CN100409857C - 一种用于抗骨质疏松的中药制剂 - Google Patents

一种用于抗骨质疏松的中药制剂 Download PDF

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Abstract

本发明属中药制剂技术领域。具体涉及一种用于抗骨质疏松的中药的有效组分及其制剂。本发明的中药制剂是由中药淫羊藿提取的有效成份与药用辅料组成的。本发明的制剂经实验动物证实对骨质疏松症有预防及治疗作用，能提高股骨骨密度及骨钙、骨磷的含量，改善股骨指数。本发明提供了制备方法。

Description

一种用于抗骨质疏松的中药制剂
技术领域
本发明属中药制剂技术领域。具体涉及一种用于抗骨质疏松的中药的有效组分及其制剂。
背景技术
淫羊藿总黄酮粉是从中药淫羊藿中提取德有效部位。中药淫羊藿有以下几个品种：小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornumMaxim.、箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum(Sieb.et Zucc)Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim.、巫山淫羊藿Epimediumwushanense T.S.Ying、或朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai。中药淫羊藿的药用部位为干燥地上部分，并除去粗梗及杂质。
朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)，又名东北淫羊藿(《全国中草药汇编》)。其药用部位化学成分以黄酮居多，已有的化学成分研究表明：它含有淫羊藿苷及淫羊藿苷A，淫羊藿定A、B、C，淫羊藿定A，、B1，槲皮素、脱水淫羊藿素-3-鼠李糖苷，朝鲜淫羊藿苷(epimedokoreanoside)I、II。
淫羊藿苷，为黄酮甙类成分，分子中C3、C7位上的羟基与糖结合形成甙，其化学结构如下：
Figure C0211210800031
从以上结构可知淫羊藿苷应具有黄酮类化合物特征的紫外吸收，
从以上结构可知淫羊藿苷应具有黄酮类化合物特征的紫外吸收，紫外扫描证实淫羊藿苷在270nm左右具有较强的吸收，故以高效液相进行含量测定时，选择270nm为测定波长。
目前未见用中药淫羊藿制备的抗骨质疏松药剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是研制一种用于抗骨质疏松的中药制剂。
本发明提供了一种含中药淫羊藿的用于抗骨质疏松的中药制剂仙灵骨康片，该制剂是由淫羊藿提取的有效成份与药用辅料组成的。
(一)本发明的用于抗骨质疏松的中药制剂药效学研究如下：
中药淫羊藿提取的有效组分(下文简称为9412)的药效学研究：1.9412对维甲酸致大鼠骨质疏松症的影响-预防作用
实验目的：观察9412对维甲酸致大鼠骨质疏松症预防作用。
1.1.材料
1.1.1.供试品
名称：9412
提供单位：上海医药工业研究院
批号：20001017
剂型：浸膏
用量：1ml/100g大鼠
给药途径：po
剂量：4、12、36mg/kg，po×28
1.1.2.阳性对照药
羟乙基膦酸钠：
上海医药工业研究院化学事业部提供，批号991010，口服50mg/kg，po×28。
1.1.3.其它
维甲酸：
上海第六制药厂生产，黄色结晶粉末，口服，作为造成大鼠骨质疏松症模型用，口服剂量1ml/100g大鼠，用0.5％CMC配成混悬液，70mg/kg剂量，po×14。
骨密度测定仪：
DPX-L型双能X线骨密度仪，美国LunAR公司生产，上海中医药大学附属曙光医院提供。
试剂盒：钙试剂盒，卫生部上海生物制品研究所。
磷试剂盒，上海捷门生物技术公司。
马福炉：上海浦东跃欣科学仪器厂。
722S分光光度计：上海科学精密仪器有限公司。
1.2.动物：
来源、种属、品系、合格证：
大鼠，SD系，中科院上海实验动物中心提供。
合格证：中科动管会第005号。
体重：110～130g
性别：雌雄均有
每组动物数：10只
实验室温度：24～26℃，相对湿度：60～70％。
1.3.试验方法：
1.3.1.建立维甲酸诱导大鼠骨质疏松症模型
大鼠随机分为6组，正常对照组、模型对照组、9412低、中、高剂量组、阳性对照组，除正常对照组外，各组大鼠均口服维甲酸70mg/kg，服用量1ml/100g大鼠，每天1次，连续14天，同时每天各组大鼠依次口服以下样品，正常对照组、维甲酸模型组为相应溶剂10ml/kg、9412低剂量组4mg/kg、中剂量组12mg/kg、高剂量组36mg/kg、阳性药羟乙基膦酸钠50mg/kg，服用量均为1ml/100g大鼠，每天1次，连续28天，其间每周称体重1次，以体重调整给药用量。
1.3.2.观察指标
给药结束，断头处死动物，取血分离血清，按试剂盒方法测S-Ca、S-P含量，取大鼠双侧股骨，剥净肉及其它组织，其中一侧股骨在双能X线骨密度仪上作大鼠股骨扫描，测出骨密度(g/cm2)，称骨重(W)，测骨长(L)，骨直径(D)，计算骨表观线密度(W/L)、表观面密度(W/L·D)，然后110℃烘干一小时，再置于马福炉内200、400、600、800℃各灰化2小时，灰化结束冷却后，称灰重(Wash·g)，用6NHCl提取后测骨灰Ca、骨灰P含量，以100g骨灰含Ca或P的克数表示。
另一侧股骨头用3％HNO3脱钙后作石蜡切片，HE染色，显微镜下测骨小梁宽度。
以上结果均以给药组与模型组比较，模型组与正常对照组比较。
1.4.结果：
1.4.1.体重：
实验当天及第1周内各组动物体重无明显差异(P＞0.05)，给药后2、4周维甲酸模型组体重比正常对照组体重减轻(P＜0.01、P＜0.05)，但用药后各组动物体重均明显增加，其中低剂量组(4mg/kg)有体重增加但无统计意义，而9412中、高剂量组(12mg/kg、36mg/kg)及羟乙基膦酸钠组大鼠第2、4周的体重均比模型组增加(P＜0.05)，各剂量组相互比较无明显差异。
表1 9412对维甲酸致大鼠骨质疏松症预防作用的体重变化
                                                
Figure C0211210800222
Figure C0211210800061
△P＜0.05，△△P＜0.01与正常对照组比较
*P＜0.05，**P＜0.01与模型对照组比较
1.4.2.大鼠股骨骨密度及SCa、SP的变化
表2结果显示模型组大鼠股骨骨密度比正常对照组低(P＜0.01)，血清Ca含量也较模型组低(P＜0.05)，血清磷含量变化不大，但用药组大鼠股骨密度都比模型组增加(P＜0.05、P＜0.01)，血清钙及磷的含量均较模型组升高，但9412中、高剂量组无明显差异。阳性药羟乙基膦酸钠的大鼠股骨骨密度及血清钙血清磷含量也比模型组有明显的差异(P＜0.05、P＜0.01)。
表2 9412对维甲酸致大鼠骨质疏松症预防作用时的股骨骨密度、SCa、Sp的变化                            
Figure C0211210800222
Figure C0211210800062
△P＜0.05，△△P＜0.01与正常对照组比较
*P＜0.05，**P＜0.01与模型对照组比较
1.4.3.9412对维甲酸诱导大鼠骨质疏松症预防作用骨指数的影响
与对照组比较，模型组的W、L、d、W/L、W/Ld均明显下降，相对于模型组9412中、高剂量组及羟乙基膦酸钠组的W、W/Ld均明显提高。
Figure C0211210800081
1.4.4.对股骨灰分、骨Ca及骨P的影响
与对照组比较，模型组的骨灰重及灰分中骨Ca及骨P含量均降低，但用药后9412中、高剂量组及羟乙基膦酸钠组骨灰重、骨Ca、骨P含量均相对增加。
表4 9412对维甲酸致大鼠骨质疏松症预防作用时的股骨灰分、骨Ca及骨Pi含量的影响                               
Figure C0211210800222
Figure C0211210800091
△P＜0.05，△△P＜0.01与正常对照组比较
*P＜0.05，**P＜0.01与模型对照组比较
2.9412对维甲酸致大鼠骨质疏松症的影响-治疗作用
实验目的：观察9412对维甲酸致大鼠骨质疏松症的治疗作用。
2.1.材料
2.1.1.供试品：
名称：9412
提供单位：上海医药工业研究院
批号：20001017
剂型：浸膏
用量：1ml/100g大鼠
给药途径：po
剂量：4、12、36mg/kg，po×14
2.1.2.阳性对照药：
羟乙基膦酸钠：上海医药工业研究院化学事业部提供，批号991010，口服50mg/kg，po×14。
2.1.3其它：
维甲酸：上海第六制药厂生产，黄色结晶粉末，口服，作为造成大鼠骨质疏松症模型用，服用量1ml/100g大鼠，用0.5％CMC配成混悬液，70mg/kg剂量，po×14。
骨密度测定仪：DPX-L型双能X线骨密度仪，美国LunAR公司生产，上海中医药大学附属曙光医院提供。
试剂盒：钙试剂盒，卫生部上海生物制品研究所。
磷试剂盒，上海捷门生物技术公司。
马福炉：上海浦东跃欣科学仪器厂。
722S分光光度计：上海科学精密仪器有限公司。
2.2.动物：
来源、种属、品系、合格证：
大鼠，SD系，中科院上海实验动物中心提供。
合格证：中科动管会第005号。
体重：110～130g
性别：雌雄均有
每组动物数：10只
实验室温度：24～26℃，相对湿度：60～70％。
2.3.试验方法：
2.3.1.建立维甲酸诱导大鼠骨质疏松症模型
大鼠随机分为6组，正常对照组、模型对照组、9412低、中、高剂量组、阳性药对照组，除正常对照组外，各组大鼠均口服维甲酸70mg/kg，服用量1ml/100g大鼠，每天1次，连续14天，结束后各用药组按各剂量组给药口服每天1次，连续28天，正常对照组及模型组给予相应溶剂，服用量均为1ml/100g体重，其间根据体重调整给药量。
2.3.2.观察指标：
给药结束，断头处死动物，取血分离血清，按试剂盒方法测S-Ca、S-P含量，取大鼠双侧股骨，剥净肉及其它组织，其中一侧股骨在双能X线骨密度仪上作大鼠股骨扫描，测出骨密度(g/cm2)，称股骨重(W)，测骨长(L)，骨直径(D)，计算骨表观线密度(W/L)、表观面密度(W/L·d)，然后110℃烘干一小时，再置于马福炉内200、400、600、800℃各灰化2小时，灰化结束冷却后，称灰重(Wash..g)，用6N HCl提取后测骨灰Ca、骨灰P含量，以100g骨灰含Ca或P的克数表示。
另一侧股骨头用3％HNO3脱钙后作石蜡切片，HE染色，显微镜下测骨小梁宽度。
以上结果均以给药组与模型组比较，模型组与正常对照组比较。
2.4.结果：
2.4.1.体重：
表5显示给予维甲酸后，各组动物体重比正常对照组体重均明显下降，但给9412后，给药组体重开始恢复，维甲酸模型组也开始恢复。
2.4.2.大鼠股骨骨密度及SCa、SP的变化
表5 9412对维甲酸致大鼠骨质疏松症治疗作用的体重变化
                                              
Figure C0211210800222
Figure C0211210800111
表6结果显示模型组大鼠股骨骨密度比正常对照组低(P＜0.01)，SCa含量也较模型组(P＜0.01)，而SP无明显变化，用药后9412各剂量组的大鼠股骨密度与模型组比较，有明显的提高股骨密度及SCa的作用，以941212mg/kg组作用最明显，羟乙基膦酸钠也有提高大鼠股骨密度及SCa的作用，但各组的SP含量模型组、用药组均与正常对照组无明显差异。
表6 9412对维甲酸致大鼠骨质疏松症治疗作用时股骨骨密度及SCa、SP的变化                                   
Figure C0211210800222
Figure C0211210800112
△△P＜0.01与正常对照组比较
*P＜0.05，**P＜0.01与模型对照组比较
2.4.3.9412对维甲酸诱导大鼠骨质疏松症治疗作用骨指数的影响
与对照组比较，模型组的骨质疏松症的W、L、d、W/L、W/Ld均有明显下降，相对于模型组9412的高剂量组及羟乙基膦酸钠组W/Ld明显提高(P＜0.01)。
Figure C0211210800121
2.4.4.对股骨灰分、骨Ca及骨P的影响
与对照组相比，模型组的骨灰重及灰分中骨Ca、骨P含量均降低，但用药后9412中、高剂量组及羟乙基膦酸钠组骨灰重、骨Ca、骨P含量均相对增加。
表8 9412对维甲酸致大鼠骨质疏松症预防作用时的股骨灰分、骨Ca及骨Pi含量的影响                                     
Figure C0211210800222
Figure C0211210800131
△△P＜0.01与正常对照组比较
*P＜0.05，**P＜0.01与模型对照组比较
3.9412对去势大鼠抗骨质疏松症的治疗作用
实验目的：观察9412对去势大鼠骨质疏松症的疗效。
3.1.材料
3.1.1.供试品：
名称：9412
提供单位：上海医药工业研究院
批号：20001017
剂型：浸膏
用量：1ml/100g大鼠
给药途径：po
剂量：4、12、36mg/kg，po×90
3.1.2.阳性对照药：
羟乙基膦酸钠：
上海医药工业研究院化学事业部提供，批号991010，口服50mg/kg，po×90。
3.1.3.其它：
骨密度测定仪：
DPX-L型双能X线骨密度仪，美国LunAR公司生产，上海中医药大学附属曙光医院提供。
试剂盒：钙试剂盒，卫生部上海生物制品研究所。
磷试剂盒，上海捷门生物技术公司。
马福炉：上海浦东跃欣科学仪器厂。
722S分光光度计：上海科学精密仪器有限公司。
3.2.动物：
来源、种属、品系、合格证：
大鼠，SD系，中科院上海实验动物中心提供。
合格证：中科动管会第005号。
体重：雌性110～130g，雄性130～150g
每组动物数：10只
实验室温度：24～26℃，相对湿度：60～70％。
3.3.试验方法：
3.3.1.建立去势大鼠骨质疏松症模型
雌雄大鼠以3％戊巴比妥钠麻醉，常规消毒，在无菌条件下摘除双侧睾丸或卵巢，随即缝合切口，假手术组仅作腹部手术消毒切开后再缝合(不切除睾丸及卵巢)，将大鼠随机分组，每组10～12只，手术一周后分组，按各用药组给药，每日1次，连续90天，模型组给予相应溶剂，服用量均为1ml/100g体重，其间根据体重调整给药量。
3.3.2.观察指标：
给药结束，断头处死动物，取血分离血清，按试剂盒方法测S-Ca、S-P含量，取大鼠双侧股骨，剥净肉及其它组织，其中一侧股骨在双能X线骨密度仪上作股骨扫描，测出骨密度(g/cm2)，称股骨重(W)，测骨长(L)，骨直径(d)，计算骨表观线密度(W/L)、表观面密度(W/L·d)，然后110℃烘干一小时，再置于马福炉内200、400、600、800℃各灰化2小时，灰化结束冷却称灰重(Wash)，用6N HNO3提取后，测骨灰Ca、骨灰P含量，以100g骨灰含Ca2+或Pi的克数表示。
另一侧股骨头用3％HNO3脱钙后作石蜡切片，HE染色，显微镜下测骨小梁宽度。
以上结果均以给药组与模型组比较，模型组与正常对照组比较。
3.4.结果：
3.4.1.体重：
各组动物之间无明显差异。
3.4.2.大鼠股骨骨密度及SCa、SP的变化
表9结果显示模型组大鼠股骨骨密度比正常对照组低(P＜0.01)，9412中、高剂量组及羟乙基膦酸钠都比模型组有显著的升高(P＜0.05)，模型组的血清Ca、血清P均比正常对照组低，用药后血清Ca比模型组提高，但无统计意义，血清P变化不大，羟乙基膦酸钠血清Ca比模型组升高P＜0.05)，血清Pi变化不大。
表109412对去势大鼠股骨骨密度、骨小梁的影响
                                    
Figure C0211210800222
Figure C0211210800161
△△P＜0.01与正常对照组比较
*P＜0.05，**P＜0.01与模型对照组比较
3.4.3.9412对去势大鼠骨指数的影响
与对照组比较，模型组的W、L、d、W/L、W/Ld均有明显的下降，相对于模型组9412的各组剂量均能增加大鼠股骨重量(P＜0.05、P＜0.01)，以中剂量组最明显，中剂量组及羟乙基膦酸钠组W/L、W/Ld均比模型组有明显差异。
表11.9412对去势大鼠血清钙、血清磷的变化
                                           
Figure C0211210800222
△△P＜0.01与正常对照组比较
Figure C0211210800171
3.4.4.对股骨骨灰分、骨Ca及骨P的影响
与对照组相比，模型组的骨灰重及骨灰分中Ca、骨Pi含量均降低，但用药后，股骨骨灰重、骨Ca、P含量比模型组有不同程度的提高(P＜0.05)。
表139412对去势大鼠股骨骨灰、骨矿Ca、P含量的影响
                                   
Figure C0211210800222
Figure C0211210800181
△P＜0.05与正常对照组比较
*P＜0.05，**P＜0.01与模型对照组比较
4.9412对大鼠成骨细胞原代培养的影响
实验目的：观察9412对大鼠成骨细胞原代细胞生长的影响。
4.1.材料：
4.1.1.供试品：
名称：9412
提供单位：上海医药工业研究院
批号：20001017
剂型：浸膏，试验对以PBS溶解后无菌过滤
4.1.2.其它试剂：
培养基：DMEM，Difco产品
小牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司
胶原酶：上海医药工业研究院生物化学事业部
胰酶：Difco产品
培养基：DMEM+10％小牛血清
消化液：PBS+EDTA(4mM)+0.1％胶原酶+0.05％胰酶组成
3H-TdR：上海原子核研究所1mci/ml
PBS：PH 7.2，0.5M
4.2.动物：
来源、种属、品系、合格证：
大鼠，SD系(新生24小时大鼠)中科院上海实验动物中心提供
合格证：中科动管会第005号
4.3.方法：
无菌条件下取出生24小时内的SD新生鼠10只的颅骨，去除骨膜及周围软组织，用剪刀剪成小块，用消化液37℃消化20分钟，消化过程中不断振摇，消化结束离心，倾去上清液，收集消化后的残余组织及细胞放于细胞培养瓶中，加DMEM(含10％小牛血清)37℃，5％CO2中培养10天后，弃去上清液，贴壁细胞以胰酶消化成单个细胞，离心，收集，计数并调整细胞浓度为5×105个/ml，在96孔细胞培养板上，每孔加入100μl细胞，不同稀释浓度的9412待试样品100μl(样品浓度为1、0.1、0.01、0.001μg/ml)，对照管以培养基代替，复设三复管，培养48小时后加入0.5μci/孔3H-TdR继续培养8小时，再用0.5％胰酶消化后用多头细胞仪收集细胞，液闪仪上测定CPM值，结果以样品与空白对照管比较。
4.4.结果：
结果见表，1μg/ml浓度的样品组对新生鼠颅骨细胞的掺入率较对照组低，其余各组均有不同程度的促进成骨细胞的生长，其中以0.01μg/ml 9412样品掺入数最高。
表149412对新生大鼠成骨细胞原代细胞生长的影响
                                        
Figure C0211210800222
Figure C0211210800191
**P＜0.01与对照组比较
5.结论：
9412系中药淫羊藿中提取的活性组分，主要为黄酮，一系列试验表明具有60％黄酮含量的9412具有抗骨质疏松症的作用。
①对维甲酸致大鼠骨质疏松症预防作用试验中，9412不论低、中、高剂量组均能提高大鼠股骨骨密度(P＜0.05，P＜0.01)，增加股骨及骨灰重量，股骨骨灰钙及磷的含量。
②对维甲酸致大鼠骨质疏松症治疗作用试验中，9412低、中、高剂量组能提高大鼠股骨骨密度(P＜0.05，P＜0.01)，并以中剂量组较为明显(P＜0.01)，中、高剂量组能增加股骨骨灰重及骨钙骨磷的含量，低剂量作用不明显。
③9412对去势大鼠造成骨质疏松症后，有中、高剂量组能提高大鼠股骨骨密度(P＜0.05)，低剂量组不明显。血清钙、磷含量影响，但能不同程度的提高大鼠股骨重量及骨灰中钙、磷含量并以中剂量组较好。
④对去势大鼠能增加大鼠股骨头骨小梁的宽度和长度，也说明9412对去势大鼠的骨质疏松有一定的治疗作用。
⑤9412对新生鼠成骨细胞有一定的促进生长的作用，以0.01μg/ml的促进作用最明显。
(二)本发明的用于抗骨质疏松的中药制剂(仙灵骨康片)的急性毒性试验：
1.试验目的：
观察9412对昆明种小鼠口服给药后，动物产生的毒性反应。
2.受试样品：
名称：9412浸膏
提供单位：上海医药工业研究院
批号：20001017
含量：每1g浸膏相当于g生药
药液配制：0.5％CMC+吐温80助溶配成混悬液
3.动物来源、种属、品系、合格证：
小鼠，昆明种，上海医药工业研究院动物房供应。
合格证：沪动合证字第107号。
体重：20±1g
性别：雌雄各半
动物数：每组20只，雌雄各半
实验室温度：25±1℃，相对湿度：65±10％。
饲以标准全价营养颗粒饲料，自由摄食饮水。
4.试验方法
剂量：
预试中941220％溶液，每鼠口服0.5ml，动物未见死亡，现增加为一日二次口服给药。
药液浓度：
配成20％浓度，每1ml含0.2g浸膏，每鼠口服0.5ml/20g体重，一日二次。
给药途径：口服
方法：
小鼠口服20％9412混悬剂，每鼠0.5ml，一日二次，观察给药后即时反应，记录二周内小鼠体重变化，观察期结束处死动物，肉眼观察动物的组织病理变化。
5.结果
动物二周内体重变化见表。
动物给药后无任何不良症状，活动饮食如常。观察期结束，尸检动物，也未见有肉眼可见的病理组织异常。
6.结论
小鼠口服9412最大耐受量为10g/kg以上。
Figure C0211210800221
(三)仙灵骨康片对大鼠的长期毒性试验如下：
本实验采用SD大鼠，每组30只，雌雄各半，分为36、120、480mg/kg/d三个给药组和对照组，连续口服灌胃仙灵骨康片六个月，停药观察期为2周。
SD大鼠口服仙灵骨康片六个月长期毒性试验结果表明，对一般症状，如体重增长、摄食量与对照组相比无明显影响。其他如动物的活力、精神状态、粪便等未见与药物有关的明显毒性反应。
给药三个月时发现雄性大鼠三个剂量组的WBC与对照组相比稍低，给药六个月时发现雄性大鼠高剂量组的WBC与RBC与对照组相比稍低，雌性大鼠低、高剂量组的RBC与对照组相比稍低。停药二周时发现雄性大鼠中剂量组的RBC与对照组相比稍低。
给药三个月时发现雄性大鼠中剂量组的BUN较对照组高，雌性大鼠低、中剂量组的ALP与对照组相比稍高。给药六个月时发现雌性大鼠中剂量组的BUN较对照组稍高。停药二周时发现雌性大鼠高剂量组的BUN较对照组高。以上这些指标的变化均在正常范围内。
病理组织学等检查均未见与给药有关的明显毒性反应，部分指标的变化均在正常范围内。
SD大鼠连续经口灌胃给予仙灵骨康片六个月，其无毒性剂量为480mg/kg/d(相当于药效剂量的40倍)。
(四)仙灵骨康片对Beagle狗的长期毒性试验如下：
Beagle狗仙灵骨康片九个月长期毒性试验结果表明，对一般症状(动物的活动、体重、精神状态、粪便等)、血液学、血清生化、尿常规、系统尸检、组织学检查及脏器系数等检查均未见与药物有关的明显毒性反应。
给药九个月后停药2周也未见与药物有关的明显毒性反应。
Beagle狗连续口服仙灵骨康片9个月，其无毒性剂量为480mg/kg/d(相当于药效剂量的40倍)。
经上述研究结果如下：
1.对维甲酸70mg/kg.d，连续14天造成大鼠骨质疏松症，并同时三级给予淫羊藿总黄酮4mg/kg、12mg/kg和36mg/kg，羧乙基磷酸钠50mg/kg作阳性对照组，并在维甲酸停药后再继续给药14天(共给药28天)。以动物体重、骨密度、骨重、骨长、骨直径，计算骨表观线密度、表观面密度、骨灰重、骨钙、骨磷，以及骨切片测骨小梁宽，血清钙、磷的含量等指标作为判定的根据，结果发现用药组各指标均有明显改善，尤以中、高剂量组明显，其疗效至少不低于50mg/kg羧乙基磷酸钠组。
2.对维甲酸所致大鼠骨质疏松症的影响——治疗作用的研究
维甲酸70mg/kg.d，连续14天，造成大鼠骨质疏松，在停药后，分三级给予淫羊藿总黄酮4mg/kg、12mg/kg和36mg/kg，羧乙基磷酸钠50mg/kg作阳性对照，连续给药28天。
3.对去势大鼠抗骨质疏松作用
大鼠去势术后一周给药，分组情况同上，连续给药90天，测定指标同上。
结果显示，中、高剂量组均有明显的抗骨质疏松症疗效。
一般药理研究：
一般药理研究表明10、30、100mg/kg，口服对狗的血压、呼吸及心电图均未产生明显影响。50、150、500mg/kg口服对小鼠神经和行为未见明显变化。
急性毒性研究：
小鼠LD50＞10g/kg。
长期毒性研究：
大鼠长期毒性试验：三个剂量组36、120和480mg/kg，连续给药6个月，停药二周，结果未见明显毒性。
Beagle mg/kg狗长期毒性试验：三个剂量组36、120和480mg/kg，连续给药9个月，停药二周，结果未见明显毒性。
故大鼠和狗的长期毒性试验表明480mg/kg是其无毒性剂量。
本发明的另一目的是提供了上述用于抗骨质疏松的中药制剂(仙灵骨康片)的制备工艺。
该工艺包括下列步骤：
(1)制备淫羊藿干浸膏
取淫羊藿药材，以水煎煮提取二次，每次用水量均为药材的20倍量，第一次煎煮2小时，第二次煎煮1.5小时，过滤，合并滤液并冷却至室温，上大孔吸附树脂(每公斤药材用已处理好的水状态下的树脂1升)，上样结束后，先以去离子水洗脱，换以15％乙醇洗脱，再换以30％乙醇洗脱，而后以40％乙醇洗脱，最后以50％乙醇进行洗脱，此时起监测洗脱液的乙醇浓度，当醇浓度达45％时起，开始收集洗脱液至结束，将该部分洗脱液减压浓缩至干，即得。
原料质量标准草案
处方：淫羊藿
制法：
将淫羊藿叶子，每次加20倍量水提取二次，第一次煎煮2小时，第二次煎煮1.5小时，过滤，合并滤液并冷却至室温，上大孔吸附树脂，以不同浓度的乙醇洗脱，收集相应流份的洗脱液，减压浓缩至干得浸膏粉。
性状：本品为棕褐色粉末。
鉴别：取浸膏粉0.01g，加甲醇至10ml，超声提取20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。另取淫羊藿苷对照品，加甲醇溶解，配制成每ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各5ul，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶GF254薄层板上，以醋酸乙酯-正丁醇-甲酸-水(10∶1∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗红色斑点；喷以三氯化铝试液后，再置紫外灯(365nm)下检视，显相同的橙红色荧光斑点。
检查：应符合质量标准的各项规定。
总黄酮含量测定：
照分光光度法(中国药典2000版一部附录VA)测定。
对照品溶液的制备精密称取淫羊藿苷对照品适量，以60％甲醇制成每1ml含淫羊藿苷10μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：
精密称取浸膏粉约16mg，置于10ml容量瓶中，加约9ml50％甲醇超声提取20分钟后，加50％甲醇至刻度，摇匀，精密吸取0.5ml，定容于50ml的容量瓶中，摇匀，即得。
测定法：
分别取对照品溶液和供试品溶液，以50％甲醇为空白，在270nm波长处照分光光度法测定，即得。
本品以淫羊藿苷为对照品计算总黄酮的含量不得少于60％。
淫羊藿苷含量测定：
照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VID)测定。
色谱条件：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈∶水(30∶70)；流速为1.0ml/min；柱温为30℃检测波长为270nm。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500。
对照品溶液的制备：
精密称取淫羊藿苷对照品适量，以50％甲醇制成每1ml含淫羊藿苷0.1mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：
精密称取浸膏粉约7.5mg，置于50ml容量瓶中，加约45ml 50％甲醇超声提取20分钟后，加50％甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。
测定法：
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品以淫羊藿苷为对照品计算淫羊藿苷的含量不得少于20％。
功能与主治：补肾阳强筋骨用于抗骨质疏松。
贮藏：密闭，置阴凉干燥处保存。
(2)制备制剂
处方：
制剂处方：
浸膏粉                100g
淀粉                  40g
乳糖                  30g
微晶纤维素            30g
7％淀粉浆             适量
硬脂酸镁              2g
薄膜包衣处方
胃溶型薄膜包衣预混剂  12g
50％乙醇              适量
以上剂量按工艺制成    1000片。
制备方法：
按处方比例称取浸膏粉、淀粉、乳糖、微晶纤维素，分别过80目筛，混匀，再过40目筛三次。将上述混合粉用7％淀粉浆制软材，过24目筛粒，50℃干燥2小时。干燥颗粒过30目筛整粒，加入处方量硬脂酸镁，混匀，压片，包衣，晾片，即得。
本品系由淫羊藿提取物制成的片剂。
性状：本品包衣片为棕红色片剂，素片为棕褐色片剂。
鉴别：
取本品5片，研细，称取0.02g，加甲醇至10ml，超声提取20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。另取淫羊藿苷对照品，加甲醇溶解，配制成每ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各5ul，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶GF254薄层板上，以醋酸乙酯-正丁醇-甲酸-水(10∶1∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗红色斑点；喷以三氯化铝试液后，再置紫外灯(365nm)下检视，显相同的橙红色荧光斑点。
检查：
应符合中国药典2000版一部片剂(附录I D)项下的各项规定。
总黄酮含量测定：
照分光光度法(中国药典2000版一部附录VA)测定。
对照品溶液的制备：见原料。
供试品溶液的制备：
取本品10片，研细混匀后，精密称取样品约32mg，置于10ml容量瓶中，加约9ml50％甲醇超声提取20分钟后，加50％甲醇至刻度，摇匀，精密吸取0.5ml，定容于50ml的容量瓶中，摇匀，即得。
测定法：见原料。
本品每片含以淫羊藿苷为对照品计算总黄酮的量，不得少于60mg。
淫羊藿苷含量测定：
照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VID)测定。
色谱条件：见原料。
对照品溶液的制备：见原料。
供试品溶液的制备：
取本品10片，研细混匀后，精密称取样品约15mg，置于50ml容量瓶中，加约45ml 50％甲醇超声提取20分钟后，加50％甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。
测定法：见原料。
本品每片含以淫羊藿苷为对照品计算淫羊藿苷的含量不得少于20mg。
功能与主治：补肾阳强筋骨，用于抗骨质疏松。
用法与用量：口服，每日3次，每次1片
规格：100mg/片
贮藏：密闭，置阴凉干燥处保存。
具体实施方式
实施例1
取淫羊藿净药材100kg，以水煎煮提取2次，每次用水量约为药材的20倍量。第一次煎煮2小时，第二次煎煮1.5小时，过滤。合并滤液并冷却至室温。上大孔树脂，上样结束后先以去离子水洗脱，换以15％乙醇洗脱，再换以30％乙醇洗脱，再后以40％乙醇洗脱，最后以50％乙醇洗脱，此时起监测洗脱液的乙醇浓度，当醇浓度达45％时起，开始收集洗脱液至结束，将该部分洗脱液减压浓缩至干。
检测得浸膏量1.21kg，总黄酮含量71.8％，淫羊藿苷含量25.8％。
实施例2
取淫羊藿净药材100kg，经上述工艺处理后，获浸膏量1.28kg，总黄酮量73.6％，淫羊藿苷含量27.5％。
实施例3
取淫羊藿净药材100kg，经上述工艺处理后获浸膏量1.19kg，总黄酮含量69.2％，淫羊藿苷含量24.4％。

Claims (2)

1. 一种用于抗骨质疏松的中药制剂，其特征在于该制剂是由淫羊藿提取的有效成份与药用辅料组成的，其中淫羊藿的有效成份是将淫羊藿药材通过水煎煮二次，滤液经树脂吸附，先以去离子水洗脱，换以15％乙醇洗脱，再换以30％乙醇洗脱，而后以40％乙醇洗脱，最后以50％乙醇进行洗脱，此时起监测洗脱液的乙醇浓度，当醇浓度达45％时起，开始收集洗脱液至结束，将该部分洗脱液减压浓缩至干，即得。
2. 一种如权利要求1所述的用于抗骨质疏松的中药制剂的制备工艺，其特征在于该工艺中制备淫羊藿干浸膏包括下列步骤：
取淫羊藿药材，以水煎煮提取二次，每次用水量均为药材的20倍量，第一次煎煮2小时，第二次煎煮1.5小时，过滤，合并滤液并冷却至室温，上大孔吸附树脂，先以去离子水洗脱，换以15％乙醇洗脱，再换以30％乙醇洗脱，而后以40％乙醇洗脱，最后以50％乙醇进行洗脱，此时起监测洗脱液的乙醇浓度，当醇浓度达45％时起，开始收集洗脱液至结束，将该部分洗脱液减压浓缩至干，即得。
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