CN102920769B - 杜仲丸在制备治疗骨质疏松药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杜仲丸在制备治疗骨质疏松药物中的应用，所述的杜仲丸为杜仲和续断按照1：1的重量比例关系混合提取的提取物。试验证明，杜仲丸能显著抑制由于大鼠去卵巢造模引起的大鼠血清中碱性磷酸酶、羟脯氨酸的含量；可以显著提高骨密度、骨重系数、骨钙和骨磷，具有显著性治疗骨质疏松的活性，在制备治疗骨质疏松的药物中具有很好的应用前景。

Description

杜仲丸在制备治疗骨质疏松药物中的应用

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及杜仲丸在制备治疗骨质疏松药物中的应用。 

背景技术

杜仲丸，又名千金保孕丸—《古今医统》卷八十五、杜续丸—《医学入门》卷八。由盐炙杜仲和盐炙续断（或者生品杜仲和生品续断）按照1:1的比例关系组成。炮制方法如下：①盐炙杜仲：取杜仲丝片，0.5倍于药材重量的2%的盐水，拌匀，闷润2h，置于铁锅中，文火加热，锅底温度控制在200左右(红外测温仪，热辐射系数0.7)，20min药材基本至干，然后温度提高至370，炒炙10min，出锅，摊凉。②盐炙续断：取续断饮片生品，放入密封袋中，加入适量浓度为0.1g/ml的盐溶液，在密封袋中充分摇匀，待密封袋内无明显液滴时，取出，置170℃（红外测温仪测定）热锅中翻炒15min，取出，晾凉，装入密封袋中，标号，密封，即得续断盐炙品样品。 

作为常用的中药，杜仲丸被用于妇女保孕，但其医药用途并没有得到充分的发掘和应用。 

发明内容

本发明的目的在于公开杜仲丸在制备治疗骨质疏松药物中的应用。以满足临床应用的需要。 

本发明的目的可以通过以下技术方案实现： 

杜仲丸在制备治疗骨质疏松药物中的应用，所述的杜仲丸为杜仲和续断按照1：1的重量比例关系混合提取的提取物。所述的杜仲为盐炙杜仲或生品杜仲，所述的续断为盐炙续断或生品续断。 

上述的应用，其在于所述的药物包括治疗有效量的杜仲丸和医药学上可接受的载体。 

所述的药物优选为丸剂、散剂、胶囊、片剂、颗粒剂、注射剂、复方制剂或其他口服剂型。 

杜仲丸在制备治疗骨质疏松药物中的应用效果显著，尤其是由性激素水平下降导致的骨质疏松。 

本发明所述的杜仲丸优选为盐炙杜仲和盐炙续断（或者生品杜仲和生品续断）按照1：1的重量比例关系混合提取的醇提取物。服用剂量可根据服用方式、病人年龄、病情严 重程度等因素而改变，成人口服剂量为20-60g（生药）/日。 

本发明的有益效果： 

试验证明，杜仲丸能显著抑制由于大鼠去卵巢造模引起的大鼠血清中碱性磷酸酶、羟脯氨酸的含量；可以显著提高骨密度、骨重系数、骨钙和骨磷，具有显著性治疗骨质疏松的活性，在制备治疗骨质疏松的药物中具有很好的应用前景。 

具体实施方式

1.实验材料 

1.1主要仪器 

TDL80-2B型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；CSS-4420电子万能材料实验机(长春机械研究所)；Discovery W型双能X射线骨密度扫描仪(美国Hologic)；TB-25型十万分之一电子天平(DENVER，北京丹佛仪器有限公司)；DG5033A 型酶联免疫检测仪(华东电子管厂)；BS-124S型电子天平(Sartorius，北京赛多利斯科技有限公司)；TGL-20M冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；高温电炉、晶体管式自动恒温控制台(江苏省东台县电器厂)。 

1.2主要药品与试剂盒 

仙灵骨葆胶囊(批号：111043，贵州同济堂制药有限公司)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na，天津市科密欧化学试剂开发中心，批号：20070429)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号：30037517)；注射用青霉素钠(批号：B111106，80万单位/支，山东鲁抗医药股份有限公司)；碘伏(武汉市联华卫生消毒用品厂)；杜仲、续断(先声再康江苏药业有限公司)；17β-雌二醇(湖北大仝生物化工科技有限公司)。 

血清碱性磷酸酶(ALP)试剂盒、血清羟脯氨酸(HOP)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。 

1.3 实验动物 

雌性，280±20g，64只，清洁级SD大鼠(南通大学实验动物中心)，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2008-0010。 

1.4试剂配制 

0.5%CMC-Na：称取15g CMC-Na，加入3000mL蒸馏水，混合均匀，使其充分溶胀，放置过夜，搅拌均匀，即得。 

3%水合氯醛：精密称取水合氯醛15g，加入500mL蒸馏水，使其充分溶解，即得到3%水合氯醛麻醉液，在使用前现用现配。 

75%乙醇溶液：移取95%乙醇789.5mL，加入210.5mL蒸馏水，混合均匀，即得到 1000mL的75%乙醇溶液。 

0.9%生理盐水溶液：称取4.5g NaCl，加入500mL蒸馏水，混合均匀，使其充分溶解，即得。 

10%的中性甲醛溶液：移取37%~40%甲醛溶液100mL，加入900mL的PBS缓冲溶液，混合均匀，即得到1000mL的10%中性甲醛溶液。 

仙灵骨葆胶囊混悬液：取仙灵骨葆胶囊内容物，用研钵研碎，精密称取5.0g，置于100mL容量瓶中，加入0.5%CMC-Na溶液定容至刻度，超声使其形成混悬液。仙灵骨葆大鼠给药体积为10mL/kg·d^-1；给药量为0.50g/kg^[1]。 

17β-雌二醇混悬液：精密称取17β-雌二醇1.5mg，置于250mL容量瓶中，加入0.5%CMC-Na溶液定容至刻度，超声使其形成混悬液。17β-雌二醇给药体积为10mL/kg·d^-1大鼠，给药剂量为60μg/kg^[2]。 

杜仲丸样品的制备方法： 

杜仲丸（盐炙品）：精密称取同批次的杜仲炮制品(盐炙杜仲，剪成2mm以下碎片)及续断炮制品粗粉(盐炙续断，粉碎，过2号筛)各250g(共500g)，置5L圆底烧瓶中，加入5L 60%乙醇，浸泡1h，分别以5L、4L、4L的60%乙醇，各水浴回流提取一次，提取时间分别为1.5h、1h、0.5h，合并三次滤液，减压回收乙醇部位至无醇味，经脱脂处理后的药液置于真空减压干燥箱中(-0.08MPa，60℃)，干燥，研细得提取物，得率为30.53%，备用。 

杜仲丸（生品）：采用生品杜仲和生品续断按照与杜仲丸（盐炙品）相同的方法制备提取物，得率为25.50%，备用。 

杜仲丸（盐炙品）低剂量组药液：杜仲丸（盐炙品）提取物适量，用0.5%CMC-Na溶解制成0.061g/mL的混悬液。给药体积为0.01mL/g大鼠；高剂量组给药剂量为0.61g/kg（2g生药/kg）大鼠。 

杜仲丸（盐炙品）高剂量组药液：杜仲丸（盐炙品）提取物适量，用0.5%CMC-Na溶解制成0.183g/mL的混悬液。给药体积为0.01mL/g大鼠；高剂量组给药剂量为1.83g/kg（6g生药/kg）大鼠。 

杜仲丸（生品）低剂量组药液：杜仲丸（生品）提取物适量，用0.5%CMC-Na溶解制成0.051g/mL的混悬液。给药体积为0.01mL/g大鼠；高剂量组给药剂量为0.51g/kg（2g生药/kg）大鼠。 

杜仲丸（生品）高剂量组药液：杜仲丸（生品）提取物适量，用0.5%CMC-Na溶解制成0.153g/mL的混悬液。给药体积为0.01mL/g大鼠；高剂量组给药剂量为1.53g/kg（6g生 药/kg）大鼠。 

2.实验目的 

通过采用大鼠去卵巢的骨质疏松模型，以大鼠血清中羟脯氨酸(HOP)、血清中碱性磷酸酶含量；股骨骨密度；股骨骨灰重系数；骨钙和骨磷含量作为考察指标，证明杜仲丸治疗去卵巢大鼠骨质疏松的在体药理活性。 

3.实验方法 

3.1动物模型的制备 

取体重280±20g的6月龄清洁级雌性SD大鼠64只^[3]。随机分组，禁食24小时(不禁水)后，其中8只在相应部位只作手术切口，不摘除卵巢作为正常对照组（假手术对照组）；40只按文献法^[4]进行卵巢摘除术，大鼠用3%水合氯醛麻醉(3g水合氯醛/100mL，给药剂量100g动物/mL，腹腔注射)，背位固定，于距最末肋骨下约1cm和脊柱外测约2cm处，剪毛，然后切开约1.5-2cm皮肤和背肌，切口视野中可见一团白色发亮的脂肪，卵巢即包埋在其中，用小镊子轻夹住脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，便可见到粉红色菜花状的卵巢，将其余子宫连接处用4号手术缝合线结扎后，再摘除卵巢，同法摘除另一侧卵巢，术后顺势将子宫送回原位，皮肤切口处给予少许青霉素粉剂，缝合切口。 

各组大鼠术后分笼饲养，大鼠术后活动正常，可自行饮水摄食，术后大鼠伤口愈合正常，没有红肿、渗出、化脓等现象。各组大鼠再分笼饲养，术后每日腹腔注射青霉素注射液(生理盐水配制，10万单位/mL，给药体积0.5mL/100g，80万单位/瓶)，连续3天。手术2周后开始给药，连续给药12周。 

3.2动物分组及给药 

将去卵巢大鼠分别按体重随机分为8组：假手术组、模型对照组(OVX)、两组阳性对照组、杜仲丸（盐炙品）的高剂量组和低剂量组、杜仲丸（生品）的高剂量组和低剂量组。假手术对照组(SHAM)和模型对照组(OVX)，给予蒸馏水；两组阳性对照组，分别给予仙灵骨葆胶囊0.5g/kg(中阳)和17β-雌二醇60μg/kg(西阳)；杜仲丸（盐炙品）的高、低剂量组分别为0.61g/kg(DZW低)、和1.83g/kg(DZW高)；杜仲丸（生品）的高、低剂量组分别为0.51g/kg(DZW低)、和1.53g/kg(DZW高)。 

灌胃给药，给药体积为0.01mL/g大鼠，每周给药6次(周日休息一天)，均于每天晚上18:00-20:00左右给药，连续给药12周，于给药过程中，每周称一次体重，根据体重调整给药量。 

3.3样品采集 

末次给药后禁食24小时(不禁水)后，先对大鼠进行称重，然后3%水合氯醛麻醉(3g水合氯醛/100mL，给药剂量100g动物/mL，腹腔注射)，大鼠颈总动脉插管取血，至10mL的离心管中并处死大鼠。 

血液室温静置15min，3500rpm离心10min后，分离血清及血浆，血清标号后，-20℃保存，用于各指标含量测定。 

总动脉插管取血后处死大鼠，分离双侧股骨，取右侧股骨测定以下指标：①将标本用10%的中性甲醛溶液固定，用双能X射线骨密度测定仪测定股骨骨密度；②再将测完骨密度之后的右侧股骨干燥并碳化后置于800℃马福炉中灰化制成骨灰，测定骨灰重系数(mg/g体重)；⑦称取一定量骨灰，用血清磷测定试剂盒测定骨磷；另取一定量的骨灰用钙试剂盒测定骨钙含量，将所测结果折算成每克骨重所含骨钙或骨磷的量。 

3.4实验各项指标测定及实验结果 

3.4.1 血清各不同指标测定 

3.4.1.1羟脯氨酸(HOP)的含量测定 

(1)基本原理 

羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色，根据其呈色的深浅可推算出其含量。 

(2)测定方法 

按试剂盒要求测定。在550nm处，测各孔的吸光度OD值。 

(3)样品中HOP浓度的测定结果 

羟脯氨酸含量(μg/mL)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准管含量(5μg/mL)×水解液总体积(mL)/取样量(mL) 

实验结果见下表1所示。 

3.4.1.2血清中碱性磷酸酶(ALP)的含量测定 

(1)原理 

碱性磷酸酶分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物，根据红色深浅可以测定酶活力的高低。 

(2) 测定方法 

按试剂盒要求测定。在450nm处，测各孔的吸光度OD值。 

(3)样品中碱性磷酸酶的测定结果 

碱性磷酸酶(金氏单位/100mL)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸 光度)×酚标准品浓度(0.1mg/mL)×100mL×样本测定前稀释倍数。 

实验结果如下表2所示。 

3.4.2股骨相关参数的测定 

3.4.2.1 股骨骨灰重系数测定 

大鼠右侧股骨在进行骨密度测定和Micro-CT检测后，先置坩锅内于120℃干烤2h，取出，置干燥器中保存，放置过夜。隔日，将烤干的股骨盛于坩锅内，置箱式电阻炉(马弗炉)中，分别在250℃，400℃，600℃各加热0.5h，最后于800℃灰化1h，取出，置干燥器冷却0.5h，对骨灰称重，实验结果见下表3。 

电子天平称量，骨灰重系数=股灰重(g)×1000/大鼠体重(g)。 

3.4.2.2骨钙测定 

(1)原理 

尿液中钙离子在碱性溶液中与甲基百里香酚蓝(MTB)结合，生成蓝色络合物。通过比色与同样处理的钙标准进行比较，可计算出钙的含量。 

(2) 测定方法 

按试剂盒要求测定。 

(3)样品中骨钙的测定结果 

实验结果如下表4所示。骨灰中钙的含量(mmol/g)＝(测定孔吸光度－空白孔吸光度)÷(标准孔吸光度－空白孔吸光度)×标准品浓度(1mmol/L)÷待测样本的重量(0.1g)。 

3.4.2.3骨磷测定 

(1)原理 

样品中的无机磷与钼酸作用生成磷钼酸，后者被还原成钼蓝，在660nm处有最大吸收峰，通过比色法可以计算出无机磷的含量。 

(2) 测定方法 

按试剂盒要求测定。 

(3)样品中骨磷的测定结果 

实验结果如下表5所示。磷含量(mmol/g)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准管浓度(0.5mmol/L)×测试前稀释倍数(5)÷骨灰浓度(0.1g/mL)。 

3.4.3股骨骨密度的测定 

分离出大鼠右侧股骨后，股骨标本经10%甲醛溶液固定，用双能X射线骨密度测定仪测定股骨的骨密度。股骨骨密度测定结果如下表6。 

3.5统计学处理 

实验数据均采用均数±标准差(SD)来表示，组间差异显著性用t-test比较，p<0.05为有显著性差异。不同亚组之间采用SPSS 15.0统计软件进行数据处理。 

4.实验结果及结论 

4.1实验结果 

实验结果，详见1-6。 

表1 大鼠去卵巢的骨质疏松模型实验中杜仲丸对羟脯氨酸含量的影响 

注：与假手术组比较，^#表示p＜0.05，^##表示p＜0.01；与模型组比较，^＊表示p＜0.05，^＊＊表示p＜0.01。 

表2 大鼠去卵巢的骨质疏松模型实验中杜仲丸对碱性磷酸酶含量的影响 

注：与假手术组比较，^#表示p＜0.05，^##表示p＜0.01；与模型组比较，^＊表示p＜0.05，^＊＊表示p＜0.01。 

表3 大鼠去卵巢的骨质疏松模型实验中杜仲丸对骨重系数的影响 

注：与假手术组比较，^#表示p＜0.05，^##表示p＜0.01；与模型组比较，^＊表示p＜0.05，^＊＊表示p＜0.01。 

表4大鼠去卵巢的骨质疏松模型实验中杜仲丸对骨钙含量的影响 

注：与假手术组比较，^#表示p＜0.05，^##表示p＜0.01；与模型组比较，^＊表示p＜0.05，^＊＊表示p＜0.01。 

表5大鼠去卵巢的骨质疏松模型实验中杜仲丸对骨磷含量的影响 

   注：与假手术组比较，^#表示p＜0.05，^##表示p＜0.01；与模型组比较，^＊表示p＜0.05，^＊＊表示p＜0.01。 

表6大鼠去卵巢的骨质疏松模型实验中杜仲丸对骨密度的影响 

注：与假手术组比较，^#表示p＜0.05，^##表示p＜0.01；与模型组比较，^＊表示p＜0.05，^＊＊表示p＜0.01。 

4.2结论 

本实验采用大鼠去卵巢的骨质疏松模型，以血清中羟脯氨酸(HOP)、血清中碱性磷酸酶含量、股骨骨密度、骨灰重系数、骨钙含量、骨磷含量指标，验证杜仲丸治疗去卵巢大鼠骨质疏松的在体药理活性。 

实验结果表明：模型组与空白组相比，大鼠血清中ALP和TRACP-5b的含量显著增 加，实验结果与文献报道一致^[5]，表明大鼠去卵巢的骨质疏松模型组造模成功。大鼠灌胃给药杜仲丸提取物、仙灵骨葆胶囊和17β-雌二醇12周后，与模型组相比，能显著抑制由于大鼠去卵巢造模引起的大鼠血清中碱性磷酸酶、羟脯氨酸的含量，实验结果表明杜仲丸可以改善骨质疏松大鼠血清的相关指标，可能是通过抑制骨吸收、促进骨生成、降低骨钙的流失以及促进骨胶原的生成作用来实现的。 

对大鼠的股骨进行了骨密度检测，实验结果表明：与模型组相比，杜仲丸给药12周后可以显著提高大鼠股骨的骨密度，并呈现一定的剂量依赖性，表明杜仲丸可以提高骨密度。 

对大鼠的股骨进行了骨灰重系数、骨钙、骨磷测定，结果表明：与模型组相比，杜仲丸给药12周后可以显著提高大鼠股骨的骨重系数、骨钙、骨磷。 

综上所述，杜仲丸具有显著性治疗骨质疏松的活性，在制备治疗骨质疏松的药物中具有很好的应用前景，特别是由性激素水平下降导致的骨质疏松。 

实施例1 

片剂：取1.4试剂配制中按照杜仲丸（盐炙品）的制备方法制备的提取物加入淀粉混匀，打片，即得片剂。 

实施例2 

胶囊：取1.4试剂配制中按照杜仲丸（盐炙品）的制备方法制备的提取物加入辅料淀粉，湿法制粒，灌注胶囊，即得胶囊剂。 

参考文献： 

[1] 张文明,何元诚,申喜生等. 仙灵骨葆对去卵巢骨质疏松大鼠的骨形态计量学影响. 中国中医骨伤科杂志[J]. 2009, 17(11):7~9. 

[2]Chow J, Tobias JH, Colston KW, Chambers TJ. Estrogen maintains trabecular bone volume in rats not only by suppression of bone resorption but also by stimulation of bone formation. J Clin Invest. 1992, 89(1):74-8. 

[3]章明放,张乃鑫,谭郁彬等.间断性腹腔注射羟乙膦酸钠对去势大鼠骨矿化和骨重塑的影响.天津医药.1996年2月.Vol.24.No.2:97. 

[4]徐叔云,卞如濂,陈修主编.药理实验方法学.第二版.人民卫生出版社.1991.11月：1293. 

[5] Shimizu H, Nakagami H, Osako MK, Hanayama R, Kunugiza Y, Kizawa T, et al (2008) Angiotensin II accelerates osteoporosis by activating osteoclasts. FASEB 22 : 2465-75。

Claims (4)

1.杜仲丸在制备治疗骨质疏松药物中的应用，所述的杜仲丸为杜仲和续断按照1：1的重量比例关系混合提取的提取物；所述的杜仲为盐炙杜仲，所述的续断为盐炙续断。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物包括治疗有效量的杜仲丸和医药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的药物为丸剂、散剂、胶囊、片剂、颗粒剂、注射剂、复方制剂或其他口服剂型。

4.根据权利要求1、2 或3所述的应用，其特征在于所述的骨质疏松为由性激素水平下降导致的骨质疏松。