的抗原或药物递送复合物:其含有抗原或药物与阳离子型分子的复合物以及包合该复合物的阴离子型分子,并具有对细胞或器官的趋向性。
此外,通过向抗原或药物与阳离子型分子的复合物添加选自磷脂酰丝氨酸、N-月桂酰肌氨酸和甘草皂苷的阴离子型分子,成功的制备了被赋予对脾、肺或肝的选择性(器官选择性)的抗原或药物递送复合物。
进一步发现,使用γ-聚谷氨酸作为阴离子型分子,可以制备出具有树突状细胞趋向性的复合物。
这些复合物是抗原或药物与阳离子型分子的复合物,以及阴离子型分子通过静电结合而成的,因此已确定安全性极高,且没有细胞毒性。
此外,还通过向抗原或药物与阳离子型分子的复合物添加选自适体、miRNA和抗体的阴离子型分子,成功地制备了被赋予更特异的细胞或器官选择性的复合物。
此外,在使用公知的成像用核素(成像探针)或诊断试剂作为抗原或药物时,也成功地将上述复合物用作将成像用核素(成像探针)或诊断试剂递送至特定细胞或器官的运输载体。
换言之,本发明提供了以下内容。
[1]抗原或药物递送复合物,其含有抗原或药物与阳离子型分子的复合物、以及阴离子型分子,并且具有对细胞或器官的趋向性,所述阴离子型分子包合(内包)所述抗原或药物与阳离子型分子的复合物。
[2][1]记载的复合物,所述抗原或药物是核酸、肽、蛋白质或失活的病毒。
[3][1]或[2]记载的复合物,其特征是所述阴离子型分子选自磷脂酰丝氨酸、月桂酰肌氨酸和甘草皂苷,具有对脾脏、肺或肝脏的趋向性。
[4][3]记载的复合物,其特征是所述阴离子型分子是磷脂酰丝氨酸;抗原或药物与阳离子型分子、磷脂酰丝氨酸的配比为1:2:4-1:8:8;且具有对脾脏的趋向性。
[5][3]记载的复合物,其特征是所述阴离子型分子是月桂酰肌氨酸;阳离子型分子由阳离子型高分子和阳离子型脂类组成;抗原或药物与阳离子型高分子、阳离子型脂类、月桂酰肌氨酸的配比为1:2:2:1-1:2:2:4;且具有对肺的趋向性。
[6][3]记载的复合物,其特征是所述阴离子型分子是甘草皂苷;抗原或药物与阳离子型分子、甘草皂苷的配比为1:2:8-1:8:16;且具有对肝脏的趋向性。
[7][1]或[2]记载的复合物,其特征是所述阴离子型分子是γ-聚谷氨酸,具有对树突状细胞或脾脏的趋向性。
[8][7]记载的复合物,其特征是抗原或药物与阳离子型分子、γ-聚谷氨酸的配比为1:2:8-1:8:16;且具有对树突状细胞或脾脏的趋向性。
[9][1]或[2]记载的复合物,所述阴离子型分子选自适体、miRNA和抗体。
[10][9]记载的复合物,所述抗原或药物与阳离子型分子、阴离子型分子的配比为1:2:8-1:8:16。
[11][1]-[10]的任一项记载的复合物,所述复合物由抗原或药物;和选自聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、聚乙烯亚胺和阳离子型树形化合物(dendrimer)的阳离子型高分子;或选自DOTMA、DOTAP、DC-Chol和苯扎氯铵的阳离子型脂类组成。
[12][1]-[10]的任一项记载的复合物,所述复合物由抗原或药物;选自DOTMA、DOTAP和DC-Chol的阳离子型脂类;以及选自DOPE和胆固醇的脂类组成的脂质体或胶粒组成。
[13]用于成像的、包含权利要求1-12的任一项记载的复合物的成像用核素的载体。
[14][13]记载的载体,其特征是抗原或药物是由成像用核素、阳离子型树形化合物(dendrimer)和螯合剂组成的复合物;阳离子型分子是聚乙烯亚胺;阴离子型分子是γ-聚谷氨酸;且具有对淋巴结的趋向性。
[15]前哨淋巴结的成像方法,其特征是使用由药物复合物、聚乙烯亚胺和γ-聚谷氨酸组成的复合物,其中所述药物复合物由成像用核素、阳离子型树形化合物(dendrimer)和螯合剂组成。
[1’]抗原递送复合物,包含抗原与阳离子型分子的复合物,和将其包合在内的阴离子型分子,是实质上不带电荷或具有表面负电荷的抗原递送复合物,所述阴离子型分子选自γ-聚谷氨酸、硫酸软骨素、海藻酸及其盐。
[2’][1’]记载的复合物,所述抗原是病原体抗原或编码其的DNA。
[3’][2’]记载的复合物,所述病原体是疟原虫。
[4’][1’]记载的复合物,所述抗原是失活的病毒。
[5’][4’]记载的复合物,病毒是流感病毒、肝炎病毒、SARS病毒、人乳头瘤病毒或HIV病毒。
[6’][1’]记载的复合物,阳离子型分子的带正电荷的官能团与阴离子型分子的带负电荷的官能团的摩尔比是3:1~1:4。
[7’][1’]记载的复合物,阴离子型分子的分子量为10万以下。
[8’][1’]记载的复合物,阴离子型分子是γ-聚谷氨酸或其盐。
[9’][1’]记载的复合物,阳离子型分子是聚乙烯亚胺、苯扎氯铵、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵或其盐。
[10’][8’]记载的复合物,使抗原递送至脾脏。
[11’]感染性疾病的疫苗,其包含[1’]-[10’]的任一项记载的复合物。
[12’][11’]记载的疫苗,所述感染性疾病是疟疾感染或病毒感染性疾病。
[13’]向树突状细胞内递送抗原的方法,其特征是使[1’]-[10’]的任一项记载的复合物或[11’]或[12’]记载的疫苗与树突状细胞接触。
[14’]向动物细胞内递送抗原的方法,其特征是向哺乳动物细胞给药[1’]-[10’]的任一项记载的复合物或[11’]或[12’]记载的疫苗。
[15’]药物递送复合物,包含含有药物与阳离子型分子的复合物的脂质体,和将其包合在内的阴离子型分子,是实质上不带电荷或具有表面负电荷的药物递送复合物,所述阴离子型分子选自月桂酰肌氨酸和磷脂酰丝氨酸。
[16’][15’]记载的复合物,使药物递送至脾脏。
[17’][15’]记载的复合物,使药物递送至肺。
[18’][15’]记载的复合物,所述脂质体由药物、阳离子型分子和阳离子型脂类组成。
[19’][18’]记载的复合物,所述阳离子型分子是聚乙烯亚胺,阳离子型脂类是N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵。
[20’][1’]和[6’]-[10’]的任一项记载的复合物,所述抗原是癌抗原或编码癌抗原的DNA。
[21’]包含[20’]记载的复合物的癌疫苗。
[22’][21’]记载的疫苗,所述癌是恶性黑色素瘤。
[23’]向树突状细胞内递送抗原的方法,其特征是使[20’]记载的复合物或[21’]或[22’]记载的疫苗与树突状细胞接触。
[24’]向动物细胞内递送抗原的方法,其特征是向哺乳动物细胞给药[20’]记载的复合物或[21’]或[22’]记载的疫苗。
[25’]药物递送复合物,其特征是包含药物与阳离子型分子的复合物,和将其包合在内的抗体、适体或其盐的器官特异性药物递送复合物,所述抗体、适体或其盐与药物和阳离子型分子的复合物静电结合。
[26’]向细胞内递送药物的方法,其特征是将[25’]记载的药物递送复合物递送到特定细胞。
[27’]向动物的特定细胞内递送药物的方法,其特征是向哺乳动物给药[25’]记载的药物递送复合物。
[28’][15’]或[25’]记载的药物递送复合物,所述药物是DNA、siRNA、miRNA、反义DNA等带负电荷的核酸。
发明的效果
本发明的复合物不引起红细胞凝集,且细胞毒性低,细胞内摄入的效率好,可以安全有效地递送抗原或药物。
特别地,本发明的复合物的特征是具有对目标细胞、器官的高趋向性,可以作为新型药物递送系统的有效成分。
附图简介
[图1]示出了实施例1中的疫苗抗体效价。
[图2]示出了实施例1中的疟疾感染后的小鼠的存活率。
[图3]示出了实施例2中的疫苗抗体效价。
[图4]示出了向细胞添加实施例3中的复合物后的荧光显微镜观察图像。
[图5]示出了实施例4中的肿瘤重量的变化。
[图6]示出了实施例4中的恶性黑色素瘤的肺转移情况。
[图7]示出了实施例4中的肺转移的细胞数。
[图8]示出了实施例5中的粒子大小和表面电荷。
[图9]示出了实施例5中的基因表达(萤光素酶活性)。
[图10]示出了实施例5中的小鼠的萤光素酶成像图像。
[图11]示出了实施例5中的多变量样条插值法和贡献指数。
[图12]示出了实施例6中的基因表达(萤光素酶活性)。
[图13]示出了实施例7中的粒子大小和表面电荷。
[图14]示出了实施例7中的基因表达(萤光素酶活性)。
[图15]示出了实施例7中的粒子大小和表面电荷。
[图16]示出了实施例8中的基因表达(萤光素酶活性)。
[图17]示出了树突状细胞摄入实施例9中的失活病毒。
[图18]示出了实施例10中的基因表达(萤光素酶活性)。
[图19]示出了实施例11中的基因抑制效率。
[图20]示出了实施例12中的感染疟疾后的小鼠的存活率。
[图21]A:实施例13中基于稀释小鼠血清的抗体效价变化。B:稀释倍数10-4的小鼠抗体效价。
[图22]示出了实施例14中的肿瘤增殖变化。
[图23]示出了实施例15中的细胞毒性。
[图24]示出了实施例15中向大鼠足垫给药24小时后,复合物在生物体内的分布。
[图25]示出了实施例15中向大鼠足垫给药24小时后的SPECT/CT图像。箭头(实线)表示腘淋巴结;箭头(虚线)表示腰部淋巴结。
发明的实施方式
本发明提供用于将抗原递送至期望的细胞或器官内的抗原或药物复合物(下文称为“本发明的抗原递送复合物”、“本发明的药物递送复合物”,或合称为“本发明的复合物”)
下面分别针对本发明的抗原递送复合物和本发明的药物递送复合物进行说明。
本发明的“抗原递送复合物”的特征是包含抗原与阳离子型分子的复合物及包合所述复合物的阳离子型分子,并具有对细胞或器官内的趋向性。
本发明的抗原递送复合物中的“抗原”可列举例如病原体抗原(特别是病原体的表面抗原)或编码它的DNA,或失活病毒。
作为病原体抗原中作为对象的“病原体”,考虑如后文所述的本发明的抗原递送复合物作为疫苗使用的情况,可列举疫苗疗法期望的各种病原体。具体而言,可列举疟原虫、流感病毒、肝炎病毒、西尼罗热病毒、HIV病毒(人免疫缺陷病毒)、乳头瘤病毒、SARS(严重急性呼吸综合征)病毒等。
此类病原体抗原选自病原体的表面抗原(例如蛋白质(抗原)、肽(抗原)等)及其编码核酸(例如,DNA)抗原等。
上述核酸抗原中的核酸的种类可以根据使用目的恰当地选择,没有特殊的限制,可列举质粒DNA(pDNA)、cDNA、反义DNA、siRNA、miRNA、染色体DNA、PAC、BAC等,优选质粒DNA、cDNA、反义DNA。质粒DNA等环状DNA通过适宜地限制性内切酶消化后,也可以作为线性DNA使用。
核酸的大小没有特殊的限制,在质粒DNA的情况下,是2-15kbp,优选2-10kbp,更优选4-10kbp。此外,1-5kbp的DNA也是优选的。
核酸可以是天然存在的,或者也可以是合成的,如果大小在约100bp以下,可以通过磷酸三乙酯法、磷酸二酯法等,使用常规使用的核酸自动合成仪来合成。
对于大小更大的核酸,可以用通常使用的方法适宜地制备。
本发明中使用的核酸没有特殊的限制,优选通过本领域技术人员常用的方法纯化。
本说明书中的抗原除上述病原体的表面抗原或其编码核酸以外,还可以使用病原体(病毒)自身。在此情况下,从防止感染的观点看,使用失活病毒。
就失活病毒而言,只要是通过常规方法获得的就可以使用,例如,可以使用通过福尔马林处理、紫外线照射、β-丙内酯等获得的失活病毒。
此类抗原可列举优选核酸、肽、蛋白质或失活病毒,作为实例,可列举疟疾抗原基因、失活流感病毒等。
作为本发明的其他实施方式,抗原可列举用癌抗原或其编码DNA获得的抗原递送复合物。从使用癌抗原作为抗原的观点出发,优选所述抗原被细胞特异性地递送。也就是说,通过特异性地将抗原递送至树突状细胞等抗原呈递细胞,可以期待高的免疫诱导效果。
上述抗原可以与下文所述的本发明的药物共同形成本发明的复合物。因此,本发明的抗原递送复合物也可以是纳入了药物的抗原递送复合物。
另一方面,本发明的“药物递送复合物”的特征是包含药物与阳离子型分子的复合物,以及包合所述复合物的阴离子型分子,并具有对细胞或器官的趋向性。
本发明的药物递送复合物中的“药物”可以是任何物质,可列举例如核酸、肽、蛋白质、脂类、肽脂、糖、低分子化合物、其他合成的或天然的化合物等。这些化合物还可以包含各种核素(例如,天然放射性核素、人工放射性核素、正电子放射性核素等),也可以通过核素进行放射性标记。或者也可以用各种化合物(例如,公知的荧光色素、酶等)标记。此外,所述药物可以只有一种,也可以是两种以上。
在以治疗和/或预防疾病为目的通过本发明的药物递送复合物向细胞或器官内递送药物的情况下,所述药物是具有治疗和/或预防所述疾病的活性的药物,可列举例如可作为抗高血压剂、抗低血压剂、抗精神病剂、镇痛剂、抗抑郁剂、抗躁剂、抗不安剂、镇静剂、催眠剂、抗癫痫剂、阿片激动剂、哮喘治疗剂、麻醉剂、抗心律不齐剂、关节炎治疗剂、解痉剂、ACE抑制剂、解充血药、抗生素、抗心绞痛剂、利尿剂、抗帕金森氏病剂、支气管扩张剂、促分娩剂、抗利尿剂、抗高脂血症剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、止吐剂、抗感染剂、抗新生物剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗糖尿病剂、抗过敏剂、解热剂、抗肿瘤剂、抗痛风剂、抗组胺剂、止痒剂、骨调节剂、心血管剂、降胆固醇剂、抗疟剂、用于戒烟的药剂、镇咳剂、去痰剂、粘液溶解剂、鼻塞用药剂、多巴胺能剂、消化道用药剂、肌肉舒张剂、神经肌肉阻断剂、副交感神经激动剂、前列腺素、兴奋剂、食欲抑制剂、甲状腺药或抗甲状腺药、激素、抗偏头痛剂、抗肥胖剂、抗炎剂等发挥作用的药物。
在一个特别优选的实施方案中,能够导入细胞内的药物是核酸。核酸没有特殊的限制,可以是DNA、RNA、DNA和RNA的嵌合核酸、DNA/RNA的杂合体等。此外,核酸可以使用1-3条链,优选1条链或2条链。核酸也可以是作为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷的其他类型的核苷酸,或者是具有非核苷酸骨架的其他寡聚体(例如,市售的肽核酸(PNA)等),或者是含有特殊联接的其他寡聚体(但是,所述寡聚体含有DNA或RNA中可见的碱基对,或者具有允许碱基附着的配置的核苷酸)等。进一步,可以添加有公知的修饰,例如具有所属领域中已知的标志物的、加帽的、甲基化的、1个以上的天然核苷酸被类似物替换的、经过了分子内核苷酸修饰的,例如具有不带电联接(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基膦酸酯、氨基甲酸酯等)的、具有带电联接或含硫联接(例如,硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的、具有例如蛋白质(核酸酶、核酸酶抑制剂、毒素、抗体、信号肽等)或糖(例如单糖等)等侧链基团的、具有插层化合物(例如,吖啶、补骨脂素等)的、含有螯合化合物(例如,金属、具有放射性的金属、硼、氧化性的金属等)的、含有烷化剂的、具有经修饰的联接(例如,α异头物型核酸等)的。
例如,DNA的类型可以根据使用目的恰当地选择,没有特殊的限制,可列举例如质粒DNA、cDNA、反义DNA、染色体DNA、PAC、BAC等,优选是质粒DNA、cDNA、反义DNA。质粒DNA等环状DNA也可以通过适宜地限制性内切酶消化后,作为线性DNA使用。
此外,RNA的类型可以根据使用目的恰当地选择,没有特殊的限制,可列举例如siRNA、miRNA、shRNA、反义RNA、信使RNA、单链RNA基因组、双链RNA基因组、RNA复制子、转运RNA、核糖体RNA等,优选siRNA、miRNA、shRNA、mRNA、反义RNA、RNA复制子。
核酸的大小没有特殊的限制,从染色体(人工染色体等)等大型核酸分子(例如大小约107kbp)至低分子核酸(例如大小约5bp)都可以导入,但考虑到向细胞内导入核酸的效率,优选15kbp以下。例如,质粒DNA这样的高分子核酸的大小可示例为2-15kbp,优选2-10kbp,更优选4-10kbp。此外,siRNA这样的较低分子的核酸的大小可列举5-1000bp,优选10-500bp,更优选15-200bp。
核酸可以是天然存在的或者合成的,如果大小在约100bp以下,可以通过磷酸三乙酯法、磷酸二酯法等,使用常规使用的核酸自动合成仪来合成。
本发明中使用的核酸没有特殊的限制,优选是通过本领域技术人员常用的方法纯化了的。
上述药物也可以与本发明的抗原一起形成本发明的复合物。因此,本发明的药物递送复合物也可以是纳入了抗原的药物递送复合物。
在以细胞或器官的诊断或成像为目的通过本发明的药物递送复合物向细胞或器官内递送药物的情况下,,所述药物可以是接受了适合诊断装置或成像装置的修饰(例如,核素、通过核素标记(放射标记)的化合物、荧光色素、用荧光色素标记的化合物等)的化合物(下文有时将其统一简写为“成像用核素”)。
此类药物可列举例如用于正电子体层扫描(PET)的放射性核素(11C、13N、15O、18F等)或用所述核素标记的化合物、用于单光子发射计算机体层扫描(SPECT)的放射性核素(67GA、99mTC、111In、123I等)或用所述核素标记的化合物、用于MRI(核磁共振成像)的造影剂(Gd3+等)或用所述造影剂标记的化合物、色素(异舒泛蓝(イソフアルサンブル一)、舒泛蓝、亚甲基蓝、吲哚氰绿、靛胭脂等)或用所述色素标记的化合物、荧光色素或用所述荧光色素标记的化合物(形成荧光络合物的镧系元素等)、以及其他作为分子探针或示踪物使用的化合物。本领域技术人员可以用本身已知的方法制备这些化合物。
或者这些成像用核素可以通过共价键或配位键与后述各种阳离子型分子或阴离子型分子(优选阳离子型分子)结合。此类结合方法是本领域技术人员公知的。
作为上述药物封入本发明的药物递送复合物中的化合物没有特殊的限制,可使用本身公知的核素、色素、荧光色素、分子探针、诊断药物等。
换言之,本发明的药物递送复合物可以作为用于递送上述成像用核素的载体使用。所述复合物基于本发明的药物递送复合物所具有的趋向性而去往特定的细胞或器官,因此通过使用本发明的药物递送复合物作为递送成像用核素的载体,与只使用成像用核素的传统诊断方法、成像方法相比,可以更正确地对目的部位进行诊断、成像。
或者,本发明的药物递送复合物本身可作为用作诊断或成像试剂的药物的分子探针使用。
本发明的药物递送复合物不引起红细胞凝集,细胞毒性低,且向细胞内摄入的效率好,并具有对细胞、器官的趋向性,因此可以说是可以安全且有效地使用的分子探针。
当本发明的药物递送复合物作为用于递送成像用核素的载体使用的情况下,本发明的药物优选制备为阳离子型树形化合物与螯合剂的复合物(下位简称为药物复合物)。
对于阳离子型树形化合物所具有的阳离子基团(例如氨基),可以通过共价键导入色素、荧光色素分子等药物,此外,对于螯合剂,也可以导入放射性核素、MRI造影剂、镧系元素等药物。
使阳离子型树形化合物与螯合剂结合的方法,或制备本发明的药物与阳离子型树形化合物和螯合剂的复合物的方法是本领域技术人员公知的。例如,药物复合物的制备方法可列举混合阳离子型树形化合物和螯合剂而形成阳离子型树形化合物与螯合剂的复合物,并用成像用核素加以标记的方法。
通过适用作为此类阳离子型树形化合物和螯合剂的复合物而制备的药物,本发明的载体也可能适用于多模态成像探针。
在用于所述用途时,包含在药物复合物中的阳离子型树形化合物可列举聚酰胺树形化合物等。此外作为螯合剂,可列举p-SCN苄基二乙烯三胺五乙酸(DTPA)等。
用于本发明的复合物中的阴离子型分子是与上述抗原或后述药物和阳离子型分子一起形成的具有细胞或组织趋向性的复合物的、作为阴离子型的分子。阴离子型分子与后述的阳离子型分子通过静电相互作用缔合,形成实质上不带电荷或带负的表面电荷的本发明的复合物。
优选的阴离子型分子可列举阴离子型高分子、阴离子型脂类(例如月桂酰肌氨酸(下文有时缩写为LS)、磷脂酰丝氨酸(下文有时缩写为DOPS)等)、整体上带负电荷的基因(例如适体等)、整体上带负电荷的抗体等。其中,例如月桂酰肌氨酸、γ-聚谷氨酸(下文有时缩写为γ-PGA)、甘草皂苷(下文有时缩写为GLY)、磷脂酰丝氨酸、硫酸软骨素、海藻酸等是特别优选的。
这些阴离子型分子可以是包含各种核素(例如,天然放射性核素、人工放射性核素、正电子放射性核素等)的,也可以是用核素进行放射性标记的。或者,也可以是用各种化合物(例如,公知的荧光色素、酶等)标记的。
各种阴离子型分子可以呈现盐的形态,所述盐的形态可列举钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铝盐、盐酸盐等。
在本发明的复合物中,阴离子型分子是赋予复合物的细胞或器官趋向性最重要的分子。
例如,在赋予脾、肺或肝趋向性的情况下,阴离子型分子优选选自磷脂酰丝氨酸、月桂酰肌氨酸和甘草皂苷。特别是在赋予脾趋向性的情况下,优选选择磷脂酰丝氨酸,在赋予肺趋向性的情况下,优选选择月桂酰肌氨酸,在赋予肝脏趋向性的情况下,优选选择甘草皂苷。
对各器官中摄入本发明的复合物的细胞没有特殊的限制,可以是形成各器官的任何细胞。例如,具有肝趋向性的本发明的复合物可以被肝实质细胞摄入。
阴离子型脂类也可以作为本发明的复合物中的脂质体的组成成分使用。此类阴离子型脂类可列举磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰甘油、LS等。
在本发明的一个实施方案中,阴离子型分子可选自适体、miRNA和抗体。
在本说明书中,适体是指通过体外选择方法(SELEX:基于指数富集的配体系统性进化)产生的高亲和力、高特异性的基于RNA或DNA的配体。适体是从20-30个核苷酸的随机配列生成的,基于与分子抗原或细胞的吸附选择性地进行筛选,并进行浓缩以特异性地纯化高亲和力的结合配体。为了提高体内的稳定性和实用性,通常化学修饰适体,以抑制核酸酶分解,或使其易于与试剂、标志物或颗粒结合。此外,通过更简单的化学交联方法,替换不具体参与与配体的相互作用的核酸。在溶液中,适体虽不形成结构,但有可能折叠、包围目标表位,据此特异性地识别。表位周围的核酸的特异折叠产生氢键、静电力、堆积、具有由形状互补性介导的识别力的分子间接触。与基于蛋白质的配体相比,一般而言,适体是稳定的,加热灭菌的传导性高,免疫原性低。现在,适体已以包括血管形成、血小板活化、实体肿瘤在内的多种具有临床意义的病变为目标使用,其用途正在增多。在适体作为成像和/或治疗用乳液颗粒中的靶向配体使用的情况下,其临床实用性有时依赖于相对于清除率的由核酸的磷酸基赋予的表面负电荷强度。使用基于脂类的颗粒进行的在先研究表示,负的ζ电位显著降低脂质体的血液半衰期,另一方面,中性或阳离子型颗粒则都在全身维持更长的时间。
本发明的适体还可以采用盐的形态,此类适体的盐可列举钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铝盐等。所述适体或其盐可以使用市售的(例如,北海道SystemScience公司生产),也可以使用常用规程来恰当地制备。
在本发明的复合物中,作为阴离子型分子使用的抗体只要是表现为阴离子型分子(例如,抗体表面作为整体带负电)的抗体即可,没有特殊的限制。使用抗体作为阴离子型分子,可以利用抗原抗体反应进一步提高对细胞、器官的趋向性。此类抗体可以使用市售的,也可以使用常用的规程,针对所选定的抗原来适宜地制备。
在本发明的一个实施方案中,用于本发明的复合物中的阴离子型分子选自γ-聚谷氨酸、硫酸软骨素(下文缩写为CS)、海藻酸(下文缩写为AGA)及其盐。所述实施方案中的阴离子型分子优选是γ-PGA。
本说明书中,γ-PGA或其盐可列举下列通式(1)所表示的化合物。
[化学式1]
(通式中的R是氢原子、钠、钾、锂等碱金属原子,三甲胺、三乙胺、二甲胺、二乙胺、三乙醇胺、三甲醇胺、二乙醇胺、二甲醇胺、乙醇胺等叔胺,或四甲基胺、四乙基胺等季胺;存在于分子中的R可以相同也可以不同,n是40以上的整数)。
本说明书中,CS或其盐可列举下列通式(2)所表示的化合物。
[化学式2]
(在通式中,R1-R3分别独立地是氢原子或磺酸基(但是,R1或R2中至少一个是磺酸基)、R4-R6分别独立地是氢原子、钠、钾、锂等碱金属原子;三甲胺、三乙胺、二甲胺、二乙胺、三乙醇胺、三甲醇胺、二乙醇胺、二甲醇胺、乙醇胺等叔胺;或四甲基胺、四乙基胺等季胺;存在于分子中的磺酸基可以分别被钠、钾、锂等碱金属原子、三甲胺、三乙胺、二甲胺、二乙胺、三乙醇胺、三甲醇胺、二乙醇胺、二甲醇胺、乙醇胺等叔胺、或四甲基胺、四乙基胺等季胺取代;n是10以上的整数)。
本说明书中,AGA或其盐可列举下列通式(3)所表示的化合物。
[化学式3]
(在通式中,R1-R4分别独立地是氢原子、钠、钾、锂等碱金属原子;三甲胺、三乙胺、二甲胺、二乙胺、三乙醇胺、三甲醇胺、二乙醇胺、二甲醇胺、乙醇胺等叔胺;或四甲基胺、四乙基胺等季胺;m和n表示嵌段共聚物的各嵌段的总数,m和n之和是20以上)。
本说明书中,LS是下列通式(4)所表示的化合物。
[化学式4]
LS的盐可列举钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铝盐等。
本说明书中,磷脂酰丝氨酸是下列通式(5)所表示的化合物。
[化学式5]
磷脂酰丝氨酸的盐可列举钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、盐酸盐等。
本说明书中,甘草皂苷是下列通式(6)所表示的化合物。
[化学式6]
甘草皂苷的盐可列举钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、盐酸盐等。
这些阴离子型分子可以分别通过本身公知的方法来制备。
当所述阴离子型分子是聚合物,即γ-PGA、CS、AGA或其盐时,对其聚合度没有特殊的限制,可列举例如分子量5,000以上,更优选10,000以上的。此外,从不受阴离子型分子的配比量的影响,可以稳定地包合抗原的观点看,所述阴离子型聚合物的分子量是例如20万以下,优选15万以下,更优选10万以下。
通过本发明的药物递送复合物向细胞或器官内递送抗原或药物,在以细胞或器官的诊断或分子成像为目的的情况下,阴离子型分子也可以是用适合诊断装置(方法)或成像装置(方法)的成像用核素的修饰过的阴离子型分子。
此类阴离子型分子可列举例如,用于正电子体层扫描(PET)的放射性核素(11C、13N、15O、18F等)或用所述核素标记的阴离子型分子、用于单光子发射计算机体层扫描(SPECT)的放射性核素(67Ga、99mTc、111In、123I等)或用所述核素标记的阴离子型分子、用于MRI(核磁共振成像)的造影剂(Gd3+等)或用所述造影剂标记的阴离子型分子、色素(异舒泛蓝、舒泛蓝、亚甲基蓝、吲哚氰绿、靛胭脂等)或用所述色素标记的阴离子型分子、荧光色素或用所述荧光色素标记的阴离子型分子。本领域技术人员可以用本身公知的方法制备这些阴离子型分子。
例如,在PET、SPECT、MRI等中使用的各种信号金属(放射性核素、磁性金属、形成荧光络合物的镧系元素等)可以利用螯合剂,通过配位键导入到阴离子型分子中,对于各种色素,可以通过使之与阴离子型分子共价结合来导入。这些导入方法是本领域技术人员公知的。
用于本发明复合物中的阳离子型分子只要能够通过静电相互作用与上述阴离子型分子形成复合物即可,可列举例如阳离子型高分子(例如,聚乙烯亚胺(下文缩写为PEI)、几丁质或壳聚糖等聚阳离子型多糖、聚赖氨酸、聚精氨酸、鱼精蛋白等聚阳离子型多肽等),或阳离子型脂类(例如,磷脂酰胆碱(大豆磷脂酰胆碱、卵黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱等)、磷脂酰乙醇胺(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺等)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰胆碱、鞘磷脂、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、加氢型磷脂等磷脂、例如磺氧基核糖基甘油酯(sulfoxy ribosylglyceride)、二糖基甘油酯、二半乳糖基甘油二酯、半乳糖基甘油二酯、糖基甘油酯等甘油糖脂;例如半乳糖脑苷脂、乳糖脑苷脂、神经节苷脂等鞘糖脂中导入氨基、烷基氨基、二烷基氨基、三烷基铵基、单酰氧基烷基-二烷基铵基、二酰氧基烷基-单烷基铵基、二酰氧基烷基-三烷基铵基等季胺基的脂类、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵氯化物(下文也可缩写为DOTMA)、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵甲基硫酸盐(下文也可缩写为DOTAP)、3β-[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)氨甲酰基]胆固醇(下文也可缩写为DC-ChoL)、苯扎氯铵等)、阳离子型表面活性剂[例如苯扎氯铵、氯化苄乙氧铵等]、阳离子型树形化合物[例如聚酰胺胺树形化合物等]等,但不限于此。
这些阳离子型分子也可以通过各自本身公知的方法来制备。
本发明的阳离子型分子可列举选自聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、聚乙烯亚胺和阳离子型树形化合物的阳离子型高分子、选自DOTMA、DOTAP、DC-ChoL和苯扎氯铵的阳离子型脂类,或苯扎氯铵作为优选的例子。
这些阳离子型分子还可以包含各种核素(例如,天然放射性核素、人工放射性核素、正电子放出核素等),也可以通过核素进行放射性标记。或者也可以用各种化合物(例如,公知的荧光色素、酶)标记。
通过本发明的药物递送复合物向细胞或器官内递送抗原或药物,在以细胞或器官的诊断或分子成像为目的的情况下,阳离子型分子也可以是接受了适合诊断装置(方法)或成像装置(方法)的成像用核素的修饰的阳离子型分子。
此类阳离子型分子可列举例如,用于正电子体层扫描(PET)的放射性核素(11C、13N、15O、18F等)或用所述核素标记的阳离子型分子、用于单光子发射计算机体层扫描(SPECT)的放射性核素(67Ga、99mTC、111In、123I等)或用所述核素标记的阳离子型分子、用于MRI(核磁共振成像)的造影剂(Gd3+等)或用所述造影剂标记的阳离子型分子、色素(异舒泛蓝、舒泛蓝、亚甲基蓝、吲哚氰绿、靛胭脂等)或用所述色素标记的阳离子型分子、荧光色素或用所述荧光色素标记的阳离子型分子。本领域技术人员可以用本身已知的方法制备这些阳离子型分子。
例如,在PET、SPECT、MRI等中使用的各种信号金属(放射性核素、磁性金属、形成荧光络合物的镧系元素等)可以利用螯合剂,通过配位键导入到阳离子型分子中,对于各种色素,可以通过使其与阳离子型分子共价结合来导入。这些导入方法是本领域技术人员公知的。
构成本发明复合物的抗原或药物与阳离子型分子的复合物(下文有时称为阳离子型复合物)可以是任何形态,只要所述阳离子型复合物可以通过与阴离子型分子间的静电相互作用,形成实质上不带电荷,或者带表面负电荷的抗原递送复合物即可,可列举例如:
(a)抗原或药物与阳离子型分子(包括由阳离子型高分子或阳离子型脂类组成的脂质体或胶束)混合,自组装获得的带有正的表面电荷的复合物(下文有时称为自组装型复合物);
(b)包合抗原或药物的阳离子型胶束(微球);
(c)包合抗原或药物的阳离子型脂质体;
(d)通过将形成与阳离子型树形化合物和螯合剂的复合物的药物与阳离子型分子混合,自组装获得的带有正的表面电荷的复合物
等等,但不限于此。在脂质体的情况下,可以是单层型、多层型中的任一种。
特别是在本发明的药物递送复合物中,在所述药物是siRNA的情况下,本发明的复合物优选是由含有二油酰基磷脂酰乙醇胺的脂质体自组装而成的。
本领域技术人员根据所包含的抗原或药物的物理化学性质,可以选择适宜地阳离子型复合物形态。在DNA、失活病毒等带负电荷的水溶性抗原或药物的情况下,可以使用上述(a)或(c)的复合物。此外,在带正电荷的水溶性抗原或药物的情况下,可以使用上述(c)的复合物。或者,在使用阳离子型树形化合物和螯合剂的药物复合物作为药物的情况下,可以使用上述(d)的复合物。
在本发明的其他实施方案中,在使用癌抗原作为抗原或药物的情况下,上述阳离子型复合物优选采取胶束的形态。
此外,阳离子型复合物只要带有正的表面电荷,可以是例如由2种以上的上述形态组合而成的形态,可列举例如包封了上述(a)或(b)的复合物的阳离子型脂质体这样的形态,但不限于此,可以使用任何其他的组合。
此类形态具体而言可列举由抗原或药物与阳离子型高分子和/或阳离子型脂类组成的阳离子型复合物。在该实施方案中,阳离子型高分子选自聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、聚乙烯亚胺和阳离子型树形化合物,阳离子型脂类优选选自DOTMA、DOTAP、DC-ChoL和苯扎氯铵。
进一步的,作为其他的具体实例,可列举由抗原或药物、阳离子型高分子以及阳离子型脂类组成的阳离子型复合物。在该实施方案中,阳离子型高分子选自聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、聚乙烯亚胺和阳离子型树形化合物,阳离子型脂类选自DOTMA、DOTAP、DC-ChoL和苯扎氯铵是特别优选的。
此外,除阳离子型脂类分子以外,胶束、脂质体还可以包含本身已知的中性脂类(磷脂、肽脂类、糖脂类等;例如,二油酰基磷脂酰乙醇胺(下文缩写为DOPE)、胆固醇等)、聚氧化亚烷基二醇(PEG、PPG等)作为组成分子。
此类形态的阳离子型复合物可列举这样的阳离子型复合物,所述阳离子型复合物由抗原或药物与阳离子型脂类以及由选自DOPE和胆固醇的脂类组成的脂质体或胶束构成。在该实施方案中,阳离子型脂类选自DOTMA、DOTAP和DC-ChoL是特别优选的。
用于制备本发明的阳离子型复合物的抗原或药物与阳离子型分子的配比没有特殊的限制,例如,在阳离子型复合物是通过混合带负电荷的抗原或药物与阳离子型分子而获得的自组装型复合物的情况下,可以使用所述抗原的带负电荷的官能团(例如,DNA中的磷酸基、蛋白质或肽中的羧基等)与所述阳离子型分子的带正电官能团(例如,PEI中的亚氨基、聚赖氨酸或聚精氨酸中的氨基等)摩尔比为1∶1-1:20,优选1:2-1:15,更优选1:2-1∶10的比例。
并且,本说明书中的“配比”是指形成本发明的复合物的物质中的以下值的比。
·抗原或药物:带负电荷的官能团的摩尔数
·阳离子型分子(阳离子型高分子和阳离子型脂类):带正电荷的官能团的摩尔数
·中型脂类:摩尔数
·阴离子型分子:带负电荷的官能团的摩尔数
换言之,“配比”可以通过在形成本发明的复合物的各种物质中的阳离子型官能团(例如氨基)或阴离子型官能团(例如羧基、磺酰基)的“电荷比”来定义。
在通过组合阳离子型脂类而使本发明的阳离子型复合物采用脂质体的形态的情况下,抗原或药物的带负电荷的官能团(例如,DNA中的磷酸基、蛋白质或肽中的羧基等)和所述阳离子型分子的带正电荷的官能团及阳离子型脂类(例如,二酰氧烷基-三烷基铵基等中的季铵基)的摩尔比可以使用1:1:1-1:20:20,优选1:2:2-1:15:15,更优选1:2:2-1∶10:10的比例,可以在保持脂质体的形态的范围内适宜地设定。
此外,在通过组合本身已知的中性脂类而使得本发明的阳离子型复合物采用脂质体的形态的情况下,可以仅将中性脂类与抗原或药物、以及阳离子型分子混合,本领域技术人员可以适宜地确定所述配比。
此类本发明的阳离子型复合物可以通过适宜地混合抗原和阳离子型分子来制备。本领域技术人员可以适宜地设定制备所必需的手段、实验设备、反应时间、反应温度等各种条件。
在本发明的复合物中,上述阳离子型复合物包合在上述阴离子型分子中。在本文中,“包合”指包含在内部,例如可以是阴离子型分子通过静电相互作用结合覆盖在阳离子型复合物的表面上的非包封性形态,或者也可以采用如脂质体那样将阳离子型复合物包封的形态。在前一种情况下,复合物只要实质上不带电荷,或者具有负的表面电荷,阳离子型复合物无需被阴离子型分子完全覆盖。复合物“实质上不带电荷”指所述复合物在与血液接触的情况下不引起红细胞凝集,以及在所述复合物与细胞接触的情况下,正电荷降低到所述细胞的存活率为至少50%的程度。具体而言,复合物的表面电荷(ζ电位)是在+20mV以下,优选+10mV以下,更优选+5mV以下,更优选0mV以下,还优选-10mV以下,特别优选-15mV以下。表面电荷(ζ电位)的下限没有特殊的限制,是例如-50mV以上,优选-40mV以上,更优选-30mV以上。
用于制备本发明的复合物的阳离子型分子和阴离子型分子的配比没有特殊的限制,只要所述复合物实质上不带电荷,或者具有负表面电荷即可,例如所述阳离子型分子的带正电荷的官能团(例如,PEI中的亚氨基、聚赖氨酸或聚精氨酸中的氨基等)与所述阴离子型分子的带负电荷的官能团(例如,γ-PGA、AGA、CS的磺酸基和羧基)的摩尔比是5:1-1:5,优选4:1-1:4,更优选3:1-1:4。但是,可以顺应阳离子型分子的性质加以最优化,对所述比例没有限制。
在通过组合阳离子型脂类而使本发明的阳离子型复合物采用脂质体的形态的情况下,阳离子型分子与阴离子型分子的配比可以使用下述比例:所述阳离子型分子的带正电荷的官能团(例如,PEI中的亚氨基、聚赖氨酸或聚精氨酸中的氨基等)、阳离子型脂类的带正电荷的官能团(例如二酰氧烷基-三烷基铵基等中的季铵基)、以及阴离子型分子的带负电荷的官能团(例如,LS、磷脂酰丝氨酸、适体的磷酸基和羧基)的摩尔比为1:1:1-1∶1:5,优选1∶1:1-1∶1:4,更优选1∶1:1-1:1:2。可以在保持脂质体形态的范围内适宜地设定。
上述配比对于使本发明的复合物具有期望的对细胞或器官的趋向性是重要的。
在本发明的一个实施方案中,若阴离子型分子是磷脂酰丝氨酸,则如前所述,所获得的本发明的复合物具有对脾的趋向性。然而此时,将抗原或药物、阳离子型分子以及作为阴离子型分子的磷脂酰丝氨酸的配比调节为1:2:4-1:8:8,可以进一步提高对脾的趋向性。
即,根据本发明的优选实施方案,提供了这样的复合物,其特征是阴离子型分子为磷脂酰丝氨酸;抗原或药物、阳离子型分子、磷脂酰丝氨酸的配比是1:2:4-1:8:8;且具有对脾的趋向性。通过使配比在此范围内,可获得具有对于脾趋向性而言最适的表面电荷的本发明的复合物。
在此情况下的阳离子型高分子和阳离子型脂类没有特殊的限制,优选聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚精氨酸。
在本发明的一个实施方案中,若阴离子型分子是月桂酰肌氨酸,则如前所述,所获得的本发明的复合物具有对肺的趋向性。然而此时,阳离子型分子由阳离子型高分子和阳离子型脂类组成,且将抗原或药物、阳离子型高分子、阳离子型脂类以及作为阴离子型分子的月桂酰肌氨酸的配比调节为1:2:2:1-1:2:2:4,可以进一步提高对肺的趋向性。换言之,根据本发明的优选实施方案,提供了这样的复合物,其特征是:阴离子型分子为月桂酰肌氨酸;阳离子型分子由阳离子型高分子和阳离子型脂类组成;抗原或药物、阳离子型分子、磷脂酰丝氨酸的配比是1:2:2:1-1:2:2:4;且具有对肺的趋向性。通过使配比在此范围内,可获得具有对于肺趋向性而言最适的表面电荷的本发明的复合物。
在此情况下的阳离子型高分子和阳离子型脂类没有特殊的限制,优选阳离子型高分子是聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚精氨酸;阳离子型脂类是DOTMA或DOTAP。
在本发明的一个实施方案中,若阴离子型分子是甘草皂苷,则如前所述,所获得的本发明的复合物具有对肝的趋向性。然而此时,将抗原或药物、阳离子型分子、以及作为阴离子型分子的甘草皂苷的配比调节为1:2:8-1:8:16,可以进一步提高对肝的趋向性。换言之,根据本发明的优选实施方案,提供了这样的复合物,其特征是:阴离子型分子为甘草皂苷;抗原或药物、阳离子型分子、甘草皂苷的配比是1:2:8-1:8:16;且具有对肝的趋向性。通过使配比在此范围内,可获得具有对于肝趋向性而言最适的表面电荷的本发明的复合物。
在此情况下的抗原或药物优选核酸。阳离子型分子优选聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚精氨酸。
或者,在本发明的其他实施方案中,若阴离子型分子是γ-聚谷氨酸,则如前所述,所获得的本发明的复合物具有对树突状细胞或脾的趋向性。
特别是在使用蛋白质抗原作为抗原或药物的情况下,阳离子型分子使用苯扎氯铵,且阴离子型分子使用γ-聚谷氨酸,则对树突状细胞的趋向性可进一步加强。
本发明的复合物可以如下制备:使抗原或药物与阳离子型分子按适宜的配比接触,使之形成阳离子型复合物,进一步使所述阳离子型复合物与阴离子型分子按适宜的配比接触。
例如,对于利用DNA等带负电荷的水溶性抗原或药物与PEI等水溶性阳离子型聚合物之间的静电相互作用的阳离子型复合物,可以通过将抗原或药物与阳离子型聚合物在水或适宜的缓冲液中混合,在室温下温育0.5-300分钟,优选1-180分钟来制备。混合物中的抗原或药物的浓度可以考虑所使用的抗原或药物的种类、大小(分子量)等来适宜地决定,当所述抗原或药物是DNA时,通常是在0.01-1000ng/μL的范围内。在所述抗原或药物是通常的质粒DNA(大小约4-7kbp)的情况下,所述混合液中的DNA浓度优选是在50-500ng/μL的范围内。当浓度太低时,向细胞导入的DNA不能表现出预期的功能,当浓度太高时,核酸导入效率反而降低。并且,抗原或药物与阳离子型聚合物的配比可以从前文所述的范围中适宜地选择。混合液的温育时间可以根据所使用的抗原或药物与阳离子型聚合物的种类在上述的范围适宜地选择,当温育时间太短时,抗原或药物与阳离子型聚合物间的复合物形成不充分,当温育时间太长时,所形成的复合物有时不稳定化,任何一种情况下抗原或药物向细胞递送的效率都会降低。
对于包合抗原或药物的阳离子型胶束的情况,例如,将阳离子型脂类盐与脂溶性抗原或药物溶解在氯仿中,充分混和后,用蒸发器、干燥器完全去除氯仿,加入任意的等渗溶液水合过夜。水合后,通过超声制备将抗原或药物包封在内的阳离子型胶束。完成时,可以根据抗原或药物的脂溶性等物理化学性质,适宜地调整所使用的抗原或药物的量与阳离子型脂类的配比。此外,不限于该方法,还可以通过公知的方法进行制备。所使用的抗原或药物的量、抗原或药物与阳离子型脂类的配比可以分别从上述范围中适宜地选择。
此外,对于包合抗原或药物的阳离子型脂质体的情况,可以通过例如超声波处理、加热、涡旋振荡、乙醚注入法、弗氏压碎器法、胆酸法、Ca2+融合法、冻融法、逆向蒸发法等本身公知的方法来制备。所使用的抗原或药物的量、抗原或药物与阳离子型脂类的配比可以分别从上述范围内适宜地选择。
在所获得的阳离子型复合物溶液中加入阴离子型分子,室温下温育0.5-300分钟,优选15-60分钟,使其自组装,从而可以获得阳离子型复合物被阴离子型分子覆盖而成的抗原递送复合物。当温育时间太短时,阳离子型复合物与阴离子型分子间的复合物形成不充分,当温育时间太长时,所形成的复合物有时会不稳定化,任何一种情况都会降低抗原向细胞递送的效率。构成阳离子型复合物的阳离子型分子与阴离子型分子的配比可以从上述范围内适宜地选择。
由此获得的本发明的复合物的表面实质上不带电荷,或者具有负的表面电荷。本文中的“实质上不带电荷”如上所述。具体而言,实质上不带电荷是指表面电荷(ζ电位)在+20mV以下且-20mV以上,优选+10mV以下且-10mV以上,更优选+5mV以下且-5mV以上。此外,“表面负电荷”指0mV以下,优选-5mV以下,更优选-10mV以下,更优选-15mV以下。表面电荷(ζ电位)的下限没有特殊的限制,例如-50mV以上,优选-40mV以上,更优选-30mV以上。可以使用市售的ζ电位测量装置,测量抗原或药物递送复合物的ζ电位。
本发明的复合物由于实质上不带电荷或带负电荷,因此即使在通过静脉内给药等全身给药时,也不会像使用PEI等阳离子型聚合物或阳离子型脂质体的传统载体分子那样造成红细胞凝集。此外,向目标以外的细胞的非特异性抗原递送也得以降低。
本发明的复合物具有500nm以下,优选300nm以下,更优选200nm以下的平均粒径。可以使用例如动态光散射测量装置获得的散射强度分布来计算复合物的粒径分布和平均粒径。
一直以来,已经尝试来通过增大颗粒尺寸,使其栓塞在目标部位的网状内皮系统中,来提高向肺等器官的移动性,但该手段存在颗粒堵塞在全身的毛细血管中而引起栓塞症的危险。与此相对,本发明的复合物具有与阳离子型复合物几乎相同的颗粒大小,实现了充分的滞留性,且能够提高向特定器官递送抗原或药物的效率,因此可以安全的全身给药。
本发明的复合物与不含阴离子型分子的、使用PEI等阳离子型聚合物的阳离子型复合物相比,显著降低了细胞毒性,因此可以将不理想的副作用抑制到最低程度。
本发明的复合物可以单独或与药理学上可接受的载体一起,通过常规手段进行制剂化,作为医药或试剂组合物使用。在复合物制剂为试剂组合物的情况下,所述复合物可以直接提供,或者作为在例如水或其以外的生理学可接受的溶液(例如,生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、用于普通细胞培养的培养基(例如RPMI1640、DMEM、HAM F-12、EAGLE培养基等)等水性溶剂、乙醇、甲醇、DMSO等有机溶剂或水性溶剂与有机溶剂的混合溶液等)中的无菌溶液或悬浮液提供。所述组合物可以包含适宜的、公知的生理学可相容的赋形剂、溶媒、防腐剂、稳定剂、粘合剂等。
此外,在将本发明的复合物制剂为医药组合物的情况下,所述复合物可以直接的,或者与医药上可接受的载体、香味剂、赋形剂、溶媒、防腐剂、稳定剂、粘合剂等一起,按一般认可的符合制剂实施要求的单位剂量形态混合,制备成口服剂(例如片剂、胶囊剂等)或非口服剂(例如注射剂、喷雾剂等)。
可以混合在片剂、胶囊剂等中的添加剂可使用例如明胶、玉米淀粉、黄芪胶、阿拉伯树胶之类的粘合剂;结晶纤维素之类的赋形剂;玉米淀粉、明胶等之类的膨化剂;硬脂酸镁之类的润滑剂、蔗糖、乳糖或糖精之类的甜味剂、薄荷、红珠树油或樱桃之类的香味剂等。在单位剂型为胶囊的情况下,上述类型的材料中可以进一步包括油脂之类的液态载体。用于注射剂的含水液体可使用例如生理盐水、含葡萄糖或其他辅助药物的等渗液(例如,D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化钠等)等,也可以组合使用适宜的助溶剂例如醇类(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂(例如吐温80TM、HCO-50)等。油性溶液可使用例如芝麻油、大豆油等,也可以组合使用助溶剂苯甲酸苄酯、苯甲醇等。
此外,上述医药组合物也可以与例如缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液等)、镇痛剂(例如苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂(例如苯甲醇、苯酚等)、抗氧化剂(例如抗坏血酸等)等组合使用。
本发明还提供了向细胞内递送抗原或药物的方法,其特征是将上述本发明的复合物与细胞接触。
对细胞的种类没有特殊的限制,可以使用原核生物和真核生物的细胞,优选真核生物的细胞。真核生物的种类没有特殊的限制,可列举例如包括人在内的哺乳动物(人、猿、小鼠、大鼠、仓鼠、牛等)、鸟类(鸡、鸵鸟等)、两栖类(蛙等)、鱼类(斑马鱼、鳉等)等脊椎动物、昆虫(蚕、蛾、果蝇等)等无脊椎动物、植物、酵母等微生物等。更优选的是,作为本发明对象的细胞是动物或植物细胞,更优选的是哺乳动物细胞。所述细胞可以是包括癌细胞在内的培养细胞株,也可以是从个体、组织中分离的细胞,或组织或组织切片的细胞。此外,细胞可以是贴壁细胞,也可以是不贴壁的细胞。
例如,如下具体说明使本发明的复合物与细胞接触的步骤。
即,在与本发明的复合物接触的数天前,将细胞悬浮在适宜的培养基中,用合适的条件培养。在与复合物接触时,细胞可以处于或不处于增殖期。接触时的培养液可以是含血清的培养基,也可以是不含血清的培养基,培养基中的血清浓度为30%以下,优选20%以下。因为培养基中如果含有过多的血清等蛋白质,则可能抑制复合物与细胞的接触。
接触时的细胞密度没有特殊的限制,可以考虑细胞类型等而适宜地决定,一般是0.1×105-5×105细胞/mL,优选0.1×105-4×105细胞/mL,更优选0.1×105-3×105细胞/mL,更优选0.2×105-3×105细胞/mL,最优选在0.2×105-2×105细胞/mL的范围内。
向包含如此制备的细胞的培养基中添加含有复合物的溶液。含有复合物的溶液的添加量没有特殊的限制,可以考虑细胞数等适宜地决定,每1mL培养基一般是1-1000μL,优选1-500μL,更优选1-300μL,更优选1-200μL,最优选在1-100μL的范围内。
向培养基中添加含有复合物的溶液,培养细胞时的温度、湿度、CO2浓度等可以考虑细胞类型来适宜地决定。在哺乳动物细胞的情况下,通常是约37℃,湿度是约95%、CO2浓度是约5%。
此外,对于培养时间,可以考虑所使用的细胞类型适宜地决定,通常是1-72小时,优选1-60小时,更优选1-48小时,更优选1-40小时,最优选1-32小时的范围内。
若上述培养时间太短,抗原或药物有时不能充分导入到细胞内;若温育时间太长,细胞有时会衰退。
通过上述培养,将抗原或药物导入到细胞内,优选将培养基更换为新鲜的培养基,或者向培养基中加入新鲜的培养基再继续培养。在细胞是哺乳动物来源的细胞的情况下,新鲜的培养基优选包含血清或营养因子。
进一步培养的时间可以考虑预期的抗原或药物的功能来适宜地决定,在抗原或药物是表达载体等质粒DNA的情况下,通常是8-72小时,优选8-60小时,更优选8-48小时,更优选8-36小时,最优选12-32小时的范围内。
本发明还提供了向动物的细胞或器官递送抗原或药物的方法,其特征是向对象给药上述本发明的复合物。
即,通过向对象给药本发明的复合物,所述复合物到达/接触目标细胞或目标器官,在生物体内将包含所述复合物的抗原或药物导入到细胞或器官中。
可以给药本发明的复合物的对象没有特殊的限制,例如包括人在内的哺乳动物(人、猿、小鼠、大鼠、仓鼠、牛等)、鸟类(鸡、鸵鸟等)、两栖类(蛙等)、鱼类(斑马鱼、鳉等)等脊椎动物、昆虫(蚕、蛾、果蝇等)等无脊椎动物、植物等。作为所述复合物的优选的给药对象可列举人或其他哺乳动物。
本发明复合物的给药方法没有特殊的限制,只要在所述复合物能够到达/接触目标细胞或目标器官,将所述复合物中包含的抗原或药物导入到细胞或器官中的范围内即可,可以考虑抗原或药物的种类、目标细胞或目标器官的种类、部位等,来适宜地选择本身已知的给药方法(口服给药、非口服给药(静脉内给药、肌肉内给药、局部给药、透皮给药、皮下给药、腹腔内给药、喷雾等)等)。
本发明的复合物的给药量没有特殊的限制,只要在能够向细胞或器官中导入抗原或药物的范围内即可,可以考虑给药对象的种类、给药方法、抗原或药物的种类、目标细胞或目标器官的种类、部位等来适宜地选择,在口服给药的情况下,一般来说,例如,人体(体重设为60kg)中每1次的给药量以复合物计是约0.001mg-10000mg。在非口服给药的情况下(例如静脉内给药等),一般来说,例如,人体(体重设为60kg)中每1次的给药量以复合物计为约0.0001mg-3000mg。
在通过静脉给药等将本发明的复合物全身给药后,在阴离子型分子使用γ-PGA、CS或AGA或其盐,优选γ-PGA或CS或其盐,更优选γ-PGA或其盐的情况下,以高选择性被递送到脾。
本发明还涉及包含本发明的复合物的疫苗。
具体而言,在使用病原体抗原或其编码DNA作为抗原或药物的情况下,可以作为感染性疾病的疫苗使用,在使用癌症抗原作为抗原或药物的情况下,可以作为癌症疫苗使用(下文将本发明的感染性疾病的疫苗和癌症疫苗统称为本发明的疫苗)。
本发明的疫苗中包含的本发明复合物可以使用和前述一样的复合物。
本发明的疫苗可以是本发明的复合物本身,也可以使用通过本领域常用的方法与上述医药上可接受的载体等一起进行制剂化。
此外,基于产生栓塞症的危险性的观点,与本发明的复合物相同,本发明的疫苗的平均粒径也在500nm以下,优选在300nm以下,更优选在200nm以下。
本发明的疫苗还可以添加上述生理学可接受的液体、医药上可接受的载体、香味剂、赋形剂、溶媒、防腐剂、稳定剂、粘合剂等来使用。
本发明的疫苗还可以通过与本发明的复合物相同的方式与细胞接触,向所述细胞内递送抗原,从而提高免疫力。
进一步的,本发明的疫苗可以通过与本发明复合物相同的方式向哺乳动物给药,向所述动物的细胞内递送抗原,从而提高免疫力。
或者,本发明涉及用作递送成像用核素的载体的药物递送复合物。
本发明的复合物是基于自身具有的趋向性而递送到特定的细胞或器官中的,因此上述载体(下文称为本发明的载体)与仅用探针的传统诊断方法、成像方法相比,可以更准确地诊断目的部位。
本发明的载体可以是本发明的复合物本身,也可以包含本发明的复合物。
如前所述,在将本发明的复合物适用于成像用核素的载体(下文有时记载为成像探针)的情况下,本发明的药物优选作为药物复合物制备。可以在阳离子型树形化合物所具有的阳离子型基团(例如氨基)中,通过共价键导入色素、荧光色素分子等药物,也可以在螯合剂中导入放射性核素、MRI造影剂、镧系元素等药物。通过应用作为此类阳离子型树形化合物和螯合剂的复合物而制备的药物,本发明的载体能够适用为多模态成像探针。
对上述药物复合物而言适用的阳离子型分子和阴离子型分子没有特定的限制,可以从本说明书的记载内容中选择适宜的分子。
然而,特别是在进行淋巴结成像的情况下,阳离子型分子优选聚乙烯亚胺,阴离子型分子优选γ-聚谷氨酸。
通过该药物复合物/聚乙烯亚胺/γ-聚谷氨酸的组合,本发明的复合物变得具有对淋巴结的趋向性,由此借助药物复合物中所含的成像用核素,使得适用于多种用途的淋巴结成像成为可能。
本发明中的淋巴结优选前哨淋巴结。
前哨淋巴结是指从肿瘤进入淋巴液的癌细胞最初到达的、局部淋巴结中最早发生转移的淋巴结。因此,对于判断恶性肿瘤是否发生向其他组织的转移而言,对前哨淋巴结进行活组织检查是必要的,而由于前哨淋巴结无法用肉眼区别,成像对于准确采集是重要的。
迄今为止,已开发了几种用于检测前哨淋巴结的同位素示踪剂,但检测方法受限制,若用不同的方法进行成像,有时会由于同位素示踪剂的行为差异而获得不同结果。此外,从向前哨淋巴结的移动性、滞留性的观点看,也尚未获得理想的同位素示踪剂。
本发明提供了可以适用于各种成像方法、且具有对淋巴结的趋向性,特别是可以滞留在前哨淋巴结中的成像用核素的载体。具体地说,提供了包含这样的复合物的成像用核素的运输体:该复合物中抗原或药物是由成像用核素、阳离子型树形化合物和螯合剂组成的复合物;阳离子型分子是聚乙烯亚胺;阴离子型分子是γ-聚谷氨酸;并且以具有对淋巴结(特别是前哨淋巴结)的趋向性为特征。
本发明还涉及使用本发明的复合物进行成像的方法。
在此情况下,在本发明的复合物中,优选对抗原或药物、阳离子型分子或阴离子型分子中的任一种进行适合诊断装置(方法)或成像装置(方法)的修饰,此类修饰可列举用各种核素(例如,用于PET的放射性核素、用于SPECT的放射性核素等)标记、用MRI造影剂(具有MRI造影效果的元素)的标记、用荧光色素(例如,FITC、Alexa Fluor等)的标记、通过酶(例如,过氧化物酶等)的标记等。
特别是在进行前哨淋巴结成像的情况下,优选选择由成像用核素、阳离子型树形化合物和螯合剂组成的复合物作为抗原或药物,选择聚乙烯亚胺作为阳离子型分子,选择γ-聚谷氨酸作为阴离子型分子。由此可以用各种成像方法对前哨淋巴结进行成像。
下面列举实施例来更具体的说明本发明,但不言而喻的是本发明不受这些实施例的限制。
实施例
实施例1
方法
将pMSP-1(编码疟疾抗原MSP-1的pDNA)与聚乙烯亚胺(PEI)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)按电荷比1:8:6制备成pMSP-1/PEI/γ-PGA复合物。此外,使用pCMV-Luc/PEI/γ-PGA复合物作为对照,该复合物使用编码无药效的萤火虫萤光素酶的pCMV-Luc。将pCMV-Luc/PEI/γ-PGA复合物以40μg(A)的DNA量,pMSP-1/PEI/γ-PGA复合物以0.4(B)、4(C)、40(D)、80(E)μg的DNA量每三周一次向小鼠静脉给药3次。自最后一次免疫起10天后,收集小鼠血清,使用ELISA测定针对疟疾的抗体效价。此外,自最后一次免疫起三周后,用疟原虫感染小鼠,每天观察感染后的小鼠的存活。
结果
图1示出了疫苗的抗体效价。在稀释血清320倍以上的情况下,抗体效价没有差异,在稀释倍数低于上述倍数的情况下,复合物中所含pDNA的量较多者具有更高的抗体效价。此外,在对照组中没有观察到抗体效价升高。
图2示出了感染疟疾后的存活率。在pCMV-Luc/PEI/γ-PGA复合物给药组,或pMSP-1/PEI/γ-PGA复合物给药组的pDNA量为~4μg的情况下,感染后第9天的存活率几乎变为0%,相对而言,在pDNA为40μg和80μg的情况下,经过9天后的存活率仍保持很高。
实施例2
方法
使用苯扎氯铵(BAC)和γ-PGA将失活的流感病毒(疫苗)制备成微颗粒化的疫苗/BAC/γ-PGA复合物。向小鼠给药单独的疫苗、疫苗与BAC或γ-PGA中任一种的混合物、或疫苗/BAC/γ-PGA复合物,4周后采血,用ELISA测量对于流感病毒的抗体效价。
结果
图3示出了各种疫苗的抗体产生效果(疫苗抗体效价)。疫苗与BAC或γ-PGA的任一种的混合物与单独疫苗的抗体效价相比未产生显著差异,而疫苗/BAC/γ-PGA复合物获得了比单独疫苗明显更高的抗体效价。
实施例3
方法
使用用异硫氰酸罗丹明B荧光标记的牛血清白蛋白(BSA)作为模式蛋白质。向树突状细胞株DC2.4细胞中添加BSA或BSA与苯扎氯铵(BAC)及γ-PGA制备成的BSA/BAC/γ-PGA复合物,温育2小时。洗净细胞,22小时后使用荧光显微镜测量细胞的荧光图像。
结果
图4示出了细胞的荧光显微镜观察图像。在单独BSA的情形未观察到细胞内摄入,而在添加了BSA/BAC/γ-PGA复合物的细胞中,观察到了强的BSA荧光,表明BSA/BAC/γ-PGA复合物被高度的细胞内摄入至树突状细胞中。
实施例4
方法
将pUb-M和PEI、γ-PGA按配比(电荷比)1:8:6制备成pUb-M/PEI/γ-PGA复合物,其中pUb-M是编码黑色素瘤抗原基因gp100和TRP-2的泛素化表位的pDNA。每两周一次向C57BL小鼠共给药4次5%糖液(对照)或单独的pUb-M、使用无药效的pCMV-Luc和PEI、γ-PGA制备成的pCMV-Luc/PEI/γ-PGA复合物、或pUb-M/PEI/γ-PGA复合物,以激发免疫。在最后一次免疫2周后,向皮下或静脉内给药黑色素瘤细胞株B16-F10细胞或组成型表达萤光素酶的B16-F10-Luc细胞,分别制备皮下移植模型和肺转移模型。每天测量皮下移植模型的肿瘤直径。此外,在自制备肺转移模型起第21天摘出肺,在观察后测量肺的萤光素酶活性,计算肺转移的细胞数。
结果
图5示出了皮下移植的恶性黑色素瘤的肿瘤重量的变化。仅给药pUb-M、或给药pCMV-Luc/PEI/γ-PGA复合物的小鼠的肿瘤增殖没有表现出与对照组显著的差异,而给药pUb-M/PEI/γ-PGA复合物的小鼠的肿瘤增殖表现出显著低于对照组的值。
图6示出了静脉注入的恶性黑色素瘤向肺转移的情况。此外,图7示出了肺转移的细胞数。与5%糖液给药组(对照)相比,pUb-M/PEI/γ-PGA复合物给药组中肺转移显著被抑制。
实施例5
方法
将pDNA(pCMV-Luc)与PEI混合,制备pDNA/PEI复合物。此外,向该pDNA/PEI复合物中加入N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTMA),再进一步加入N-月桂酰肌氨酸(LS),制备成新型药物递送复合物。按pDNA与PEI和DOTMA和LS的配比(电荷比)为1:2:0:0、1:2:2:0、1:2:2:2、1:2:2:4制备各个复合物,测量粒径和表面电荷。进一步的,将配比(电荷比)为1:2:2:0、1:2:2:2、1:2:2:4的复合物分别给药到小鼠的尾静脉内,6小时后,检查肝脏、脾脏和肺的基因表达。此外,使用1:8:0:0的复合物作为对照。
向小鼠给药配比(电荷比)为1:8:0:0和1:2:2:2的复合物,使用体内成像装置观察基因表达。
此外,制备各种配比(电荷比)的复合物,使用多变量分析测量各成分对在肺中的基因表达量的贡献率。
结果
图8示出了颗粒大小和表面电荷。可以确认的是,即使添加LS,颗粒大小也几乎是一定的,而表面电荷由于添加LS接近负电荷。
图9示出了萤光素酶活性。通过添加LS,肺中的基因表达量显著增加。
图10示出了用萤光素酶成像的小鼠。可确定在添加了LS的复合物的情况下,萤光素酶在肺中高表达。
图11示出了多变量的样条插值法(Spline Interpolation)和贡献指数。由此发现LS对于向肺递送的贡献最大。
实施例6
方法
制备仅由磷脂酰丝氨酸(DOPS)组成的脂质体。向用pCMV-Luc制备的pDNA/PEI复合物中按pDNA与PEI、DOPS为1:8:6的比例(电荷比)添加DOPS脂质体,制备pDNA/PEI/DOPS复合物。向小鼠静脉给药pDNA/PEI复合物和pDNA/PEI/DOPS复合物,6小时后测量各个器官的基因表达量。
结果
图12示出了各个器官中的基因表达(萤光素酶活性)。与pDNA/PEI复合物相比,pDNA/PEI/DOPS复合物在脾脏中尤其表现出高的基因表达效果。
实施例7
方法
除识别癌表面抗原MUC1的适体以外,还使用非特异性序列的适体。按pCMV-Luc和聚乙烯亚胺的电荷比为1:8制备pDNA/PEI复合物。向pDNA/PEI复合物中,按pDNA和PEI、适体的配比(电荷比)为1:8:1.25、1:8:2.5、1:8:5、1:8:10分别加入适体,制备pDNA/PEI/适体复合物,测量粒径和表面电荷。此外,测量电荷比为1:8:10的复合物在A549细胞(MUC1+)中的基因表达量。
按pDNA和PEI的电荷比为1:8制备pDNA/PEI复合物。向包含10μg的pDNA的pDNA/PEI复合物中分别添加200、300、400μg的STEAP-4(前列腺的6次跨膜的上皮抗原-4:脂肪细胞的膜蛋白)抗体,制备pDNA/PEI/抗体复合物,测量粒径和表面电荷。
结果
图13示出了由适体包被的复合物的颗粒大小和表面电荷。pDNA/PEI/适体复合物的配比(电荷比)为1:8:10时,颗粒尺寸小,表面电荷变为负,获得最理想的复合物。
图14示出了表达MUC1的细胞中的萤光素酶活性。在表达MUC1的A549细胞中,由针对MUC1的适体包被的复合物的萤光素酶活性显著高于非特异性适体。
图15示出了由抗体包被的复合物的颗粒大小和表面电荷。抗体为300μg时,颗粒大小最小,而在任一种由抗体包被的复合物中未发现表面电荷的差异。因此,认为pDNA/PEI/抗体300μg的复合物是最合适的。
实施例8
方法
向用pCMV-Luc制备而成的pDNA/PEI复合物中,按pDNA与PEI、GLY为1:8:12的比例(电荷比)添加甘草皂苷,制备pDNA/PEI/GLY复合物。对小鼠静脉给药pDNA/PEI复合物(市售基因载体)和pDNA/PEI/GLY复合物(新型基因载体),6小时后测量各个器官的基因表达量。
结果
图16示出了各个器官中的基因表达(萤光素酶活性)。与pDNA/PEI复合物相比,pDNA/PEI/GLY复合物在肝脏中表现出尤其高的基因表达效果。
实施例9
方法
制备用荧光色素荧光标记的失活流感病毒(下称疫苗)与苯扎氯铵(BK)及γ-PGA自组装而成的疫苗/BAC/γ-PGA复合物,添加到树突状细胞株(DC2.4)中。
结果
图17示出了失活病毒的摄入和小鼠的抗体效价。单独的病毒未见被摄入树突状细胞株,而通过形成VaccinE/BAC/γ-PGA复合物,大大增加了摄入量。
实施例10
方法
向用pCMV-Luc制备而成的pDNA/PEI复合物中,按pDNA与PEI、γ-PGA为1:8:6的配比(电荷比)添加γ-PGA,制备pDNA/PEI/γ-PGA复合物。向树突状细胞株DC2.4细胞中添加单独的pDNA、pDNA+γ-PGA、pDNA/PEI/γ-PGA复合物、或市售基因载体Lipofectin与pDNA的复合物,22小时后测量萤光素酶活性。
结果
图18示出了在树突状细胞中的基因表达(萤光素酶活性)。仅添加pDNA,或添加pDNA和γ-PGA都没有产生基因表达,而pDNA/PEI/γ-PGA复合物则表现出比市售的基因载体明显更高的基因表达效果。
实施例11
方法
为了测试什么样的复合物对siRNA最起作用,以萤光素酶活性为指标,进行基因抑制测试。使用组成型表达萤光素酶的大肠癌细胞株colon26细胞。使用萤光素酶的siRNA作为siRNA,将其与市售的基因载体LipofectinRNAImAx或PEI、聚精氨酸(PLA)、DOTMA-Chol脂质体、DOTMA-DOPE脂质体、DC-Chol-EggPC脂质体、DC-Chol-DOPE脂质体混合,制备阳离子型复合物。进一步,加入γ-PGA,分别构建阴离子型复合物。将各复合物添加到细胞中,22小时后测量萤光素酶活性。以未处理过的细胞的萤光素酶活性为100%,计算相应的值。
结果
图19示出了以萤光素酶活性为指标的基因抑制效率。作为考察各种阳离子型高分子和脂质体的结果,对于siRNA而言,脂质体比高分子更适合作为阳离子型分子。此外,通过用γ-PGA包被siRNA与含有膜融合脂类DOPE的脂质体的复合物,开发出了表现出可以与市售的siRNA载体相比较的效果,同时可能具有靶向性的载体。
实施例12
方法
除将复合物的给药量(以DNA量计)增加到100μg以外,按实施例1相同的方法,每3周一次向小鼠给药共3次单独的疟疾DNA疫苗(pMSP-1)或者pMSP-1/PEI/γ-PGA复合物,自最后一次免疫10天后,使其感染疟原虫。
结果
图12示出了感染疟疾后的小鼠生存率。单独的DNA疫苗几乎没有获得抑制疟疾感染的效果,但通过给药pMSP-1/PEI/γ-PGA复合物,可以100%抑制疟疾的感染。
实施例13
方法
使用卵清白蛋白(OVA)和苯扎氯铵(BK)、γ-PGA构建OVA/BK/γ-PGA复合物。每周一次向小鼠分别给药共4次单独的OVA、苯扎氯铵和γ-PGA(单独的载体)、OVA/BK/γ-PGA复合物来进行免疫,自最终免疫起2周后收集血清,用ELISA测定针对OVA的抗体效价。抗体效价测定使用HRP标记的山羊来源的抗小鼠IgG抗体作为二抗。
结果
图21示出了小鼠血清中的抗体效价(A:在稀释血清的情况下,抗体效价的变化;B:稀释倍数10-4时血清的抗体效价)。仅用OVA,或BK和γ-PGA的混合物没有获得免疫诱导效果,但用苯扎氯铵和γ-PGA制备而成的OVA/BK/γ-PGA复合物表现出高的体液免疫诱导效果。
实施例14
方法
使用卵清白蛋白(OVA)和苯扎氯铵(BK)、γ-PGA构建OVA/BK/γ-PGA复合物。每周一次向小鼠给药共4次单独的OVA、苯扎氯铵和γ-PGA(仅载体)、OVA/BK/γ-PGA复合物,自最终免疫起2周后,将表达OVA的癌细胞(EG7)移植到皮下,观察移植后的肿瘤增殖。
结果
图22示出了自EG7肿瘤移植以来的肿瘤增殖的观察结果。单独的OVA,或BK与γ-PGA的混合物都没有获得抑制肿瘤增殖的效果,但是,在给药OVA/BK/γ-PGA复合物的小鼠中,由于高免疫诱导效果,可以完全抑制表达OVA的癌细胞。
实施例15
方法
使聚酰胺树形化合物(G4)和p-SCN苄基二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)反应,合成在1分子G4中导入约53个DTPA的G4-DTPA。将其与PEI混合成为PEI/G4-DTPA后,再与γ-PGA混合,制备γ-PGA/PEI/G4-DTPA。另一方面,按照相同的方法使用G4-DTPA-111In制备111In标志物。通过测量粒径和ζ电位,确定生成了膜电位为47.7±6.0mV、粒径为30.2±3.2nm的PEI/G4-DTPA,以及膜电位为-48.9±1.6mV、粒径为24.8±3.7nm的γ-PGA/PEI/G4-DTPA。还使用相同的操作制备了含有其他阴离子型高分子海藻酸(ALG)的ALG/PEI/G4-DTPA及其111In标志物,作为比较对照。
在RAW264中加入PEI/G4-DTPA、γ-PGA/PEI/G4-DTPA、ALG/PEI/G4-DTPA,评估细胞毒性。进一步将各种复合物从雄性大鼠的足垫给药,通过随时间测量各脏器中的放射能,评估各种粒子在生物体内的分布。
结果
PEI/G4-DTPA表现出非常强的细胞毒性,而γ-PGA/PEI/G4-DTPA、ALG/PEI/G4-DTPA未发现细胞毒性(图23)。此外,根据使用小鼠红细胞评估各种复合物的红细胞凝集功能、溶血性的结果,确认PEI/G4-DTPA有显著的红细胞凝集和微弱的溶血,而γ-PGA/PEI/G4-DTPA、ALG/PEI/G4-DTPA未发现红细胞凝集和溶血。γ-PGA/PEI/G4-DTPA-111In给药24小时后向前哨淋巴结的积累显著高于其他复合物。此外,任何一种复合物向除前哨淋巴结和给药位点以外的脏器的摄取都表现出非常低的值,表明各种复合物难以从淋巴管泄漏到血管中(图24)。此外,在SPECT/CT摄像中,γ-PGA/PEI/G4-DTPA-111In在前哨淋巴结中的积累高于其他复合物,成功地实现了清晰的成像(图25)。
产业实用性
本发明的复合物不引起红细胞凝集,细胞毒性低,且向细胞内摄入的效率好,因此可以安全有效的递送抗原或药物。
特别是本发明的复合物由于具有对作为目标的细胞或内脏的高趋向性的特征,可以作为新型药物递送系统的有效成分。
此外,本发明的复合物可作为成像探针的载体使用。
本申请以在日本提交的特愿2010-043186(申请日:2010年2月26日)为基础,其内容全文包括在本说明书中。
Claims (2)
1.核酸、聚乙烯亚胺及γ-聚谷氨酸在制备核酸递送复合物中的用途,所述核酸递送复合物含有核酸与聚乙烯亚胺的复合物、以及γ-聚谷氨酸,所述γ-聚谷氨酸包合所述核酸与聚乙烯亚胺的复合物,
其中,核酸、聚乙烯亚胺、及γ-聚谷氨酸的电荷比为1:8:6,所述核酸递送复合物用于将核酸递送到树突状细胞,
所述核酸是大小为2-15kbp的质粒DNA。
2.根据权利要求1所述的用途,其中,所述核酸递送复合物包含于感染性疾病的疫苗或癌疫苗。
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