CN102796088A

CN102796088A - 一种拉米夫定的制备方法

Info

Publication number: CN102796088A
Application number: CN2012102332125A
Authority: CN
Inventors: 袁秀菊; 姚亮元; 宿亮; 钟爱军; 王雪姣; 朱婧; 宋维
Original assignee: HUNAN QIANJIN XIANGJIANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HUNAN QIANJIN XIANGJIANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2012-05-21
Filing date: 2012-07-06
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2032-07-06
Also published as: CN102796088B

Abstract

本发明提供了一种拉米夫定的制备方法，先采用尿嘧啶作为原料定向合成杂质J，并对其结构进行确证，即通过高效液相色谱（HPLC）测试得到其相对保留时间；然后对拉米夫定的合成原料进行质量控制，即通过选择尿嘧啶含量低于1.0%的胞嘧啶作为原料，可得到杂质J含量低于0.1%的拉米夫定。

Description

一种拉米夫定的制备方法

技术领域

本发明属于核苷类抗病毒药物领域，具体涉及一种拉米夫定的制备方法。

背景技术

拉米夫定(lamivudine)的结构式为：

化学名为(2R，5S)-4-氨基-1-(2-羟甲基-1,3-氧硫杂环戊-5-基)-1H-嘧啶-2-酮，是一种新的核苷类抗病毒药，适用于慢性乙型肝炎。拉米夫定能迅速抑制HBV复制，其抑制作用持续于整个治疗过程。

关于拉米夫定的文献很多，主要集中在合成路线和异构体拆分方面。例如，涉及拉米夫定合成路线的专利申请有CN201010141026.X、CN201010158830.9、CN20101018710524；涉及拉米夫定手性制备方面的专利申请有CN200810212154.1，CN200810212154.1，CN200910043203.8；涉及拉米夫定的杂质控制方面，美国药典（USP34）拉米夫定质量标准中相对保留时间为0.4的杂质限度为0.3%，相对保留时间为0.9的杂质限度为0.2%，其他单个杂质限度为0.1%。对于拉米夫定产物中所含的杂质J，在USP34中并未有专门的论述和规定限度。按照人用药物注册技术要求国际协调会议的要求,原料药中的单个杂质含量超过0.05%需要报告，单个杂质含量超过0.1%需要进行结构确证，单个杂质含量超过0.15%需要有安全性数据支持。

发明内容

本发明解决了现有技术中存在拉米夫定产物中未对杂质J限度进行控制进而不能保证产物质量的技术问题。

本发明提供了一种拉米夫定的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、以尿嘧啶为原料，合成得到杂质J，所述杂质J为1-((5S)-2-(羟甲基)-1，3-氧硫杂戊环-5-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮；

S2、对步骤S1得到的拉米夫定J进行高效液相色谱测试，得到杂质J的相对保留时间tj；

S3、直接以含有不同含量尿嘧啶的若干种胞嘧啶作为原料，分别合成得到拉米夫定粗产物，并对这些拉米夫定粗产物分别进行高效液相色谱测试，根据S2的相对保留时间tj，确定杂质J峰的位置，然后根据高效液相色谱图中的峰面积比，计算得出各种拉米夫定粗产物中杂质J的含量；

S4、对步骤S3中的各种原料胞嘧啶进行高效液相色谱测试，计算得出各种胞嘧啶原料中尿嘧啶的含量；然后通过对比分析获得各种胞嘧啶原料中尿嘧啶的含量与相应各种拉米夫定粗产物中杂质J的含量之间的对应关系；

S5、利用步骤S4中获得的对应关系，根据所要制备的拉米夫定粗产物的预期杂质J含量，选择具有相应尿嘧啶含量的胞嘧啶作为原料，合成得到所需拉米夫定。

本发明提供的拉米夫定的制备方法，先采用尿嘧啶作为原料定向合成杂质J，并对其结构进行确证，即通过高效液相色谱（HPLC）测试得到其相对保留时间；然后对拉米夫定的合成原料进行质量控制，从而得到具有预期杂质J含量的拉米夫定粗产物，例如通过选择尿嘧啶含量低于1.0wt%的胞嘧啶作为原料，可得到杂质J含量低于0.1wt%的拉米夫定。

附图说明

图1是原料胞嘧啶中尿嘧啶含量与得到的拉米夫定粗产物中杂质J含量的拟合成曲线。

具体实施方式

拉米夫定原料胞嘧啶或胞嘧啶盐中，可能含有尿嘧啶（代号为lamivudine-F，化学名为：2，4-二羟基(酮基)嘧啶），lamivudine-F可衍生得到的杂质J，其化学名为：1-((2R,5S)-2-(羟甲基)-1,3-氧硫杂戊环-5-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮，具有如下所示结构：

本发明的发明人发现，拉米夫定产物的质量控制点关键之一在于杂质J的含量的控制。本发明的发明人通过对原料胞嘧啶的质量进行控制，具体选择尿嘧啶含量低于1.0wt%的胞嘧啶作为起始原料，可得到杂质J含量低于0.1wt%的拉米夫定。

因此，本发明提供的拉米夫定的制备方法，先采用尿嘧啶作为原料定向合成杂质J，并对其结构进行确证，即通过高效液相色谱（HPLC）测试得到其相对保留时间；然后对拉米夫定的合成原料进行质量控制，从而得到具有预期杂质J含量的拉米夫定粗产物，例如通过选择尿嘧啶含量低于1.0wt%的胞嘧啶作为原料，可得到杂质J含量低于0.1wt%的拉米夫定。

本发明中，通过对比分析各种胞嘧啶原料中的尿嘧啶含量与相应各种拉米夫定粗产物中杂质J的含量，可得到二者之间的对应关系。即步骤S4中的对比分析包括根据各种胞嘧啶原料中尿嘧啶的含量与相应各种拉米夫定粗产物中杂质J的含量，做出二者的拟合成曲线。通过该拟合成曲线，能通过简单地选择相应尿嘧啶含量的胞嘧啶原料用于拉米夫定粗产物的合成，以简单的方法确保实现控制质量的目的，显著降低生产成本，减少不合格产品，提高产量或收率。

企业或制造商根据所要生产的产品批次的品质，来选择相应尿嘧啶含量的胞嘧啶原料，以便满足不同的产品要求。例如，根据步骤S4中对比分析得到的对应关系，选择尿嘧啶含量低于1.0wt%的胞嘧啶作为原料，合成得到杂质J含量低于0.1wt%的拉米夫定粗产物。进一步优选地，根据步骤S4中对比分析得到的对应关系，选择尿嘧啶含量低于0.5wt%的胞嘧啶作为原料，合成得到未检出杂质J的拉米夫定的粗产物。

具体地，本发明中，步骤S1中，以尿嘧啶为原料，合成得到杂质J的方法为：将六甲基二硅氮烷、尿嘧啶与(2R，5S)-((1R，2S，5R)-2-异丙基-5-甲基环己基)5-乙酰氧基-1,3-氧硫杂戊环-2-甲酸酯在溶剂中反应，得到5S-尿嘧啶-1’-基-1,3-氧硫杂环戊烷-2-羧酸-(1’R，2’S，5’R)薄荷酯，然后与磷酸盐、硼氢化钠反应，得到所述杂质J。

根据英国药典（BP2012）中拉米夫定质量标准要求的色谱条件，步骤S2中，在HPLC图谱中杂质J的相对保留时间为约1.45(相对于拉米夫定(停留时间约等于9分钟))。

本发明中，步骤S3中，以含有不同含量尿嘧啶的胞嘧啶为原料，合成得到拉米夫定粗产物的方法为：将六甲基二硅氮烷、含有不同含量尿嘧啶的胞嘧啶与(2R，5S)-((1R，2S，5R)-2-异丙基-5-甲基环己基)5-乙酰氧基-1,3-氧硫杂戊环-2-甲酸酯在溶剂中反应，得到5S-胞嘧啶-1’-基-1,3-氧硫杂环戊烷-2-羧酸-(1’R，2’S，5’R)薄荷酯，然后与磷酸盐、硼氢化钠反应，得到所述拉米夫定粗产物。

步骤S3中，对拉米夫定粗产物进行高效液相色谱测试的方法采用现有技术中常用的高效液相色谱测试方法，其条件包括：色谱柱为VP-ODS柱，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为醋酸铵的甲醇溶液，流速为1.0mL/min，柱温为35℃，进样量为20μL。

步骤S4中，对原料胞嘧啶进行高效液相色谱测试的的条件包括：色谱柱为Wondasil C₁₈柱，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为含有醋酸铵的甲醇-水混合体系，流速为1.0mL/min，柱温为35℃，进样量为10μL。

本发明中，步骤S5中选择具有相应尿嘧啶含量的胞嘧啶作为原料，合成得到所需拉米夫定的反应条件与步骤S3中以含有不同含量尿嘧啶的胞嘧啶为原料，合成得到拉米夫定粗产物的反应条件完全相同。此外，S3、S5中采用胞嘧啶合成拉米夫定的步骤与步骤S1中合成杂质J的过程在条件上相同，区别仅在于各步骤中所采用的主原料不同。

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

（1）合成杂质J

氮气保护下，将50g六甲基二硅氮烷、4g尿嘧啶、二氯甲烷加入250ml反应瓶内，加热回流3小时，减压蒸除溶剂。加入二氯甲烷，搅拌溶解。滴加(2R,5S)-((1R,2S,5R)-2-异丙基-5-甲基环己基)5-乙酰氧基-1,3-氧硫杂戊环-2-甲酸酯的二氯甲烷溶液，回流反应5小时，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，收集有机层，弃去水层。再分别用饱和盐水、水洗涤，收集有机层，至反应釜。减压蒸除溶剂，得油状物。加少量乙醚搅拌30分钟，加入饱和NaHCO₃溶液剧烈搅拌，析出白色沉淀，抽滤干燥得到11g白色固体5S-尿嘧啶-1’-基-1,3-氧硫杂环戊烷-2-羧酸-(1’R,2’S,5’R)薄荷酯。

250mL三口反应瓶中加入50g磷酸盐、水、10g的5S-尿嘧啶-1’-基-1,3-氧硫杂环戊烷-2-羧酸-(1’R,2’S,5’R)薄荷酯，加入乙醇搅拌，于低温条件下向反应瓶内慢慢滴加10g硼氢化钠溶液。静置分层，有机层降温，滴加稀盐酸溶液调PH至6.8~7.2。减压蒸除溶剂乙醇。得淡黄色油状物。柱层析分离得到6g的1-((2R，5S)-2-(羟甲基)-1，3-氧硫杂戊环-5-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮，即杂质J。

（2）采用HPLC方法对步骤（1）得到的杂质J进行测试，测试条件为：

色谱柱：VP-ODS柱(粒径为5μm，250×4.6mm)

流动相：甲醇-0.05mol/L醋酸铵溶液(pH3.9±0.1)(5:95)

流速：1.0mL/min

柱温：35℃

检测波长：277nm

进样量：20μL。

得到HPLC图谱中，杂质J的相对保留时间为1.45。

（3）称取武汉金诺化工有限公司生产的胞嘧啶，采用HPLC方法检测对其进行测试，测试条件为：

色谱柱：Wondasil C18柱(粒径为5μm，250×4.6mm)

检测器:紫外检测器

色谱条件:甲醇-0.05mol/L醋酸铵溶液(pH3.9±0.1)(5:95)

流速:1.0mL/min

柱温:35℃

进样量：10μLL。

测得胞嘧啶中，尿嘧啶的含量为1.00wt%。

然后氮气保护下，将200g六甲基二硅氮烷、14g胞嘧啶、二氯甲烷加入500ml反应瓶内，加热回流3小时，减压蒸除溶剂。加入二氯甲烷，搅拌溶解。滴加40g的(2R,5S)-((1R,2S,5R)-2-异丙基-5-甲基环己基)5-乙酰氧基-1,3-氧硫杂戊环-2-甲酸酯的二氯甲烷溶液，回流反应5小时，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，收集有机层，弃去水层。再分别用饱和盐水、水洗涤，收集有机层，减压蒸除溶剂，得油状物。加少量乙醚搅拌30分钟，加入饱和NaHCO₃溶液剧烈搅拌析出白色沉淀，抽滤干燥得到43g白色固体5S-胞嘧啶-1’-基-1，3-氧硫杂环戊烷-2-羧酸-(1’R，2’S，5’R)薄荷酯。

500ml三口反应瓶中加入50g磷酸盐、水和30g制得的5S-胞嘧啶-1’-基-1，3-氧硫杂环戊烷-2-羧酸-(1’R，2’S，5’R)薄荷酯，加入乙醇搅拌，于低温条件下向反应瓶内慢慢滴加40g硼氢化钠溶液。静置分层，有机层降温，滴加稀盐酸溶液调PH至6.8~7.2。减压蒸除溶剂乙醇。得淡黄色油状物。加入无水乙醇，开搅拌，升温至75±5℃，待物料全溶，加入活性碳，冷却至5℃以下析出白色固体，抽滤干燥得到32g拉米夫定粗品。将得到的拉米夫定粗品加入400ml异丙醇，加热回流1小时。趁热过滤。浓缩冷却，抽滤，滤饼用乙醚洗涤，干燥得到白色拉米夫定S1。

采用与步骤（2）相同的条件对步骤（3）得到的拉米夫定S1进行HPLC测试，采用不加校正因子的主成分自身对照法(取本品适量，加流动相制成每1ml中约含250μg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相稀释成每1ml中约含2.5μg的溶液，作为对照溶液；精密量取供试品溶液与对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2倍)计算得到拉米夫定中杂质J的含量为0.1wt%。

实施例2-11

采用与实施例1相同的方法进行，不同之处在于步骤（3）中尿嘧啶的含量如表1所示，最终的拉米夫定S2-S11中杂质J的含量如表1所示。

对比例1-3

采用与实施例1相同的方法进行，不同之处在于步骤（3）中尿嘧啶的含量如表1所示，最终的拉米夫定DS1、DS2、DS3中杂质J的含量如表1所示。

表1

	尿嘧啶含量（wt%）	杂质J含量（wt%）
			S1	1.00	0.1
S2	0.91	0.09
			S3	0.82	0.08
S4	0.70	0.07
			S5	0.63	0.06
S6	0.55	0.05
			S7	0.50	未检出
S8	0.42	未检出
			S9	0.29	未检出
S10	0.23	未检出

S11	0.12	未检出
			DS1	1.10	0.12
DS2	1.23	0.14
			DS3	1.34	0.15

用表1中胞嘧啶原料中的尿嘧啶含量与相应各种拉米夫定粗产物中杂质J的含量拟合成曲线(参见图1)，便于更细地选择胞嘧啶原料，以简单的方法实现控制质量的目的。

从上表1的测试结果可以看出，采用本发明提供的方法，通过控制原料胞嘧啶的质量，具体通过选择尿嘧啶含量低于1.0wt%的胞嘧啶作为原料，可制备得到杂质J含量低于0.1wt%的拉米夫定；通过选择尿嘧啶含量低于0.5wt%的胞嘧啶作为原料，可制备得到未检出杂质J的拉米夫定。

以上实施例仅为本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，所作出的若干改进，也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种拉米夫定的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤S4中的对比分析包括根据各种胞嘧啶原料中尿嘧啶的含量与相应各种拉米夫定粗产物中杂质J的含量，做出二者的拟合成曲线。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中，根据步骤S4中对比分析得到的对应关系，选择尿嘧啶含量低于1wt%或0.5wt%的胞嘧啶作为原料，分别合成得到杂质J含量低于0.1wt%的拉米夫定或未检出杂质J的拉米夫定。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，以尿嘧啶为原料，合成得到杂质J的方法为：将六甲基二硅氮烷、尿嘧啶与(2R，5S)-((1R，2S，5R)-2-异丙基-5-甲基环己基) 5-乙酰氧基-1,3-氧硫杂戊环-2-甲酸酯在溶剂中反应，得到5S-尿嘧啶-1’-基-1, 3-氧硫杂环戊烷-2-羧酸-(1’R， 2’S，5’R)薄荷酯，然后与磷酸盐、硼氢化钠反应，得到所述杂质J。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，杂质J的相对保留时间为1.45。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，以含有不同含量尿嘧啶的胞嘧啶为原料，合成得到拉米夫定粗产物的方法为：将六甲基二硅氮烷、含有不同含量尿嘧啶的胞嘧啶与(2R，5S)-((1R，2S，5R)-2-异丙基-5-甲基环己基) 5-乙酰氧基-1,3-氧硫杂戊环-2-甲酸酯在溶剂中反应，得到5S-胞嘧啶-1’-基-1, 3-氧硫杂环戊烷-2-羧酸-(1’R， 2’S，5’R)薄荷酯，然后与磷酸盐、硼氢化钠反应，得到所述拉米夫定粗产物。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，对拉米夫定粗产物进行高效液相色谱测试的条件包括：色谱柱为VP-ODS柱，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为醋酸铵的甲醇溶液，流速为1.0mL/min，柱温为35℃，进样量为20μL。

8.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中，对原料胞嘧啶进行高效液相色谱测试的的条件包括：色谱柱为Wondasil C₁₈柱，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为以甲醇--醋酸铵缓冲溶液为流动相，流速为1.0mL/min，柱温为35℃，进样量为10μL。

9.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中选择具有相应尿嘧啶含量的胞嘧啶作为原料，合成得到所需拉米夫定的反应条件与步骤S3中以含有不同含量尿嘧啶的胞嘧啶为原料，合成得到拉米夫定粗产物的反应条件完全相同。