CN102824400A - 包含杜仲和续断的组合物及其治疗骨质疏松症的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含杜仲和续断的组合物及其治疗骨质疏松症的用途。所述组合物包含中药材续断和杜仲组合,包括包含续断和杜仲单独提取所得提取物的混合物,或者包含续断和杜仲二者共同提取得到的提取物。该组合物具有良好的治疗骨质疏松症的作用。
Description
技术领域:
本发明涉及中药技术领域,具体涉及一种包含杜仲和续断的组合物,特别是涉及包括中药杜仲和续断的提取物的组合物。该组合物对于骨质疏松症具有较好的治疗作用。
背景技术:
骨质疏松症(ostcoporosis,OP)是一种全身性骨病,以骨量减少、骨的微细结构退化、骨强度降低、脆性增加导致骨折易感性增高为特征的系统性骨胳病变。
类固醇激素17β-雌二醇(estradiol,E2)是许多靶组织生长、分化以及行使生物学功能的关键调节因子。流行病学研究发现,绝经前女性心血管事件低于同年龄男性,而在围绝经期及绝经后女性心血管事件发生高于同年龄男性,提示雌激素在此过程中发挥着重要作用。近年来越来越多的研究发现,雌激素效应异常与许多疾病的病理过程密切相关,如乳腺癌、高血压、动脉粥样硬化、骨质疏松症等。针对雌激素水平低下采用的激素替代疗法(Hormone Replacement Therapy,HRT)已成为临床上一种重要的治疗手段,在过去的二十多年中,HRT一直用来补充绝经后妇女雌激素的分泌不足,改善更年期综合征症状,降低心血管疾病的发生率,预防骨质疏松发生。2003年美国妇女健康协会(Women’s Health Initiative,WHI)临床研究发现,在患有冠心病的老年更年期妇女HRT干预期间虽然降低了骨质疏松和骨折的危险性,但增加乳腺癌、子宫内膜癌的风险性,为此对于HRT或E2研究成为新的热点。与此同时,人们也在致力于寻求雌激素替代物,期望这种替代物既能发挥雌激素对心血管等系统的保护作用,缓解更年期综合征,又能降低肿瘤的风险,这类物质即被称为选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulators,SERMs)。
雌激素的生物学功能主要是通过基因组效应和非基因组效应实现的。基因组效应主要通过雌激素受体α和β(ERα和ERβ)介导:雌激素与ERα(β)结合,引起受体变构形成二聚体,在细胞核内与靶基因调节区的雌激素应答元件(estrogen response element,ERE)直接结合,调节该基因的转录。雌激素除了通过直接调节靶基因的转录发挥生物学效应之外,还可以通过膜受体在细胞内产生一些快速的信号转导,包括生成第二信使、改变离子通道状态、蛋白激酶活化等。这些反应的发生非常迅速,通常在几分钟甚至是几秒钟这样不足以产生新蛋白的时间内完成。雌激素的这种不需要基因转录的快速效应通常被称为“非基因组效应”或“快速反应”。当然,快速反应不但可以引起离子通道改变、NO释放这样的快速反应,也可以通过一系列的信号转导过程将效应信号传导到细胞核内, 引起细胞内基因表达的变化,从而产生长期的效应。
同时雌激素的生物学效应有着细胞差异性。首先ERα和ERβ是不同基因的产物,ERα基因定位于6号染色体的6q 25.1区,由140kb碱基构成,编码595个氨基酸的蛋白质;ERβ基因定位于14号染色体的14q 22-24,由40kb碱基构成,编码530个氨基酸的蛋白质,它们的序列在不同的区域都有一定的同源性。其次在分布和功能上ERα和ERβ也有着相当大的差别,在不同的器官中,使用原位杂交的方法发现,ERαmRNA主要高表达在子宫、睾丸、脑下垂体等,ERβmRNA主要高表达在前列腺、卵巢、肺、血管等。在心血管系统中,研究发现血管平滑肌(VSMC)主要表达ERβ,在VSMC中E2降低了p42/44和p38MAPK活性,通过ERβ抑制平滑肌细胞增殖和迁移;而在内皮细胞(EC)中主要表达ERα,在EC中E2显著诱导p42/44和p38MAPK活性,通过ERα促进EC的增殖、迁移和eNOS表达。在成骨细胞、破骨细胞中,ERα和ERβ均有表达,但是以ERβ为主。在单核巨噬细胞(Raw264.7)中ERα和ERβ亦均有表达。这就意味着同种配体与分布在不同细胞中的ERα和ERβ亚型作用会表现出不同的生物活性,而不同的配体与同种受体亚型作用也可能产生不同的药理作用。目前对雌激素效应的细胞差异性机制尚不十分清楚,以至于在雌激素与相关疾病关系的研究中出现一些混乱,甚至相互矛盾的结果。不能完全解释患者复杂的临床表现、病理改变以及对雌激素类药物的不同治疗反应,使人们对与雌激素相关重大疾病发病机理和治疗药物的研究受到了限制。
骨是雌激素靶组织,雌激素可通过多种途径影响骨代谢。成骨细胞存在雌激素受体(estrogen receptor,ER)、细胞因子(IL-1,TNF,IL-6)受体,ER激活时抑制细胞因子的释放,雌性激素减少后,抑制作用减弱,细胞因子刺激破骨细胞,抑制成骨细胞,导致骨量丧失。补充雌激素可有效防止绝经后骨质疏松症及其相关骨折的发生,但长期应用增加子宫内膜癌和乳腺癌的危险性。
成骨能力下降是骨质疏松症的主要病理基础之一,提高成骨细胞功能及促进骨形成对治疗骨质疏松症有直接意义,研究药物对成骨细胞的作用成为治疗骨质疏松创新药物开发的重要内容。碱性磷酸酶作为骨代谢中分化早期的一个标志性产物,它可以从侧面反映药物对成骨细胞的作用,其活性的高低可反映相应细胞向成骨方向转化的趋势。骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)是重要的骨形成调节因子,能够促进新骨形成,在成骨细胞分化过程中起关键作用,有可能成为骨质疏松症防治药物的重要靶点。结合雌激素受体激活、成骨细胞增殖、碱性磷酸酶活性影响和物质对BMP-2的表达,可以预期物质对骨的影响,从而可以用于治疗骨质疏松创新药物的研发。
本领域仍然期待有新的治疗骨质疏松症的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的治疗骨质疏松症的方法。本发明人使用中药材续断和杜仲组合,或者使用续断和杜仲单独提取所得提取物的混合物,或者使用续断和杜仲二者共同提取得到的提取物,令人惊奇的发现二者配伍使用效果优于单独使用,达到了协同增效的治疗效果。本发明基于此发现而得以完成。
为此,本发明第一方面提供了组合物,其包括中药材续断和杜仲。
根据本发明第一方面的组合物,其中所述续断和杜仲二者重量比是(0.01~100):1,或者(0.02~50):1,或者(0.05~20):1,或者(0.1~10):1,或者(0.2~5):1。
根据本发明第一方面的组合物,其是由中药材续断和杜仲制备得到的。在一个实施方案中,所述续断和杜仲二者重量比是(0.01~100):1,或者(0.02~50):1,或者(0.05~20):1,或者(0.1~10):1,或者(0.2~5):1。
根据本发明第一方面的组合物,其包括续断和杜仲的提取物。在一个实施方案中,所述提取物是续断和杜仲分别提取得到的各自的提取物,然后按药材重量比混合得到的。在一个实施方案中,所述提取物是续断和杜仲一起提取得到的。在一个实施方案中,所述分别或一起提取得到的提取物,所用药材续断和杜仲二者重量比是(0.01~100):1,或者(0.02~50):1,或者(0.05~20):1,或者(0.1~10):1,或者(0.2~5):1。
根据本发明第一方面的组合物,其中所述续断提取物是通过用水或含水乙醇提取,再任选地用碱处理和/或大孔树脂处理后,浓缩得到的。在一个实施方案中,所述含水乙醇是30%~95%乙醇,优选50%~90%乙醇。
根据本发明第一方面的组合物,其中所述杜仲提取物是通过水或含水乙醇提取后浓缩得到的。在一个实施方案中,所述含水乙醇是30%~95%乙醇,优选50%~90%乙醇,优选50%~80%乙醇,优选60%~80%乙醇。
根据本发明第一方面的组合物,其中所述续断和杜仲二者一起提取得到提取物。在一个实施方案中,该提取物所用药材续断和杜仲二者重量比是(0.01~100):1,或者(0.02~50):1,或者(0.05~20):1,或者(0.1~10):1,或者(0.2~5):1。在一个实施方案中,所述提取物是续断和杜仲二者一起用水或含水乙醇提取后浓缩得到的。在一个实施方案中,所述提取物是续断和杜仲二者一起用水或含水乙醇提取,再任选地用碱处理和/或大孔树脂处理后,浓缩得到的。在一个实施方案中,所述含水乙醇是30%~95%乙醇,优选50%~90%乙醇。
根据本发明第一方面的组合物,其中包含至少一种选自下列的物质:葳岩仙皂苷A、3-O-a-L-吡喃阿拉伯糖-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、马钱子苷(Loganin)、裂马钱素苷、triplostoside A、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、白桦脂酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷、丁香脂素单葡萄糖苷、汉黄芩素、千叶素A、黄芩素、二氢查耳酮3-O-β-D-葡萄糖苷、α-氧-β-D-葡萄吡喃糖基-4,2′,4′-三羟基二氢查耳酮、绿原酸、木通皂苷D。根据本发明第一方面的组合物,其中包含至少一种选自下列的物质:葳岩仙皂苷A、3-O-a-L-吡喃阿拉伯糖-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、马钱子苷(Loganin)、裂马钱素苷、triplostoside A、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、白桦脂酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷、丁香脂素单葡萄糖苷、汉黄芩素、千叶素A、黄芩素、二氢查耳酮3-O-β-D-葡萄糖苷、α-氧-β-D-葡萄吡喃糖基-4,2′,4′-三羟基二氢查耳酮、绿原酸、木通皂苷D,并且当存在它们的二种以上时,它们任意两者之间的重量比率为0.0001~10000:1。
本发明第二方面提供了本发明第一方面所述组合物在制备用于治疗和/或预防骨质疏松症的药物中的用途。
本发明第二方面还提供了本发明第一方面所述组合物在制备用于治疗和/或预防骨病的药物中的用途。
本发明第二方面还提供了本发明第一方面所述组合物在制备用于治疗和/或预防绝经后认知缺陷疾病的药物中的用途。
本发明第三方面提供了一种药物组合物,其中包含本发明第一方面所述组合物,以及药学可接受的载体。
根据本发明第三方面的药物组合物,其中包含至少一种选自下列的物质:葳岩仙皂苷A、3-O-a-L-吡喃阿拉伯糖-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、马钱子苷(Loganin)、裂马钱素苷、triplostoside A、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、白桦脂酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷、丁香脂素单葡萄糖苷、汉黄芩素、千叶素A、黄芩素、二氢查耳酮3-O-β-D-葡萄糖苷、α-氧-β-D-葡萄吡喃糖基-4,2′,4′-三羟基二氢查耳酮、绿原酸、木通皂苷D。
根据本发明第三方面的药物组合物,其中包含至少一种选自下列的物质:葳岩仙皂苷A、3-O-a-L-吡喃阿拉伯糖-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、马钱子苷(Loganin)、裂马钱素苷、triplostoside A、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、白桦脂酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷、 丁香脂素单葡萄糖苷、汉黄芩素、千叶素A、黄芩素、二氢查耳酮3-O-β-D-葡萄糖苷、α-氧-β-D-葡萄吡喃糖基-4,2′,4′-三羟基二氢查耳酮、绿原酸、木通皂苷D,并且当存在它们的二种以上时,它们任意两者之间的重量比率为0.0001~10000:1。
根据本发明第三方面的药物组合物,其是用于治疗和/或预防骨质疏松症、骨病、绝经后认知缺陷疾病的药物。
根据本发明第三方面的药物组合物,其是呈片剂、胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、外用药剂、注射制剂等形式。
具体实施方式
A、续断部分
续断例1:续断提取物的制备和含量测定
制备方法:
步骤(i)取10千克续断药材(购自河北安国祁新中药颗粒饮片有限公司)粉碎成粗粉(不加筛网),用10倍量70%乙醇提取,回收乙醇得到浸膏;
步骤(ii)取步骤(i)所得浸膏水溶液用氢氧化钠(加至水相量的2%)在60°C处理2小时,加适量盐酸中和;
步骤(iii)使上述中和液过D101大孔树脂分离,50%乙醇洗脱,洗脱液干燥,即为本发明的续断提取物。
经HPLC法测定,其中包含12.6%化合物①、3.6%化合物②、4.2%化合物③、4.3%化合物④、和3.5%化合物⑤。其中化合物①为葳岩仙皂苷A、化合物②为3-O-a-L-吡喃阿拉伯糖-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、化合物③为马钱子苷(Loganin)、化合物④为裂马钱素苷、化合物⑤为triplostoside A。
续断例2:续断提取物的制备和含量测定
制备方法:
步骤(i)取1千克续断药材(购自河北安国祁新中药颗粒饮片有限公司)粉碎成粗粉(不加筛网),用10倍量60%乙醇提取,回收乙醇得到浸膏;
步骤(ii)取步骤(i)所得浸膏水溶液用氢氧化钠(加至水相量的2%)在60°C处理2小时,加适量盐酸中和;
步骤(iii)使上述中和液过D101大孔树脂分离,80%乙醇洗脱,洗脱液干燥,即为本发明的续断提取物。
经HPLC法测定,其中包含9.8%化合物①、3.7%化合物②、2.9%化合物③、3.4%化合物④、和6.1%化合物⑤。
续断例3:续断提取物的制备和含量测定
制备方法:
步骤(i)取10千克续断药材(购自河北安国祁新中药颗粒饮片有限公司)粉碎成粗粉(不加筛网),用10倍量80%乙醇提取,回收乙醇得到浸膏;
步骤(ii)将该浸膏加适量水分散,再用乙酸乙酯萃取,得到乙酸乙酯部分;
步骤(iii)萃取所得水相用氢氧化钠(加至水相量的2%)在60°C处理2小时,加适量盐酸中和;
步骤(iv)使上述中和液过D101大孔树脂分离,依次用20%乙醇、50%乙醇、80%乙醇洗脱,取80%乙醇洗脱级分,干燥,即为本发明的续断提取物。
经HPLC法测定,其中包含17.6%化合物①、6.6%化合物②、9.2%化合物③、14.7%化合物④、和8.3%化合物⑤。
续断例4:续断提取物的制备和含量测定
制备方法基本上参考提取物例3,不同之处是步骤(i)用10倍量50%乙醇,步骤(iii)用氢氧化钾(加至水相量的1%)在50°C处理5小时,步骤(iv)用D201大孔树脂并依次用15%乙醇、55%乙醇、75%乙醇洗脱。75%乙醇洗脱级分经干燥,即得本发明续断提取物。
经HPLC法测定,其中包含15.4%化合物①、7.2%化合物②、3.1%化合物③、4.7%化合物④、和7.4%化合物⑤。
续断例5:续断提取物的制备和含量测定
制备方法基本上参考提取物例1,不同之处是步骤(i)用10倍量90%乙醇,步骤(iii)用碳酸氢钠(加至水相量的5%)在80°C处理2小时,步骤(iv)用AB-8大孔树脂并依次用25%乙醇、85%乙醇洗脱。85%乙醇洗脱级分经干燥,即得本发明提续断提取物。
经HPLC法测定,其中包含16.3%化合物①、5.6%化合物②、7.2%化合物③、11.8%化合物④、和6.9%化合物⑤。
续断例6:续断提取物的制备和含量测定
称取1000g续断药材,不加筛网过粉碎机,80%乙醇提取三次,每次2h,10倍量溶剂,合并提取液,回收乙醇浓缩至尽,真空干燥得续断提取物。HPLC含量测定含有9.8%木通皂苷D,1.2%化合物①。
续断例7:续断提取物的制备和含量测定
称取1000g续断药材,不加筛网过粉碎机,50%乙醇提取三次,每次2h,10倍量溶剂,合并提取液,回收乙醇浓缩至尽,真空干燥得续断提取物。HPLC含量测定含有7.8%木通皂苷D,0.82%化合物①。
续断例8:单体化合物的制备
取上文续断例1所得续断提取物,采用制备型HPLC法并参考上文测定提取物含量的HPLC法,分别制得化合物①、化合物②、化合物③、化合物④、和化合物⑤。五种化合物的纯度分别为98.8%、99.8%、97.3%、97.8%、和99.1%。
续断例9:单体化合物的表征
各化合物的结构确证委托天津大学分析测试中心进行检测,结果如下:
化合物①,经鉴定为葳岩仙皂苷A(cauloside A),白色粉末(丙酮),mp239-241℃,易溶于丙酮和甲醇,1H-NMR(吡啶-d5)δ:5.47(1H,brs,H-12),4.99(1H,d,J=8Hz,H-1′),1.22、1.02、0.99、0.93、0.92、0.91(3H,s,6×CH3);13C-NMRδ:38.8(C-1),26.1(C-2),82.0(C-3),43.5(C-4),47.6(C-5),18.2(C-6),32.9(C-7),39.8(C-8),48.2(C-9),37.0(C-10),23.7(C-11),122.6(C-12),144.9(C-13),42.2(C-13),28.3(C-14),28.3(C-15),23.9(C-16),46.7(C-17),42.0(C-18),46.5(C-19),30.9(C-20),34.2(C-21),33.2(C-22),64.5(C-23),13.6(C-24),16.1(C-25),17.5(C-26),26.2(C-27),180.3(C-28),33.2(C-29),23.6(C-30),106.6(C-1′),73.1(C-2′),74.7(C-3′),69.6(C-4′),66.9(C-5′)。以上理化数据及波谱数据与文献基本一致。结构如下。
其中R1=a-L-Ara;R2=H;R3=CH2OH。
化合物②,经鉴定为3-O-a-L-吡喃阿拉伯糖-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷,白色针状晶体(甲醇),mp227-230℃,易溶于甲醇,不溶于氯仿和丙酮,1H-NMR(吡啶-d5)δ:6.30(1H,d,J=8.5Hz,H-1′),5.41(1H,brs,H-12),4.95(1H,d,J=7.0Hz,H-1″),1.16、1.10、0.94、0.90、0.87、0.85(3H,s,6×CH3);13C-NMRδ:39.1(C-1),26.4(C-2),17.9(C-3),43.8(C-4),47.9(C-5),18.5(C-6),33.4(C-7),40.3(C-8),48.5(C-9),37.2(C-10),24.2(C-11),123.2(C-12),144.4(C-13),42.4(C-14),28.6(C-15),23.7(C-16),47.3(C-17),42.0(C-18),28.6(C-15),23.7(C-16),47.3(C-17),42.0(C-18),46.5(C-19),31.1(C-20),34.3(C-21),32.8(C-22),64.8(C-23),13.9(C-24),16.5(C-25),17.9(C-26),26.4(C-27),176.8(C-28),33.1(C-29),24.0(C-30),107.0(C-1′),73.4(C-2′),75.0(C-3′),70.0(C-4′),67.3(C-5′),96.0(C-1″),74.4(C-2″),79.6(C-3″),71.4(C-4″),79.2(C-5″),62.5(C-6″)。波谱学与文献中的1H-NMR和13C-NMR数据基本一致,其结构如下:
其中:R1=a-L-Ara;R2=β-D-Glc(1-6)β-D-Glc;R3=H。
化合物③,经鉴定为马钱子苷(Loganin),淡黄色粉末,溶于甲醇。1H-NMR(CD3OD)δ:5.22(1H,d,J=4.0Hz,H-1),7.33(1H,d,J=1.0Hz,H-3),1.04(3H,d,J=7.0Hz,H-10),3.63(3H,s,OCH3);4.59(1H,d,J=8.0Hz,H-1′);13C-NMR(CD3OD)δ:97.8(C-1),150.9(C-3),112.8(C-4),31.0(C-5),41.5(C-6),73.9(C-7),41.0(C-8),45.3(C-9),12.3(C-10),168.3(C-11),50.5(C-12),98.8(C-1′),73.5(C-2′),77.2(C-3′),70.4(C-4′),76.8(C-5′),61.6(C-6′)。波谱学与文献中的1H-NMR和13C-NMR数据基本一致,其结构如下:
白色针状结晶(甲醇),Molish反应显阳性,酸水解后糖部分经薄层色谱检识证明仅含有D-葡萄糖。1H-NMR(CD3OD):7.59(1H,s,H-3),5.79(1H,br.s,H-7),5.16(1H,d,J=7.8Hz,H-1),4.70(1H,d,J=8.0Hz,H-1′),4.19(2H,q,H-10),3.70(3H,s,H-12),2.70(2H,t,J=16.0Hz,H-6),2.10(1H,q,H-5)。13C-NMR(CD3OD):98.1(C-1), 153.9(C-3),106.1(C-4),28.5(C-5),25.9(C-6),69.7(C-7),133.3(C-8),43.8(C-9),120.8(C-10),168.5(C-11),99.8(C-1′),74.8(C-2′),78.4(C-3′),71.6(C-4′),77.9(C-5′),62.7(C-6′)。以上理化数据及波谱数据与文献一致。
化合物⑤,经鉴定为triplostoside A,白色粉末,溶于甲醇。1H-NMR(CD3OD)δ:单元A 5.47(1H,d,J=5.5Hz,H-1),7.39(1H,s,H-3),2.86(1H,brq,J=7.0Hz,H-5),1.66-1.73(1H,m,H-6);1.98-2.05(1H,m,H-6),4.46(1H,dd,J=4.5Hz,H-7)5.65-5.71(1H,m,H-8),2.61-2.65(1H,m,H-9),4.46(1H,d,J=7.0,H-1′),3.30(6H,s,2×OCH3);单元B5.25(1H,d,J=4.5Hz,H-1),7.37(1H,s,H-3),3.10(1H,dd,J=4.0,8.4Hz,H-5),1.59-1.67(1H,m,H-6);2.00-2.07(1H,m,H-6),4.46(1H,dd,J=4.4,H-7),4.46(1H,d,J=6.8,H-1′)3.63(3H,s,OCH3);13C-NMR(CD3OD)δ:单元A 97.9(C-1),153.3(C-3),113.3(C-4),29.5(C-5),33.3(C-6),104.3(C-7),135.9(C-8),45.4(C-9),119.9(C-10),169.4(C-11),53.7(OCH3),52.8(OCH3),100.1(C-1′),74.7(C-2′),78.0(C-3′),71.6(C-4′),78.4(C-5′),62.8(C-6′);单元B 97.5(C-1),152.6(C-3),112.0(C-4),32.6(C-5),40.3(C-6),78.4(C-7),41.0(C-8),47.1(C-9),13.9(C-10),168.3(C-11),51.8(OCH3),100.0(C-1′),74.6(C-2′),78.0(C-3′),71.5(C-4′),78.4(C-5′),62.7(C-6′)。波谱学与文献中的1H-NMR和13C-NMR数据基本一致,triplostoside A的结构下:
其中竖线左侧为单元A,竖线右侧为单元B。
B、杜仲部分
杜仲例1:杜仲提取物的制备和含量测定
杜仲药材500g,加入5000ml 70%乙醇回流提取两次,每次2小时,合并提取液过 滤后浓缩至尽,真空干燥得杜仲提取物。
经检测,该提取物中京尼平和京尼平苷的量分别为0.214%,0.488%。
另外经检测,发现该提取物中下列物质的量为京尼平苷酸0.925%,绿原酸0.302%,松脂醇二葡萄糖苷0.99%,丁香脂素二葡萄糖苷0.34%。
杜仲例2:杜仲提取物的制备和含量测定
杜仲药材500g,加入5000ml 70%乙醇回流提取两次,每次2小时,合并提取液过滤后浓缩至尽,然后均分成两份,分别用乙酸乙酯和正丁醇进行萃取,干燥,得到两种萃取物分别作为本发明的杜仲提取物。
经检测,乙酸乙酯萃取的提取物中,京尼平和京尼平苷的量分别为1.14%、12.38%;正丁醇萃取的提取物中,京尼平和京尼平苷的量分别为9.4%、0.89%。
另外经检测,以上两种提取物中含有分别为0.41~6.7%的下列物质:京尼平苷酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷。
杜仲例3:杜仲提取物的制备和含量测定
杜仲药材500g,加入5000ml 85%乙醇回流提取两次,每次2小时,合并提取液过滤后浓缩至尽,得醇提浓缩液。使该浓缩液上D101大孔吸附树脂,用20-80%乙醇洗脱,收集京尼平、京尼平苷两者含量高的洗脱液,浓缩,干燥,得提取物。
经检测,该提取物中,京尼平和京尼平苷的量分别为16.2%、7.8%。
杜仲例4:从杜仲制备京尼平和京尼平苷化合物并对其表征
将31.5千克杜仲药材(购自河南信阳药材公司)剪成小块,加入315升95%乙醇浸泡过夜,回流提取2小时,倾出提取液,药渣再加入315升95%乙醇回流提取2小时,提取液合并后过滤,续滤液回收乙醇,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取,分别回收溶剂后得固形物。结果:石油醚部分固形物153g,氯仿部分固形物384g,乙酸乙酯部分固形物126g,正丁醇部分固形物520g。
杜仲乙酸乙酯萃取部分,通过硅胶柱层析,采取氯仿:甲醇溶剂系统梯度洗脱,19~27馏分再利用硅胶柱层析,通过石油醚-乙酸乙酯溶剂系统梯度洗脱,得到粉末状物质,经鉴定为京尼平。
杜仲正丁醇部分500g过D101大孔吸附树脂后,30%部分130g进行硅胶柱色谱分离,EtOAc:CH3OH溶剂系统梯度洗脱,18~20流分以CHCl3:CH3OH:H2O系统进行硅胶柱层析,所得8~14流分中有白色粉末析出,标记为EUB30-1,跟文献值比对后,确定EUB30-1为京尼平苷。
京尼平,白色粉末。1H-NMR(CD3OD,500MHz):δ4.18(1H,d,J=8.0Hz,H-1),7.53(1H,s,H-3),3.14(1H,m,H-5),2.83(1H,m,H-6),2.03(1H,m,H-6),5.83(1H,s,H-7),2.47(1H,t,J=8.5Hz,H-9),4.25(2H,dd,J=14.5Hz,H-10),3.71(3H,s,-OCH3)。
京尼平苷,白色针状结晶(甲醇),mp为159~160℃,Molish反应显阳性,酸水解后糖部分经薄层色谱检识证明仅含有D-葡萄糖。1H-NMR(CD3OD):7.51(1H,s,H-3),5.79(1H,br.s,H-7),5.16(1H,d,J=7.8Hz,H-1),4.70(1H,d,J=8.0Hz,H-1′),4.19(2H,q,H-10),3.70(3H,s,H-12),2.70(2H,t,J=16.0Hz,H-6),2.10(1H,q,H-5)。13C-NMR(CD3OD):98.2(C-1),153.4(C-3),112.5(C-4),39.7(C-5),36.6(C-6),128.3(C-7),144.8(C-8),47.0(C-9),61.4(C-10),169.5(C-11),51.7(C-12),100.3(C-1′),74.8(C-2′),78.4(C-3′),71.5(C-4′),77.8(C-5′),62.6(C-6′)。以上理化数据及波谱数据与文献一致,鉴定化合物为京尼平苷。
C、续断杜仲复方组合提取物(在本文亦可称为复方杜仲药物组合物)制备例:
组合例1:复方杜仲药物组合物的制备及检测
500g杜仲和500g续断混合,加入10倍量60%乙醇提取两次,每次2h,合并提取液回收乙醇并浓缩至尽真空干燥得组合提取物。经检测,该提取物中,包含5.7%木通皂苷D,1.2%的松脂醇二葡萄糖苷。
组合例2:复方杜仲药物组合物的制备及检测
50g杜仲和500g续断混合,加入10倍量水提取两次,每次2h,合并提取液浓缩至尽真空干燥得组合提取物。经检测,该提取物中,包含3.9%木通皂苷D,0.9%的松脂 醇二葡萄糖苷。
组合例3:复方杜仲药物组合物的制备及检测
500g杜仲和50g续断混合,加入10倍量85%乙醇提取两次,每次2h,合并提取液浓缩至尽真空干燥得组合提取物。经检测,该提取物中,包含4.6%木通皂苷D,1.6%的松脂醇二葡萄糖苷。
组合例4:复方杜仲药物组合物的制备及检测
500g杜仲和500g续断混合,加入10倍量70%乙醇提取两次,每次2h,合并提取液回收乙醇至无醇味。溶液加入4%氢氧化钠调节pH值至10-11,加热至60℃持续4h,用10%盐酸溶液调节pH值至中性。浓缩干燥得组合提取物。
组合例5:复方杜仲药物组合物的制备及检测
500g杜仲和500g续断混合,加入10倍量70%乙醇提取两次,每次2h,合并提取液回收乙醇至无醇味。溶液加入4%氢氧化钠调节pH值至10-11,加热至60℃持续4h,用10%盐酸溶液调节pH值至中性。溶液上D101大孔吸附树脂,弃去水流出液和水洗脱液,70%乙醇洗脱液浓缩干燥得组合提取物。
药效试验部分:
试验例1:细胞增殖试验
1、细胞培养及药物处理
MC3T3-E1细胞以含10%FBS的α-MEM含核苷培养液常规培养,至80%融合时用0.25%胰酶消化,以8000个细胞/孔接种于96孔板。置于37℃,5%CO2培养箱中培养24h后,细胞贴壁良好,铺展生长。此时吸去培养液,用PBS液1mL/孔洗涤1次,加入含1%FBS的α-MEM含核苷培养液1mL,预培养24h,进行同步化。更新实验培养液,并同时加入不同浓度药物。同时每块96孔板都设空白对照组(0.1%DMSO)、雌 二醇(E2)组(10-8M)、药物各浓度组,培养24h。
2、细胞增殖率检测
细胞的增殖需要大量的能量,以供合成各种大分子物质和完成分裂过程。因此,细胞能量代谢的水平可以间接反应细胞增殖的情况。活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶能催化MTT形成蓝色的甲臜,且其形成量与活细胞数和功能状态呈正相关。甲臜可溶于DMSO,呈紫色,其显色程度可以反映细胞的存活及增殖。本实验采用此法来测定药物对细胞增殖的影响。具体操作步骤如下:
①.用0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化细胞,1000rpm离心5min,弃去上清,用细胞培养液混匀制成细胞悬液。
②.细胞计数:取10μL混匀的细胞悬液,滴加于盖有盖玻片的细胞计数板上,在显微镜下计数。
③.将细胞接种于96孔板中,每孔0.2mL培养液。置于37℃,5%CO2培养培养箱中培养。
④.培养24h后,每孔加MTT溶液(5mg/mL用PBS溶解,pH=7.4)20μL。继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液。每孔加100μL DMSO,振荡10分钟,使结晶物充分溶解,溶液为紫红色。
⑤.选择570nm波长,在多功能读板机上测定各孔光吸收值(以A表示),记录结果,以空白组为标准,计算各组细胞相对增殖率(relative proliferative effect,RPE),其计算方法为:
RPE=(A样品/A对照)×100%
3、药物对MC3T3-E1细胞增殖影响的结果
续断提取物(续断例1,100、50、5μg/ml)、杜仲提取物(杜仲例1,100、50、5μg/ml)、复方杜仲提取物(组合例1,100、50、5μg/ml),均可浓度依赖性地促进MC3T3-E1成骨细胞增殖(表1),与空白对照组比较,具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。试验中同时使用雌二醇(E2)作为对照,并且复方给药成骨细胞增殖效果优于单一药物给药。
表1:药物对MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响
*P<0.05,**P<0.01,与对照相比(n=6)
#为续断和杜仲各500克药材提取得到的提取物;##为续断1000克药材提取得到的提取物;###为杜仲1000克药材提取得到的;表示各种提取物以总重量相当量的试药量进行试验。
结果以细胞增殖的百分数表示。单独用DMSO(10-8moL/L)孵育作为100%,提试药与对照有显著差异(*p<0.05,**p<0.01,各自n=6)。
在另外的平行试验中,本发明人用组合例4和5分别进行试验。结果显示,在使用与以上表1所示组合例1相同剂量下,组合例4和5在各剂量下均比组合例1的RPE结果高7~16%。可见,用碱处理过的复方杜仲药物组合物效果优于制备过程中未用碱处理的复方杜仲药物组合物。
试验例2:药物雌激素受体激活试验
在37℃,5%CO2的条件下,在细胞培养箱中使用含有10%小牛血清的无酚红高糖DMEM培养液培养Hela细胞,至细胞密度90%左右时将细胞按60%密度铺于96孔板中,每孔中加入含10%血清的无酚红DMEM培养液150ul,培养过夜。按96孔板每孔100ul无血清DMEM培养基,0.4μg质粒(ptk-ERE-luc2μg,tk-Renila1μg,ERα或ERβ1μg)进行转染。转染6个小时后,每孔加入150ul无血清无酚红DMEM培养液。选取每组三个孔,加入10-8M雌二醇E2,以及不同浓度的受试物15ul/孔(样品高、中、低三个浓度组),37℃,5%CO2条件下继续培养24小时。24小时后每孔加入80μl细胞裂解液,并冻融细胞一次以使其充分裂解。对每孔的细胞裂解液分别测定其对萤火虫萤光素酶及Renila萤光素酶的活性。每 孔均用萤火虫萤光素酶/Renila萤光素酶值作为结果,分别以各组中未加雌激素处理的孔作为对照,计算加雌激素或被测物组相对于对照组的比值,每组三个孔取平均值。结果如表2所示:
表2杜仲续断提取物以及复方杜仲方对雌激素受体的激活作用
*p<0.05,**p<0.01
表中,“杜仲提取物”是杜仲例1提取物,“续断提取物”是续断例1提取物,“复方杜仲方”是组合例1的提取物。
结果表明杜仲提取物和复方杜仲提取物具有雌激素受体激活作用,并且复方杜仲提取物雌激素受体激活效果显著优于单一杜仲提取物。结果提示更为有意义的是,与杜仲提取物相比复方杜仲方药物组合物ERβ/ERα比值增大,说明本发明药物组合物对ERβ的选择性激活作用增强,这就使本发明药物组合物在起到拟雌激素作用的同时,降低了促进乳腺癌细胞增殖的风险,适合于长期使用。在另外平行的分别用组合例2和3的试验中,结果显示出与用组合例基本相同的结果。
试验例3:药物对整体动物骨质疏松预防和治疗试验
实验动物:选择健康的6月龄经产雌性SPF级Sprague-Dawley大鼠(SD),平均体重270士50g。分组如下:
Sham组:假手术组;
OVX组:去卵巢组;
杜仲提取物组:去卵巢+杜仲提取物;
续断提取物组:去卵巢+续断提取物;
复方杜仲组:去卵巢+复方杜仲药物组合物;
实验所采用的6月龄的SD大鼠,于卵巢切除手术后7天开始进行阴道涂片检查。去势手术前阴道涂片显示动情周期存在,术后仅能观察到动情后期和动情间期的白细胞,动情周期消失,标志OVX手术成功。卵巢去势第3周开始,持续给药6周。
本发明中药组合物对骨密度的影响
解剖并分离右侧胫骨,迅速剔除所附着的肌肉和肌键,软组织剔除干净但尽量不破坏骨膜。然后放入70%酒精溶液中固定1周,用于外周骨定量计算机体层摄影(pQCT)测定。先对胫骨样品纵向扫描,显示胫骨近端的形态后,以骨骺线为基点向下3.0mm和12.0mm处作断层测定,前者以松质骨为主,后者密质骨为多,可以反映被试化合物对骨组织不同部位结构的影响。
检测部位距骨骺线3.0mm处骨密度结果显示,大鼠去卵巢后骨小梁密度、总骨密度降低,但皮质骨密度无明显改变。给予本发明中药组合物治疗后,骨小梁密度及总骨密度都得到增加,并且复方杜仲药物组合物组增加程度明显优于单独续断组,更优于单独杜仲组。
试验例4杜仲丸及其组成药物对老年性骨质疏松模型小鼠骨质疏松的影响
1.1实验方法
1.1.1实验动物与分组给药
清洁级6月龄快速老化骨质疏松模型小鼠SAMP650只,正常同源对照小鼠SAMR1 10只,雄性,SAMP6小鼠按体重随机分为SAMP6模型组,杜仲丸6g组,杜仲丸3g组,杜仲3g组,续断3g组,SAMR1对照组,SAMP6模型组分别灌服蒸馏水,各组用药量见表3,灌胃给药12周。其中,杜仲丸组使用组合例1的组合物,杜仲组使用杜仲例1的提取物,续断组使用续断例1的提取物。
表3杜仲丸及组成单味药各组小鼠用药量
1.1.2实验主要仪器
骨密度测定采用瑞士Scanco Medical AG公司的Micro-CT(vivaCT40)检测。
2.1实验结果
表4杜仲丸对SAMP6小鼠股骨干骺端骨密度骨和体积分数的影响(mean±SD)
组别 | n | BMD(mg/ccm) | TMD(mg/ccm) | BV/TV(%) |
SAMR1对照组 | 10 | 778.36±14.66 | 463.27±19.28 | 61.16±2.41 |
SAMP6模型组 | 10 | 740.79±17.85 | 395.75±34.85 | 55.66±3.79 |
杜仲丸6g组 | 10 | 764.17±16.98 | 459.87±29.56 | 60.94±3.85 |
杜仲丸3g组 | 9 | 748.77±13.45 | 428.88±26.64 | 59.16±3.88 |
杜仲3g组(DZ) | 10 | 749.19±8.44 | 396.95±31.98 | 56.40±3.02 |
续断组3g组(XD) | 10 | 740.70±15.13 | 396.48±22.96 | 55.28±2.14 |
试验例5SAMP6小鼠Morris水迷宫实验结果
2.1实验方法
2.1.1实验动物与分组给药
同1.1.1
2.1.2水迷宫实验隐藏平台获得实验方法
将平台置于任一象限中央且位置保持不变,每天训练4次,每次60s,共进行5天。将动物面向池壁上放入水中,动物寻找爬上平台并在平台滞留满2s为实验成功,记录所需时间即逃避潜伏期(escapelateney)。如果动物在60s内未找到平台,由实验者将其引导至平台,逃避潜伏期记为60s。不论动物是否成功寻找到平台均让小鼠在台上停留20s,将小鼠放回笼中休息30s后,进行下一次训练。4次训练完成后,迅速将动物洗净擦干,置于加热器旁烘干。其中,杜仲丸组使用组合例1的组合物,杜仲组使用杜仲例1的提取物,续断组使用续断例1的提取物。结果见下表。
表5杜仲丸及组成单味药对SAMP6小鼠逃避潜伏期(s)的影响(mean±SD)
表中,#表示P<0.05,##表示P<0.01,与SAMP6模型组相比。
结果表明:SAMP6存在骨老化同时,也表现出认知记忆受损的脑老化现象。杜仲丸能显著缩短SAMP6小鼠隐蔽平台获得实验逃避潜伏期,提示杜仲丸能够显著改善实验动物的学习记忆能力,对于老年人尤其是老龄化妇女因雌激素确实造成的骨质疏松并发脑老化有显著的改善作用,有望开发为相应的药物。
申请人在另外的试验中,使用组合例4的复方杜仲药物组合物作为试验试药,以CN1448176A实施例1得到的胶囊剂作为对照试药,以诊断为骨质疏松症就诊病人作为临床观察对象,共86例收治患者均分为2组。治疗方法:诊断为骨质疏松症的病人,以上述试验试药和对照试药为主,结合临床症状配合相应的药物治疗。药物用法:对照试药胶囊剂每日3次,每次4粒;试验试药每天服用与对照试药中相当剂量的杜仲和续断,分3次服。结果:试验试药组总有效率86.1%,试验试药组总有效率85.6%,二者基本相同。
Claims (12)
1.一种组合物,其包括中药材续断和杜仲;进一步地,其中所述续断和杜仲二者重量比是(0.01~100):1。
2.根据权利要求1的组合物,其是由中药材续断和杜仲制备得到的,所述续断和杜仲二者重量比是(0.01~100):1。
3.根据权利要求1至2任一项的组合物,其包括续断和杜仲的提取物。进一步地,所述提取物是续断和杜仲分别提取得到的各自的提取物,然后按药材重量比混合得到的;或者,所述提取物是续断和杜仲一起提取得到的。
4.根据权利要求3的组合物,其中:
所述续断提取物是通过用水或含水乙醇提取,再任选地用碱处理和/或大孔树脂处理后,浓缩得到的;
所述杜仲提取物是通过水或含水乙醇提取后浓缩得到的;或者
所述提取物是续断和杜仲二者一起用水或含水乙醇提取后浓缩得到的。
5.根据权利要求1至4任一项的组合物,其中包含至少一种选自下列的物质:葳岩仙皂苷A、3-O-a-L-吡喃阿拉伯糖-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、马钱子苷(Loganin)、裂马钱素苷、triplostoside A、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、白桦脂酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷、丁香脂素单葡萄糖苷、汉黄芩素、千叶素A、黄芩素、二氢查耳酮3-O-β-D-葡萄糖苷、α-氧-β-D-葡萄吡喃糖基-4,2′,4′-三羟基二氢查耳酮、绿原酸、木通皂苷D。
6.根据权利要求1至4任一项的组合物,其中包含至少一种选自下列的物质:葳岩仙皂苷A、3-O-a-L-吡喃阿拉伯糖-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、马钱子苷(Loganin)、裂马钱素苷、triplostoside A、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、白桦脂酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷、丁香脂素单葡萄糖苷、汉黄芩素、千叶素A、黄芩素、二氢查耳酮3-O-β-D-葡萄糖苷、α-氧-β-D-葡萄吡喃糖基-4,2′,4′-三羟基二氢查耳酮、绿原酸、木通皂苷D,并且当存在它们的二种以上时,它们任意两者之间的重量比率为0.0001~10000:1。
7.权利要求1至6任一项的组合物在制备用于治疗和/或预防骨质疏松症的药物中的用途,或者在制备用于治疗和/或预防骨病的药物中的用途,或者在制备用于治疗和/或预防绝经后认知缺陷疾病药物中的用途。
8.一种药物组合物,其中包含权利要求1至6任一项的组合物,以及药学可接受的载体。
9.根据权利要求8的药物组合物,其中包含至少一种选自下列的物质:葳岩仙皂苷A、3-O-a-L-吡喃阿拉伯糖-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、马钱子苷(Loganin)、裂马钱素苷、triplostoside A、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、白桦脂酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷、丁香脂素单葡萄糖苷、汉黄芩素、千叶素A、黄芩素、二氢查耳酮3-O-β-D-葡萄糖苷、α-氧-β-D-葡萄吡喃糖基-4,2′,4′-三羟基二氢查耳酮、绿原酸、木通皂苷D。
10.根据权利要求8的药物组合物,其中包含至少一种选自下列的物质:葳岩仙皂苷A、3-O-a-L-吡喃阿拉伯糖-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、马钱子苷(Loganin)、裂马钱素苷、triplostoside A、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、白桦脂酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷、丁香脂素单葡萄糖苷、汉黄芩素、千叶素A、黄芩素、二氢查耳酮3-O-β-D-葡萄糖苷、α-氧-β-D-葡萄吡喃糖基-4,2′,4′-三羟基二氢查耳酮、绿原酸、木通皂苷D,并且当存在它们的二种以上时,它们任意两者之间的重量比率为0.0001~10000:1。
11.根据权利要求8至10任一项的药物组合物,其是用于治疗和/或预防骨病的药物,或者其是用于治疗和/或预防骨质疏松症的药物,或者是用于治疗和/或预防绝经后认知缺陷疾病药物。
12.根据权利要求8至10任一项的药物组合物,其是呈片剂、胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、外用药剂、注射制剂等形式。
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