CN102851292A - 特异性沉默鸡马立克氏病病毒gI、gE基因的siRNA序列及其载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种能有效地特异性沉默鸡马立克氏病病毒(MDV)gI和gE的siRNA序列及其载体和在MDV基因治疗和制备基因工程疫苗中的应用。本发明使用http//www.ambion.com的靶位点筛选和设计工具，通过一步法PCR扩增含有禽源U6启动子的siRNA表达盒用于快速筛选出MDV gI和gE基因的干扰序列。根据siRNA对应的起始位点在gI和gE基因mRNA序列上的位置，分别命名为sigI735和sigE936。构建分别含有干扰序列的siRNA真核表达载体，提取纯化的质粒转染CEF细胞，可有效抑制MDV gI和gE基因的表达，并利用DF1、Vero、MDCK稳定细胞系进一步检测干扰序列抑制MDV gI和gE基因表达的效果。

Description

特异性沉默鸡马立克氏病病毒gI、gE基因的siRNA序列及其载体和应用

技术领域

本发明属于生物技术，涉及分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及针对鸡马立克氏病病毒US7(gI)和US8(gE)基因的siRNA序列设计、筛选及其在体外抑制MDV gI和gE的应用。具体地，本发明涉及序列为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的siRNA序列，其可以特异性干扰鸡马立克氏病病毒gI基因。 

背景技术

1.MDV的研究现状

鸡马立克氏病(MD)是鸡的一种淋巴增生性病，在养殖业受到广泛关注。如果缺乏控制手段，MD将产生巨大的损失。MD在1907年被发现，1968年首次分离到鸡马立克氏病病毒(MDV)。MDV属疱疹病毒科双链DNA病毒，基因组接近180kb，MDV具有γ-疱疹病毒的生物学特性，但是根据其基因组结构被归类为α-疱疹病毒。其基因组庞大，由长独特区(UL)及其两侧的反向长重复序列(TRL和IRL)、短独特区(US)及其两侧的反向短重复序列(TRS和IRS)组成。MDV包括三种血清型，凡能引起肿瘤的MDV均属于血清1型(MDV-1)，而天然不致瘤的MDV和火鸡疱疹病毒(HVT)分别属于血清2型和血清3型。相比其他α-疱疹病毒，MDV具有如下特点：严格的细胞结合特性，在淋巴细胞中建立潜伏感染，基因组中包含的致癌基因能够产生淋巴瘤。从1969年开始，MD就通过疫苗免疫得到了很好的控制。然而，伴随着MDV毒力不断增强，疫苗的免疫效果逐步降低，病毒不断演化迫使我们必须加快MD新疫苗的研发进度以应对毒力不断增强所带来的疾病控制压力。然而，新疫苗研发速度还远跟不上病毒进化速度，这对家禽业无疑一个潜在的最大威胁。另外，，强化商品鸡的生产管理、使鸡早期接触病毒或接种低剂 量病毒也是控制该病的一个好方法。现有的结果证明，MD疫苗能有效地控制该病，但是并不能阻止病毒的进化。CVI988病毒株仍然是当前控制MD的最好的疫苗，应对(或者适应)将来不断进化的MDV毒力增强的趋势，开发免疫效果更好的新型MD疫苗是控制该病的一种战略需要。在MD的控制环节上有三个关键控制点，即：呼吸道、细胞间播散、病毒门户(羽毛毛囊上皮细胞)，这三个环节任何一点的突破都会对MD的控制产生跨越性的影响。 

2.MDVgI和gE基因及其表达蛋白的研究现状。

gI和gE是MDV基因编码很重要的病毒糖蛋白，位于MDV的基因组的US区，在所有的α-疱疹病毒中均存在编码gE的同源基因，gE中都具有2个保守的半胱氨酸簇，并且gE蛋白C端的半胱氨酸簇在所有的α-疱疹病毒中都有5个半胱氨酸残基，说明疱疹病毒属各成员的gE具有相似的功能很保守。与I型单纯疱疹病毒(HSV-1、VZV、PRV等)有很高的同源性，影响体外病毒的生长。gE是一个重要的毒力基因，gI也与毒力有关，且对诱导完全保护是必须的。gE和gI基因是以非共价键形式结合成复合体gI/gE，它们与MDV在淋巴组中的侵袭和扩散作用密切相关，是影响病毒生长的功能成分。 

有文献报道gI/gE是病毒复制、增殖必需基因，gE是gG Fc受体，利用细胞的衔接机制来帮助病毒在细胞间扩散。且gI-gE复合物有助于介导病毒侵入细胞，在细胞间传播起到重要的作用(Schumacher et al.，2001；shamblin et al.，2004；Tischer et al.，2002)。Knapp等的研究证明，缺失gI/gE的PrV对大鼠的毒力大幅度降低，但将BHV-1的gI/gE克隆到该PrV突变株后，重组病毒又恢复了对大鼠的毒力。BHV-1的同源区段能够弥补PrV gE和gI缺失株对小鼠的毒力缺损，这也进一步证明疱疹病毒同源gE蛋白具有相互互补的功能。通过对BHV-1gE缺失突变病毒体外表现型的分析揭示，gE对病毒分泌和蚀斑的缩小都有利。 

3.RNA干扰的研究现状

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是序列特异的双链RNA(dsRNA)使细胞内同源mRNA降解，从而产生特异性基因表达沉默的 过程。它是机体的一种小分子RNA介导的序列特异性免疫保护机制，可以对抗侵入性遗传因子的作用。自1998年首次被报道以来，RNAi技术以其特有的优越性而被迅速应用于抗病毒及其相关方面的研究中，目前已在HBV、HCV、流感病毒等的抗病毒研究中取得重要进展。已有成功的可抗丙型肝炎表达小干扰RNA的转基因鼠。MicroRNAs(miRNAs)是众多生物体内的主要基因表达调节因子，包括病毒。当前，已报道MDV基因组的MEQ和LAT区域编码6个miRNAs。另外，识别了17个新的血清特性型miRNAs。这些miRNAs在致病过程和疫苗免疫应答中的作用功能分析工作正在开展。 

RNAi的作用主要由长约19-21nt的dsRNA介导，其中一类称为小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，它和目的mRNA序列具有严格的配对，能引起相应mRNA降解。由于RNAi是SiRNA靶向作用mRNA引起的特异性降解，因此要产生有效RNAi的关键是选择合适的SiRNA作用靶点。目前RNAi靶点的选择原则可以概括为以下几点：①选择GC含量在50％左右的mRNA区域；②避免选择启动子起始部位下游50-100nt以内或终止子上游50-100nt内的区域；③避免超过三个G或三个C的重叠，因为多聚G或多聚C能形成类聚物而干扰RNAi的沉默机制；④选择以两个AA开始的序列，这将使合成siRNA更加容易；⑤保证靶序列与其他基因没有同源性。目前，制备siRNA的方法主要包括化学合成法、体外转录法、长片段dsRNA经RNaseIII降解法、siRNA表达载体转录法及PCR制备的siRNA表达框法等5种。 

发明内容

本发明根据siRNA设计原则，选择的siRNA其序列的GC含量分别为47.5％和52％，对应的起始位点在gI和gE基因mRNA序列上的位置，分别命名为sigI735和sigE936。构建针对MDV gI和gE基因的siRNA真核表达载体，提取纯化质粒后，转染CEF细胞可有效地抑制MDV gI和gE基因的表达，再通过DF1、Vero、MDCK稳定细胞系进一步检测干扰序列抑制MDV gI和gE基因的表达效果。 

在一个方面中，本发明提供一种针对MDV gI和gE基因的siRNA序列，其核苷酸序列是：sigI735正义链5′CAATTCCCATGTCGATGCA 3′(SEQ ID NO：1)，反义链5′TGCATCGACATGGGAATTG 3′(SEQ ID NO：3)；sigE936正义链5′AGATGTCCAGGTAGACGAT 3′(SEQ ID NO：2)；反义链5′ATCGTCTACCTGGACATCT 3′(SEQ ID NO：4)。 

在第二个方面中，本发明提供包含上述第一个方面所述的siRNA序列的载体。在一个实施方案中，所述载体为pGEM-T Easy载体。在一个实施方案中，所述载体特征在于按下述方法构建而成：一步法PCR扩增含有禽源U6启动子的特异性干扰gI和gE基因的cU6-3-siRNA的表达盒，将其定向克隆到pGEM-T Easy载体，构建得到pGEM-T-cU6-3-shgI735和pGEM-T-cU6-3-shgE935表达载体；所述cU6-3-siRNA序列包含394bp的cU6-3启动子、19nt的siRNA正义链、7bp loop环、19nt的siRNA反义链、6个连续T为终止信号序列，5′和3′端均为HindIII酶切位点。在一个实施方案中，所述载体为真核表达载体。在一个实施方案中，所述真核表达载体为带有EGFP标记的真核表达载体。在一个实施方案中，所述载体为基于pGEM-T Easy载体构建的载体。 

在第三个方面中，本发明提供第一个方面所述的siRNA序列和第二个方面所述的载体在针对MDV的基因研究中的应用。 

在第四个方面中，本发明提供第一个方面所述的siRNA序列和第二个方面所述的载体在制备用于针对MDV基因工程疫苗中的应用。 

在第五个方面中，本发明提供第一个方面所述的siRNA序列和第二个方面所述的载体在制备用于预防或治疗由鸡马立克氏病病毒导致的疾病的药物中的应用。在一个实施方案中，所述由鸡马立克氏病病毒导致的疾病是鸡马立克氏病。 

在第六个方面中，本发明提供一种用于预防或治疗由鸡马立克氏病病毒导致的疾病的药物，所述药物包含第一个方面所述的siRNA序列和第二个方面所述的载体作为活性成分。在一个实施方案中，所述由鸡马立克氏病病毒导致的疾病是鸡马立克氏病。 

本发明的另一个目的是提供了一种初步鉴定鸡马立克氏病病毒复制特异性干扰靶位点的方法，及其在制备治疗MDV病毒感染的基因治疗药物中的应用。 

本发明的有益之处是：提供的siRNA序列针对MDV的增殖必需基因gI和gE，目前，国内外尚无以此基因作为RNAi靶点的报道。以此序列为基础的真核表达载体在细胞中能有效抑制gI和gE基因mRNA水平和蛋白表达水平，因此可作为MDV基因治疗的一个新靶点。 

附图说明

图1为一步法PCR快速扩增cU6-3-表达盒上下游设计。 

M：DL2000DNA；1：cU6-3-shgI97；2：cU6-3-shgI328；3：cU6-3-shgI487；4：cU6-3-shgI735；5：cU6-3-shgI922；6：cU6-3-shgE172；7：cU6-3-shgE328；8：cU6-3-shgE461；9：cU6-3-shgE936；10：cU6-3-shgE1261；11：cU6-3-conshRNA；12：Negative control. 

图2为扩增cU6-3-shRNAgI和cU6-3-shRNAgE表达盒PCR鉴定。 

图3为pEGFP-gI和pEGFP-gE酶切鉴定。 

图4为转染48h后荧光显微镜观察cU6-3-shRNA对gE-EGFP、gI-EGFP融合蛋白的表达抑制观察结果。 

A：transfection of pEGFP-C1；B：cotransfection of pEGFP-gE and pcU6-3-conshRNA；C：co-transfection of pEGFP-gI and cU6-3-conshRNA；D：transfection reagent-only control(no-plasmid DNA)；E：no-fluorescence microscopy image cU6-3-conshRNA；F-J：Co-transfected with pEGFP-gE and various cU6-3-shRNA gE expression Plasmids；K-O：Co-transfected with pEGFP-gI and various cU6-3-shRNAgI expression plasmids. 

图5为转染48h后流式细胞仪检测cU6-3-shRNA对gE-EGFP、gI-EGFP融合蛋白的表达抑制分析结果。(图注部分见图4)

图6为pGEMT-cU6-3-shRANgI735质粒载体中shRNA测序图谱。 

图7为pGEMT-cU6-3-shRANgE936质粒载体中shRNA测序图谱。 

图8为特异性重组干扰质粒在不同细胞系上的基因抑制效果。 

(a)特异性重组干扰质粒和融合基因质粒载体共转染48h后不同细胞的荧光显微镜观察(100×)；(b)流式细胞仪定量检测质粒转染组对gE-EGFP和gI-EGFP阳性细胞的抑制作用。 

具体实施方式

本发明结合实施例作进一步说明。 

实施例一：siRNA真核表达载体体外抑制gI-EGFP和gE-EGFP融合蛋白的表达

1.siRNA的设计：根据siRNA设计原则，从gI和gE mRNA起始密码子AUG下游100nt处搜索AA序列，其3′端相邻19nt序列作为候选靶点，分别选择GC含量在40％-60％的5条siRNA序列，利用GenBank数据库中Blast功能对鸡体内全基因组序列进行比对，确保无相似性。最终选择的siRNA其cDNA序列为sigI735：5′CAATTCCCATGTCGATGCA 3′(SEQ ID NO：1)；sigE936：5′AGATGTCCAGGTAGACGAT 3′(SEQ ID NO：2)，对应gI和gE mRNA的735和936位核苷酸位点。所述sigI735和sigE936反义链分别为5′TGCATCGACATGGGAATTG 3′(SEQ ID NO：3)或5′ATCGTCTACCTGGACATCT 3′(SEQ ID NO：4)。 

2.表达siRNA所需shRNA的合成与制备：

通过一步法PCR扩增含有禽源U6启动子的siRNA表达盒特异性干扰gI和gE基因的cU6-3-shRNA序列。 

(gI基因开放阅读框如下：ATGTATCTACTACAATTATTATTTTGGATCCGCCTCTTTCGAGGCATCTGGTCTATAGTTTATACTGGAACATCTGTTACGTTATCAACGGACCAATCTGCTCTTGTTGCGTTCTGCGGATTAGATAAAATGGTGAATGTACGCGGCCAACTTTTATTCCTGGGCGACCAGACTCGGACCAGTTCTTATACAGGAACGACGGAAATCTTGAAATGGGATGAAGAATATAAATGCTATTCCGTTCTACATGCGACATCATATATGGATTGTCCTGCTATAGACGCCACGGTATTCAGAGGCTGTAGAGACGCTGTGGTATATGCTCAACCTCATGATAGAGTACAACCTTTTCCCGAAAAGGGAACATTGTTGAGAATTGTCGAACCCA GAGTATCAGATACAGGCAGCTATTACATACGTGTAGCTCTCGCTGGAAGAAATATGAGCGATATATTTAGAATGGCTGTTATTATAAGGAGTAGCAAATCTTGGGCCTGTAATCACTCTGCTAGTTCATTTCAGGCCCATAAATGTATTCGCTATGTCGACCGTATGGCCTTTGAAAATTATCTGATTGGACATGTAGGCAATTTGCTGGACAGTGACTCGGAATTGCATGCAATTTATAATATTACTCCCCAATCCATTTCCACAGATATTAATATTATAACGACTCCATTTTACGATAATTCGGGAACAATTTATTCACCTACGGTTTTTAATTTGTTTAATAACAATTCCCATGTCGATGCAATGAATTCGACTGGTATGTGGAATACCGTTTTAAAATATACCCTTCCAAGGCTTATTTACTTTTCTACGATGATTGTACTATGTATAATAGCATTGGCAATTTATTTGGTCTGTGAAAGGTGCCGCTCTCCCCATCGTAGGATATACATCGGTGAACCAAGATCTGATGAGGCCCCACTCATCACTTCTGCAGTTAACGAATCATTTCAATATGATTATAATGTAAAGGAAACTCCTTCAGATGTTATTGAAAAGGAGTTGATGGAAAAACTGAAGAAGAAAGTCGAATTGTTGGAAAGAGAAGAATGTGTATAG(SEQ ID NO：5)； 

gE基因开放阅读框如下：ATGTGTGTTTTCCAAATCCTGATAATAGTGACGACGATCAAAGTAGCTGGAACGGCCAACATAAATCATATAGACGTTCCTGCAGGACATTCTGCTACAACGACGATCCCGCGATATCCACCAGTTGTCGATGGGACCCTTTACACCGAGACGTGGACATGGATTCCCAATCACTGCAACGAAACGGCAACAGGCTATGTATGTCTGGAAAGTGCTCACTGTTTTACCGATTTGATATTAGGAGTATCCTGCATGAGGTATGCGGATGAAATCGTCTTACGAACTGATAAATTTATTGTCGATGCGGGATCCATTAAACAAATAGAATCGCTAAGTCTGAATGGAGTTCCGAATATATTCCTATCTACGAAAGCAAGTAACAAGTTGGAGATACTAAATGCTAGCCTACAAAATGCGGGTATCTACATTCGGTATTCTAGAAATGGGACGAGGACTGCAAAGCTGGATGTTGTTGTGGTTGGCGTTTTGGGTCAAGCAAGGGATCGCCTACCCCAAATGTCCAGTCCTATGATCTCATCCCACGCCGATATCAAGTTGTCATTAAAAAACTTTAAAGCATTAGTATATCACGTGGGAGATACTATCAATGTCTCGACGGCGGTTATACTAGGACCTTCTCCGGAGATATTCACATTGGAATTTAGGGTGTTGTTCCTCCGTTATAATCCAACGTGCAAGTTCGTCACGATTTATGAACCTTGTATATTTCACCCCAAAGAACCAGAGTGTATTACTACTGCAGAACAATCGGTATGTCATTTCGCATCCAACATTGACATTCTGCAGATAGCCGCCGCACGTTCTGAAAATTGTAGCACAGGGTATCGTAGATGTATTTATGACACGGCTATCGATGAATCTGTGCAGG CCAGATTAACATTCATAGAACCAGGAATTCCTTCCTTTAAAATGAAAGATGTCCAGGTAGACGATGCTGGATTGTATGTGGTTGTGGCTTTATACAATGGACGTCCAAGTGCATGGACTTACATTTATTTGTCAACGGTGGAAACATATCTTAATGTATATGAAAACTACCACAAGCCGGGATTTGGGTATAAATCATTTCTACAGAACAGTAGTATCGTCGACGAAAATGAGGCTAGCGATTGGTCCAGCTCGTCCATTAAACGGAGAAATAATGGTACTATCATTTATGATATTTTACTCACATCGCTATCAATTGGGGCGATTATTATCGTCATAGTAGGGGGTGTTTGTATTGCCATATTAATTAGGCGTAGGAGACGACGTCGCACGAGGGGGTTATTCGATGAATATCCCAAATATATGACGCTACCAGGAAACGATCTGGGGGGCATGAATGTACCGTATGATAATACATGCTCTGGTAACCAAGTTGAATATTATCAAGAAAAGTCGGCTAAAATGAAAAGAATGGGTTCGGGTTATACCGCTTGGCTAAAAAATGATATGCCGAAAATTAGGAAACGCTTAGATTTATACCACTGA(SEQ ID NO：6)) 

设计原则如图1所示，以含禽源启动子(cU6-3)的鸡全基因组DNA(登录号：DQ531569)为模板，上游引物与cU6启动子5′端序列(GACTAAGAGCATCGAGACTG)互补，其引物序列为5′AAGCTTCAGACAGACGTCAGGCTTTC 3′；下游引物如表1所示：包含与cU6-3启动子3′端(GACTAAGAGCATCGAGACTG)互补的序列、编码siRNA正义链序列(斜体)、7nt的loop序列(CTCTTGA)、siRNA反义链序列(下划线)和6个连续T为终止信号的序列，此外还加入酶切位点(HindIII)。 

表1MDV gI和gE基因的siRNA下游引物Table.1The MDV gI and gE of siRNAs reverse primers 

注：另外一条无关序列cU6-3-shRNA-control的下游引物为： 

5′AAGCTTAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGT ctcttga  

GACTAAGAGCATCGAGACTG 3′，以此作为该发明的阴性对照序列。 

由上述上下游引物扩增获得cU6-3-shRNAgI97、cU6-3-shRNAgI328、cU6-3-shRNAgI487、cU6-3-shRNAgI735、cU6-3-shRNAgI922和cU6-3-shRNAgE172、cU6-3-shRNAgE328、cU6-3-shRNAgE461、cU6-3-shRNAgE936、cU6-3-shRNAgE1261、cU6-3-conshRNA共11个表达盒，其PCR扩增结果如图2所示。 

3.siRNA表达质粒载体的构建：将上述10个cU6-3-siRNA PCR产物及cU6-3-shRNA-control PCR阴性对照分别与pGEM-T Easy载体(购自Qiagen)连接、转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取单个菌落提取质粒、酶切鉴定，选取鉴定正确的质粒送上海生物工程有限公司进行DNA测序测定，并将测序正确的质粒保存备用。 

4.siRNA表达质粒(p GEM-T-cU6-3-shgI和pGEM-T-cU6-3-shgE)体外抑制gI-EGFP和gE-EGFP融合蛋白表达的实验

(1)报告质粒pEGFP-gE和pEGFP-gI的构建： 

报告质粒为绿色荧光蛋白(EGFP)和gI/gE(具体的基因序列见步骤方法2所示)的融合表达质粒，由gI和gE基因cDNA定向插入pEGFP-Cl(购自Biosciences Clontec)的多克隆位点构建而成，由于EGFP位于gI和gE的上游，且共用一个启动子，故EGFP的表达情况可间接反映gI和gE的表达。其构建方法如下： 

引物设计如表2，gI基因上下游引物分别添加HindIII和KpnI酶切位点；gE基因为BglII和HindIII酶切位点，以MDV-ZY强毒株基因组DNA为模板PCR扩增gI和gE基因(参考MDV超强毒株RB1B登录号AY032626设计引物)，将PCR产物亚克隆到pMD18-T(购自TaKaRa)中构建pMD18-T-gI和pMD18-T-gE。经酶切和测序鉴定正确的质粒与pEGFP-C1用相同的限制性内切酶(gI:HindIII和KpnI；gE:BglII和HindIII)进行双酶切处理。按试剂盒说明书回收gI(1068bp)和gE(1494bp)片段，用T4DNA连接酶将回收的基因片段与线性化的pEGFP-C1载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落接种于含Kan的LB培养液中，37℃振荡培养过夜。提取质粒，进行双酶切鉴定(如图3所示)，并将阳性质粒进行测序，重组质粒命名为pEGFP-gI和pEGFP-gE。 

表2引物扩增表 

(2)siRNA表达盒PCR产物与报告质粒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF) 

将CEF细胞(将SPF(无特定病原)鸡胚胚体经碘酒消毒，无菌取出胚体，去掉头，四肢和内脏，其余肌肉机械法剪碎，以PBS洗去红细胞后用0.5％胰蛋白酶消化，并用吸管吹散成细胞悬液，以PBS洗去胰蛋白酶，用含10％血清的DMEM制备成1×10⁶/ml的细胞悬液)接种24孔细胞培养板(购自Invitrogen)，待细胞密度达到80％-90％时，将siRNA表达盒PCR产物(cU6-3-shRNAgI97、cU6-3-shRNAgI328、cU6-3-shRNAgI487、cU6-3-shRNAgI735、cU6-3-shRNAgI922和cU6-3-shRNAgE172、cU6-3-shRNAgE328、cU6-3-shRNAgE461、cU6-3-shRNAgE936、cU6-3-shRNAgE1261、cU6-3-conshRNA)分别与上述构建的报告质粒pEGFP-gE和pEGFP-gI以Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)共转染CEF细胞，操作方法参照试剂说明书，同时设无关shRNA靶序列的阴性对照组和不转染质粒的空白对照组，每孔设置3个重复。5h后换含10％新生牛血清的DMEM，继续培养。转染48h后分别进行荧光显微镜观察和流式细胞仪分析。pEGFP-gE+cU6-3-shRNAgE936-PCR和pEGFP-gI+ cU6-3-shRNAgI735-PCR共转染细胞组较空白对照组和阴性对照组的特异性荧光强度明显减弱(如图4中R，N)，而其他转染孔中的阳性细胞表达与阴性对照组相比变化不明显，说明pEGFP-gE+cU6-3-shRNAgE936和pEGFP-gI+cU6-3-shRNAgI735转染组中的gE、gI蛋白的表达受到了明显的抑制，而其他gE、gI实验干扰组的gE、gI蛋白的表达与空白对照和阴性对照组相比受到的抑制不明显(如图4所示，其中图4-A为空白对照组，图4-B为gE阴性对照组，图4-C为gI阴性对照组，图4-F-J为gE干扰组、图4-F-J为gI干扰组)。流式细胞仪进行定量检测结果显示，以上两个转染孔荧光阳性细胞数分别为9.3％和8.5％(见图5中R，N)，分别与各自的阴性对照组相比(F：38.1％和K：40.5％)明显减少，这与荧光显微镜观察结果显示相吻合。即初步筛选的干扰序列-cU6-3-shgE936和cU6-3-shgI735抑制蛋白表达作用优于其他干扰实验组序列。 

以上荧光显微镜观察和流式细胞仪分析结果均说明了本研究成功筛选出最佳siRNA序列即：cU6-3-shgI735和cU6-3-shgE936，还建立了一套快速siRNA筛选体系。不仅节省了繁琐的筛选时间，构建过程也简易可行，为开展稳定干扰提供重要意义。 

(3)不同细胞系稳定干扰实验 

将筛选出特异性干扰靶序列的cU6-3-shgI735和cU6-3-shgE936表达盒分别克隆到pGEM-T Easy载体上，经酶切和测序鉴定正确的重组干扰质粒载体分别命名为pGEM-T-cU6-3-shgI735、pGEM-T-cU6-3-shgE936(测序图谱分别见图6、7所示)，分别与报告质粒pEGFP-gE和pEGFP-gI以Lipofectamine 2000共转染鸭胚成纤维传代细胞(DF1)、非洲绿猴肾细胞(Vero)、狗肾细胞(MDCK)(兽医生物技术国家重点实验室购买并保存)：DF1、Vero、MDCK细胞，每孔设3个重复，转染方法与4-2所示相同，分别在转染后48h进行荧光显微镜观察。设pGEM-T-cU6-3-conshRNA阴性对照，观察pGEM-T-cU6-3-shRNA转染细胞培养中的gI和gE融合蛋白表达情况。 

(4)特异性重组干扰质粒在不同细胞系上的干扰活性测定： 

重组干扰质粒载体pGEM-T-cU6-3-shgI735和pGEM-T-cU6-3-shgE936质粒分别与报告质粒pEGFP-gE和pEGFP-gI以Lipofectamine 2000共转染DF1、Vero、MDCK细胞48h后，分别收集各孔细胞，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗2次，并调整细胞密度为10⁵-10⁶cell/ml，用流式细胞仪在488nm激发波长下检测各孔细胞平均荧光强度。如图8-A所示，结果显示，与阴性对照组相比，两重组干扰质粒载体在不同细胞系上均存在抑制效果，但抑制效果不一样。在DF1细胞上，siRNA表达质粒pGEM-T-cU6-3-shRNA，即pGEM-T-cU6-3-shgI735和pGEM-T-cU6-3-shgE936对MDV gI和gE蛋白表达的抑制率((1-实验转染组融合细胞表达量/阴性对照组融合细胞表达量)×100％)分别为87.39％和85.04％；在MDCK细胞上，抑制率分别为76.19％和73.60％；在Vero细胞上，抑制率分别为60.09％和58.57％(如图8-B)。干扰质粒组在DF1细胞上gI和gE蛋白表达均受到了明显的抑制，而在MDCK、Vero细胞中gI和gE蛋白表达也受一定程度的抑制，但抑制效果较前者低，即在相同实验条件下不同细胞上存在一定的细胞种属特异性。结果显示禽源U6启动子在禽源细胞上驱动转录siRNA的活性最佳。 

本研究以gE-EGFP、gI-EGFP融合蛋白作为报告基因，采用DF1、Vero、MDCK稳定表达细胞系，用荧光显微镜观察和流式细胞仪测定表达融合蛋白阳性细胞数，结果表明禽源U6启动子能够驱动基因特异性siRNA在禽源细胞中的表达，进一步确定了筛选出的gE、gI基因特异性siRNA干扰序列的干扰效果；此外还以获得禽U6启动子为目标，通过比较分析禽源U6启动子在不同来源细胞系上的启动siRNA的转录活性，为禽源启动子介导的开发的基因沉默的研究提供参考依据。 

本发明提供了一种快速筛选特异性基因表达抑制的siRNA新思路，不仅节省了繁琐的筛选时间，构建过程也简易可行。 

本发明针对gE和gI基因的siRNA序列，可以通过脂质体、生物材料载体、病毒载体等形式来输送siRNA序列。本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：本发明提供了两条能有效地抑制MDV蛋白基因的siRNA序列，构建了能稳定表达靶基因的表达载体。该载体转染细胞后，通过稳定细胞系来进行筛选，从而得到稳定表达的siRNA的细胞株，并且使得RNA干扰作用持续时间更久，并为运用RNAi手段针对MDV的 新型疫苗研究奠定基础。 

本发明系结合最佳实施例进行描述，在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价形式同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围内。 

Claims (4)

1.一种特异性干扰鸡马立克氏病病毒gE基因的siRNA序列，其特征在于所述siRNA序列为：

sigE936：正义链5′AGATGTCCAGGTAGACGAT 3′；(SEQ ID NO：2)

         反义链5′ATCGTCTACCTGGACATCT 3′。(SEQ ID NO：4)

2.一种包含权利要求1所述的siRNA序列的载体。

3.权利要求2所述的载体，其为真核表达载体。

4.权利要求2的载体，其特征在于所述载体为基于pGEM-T Easy载体构建的载体。

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