CN102784133B - 丹酚酸a预防和\或治疗脑微血管血栓栓塞性疾病的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及丹酚酸A在制备用于预防和\或治疗脑微血管血栓栓塞性疾病的药物中的应用。

Description

丹酚酸A预防和\或治疗脑微血管血栓栓塞性疾病的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及丹酚酸A在制备用于预防和\或治疗脑微血管血栓栓塞性疾病的药物中的应用。

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)为唇形科鼠尾草属植物的干燥根，传统医学认为丹参具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效。近来对丹参的作用的研究主要集中在丹参提取物或总成分在改善心、肝、肺、脑等脏器的缺血再灌注损伤方面；对外周血栓形成和血小板聚的作用；调节免疫应答；抗感染和抗肿瘤等方面。

丹酚酸A(Salvianic acid A)是唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhizaBunge)的干燥根中所含的一种水溶性酚酸类化合物，最早由中国医学科学院药物研究所黎莲娘教授于1984年从丹参中分离得到(LiLian-Niang，et al.Planta Medica.1984，50：227)，其结构如下：

研究表明，丹参中丹酚酸类成分的抗心肌缺血缺氧的活性比丹参素和原儿茶醛更强，其中丹酚酸A更是目前已知的最强的抗氧化化合物之一，其具有改善记忆、抑制血小板聚集、降低抗癌药阿霉素的毒性等作用，具有抗肝损伤、抗肝纤维化、防治动脉粥样硬化、保护心肌损伤、诱导细胞凋亡、抗肿瘤、防治白内障等作用。

脑微血管系指内径＜100μm的脑血管系统，即毛细血管及与之相连的微动脉和微静脉，如位于穿通支动脉、软脑膜血管等。在生理状态下，微循环系统为脑组织提供营养代谢，当动脉血流中断时，则会使下游的微循环相继发生病理性改变，如微小血栓形成、内皮细胞通透性增加、基底膜破裂及炎症反应等，甚至发生继发性水肿或出血。这一系列的缺血“瀑布”反应，导致微循环结构和功能发生障碍，其为脑组织供应营养和作为屏障的作用丧失，最终导致神经元损害。因此，微循环在保持正常生理功能、疾病的发生、发展和药物作用机制中均占有突出地位。

脑微血管血栓栓塞性疾病不同于脑血栓栓塞性疾病，前者为微血管栓塞，后者为大血管栓塞。脑微血管血栓栓塞性疾病即指脑微血管部位有血栓形成，阻塞或部分阻塞脑微血管腔，导致微血管局部栓塞，由此引起的一类脑微循环障碍性疾病。微血管栓塞不仅是血栓的大小有明显区别，更重要的是其病理机制和病理作用与大血管栓塞是完全不同的，包括微血管结构、微血管病理变化过程、微血管部位血液动力学等多个方面。这是医学的基本知识，也是使用大血管血栓仿制药物不能有效防治脑微血管栓塞性疾病原因。

外周抗血栓药物不能用于脑微血管血栓性疾病的治疗。目前，临床上用于抗血栓治疗的主要药物包括肝素、华法林和tPA，它们常用于防止深静脉血栓、肺栓塞、房颤患者的血栓形成等大血管栓塞治疗。有人认为，这些药物也同时可以用于脑微血管血栓，但由于其临床效果和不良反应等原因，临床上并不建议使用，事实上临床上也没有任何使用。防治脑微血管血栓栓塞及其引起的疾病，无论是理论上还是实际治疗过程，都不同于一般的血栓栓塞性疾病，对脑微血管栓塞性疾病的治疗是药物的特殊作用。因此，外周抗血栓药物尚不能用于脑微血管栓塞性疾病。

脑微血管系统的重要组成部分之一是血脑屏障(blood brain bartier，BBB)，维持着中枢神经系统微环境的稳定。微观上BBB分三层结构，由内向外依次为：(1)脑和脊髓内的毛细血管内皮，不同于外周毛细血管内皮的是，脑毛细血管内皮细胞之间为紧密连接，细胞吞饮泡很少，细胞内含有丰富的酶系统，其屏障作用分机械屏障和酶屏障；(2)毛细血管基膜；(3)胶质膜，即星形胶质细胞足突。因此血脑屏障的存在限制了多数药物进入脑组织对神经系统疾病的治疗作用，对于脑微血管栓塞性疾病，有效改善血脑屏障功能是其重要的作用特点之一。

有文献报道丹酚酸A具有抗大鼠肠系膜动脉血栓形成及颈动脉-颈静脉短路血栓模型血栓形成的作用，然而，对丹酚酸A的药理作用研究并没有涉及到对脑微血管的作用，尤其是对脑微血管血栓的作用，因为上述所提及的所有丹酚酸A的用途均与脑微血管血栓具有不同的病理机制和症状表现。因此，本发明所述的丹酚酸A在制备用于预防和\或治疗脑微血管血栓栓塞性疾病的药物中的应用是新发现的丹酚酸A的新用途。

迄今为止，尚没有丹酚酸A防治脑微血管血栓性栓塞性疾病的文献报道，大量关于丹酚酸A的现有技术主要集中在其提取方法、制备纯化方法等方面。本发明经过大量的动物实验发现丹酚酸A可以减轻脑微血管血栓栓塞性疾病引发的脑血液流变学和微血管形态改变，还可以减轻学习记忆障碍和脑组织损伤，可用于防治脑微血管血栓栓塞引起的脑组织病变。

发明内容

本发明的一方面涉及丹酚酸A在制备用于预防和\或治疗脑微血管血栓栓塞性疾病的药物中的应用。

本发明的另一方面涉及丹酚酸A的药物制剂在预防和\或治疗脑微血管血栓栓塞性疾病中的应用。

所述的脑微血管血栓栓塞性疾病包括特发于脑微血管局部的血栓、由于脑微血管局部血栓引起的脑微血管腔阻塞继而导致的脑组织局部微循环障碍、以及脑组织病变引起的疾病。

为了考察丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞的影响，本发明通过以下实验进行研究：

1、采用透射电镜，检测丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠血脑屏障形态结构的影响及干预作用；

2、采用动物行为学测定方法，测定丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠行为学影响及干预作用；

3、采用动物学习记忆功能测定方法，检测丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠学习记忆功能的影响及干预作用；

4、采用硫代巴比妥酸比色法，检测丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠脑丙二醛(MDA)水平的影响及干预作用；

5、采用比色法，检测丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠脑谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平的影响及干预作用；

6、采用Griess试剂，检测丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠脑一氧化氮(NO)水平的影响及干预作用；

7、采用比色法，检测丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠脑总一氧化氮合酶(tNOS)水平的影响及干预作用；

8、采用血小板聚集实验法，检测丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞大鼠血液血小板聚集的影响及干预作用；

9、采用全功能自动血流变仪，检测丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠全血粘度和血浆粘度的影响及干预作用；

10、采用红细胞聚集仪，检测丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠红细胞聚集率的影响及干预作用。

实验结果显示丹酚酸A可显著减轻脑微血管血栓栓塞引起的大鼠脑微血管病变。

本发明还涉及丹酚酸A的药物制剂在预防和\或治疗脑微血管血栓栓塞性疾病中的应用，所述药物制剂包括丹酚酸A以及药学上可接受的载体和/或辅料，所述制剂可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、滴丸、微丸、注射剂等药学上可以接受的药物制剂形式。

所述包含丹酚酸A的药物制剂可以利用本领域公知的方法制备得到。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物每天的合适剂量范围为0.001-150mg/kg体重，优选为0.1-100mg/kg体重，更优选为0.1-60mg/kg体重，最优选为0.2-30mg/kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

附图说明

图1.丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠血脑屏障形态学的影响，其中比例尺为20μm，A代表正常组(N)，B代表模型组(M)，C代表3mg/kg丹酚酸A组(Sal A 3mg/kg)，D代表1mg/kg丹酚酸A组(Sal A 1mg/kg)，E代表0.3mg/kg丹酚酸A组(Sal A 0.3mg/kg)，F代表依达拉奉组(Edaravone)；

图2.丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性痴呆大鼠神经行为学的作用；

图3.丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性痴呆大鼠逃避潜伏期的影响；

图4.丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性痴呆大鼠经过原平台所在位置次数的影响；

图5.丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性痴呆大鼠在目标象限路程的影响；

图6.丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠脑组织MDA含量的影响；

图7.丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠脑组织GSH-Px含量的影响；

图8.丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠脑组织NO含量的影响；

图9.丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠脑组织tNOS含量的影响；

图10.丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠ADP诱导的血小板聚集的影响；

图11.丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠血流动力学改变的影响；

其中，MDA为丙二醛，GSH-Px为谷胱甘肽过氧化物酶，NO为一氧化氮，tNOS为总一氧化氮合酶，ADP为腺苷二磷酸。与正常组相比，**P＜0.01，*P＜0.05；与模型组比，，^##P＜0.01，^#P＜0.05，^&P＜0.1。

具体实施方式

下面的实施例用于进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的保护范围的任何限制。

实施例1.丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠血脑屏障形态学的影响

实验方法：18只SD雄性大鼠，随机分组：正常对照组(N)、模型对照组(M)、丹酚酸A组(3mg/kg，1mg/kg和0.3mg/kg)和依达拉奉组(5mg/kg)，每组3只。给药方法如下，给药体积为0.3ml/100g，模型组尾静脉注射生理盐水，正常组不给予试剂，丹酚酸A组每次给药前生理盐水新鲜配制。依达拉奉用生理盐水配制，尾静脉给药。

微血栓及模型制备方法如下：取同种属大鼠血液约10ml，放于37℃孵箱中干燥成血凝块，在研钵中研碎后分级过200目(直径74μm)、300目(直径48μm)细胞筛，临用前将15mg微血栓溶于0.5ml生理盐水中(30mg/mL)，制备微血栓混悬液。大鼠腹腔注射10％水合氯醛(0.35ml/100g)麻醉，颈中切开皮肤，分离暴露右侧颈总动脉及颈内、外动脉，用动脉夹暂时夹闭颈总动脉近心端，从颈外动脉处逆行穿刺插管注入微血栓混悬液，结扎颈外动脉，然后开放颈总动脉夹，使生理盐水通过颈内动脉进入颅内至大脑各动脉，制备大鼠脑微血管血栓栓塞性疾病模型。

造模后立即给药，24h后，用10％水合氯醛麻醉固定，打开胸腔，分别用生理盐水和4％多聚甲醛灌注固定，开颅取脑。分离海马，用锋利刀片将组织修成约1mm³的小块，并置于4℃预冷的5％戊二醛中固定2h。样品的制备及观察：(1)取出组织块，用4℃的PBS缓冲液冲洗3次，每次10min；(2)用4℃1％的锇酸后固定约1h；(3)4℃条件下乙醇梯度常规脱水：50％、60％、70％、80％、90％、100％，3次，每次10min；(4)Epon812包埋剂浸透：无水丙酮脱水3次，每次10min，1/2无水丙酮+1/2包埋剂1h，包埋剂过夜；(5)包埋：先经37℃与45℃加温各12h，再升温至60℃，保温24h；(6)钻石刀超薄切片，200目铜网捞片；(7)电子染色：载有超薄切片的铜网用醋酸双氧铀染色30min，硝酸铅染色30min。(8)H-6000型透射电镜观察并拍片。

实验结果：正常组电镜下星形细胞和微血管均无肿胀，模型组星型细胞和微血管明显肿胀，内皮细胞反应性增大，引起管腔狭窄。给予丹酚酸A(3mg/kg和1mg/kg)治疗后能显著减轻星型细胞和内皮细胞肿胀，内皮细胞未表现出反应性增大，官腔正常(参见附图1)。因此，丹酚酸A能够显著改善脑微血管栓塞性大鼠血脑屏障形态。

实验结果表明，丹酚酸A具有改善脑微血管血栓栓塞性大鼠血脑屏障形态学变化的作用。

实施例2.丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性痴呆大鼠神经行为学的作用

实验方法：60只SD雄性大鼠，每组10只。分组，造模及给药方法参见实例1，别于动物手术清醒后24h处死前进行神经行为学评分，评分采用Bederson’s评分标准。提鼠尾离开地面约1尺，观察两前肢状况；将大鼠置于水平地面，推动其双肩，观察两侧抵抗力有无差异；大鼠置于地面，观察其行走情况。采用四级评分法(0-4分)，分数越高，说明其神经行为损伤越严重。(1)行为完全正常者，记0分；(2)提起鼠尾离开地面，手术对侧前肢内旋、内收者，记1分；(3)大鼠至地面，用手挤压两侧检查其抗力，手术对侧抗力下降者，记2分；(4)大鼠至地面，观察其行走，围绕手术对侧转圈者，记3分；(5)损伤极其严重，已无法自主活动者，记4分。

实验结果：正常组大鼠无神经行为学改变，模型组大鼠神经行为学评分显著升高；栓塞后给予丹酚酸A 3mg/kg，能显著降低大鼠神经行为学评分(P＜0.05)(参见附图2)。

实验结果表明，丹酚酸A具有改善脑微血管血栓栓塞性大鼠神经行为学变化的作用。

实施例3.丹酚酸A具有能够改善脑微血管血栓栓塞性大鼠学习记忆的能力

研究表明脑微血管血栓栓塞可引起血管性痴呆，导致学习记忆功能减退。本研究采用Morris水迷宫对脑微血管血栓栓塞性大鼠学习记忆功能进行了检测，并观察丹酚酸A对大鼠学习记忆功能的影响。

实验方法：大鼠脑微血管血栓栓塞性疾病分组(n＝10)、造模及给药方法参见实施例1，连续给药2个月，水迷宫实验在手术后2个月进行，环境安静。迷宫内加水，水温(22℃±24℃)，水面下2cm设平台。操作者将大鼠尾部轻轻放入入水点并开始计时120s。动物入水后四处游寻，熟悉环境后趋于游向平台，并允许其在平台停留30s，动物四肢爬上平台的时间为逃避潜伏期。120s内，动物未到达平台，引导动物爬上平台，并让其在平台上停留30s，每天训练2次，每次一个入水点，连续训练5d。第6天撤离平台，进行探索实验，观察动物在120s内经过原平台位置的次数及经过目标象限路程占总路程的百分比。数据采集及图像分析均由图像自动监视和处理系统完成。

实验结果：Morris水迷宫实验发现，正常组大鼠在5天的训练过程中，逃避潜伏期逐渐缩短，模型组大鼠逃避潜伏期也表现出缩短的趋势，但与正常组相比显著升高，表明大鼠学习记忆能力降低。且第4天开始逃避潜伏期稍有升高，表明学习记忆能力持续下降；给予丹酚酸治疗后，微血管血栓栓塞性痴呆大鼠逃避潜伏期显著缩短，第4，5天时逃避潜伏期与模型组相比显著降低，具有统计学意义(参见附图3)。

在探索实验中，与正常组相比，模型组大鼠组经过原平台所在位置的次数显著减少，给予丹酚酸A(1mg/kg和0.3mg/kg)治疗后，能显著增加大鼠经过原平台所在位置的次数(参见附图4)。另外在探索实验中现，各组游过总路程无明显差异；与正常组相比，模型组大鼠组经过目标象限的路程显著减少，给予丹酚酸A(1mg/kg和0.3mg/kg)治疗后，能显著增加大鼠在目标象限的路程(参见附图5)。

实验结果表明，丹酚酸A能够降低脑微血管血栓栓塞性大鼠逃避潜伏期，增加其经过原平台所在位置次数，增加其在目标象限的路程，总之，丹酚酸A具有能够改善脑微血管血栓栓塞性大鼠学习记忆的能力

实施例4.丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠脑组织MDA含量的影响

MDA是氧自由基与生物膜多聚不饱和脂肪酸发生发生脂质过氧化的产物，其产量与氧自由基的量相平行，因此测定MDA可反映氧自由基的水平，间接反映细胞损伤的程度。

实验方法：49只SD雄性大鼠，每组7只。分组，造模及给药方法参见实施例1，24h后，断头取脑，测定脑组织MDA含量。

实验结果：与正常组相比，大鼠颈内静脉注射微血栓后脑MDA水平显著升高，存在显著差异(P＜0.05)。给予丹酚酸A 3mg/kg治疗，大鼠脑内MDA含量显著下降(参见附图6)。

实验结果表明，丹酚酸A可显著降低脑微血管血栓栓塞性大鼠脑组织MDA含量。

实施例5.丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠脑组织GSH-Px含量的影响

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)具有清除自由基，保护细胞免受氧化损伤的作用。因此，检测脑组织GSH-Px水平以观察丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠脑组织抗氧化水平的影响。

实验方法：49只SD雄性大鼠，分组，造模及给药方法参见实施例1，24h后，断头取脑，测定脑组织GSH-Px的含量。

实验结果：与正常组相比，大鼠颈内静脉注射微血栓后脑GSH-Px活力显著降低，存在显著差异(P＜0.05)。给予丹酚酸A 3mg/kg治疗，脑GSH-Px活力显著升高(P＜0.05)(参见附图7)。

实验结果显示，丹酚酸A可显著升高脑微血管血栓栓塞性大鼠脑组织GSH-Px含量。

实施例6.丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠脑组织NO含量的影响

一氧化氮在多种病理生理过程中如血管扩张，神经传递，铁代谢和免疫防御中起重要作用。有报道指出NO在血栓栓塞性中风中起保护性作用，增强的红细胞聚集可抑制一氧化氮表达，降低血流从而导致血管收缩，切应力下降，因此，检测NO水平可反映脑微血管功能及血流动力学改变。

实验方法：49只SD雄性大鼠，分组，造模及给药方法参见实施例1，24h后，断头取脑，测定脑组织NO的含量。

实验结果：模型组与正常组相比，大鼠脑组织中NO含量明显降低，存在显著差异(P＜0.05)。给予丹酚酸A 0.3mg/kg治疗，大鼠脑内NO含量显著升高(参见附图8)。

实验结果显示，丹酚酸A可显著升高脑微血管血栓栓塞性大鼠脑组织NO含量。

实施例7.丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠脑组织tNOS含量的影响

实验方法：49只SD雄性大鼠，分组，造模及给药方法参见实施例1，24h后，断头取脑，测定脑组织tNOS的含量。

实验结果：模型组与正常组相比，大鼠脑组织中tNOS含量明显降低，存在显著差异(P＜0.05)。给予丹酚酸A 0.3mg/kg治疗，大鼠脑内tNOS含量显著升高(参见附图9)。

实验结果显示，丹酚酸A可显著升高脑微血管血栓栓塞性大鼠脑组织tNOS含量。

实施例8.丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠ADP诱导的血小板聚集的影响

血小板聚集率的测定是一种功能性测定，是血小板活化及其释放反应、膜糖蛋白受体等综合因素的共同表现，是血小板功能检测的基础。临床上诊断血小板功能异常的疾病时，例如一些血栓前状态和血栓性疾病，通常可采用血小板聚集实验作初筛试验。测定血小板聚集性的方法有多种，如比浊法、比值法和血栓法等。比浊法检测血小板聚集由Born于1962年首先应用，是近几十年来在临床和临床研究中最常用的检测血小板聚集功能的方法。

实验方法：60只大鼠分组(n＝10)、造模及给药方法参见实例1，取血，置3.8％枸橼酸钠抗凝管抗凝。室温200g离心10min，分离富血小板血浆(PRP)，剩余血样2000g离心10min，分离贫血小板血浆(PPP)，用PPP调PRP血小板浓度为3-4×108Pl/L。按Bom氏比浊法进行血小板聚集实验，用PPP调0，用PRP调100％。取PRP加入比浊管中，37℃温育5min加入诱导剂ADP(终浓度10μM)引起血小板聚集，记录5min内血小板最大聚集率。

实验结果：与正常组相比，模型组大鼠体外诱导的血小板聚集率显著升高(P＜0.05)。预先给予丹酚酸可剂量依赖性的显著的降低血小板聚集率(参见附图10)。提示，丹酚酸A具有抗脑微血管血栓栓塞性大鼠ADP诱导的血小板聚集的作用。

实施例9.丹酚酸A对脑微血管血栓栓塞性大鼠血流动力学变化的影响

血栓与血液黏滞性、血小板聚集性和血管的病理性变化密切相关。研究表明，大多数缺血性疾病的发生最初表现为血液流变学性状的变化，血液黏度增加或血小板聚集增加或加速，使血流阻力增大，诱发血栓形成，从而引起心、脑等重要脏器及周围组织缺血，导致疾病的发生。因而，应用改善异常的血液流变学性状的药物，可以达到早期预防和治疗血栓栓塞性疾病的目的。

实验方法：60只大鼠分组、造模及给药方法参见实例1，取血，全血肝素抗凝。取全血800μl置全功能自动血流变仪中，测定高(150s-1)、中(60s-1)、低(10s-1)切变力下的全血粘度。全血3000rpm离心10min，取血浆500μl置全功能自动血流变仪中测定血浆粘度。取全血440μl，加入15％聚乙烯吡咯烷酮40溶液110μl，充分混匀，取500μl置红细胞变形仪中测定红细胞聚集率。

实验结果：模型组与正常组相比，大鼠全血粘度、血浆粘度和红细胞聚集率显著升高(P＜0.05)，给予丹酚酸A 0.3mg/kg治疗，大鼠全血粘度和血浆粘度显著降低，而给予丹酚酸A 3mg/kg显著降低大鼠红细胞聚集率(参见附图11)。

实验结果显示，丹酚酸A具有降低脑微血管血栓栓塞性大鼠全血粘度、血浆粘度和红细胞聚集的作用。

综上所述，丹酚酸A通过改善血液流变学、增加NO水平、增强脑组织抗氧化能力，从而改善脑微血管病变，保护脑组织，降低脑梗塞，改善神经行为学评分，最终改善脑微血管血栓栓塞性大鼠学习记忆功能，适用于血栓栓塞性脑微血管病变引起的脑组织损伤的治疗。

Claims (3)

1.丹酚酸A在制备用于预防和\或治疗脑微血管血栓栓塞性疾病的药物中的应用，其中所述的脑微血管血栓栓塞性疾病包括特发于脑微血管局部的血栓、由于脑微血管局部血栓引起的脑微血管腔阻塞继而导致的脑组织局部微循环障碍、以及脑组织病变引起的疾病。

2.根据权利要求1所述的应用，其中的药物是由丹酚酸A和药学上可接受的载体和/或助剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其中的药物选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、滴丸、微丸、注射剂。