CN102772633B - 一种治疗肺间质纤维化的药物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗肺间质纤维化药物组合物及其制备方法，该药物组合物以生黄芪、金银花、当归、丹参、浙贝母等为原料，该组合物的制备方法为：对当归、丹参用乙醇回流提取，合并醇提液，药液备用；生黄芪、金银花、浙贝母等加水煎煮，经过乙醇回流提取的当归、丹参药渣单独加水煎煮、滤过，合并滤液，与上述备用药液合并，减压浓缩、干燥，粉碎成细粉，加入常规辅料，按照常规工艺，制得本发明药物组合物。本发明药物组合物对肺间质纤维化疗效确切，作用迅速、时间持久，毒副作用小，并且本发明工艺简单、成本低廉，能耗低，适用于工业化生产。

Description

一种治疗肺间质纤维化的药物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种中药组合物及其制备方法，特别涉及一种用于治疗肺间质纤维化的中药组合物及其制备方法。
背景技术
肺间质纤维化是发病率高，致残率高，死亡率高，严重危害人民身体健康的疾病。特发性肺间质纤维化病因仍然不明，确诊后中位生存期为28.2个月，目前西医尚缺乏有效的治疗手段，口服糖皮质激素的有效率在20％-25％之间，但毒副作用大，病人依从性较差，常需选用肺移植手术，治疗费用高，风险大。因此研发中药抗肺间质纤维化制剂很有必要。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于治疗肺间质纤维化的中药组合物；本发明另一个目的在于提供该组合物的制备方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
本发明中药组合物原料药组成为：
生黄芪10～50重量份  金银花10～30重量份  当归10～30重量份   丹参10～20重量份   浙贝母5～15重量份  生甘草1～10重量份  石韦5～25重量份穿山龙10～20重量份
本发明中药组合物的原料药组成优选为：
生黄芪30重量份   金银花20重量份   当归20重量份    丹参15重量份浙贝母10重量份   生甘草6重量份   石韦15重量份  穿山龙15重量份
本发明中药组合物原料药组成优选为：
生黄芪20重量份  金银花25重量份  当归25重量份  丹参12重量份浙贝母8重量份  生甘草8重量份   石韦20重量份   穿山龙12重量份
本发明中药组合物原料药组成优选为：
生黄芪40重量份  金银花15重量份   当归15重量份  丹参18重量份  浙贝母12重量份  生甘草4重量份  石韦10重量份  穿山龙18重量份。
取上述原料药，加入常规辅料，按照常规工艺，制成片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂、冻干粉针剂或注射制剂。
本发明药物组合物的制备方法包括如下步骤：
取当归、丹参分别用70％～80％乙醇回流提取1～3次，每次加乙醇4～8重量倍，每次0.5～2小时；合并醇提液，在60℃～80℃，回收乙醇至相对密度为1.02～1.06的药液，备用；生黄芪、金银花、浙贝母、石韦、穿山龙、生甘草加水煎煮2～4次，经过乙醇回流提取的当归、丹参药渣单独加水煎煮3次，每次加水6～10重量倍，滤过，在60℃～80℃，合并滤液并浓缩至相对密度为1.02～1.06的药液，与上述备用药液合并，在40℃～60℃，减压浓缩至相对密度为1.12～1.17的稠膏，减压干燥，粉碎成细粉，加入常规辅料，按照常规工艺，制得本发明药物组合物。
本发明药物组合物的制备方法可以优选如下步骤：
取当归、丹参分别用75％乙醇回流提取2次，每次加乙醇6重量倍，每次1小时；合并醇提液，在70℃，回收乙醇至相对密度为1.02～1.06的药液，备用；生黄芪、金银花、浙贝母、石韦、穿山龙、生甘草加水煎煮3次，经过乙醇回流提取的当归、丹参药渣单独加水煎煮3次，每次加水8重量倍，滤过，在70℃，合并滤液并浓缩至相对密度为1.02～1.06的药液，与上述备用药液合并，在50℃，减压浓缩至相对密度为1.12～1.17的稠膏，减压干燥，粉碎成细粉，加入常规辅料，按照常规工艺，制得本发明药物组合物。
本发明药物组合物的制备方法可以优选如下步骤：
取当归、丹参分别用78％乙醇回流提取1次，每次加乙醇5重量倍，每次1.5小时；合并醇提液，在75℃，回收乙醇至相对密度为1.02～1.06的药液，备用；生黄芪、金银花、浙贝母、石韦、穿山龙、生甘草加水煎煮2次，经过乙醇回流提取的当归、丹参药渣单独加水煎煮3次，每次加水9重量倍，滤过，在65℃，合并滤液并浓缩至相对密度为1.02～1.06的药液，与上述备用药液合并，在45℃，减压浓缩至相对密度为1.12～1.17的稠膏，减压干燥，粉碎成细粉，加入常规辅料，按照常规工艺，制得本发明药物组合物。
本发明药物组合物的制备方法包括如下步骤：
取当归、丹参分别用72％乙醇回流提取3次，每次加乙醇7重量倍，每次1小时；合并醇提液，在65℃，回收乙醇至相对密度为1.02～1.06的药液，备用；生黄芪、金银花、浙贝母、石韦、穿山龙、生甘草加水煎煮4次，经过乙醇回流提取的当归、丹参药渣单独加水煎煮3次，每次加水7重量倍，滤过，在75℃，合并滤液并浓缩至相对密度为1.02～1.06的药液，与上述备用药液合并，在55℃，减压浓缩至相对密度为1.12-1.17的稠膏，减压干燥，粉碎成细粉，加入常规辅料，按照常规工艺，制得本发明药物组合物。
上述本发明药物组合物及其制备方法中的重量份与体积份的关系为g/ml的关系。
附图说明：
附图1：本发明药物组合物对博莱霉素致肺间质纤维化大鼠体重的影响
附图2：本发明药物组合物对博莱霉素致肺间质纤维化大鼠血清中III型胶原含量测定结果
附图3：本发明药物组合物对博莱霉素致肺间质纤维化大鼠血清中透明质酸含量测定结果
附图4：本发明药物组合物对博莱霉素致肺间质纤维化大鼠血清中白介素-6测定结果
附图5：各组大鼠在各时间点肺泡炎程度(HE染色)比较曲线及趋势图
附图6：各组大鼠在各时间点肺纤维化程度(HE染色)比较曲线及趋势图
附图7：各组大鼠肺组织中TGF-β1蛋白免疫组化图像分析结果
本发明以生黄芪、金银花、当归、丹参、浙贝母、生甘草、石韦等为主，对肺间质纤维化疗效确切，作用迅速、时间持久，毒副作用小，并且本发明工艺简单、成本低廉，能耗低，适用于工业化生产。
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例一：本发明药物组合物对肺间质纤维化大鼠体重及血清中透明
质酸、III型胶原、白介素-6影响的研究
1实验材料
1.1实验动物
选用健康的成年SD大鼠180只，清洁级，体重200-250g。购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有动物均饲养在洁净级动物房，所有动物在适应性喂养一周后开始实验。
1.2实验药物及试剂
实验药物(本发明药物组合物)：生黄芪30g  金银花20g  当归20g丹参15g
浙贝母10g   生甘草6g    石韦15g   穿山龙15g，取当归、丹参分别用75％乙醇回流提取2次，每次加乙醇6重量倍，每次1小时；合并醇提液，在70℃，回收乙醇至相对密度为1.02～1.06的药液，备用；生黄芪、金银花、浙贝母、石韦、穿山龙、生甘草加水煎煮3次，经过乙醇回流提取的当归、丹参药渣单独加水煎煮3次，每次加水8重量倍，滤过，在70℃，合并滤液并浓缩至相对密度为1.02～1.06的药液，与上述备用药液合并，浓缩至制备为含生药1g/ml溶液。醋酸强的松(实验中作为阳性对照药)，广东华南制药厂生产，批号011201。注射用盐酸博莱霉素，日本化药株式会社制造，批号X12100。
III型胶原、透明质酸、白介素-6放免试剂盒购于上海海研生物技术有限公司。
1.3实验仪器
GC-911-γ-放射免疫计数器(中国科技大学实业总公司)
2实验方法
2.1大鼠造模方法
采用国际上公认博莱霉素诱发肺纤维化的方法制作肺间质纤维化的模型。用1.5％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(2.5mL·kg-1)后将大鼠固定，颈部消毒，切开颈部皮肤，钝性剥离，暴露气管，然后向气管内注入0.3mL博莱霉素生理盐水溶液(5mg·kg-1)或0.9％生理盐水溶液，继续注入0.3mL的空气，注后立即将动物直立并左右旋转，使药液在肺内均匀分布。其中假手术对照组大鼠肺部注入等体积的生理盐水。实验期间，大鼠自由饮水和进食。
2.2实验动物分组和给药方法
动物模型复制：雄性SD大鼠180只，体重200±10g，随机分为博莱霉素(BLM)组(30只)、假手术组(30只)、本发明药物组合物大、中、小剂量组(90只)、阳性药物组(30只)。6组动物同步于实验开始后的第7、14、28天分别随机处死10只。选用本发明药物组合物，根据人与动物剂量进行等效换算。并根据浓度的不同分为小、中、大3个剂量组，低剂量∶中剂量∶高剂量＝1∶2∶4，本发明药物组合物低剂量给与5ml/kg，本发明药物组合物中剂量组给予10ml/kg，本发明药物组合物高剂量组给与20ml/kg，每周灌胃6天。阳性药物组选用临床常规用药强的松，灌胃给予3.5mg/kg，加水稀释为含生药0.35mg/ml，每周灌胃6天。假手术组及模型组均给予生理盐水2ml灌胃，肺间质纤维化造模成功后第1天各治疗组即开始给药。
2.3取材
分别于第7、14、28天时，各组随机抽取10只，用1.5％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(2.5mL·kg-1)后将大鼠固定，腹主动脉取血，分离血清。
2.4指标检测
观察并记录大鼠的体重，采用放免法检测血清中透明质酸、III型胶原及白介素-6的含量。
2.4.1放免法检测血清中透明质酸
采用竞争性放免分析法测定血清中透明质酸。全部操作参照试剂盒说明书进行。
操作步骤：取若干放免测定试管编号后依次放入试管架。将试剂和待测样品平衡至室温，用前缓缓摇匀，然后按表一依次操作(单位：μl)
表一：
数据处理：拟合方式采用Logit-log方程进行，各标准点结合率为B/B0＝[(B-NSB)/(B0-NSB)]*100％。以结合率的对数为纵坐标，标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线。根据个样品管的结合率即可从曲线上查得其透明质酸含量(ng/ml)
2.4.2放免法检测血清中III型胶原的含量
采用竞争性放免分析法测定血清中III型胶原的含量。全部操作参照试剂盒说明书进行。
操作步骤：按表二依次操作(单位：ul)
表二：
数据处理：使用自动γ-计数仪测定沉淀放射性强度时，采用3/2次方程或四参数质量作用定律拟合方式处理数据。
2.4.3放免法检测血清中白介素-6的含量
采用竞争性放免分析法测定血清中白介素-6含量。全部操作参照试剂盒说明书进行。
操作步骤：按表三依次操作(单位：μl)
表三：
数据处理：在半对数坐标纸上绘制标准曲线，并查出样品值。直接给出有关参数，标准曲线及样品浓度。
2.5统计处理
所有实验数据应用SPSS 11.5统计软件进行处理。各组大鼠血清中透明质酸及III型胶原及白介素-6含量的实验结果采用(x±s)表示，进行单因素方差分析，P＜0.05认为组间有显著性差异。
3实验结果
3.1一般情况观察
模型组很快出现皮毛干枯、稀疏，精神不振，饮食减少，从第7天开始明显消瘦，懒动，咳喘；假手术组皮肤光滑，身体健壮，饮食如常，善打斗，体重增加；本发明药物组合物各剂量组皮肤尚可，较活泼，饮食较模型组好，尤以本发明药物组合物中剂量组明显；西药组开始尚可，后期出现消瘦，懒动，皮毛干枯，咳喘等。
3.2本发明药物组合物对博莱霉素致肺间质纤维化大鼠体重的影响
大鼠在造模后体重逐渐下降，在造模后的第7天体重降至最低点，约为正常体重的75％。在造模后的造模14天后体重逐渐回升，到28天已恢复接近正常，经过治疗后的各组，体重下降趋势均有所缓解，可达正常体重的80％左右，尤以中剂量治疗组体重下降趋势最为缓和，达正常体重的87％。具体见表四和附图一。
表四本发明药物组合物对博莱霉素致肺间质纤维化大鼠体重(g)的影响(n＝10)
注：与7天假手术组比较▲▲P＜0.01；与模型组第7天比较**P＜0.01，*P＜0.05与14天假手术组比较P＜0.01
3.3血清中III型胶原含量测定结果
结果详见表五和附图二。
表五本发明药物组合物对博莱霉素致肺间质纤维化大鼠血清中III型胶原含量测定结果(n＝10)ng/ml
注：与假手术组比较▲P＜0.01，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，与大剂量组比较1)P＜0.05，与小剂量组比较2)P＜0.05
从表五和附图二中可以看出：与假手术组相比，7、14、28天时模型组大鼠血清中III型胶原(III-C)的含量均明显升高(P＜0.01)，以28天时血清中III-C的含量最高。与模型组相比，本发明药物组合物大、中、小剂量组均可降低肺纤维化大鼠血清中III-C的含量，其中7d、14d、28d时本发明药物组合物中剂量的降低作用较为显著(P＜0.01)，并与大、小剂量组比较具有差异性(P＜0.05)。
3.4血清中透明质酸含量测定结果
结果详见表六和附图三。
表六本发明药物组合物对博莱霉素致肺间质纤维化大鼠血清中透明质酸含量测定结果(n＝10)ng/ml
注：与假手术组比较▲P＜0.01，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，与大剂量组比较1)P＜0.05，与小剂量组比较2)P＜0.05
从表六和附图三中可以看出：与假手术组相比，7、14、28天时模型组大鼠血清中透明质酸(HA)的含量均明显升高(P＜0.01)，以28天时血清中HA的含量最高。与模型组相比，本发明药物组合物大、中、小剂量组均可降低肺纤维化大鼠血清中HA的含量，其中7d，14d、28d时本发明药物组合物中剂量的降低作用较为显著(P＜0.01)，并与大、小剂量组比较具有差异性(P＜0.05)。
3.5血清中白介素-6含量测定结果
结果详见表七和附图四。
表七本发明药物组合物对博莱霉素致肺间质纤维化大鼠血清中白介素-6测定结果(n＝10)pg/ml
注：与假手术组比较▲P＜0.01，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，与大剂量组比较1)P＜0.05，与小剂量组比较2)P＜0.05
从表七和附图四中可以看出：与假手术组相比，7、14、28天时模型组大鼠血清中白介素-6(IL-6)的含量均明显升高(P＜0.01)，以28天时血清中的IL-6含量最高。与模型组相比，本发明药物组合物大、中、小剂量组均可降低肺纤维化大鼠血清中IL-6的含量，其中7d，14d、28d时本发明药物组合物中剂量的降低作用较为显著(P＜0.01)，并与大、小剂量组比较具有差异性(P＜0.05)。
实验例二：本发明药物组合物对肺间质纤维化大鼠肺组织形态学影响的研究
1实验材料
1.1实验动物
选用健康的成年SD大鼠180只，清洁级，体重200-250g。购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有动物均饲养在洁净级动物房，所有动物在适应性喂养一周后开始实验。
1.2实验药物及试剂
实验药物(本发明药物组合物)同实验例一。醋酸强的松(实验中作为阳性对照药)，广东华南制药厂生产，批号011201。注射用盐酸博莱霉素，日本化药株式会社制造，批号X12100。
1.3实验仪器
鼠板，光源，18号大鼠气管套管，注射器，灭菌手术刀，试管，剪，钳，K-70全自动高速冷冻离心机(湘仪-TOMY联合制造)，匀浆器(型号：JY-250超声粉碎机，浙江三门超声波仪器厂)，病理切片机(型号：LEICA KMI135德国石蜡切片机)，光镜(型号：LEICADMLB德国显微镜)，日本OLYMPUS全自动显微摄像系统。
2实验方法
2.1大鼠造模方法
采用国际上公认博莱霉素诱发肺纤维化的方法制作肺间质纤维化的模型。用1.5％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(2.5ml·kg-1)后将大鼠固定，颈部消毒，切开颈部皮肤，钝性剥离，暴露气管，然后向气管内注入0.3ml博莱霉素生理盐水溶液(5mg·kg-1)或0.9％生理盐水溶液，继续注入0.3ml的空气，注后立即将动物直立并左右旋转，使药液在肺内均匀分布。其中假手术对照组大鼠肺部注入等体积的生理盐水。实验期间，大鼠自由饮水和进食。
2.2实验动物分组和给药方法
动物模型复制：雄性SD大鼠180只，体重200±10g，随机分为博莱霉素(BLM)组(30只)、假手术组(30只)、本发明药物组合物大、中、小剂量组(90只)、阳性药物组(30只)。6组动物同步于实验开始后的第7、14、28天分别随机处死10只。本发明药物组合物，根据人与动物剂量进行等效换算。并根据浓度的不同分为小、中、大3个剂量组，低剂量∶中剂量∶高剂量＝1∶2∶4，本发明药物组合物低剂量5ml/kg，本发明药物组合物中剂量组给予10ml/kg，本发明药物组合物高剂量组20ml/kg，每周灌胃6天。阳性药物组选用临床常规用药强的松，灌胃给予3.5mg/kg，加水稀释为含生药0.35mg/ml，每周灌胃6天。假手术组及模型组均给予生理盐水2ml灌胃，肺间质纤维化造模成功后第1天各治疗组即开始给药。
2.3取材
分别于第7、14、28天时，各组随机抽取10只，用1.5％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(2.5mL·kg-1)后将大鼠固定，取出肺脏，肺组织置于4％多聚甲醛中固定24h，常规石蜡包埋，连续组织切片(厚4μm)，进行苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察肺组织病理变化。
2.4指标检测
①组织病理学检查：参照Szaopiel等方法将肺泡炎和肺纤维化的程度分为四级：0级无明显改变(-)；1级轻度改变，病变范围小于全肺的20％(++)；2级中度改变，病变范围占全肺的20～50％(+++)；3级重度改变，病变范围占全肺的50％以上(++++)。
②病理图像分析：各组动物左肺标本行HE染色后，根据肺泡腔、细胞核及肺间质纤维的灰度不同，将肺组织HE染色病理切片分成以下三个区域：(a)无染区：为肺泡腔，(b)深染区：为细胞核，(c)浅染区：为肺间质纤维结缔组织。
进行图像分析，计算出肺泡炎和肺纤维化分级。
2.5统计处理
本资料所有数据均采用SPSS 11.5进行统计处理，其中计量资料用t检验，计数资料用X2检验，等级资料用秩和检验。
3实验结果
3.1肺大体形态改变
大鼠解剖后肉眼观察，假手术组第7天、14天、28天双肺呈粉红色，表面光滑，弹性良好。模型组第7天，双肺暗红，可见炎性渗出，第14天双肺暗红，散在出血点，第28天肺脏质地坚硬，颜色暗红，表面粗造不平，触之有橡胶感，可见纤维索条及瘢痕。强的松治疗和本发明药物组合物大、中、小治疗组在第7天、14天、28天双肺肺泡炎及纤维化程度较模型组减轻。
3.2肺病理结果
3.2.1光镜观察：假手术组大鼠肺结构清晰，肺泡腔完整，各时间点观察均未出现明显改变。模型组第14天时肺泡间隔水肿增厚，伴有巨噬细胞、淋巴细胞、嗜酸细胞的浸润，细支气管腔内可见分泌物，肺组织局部可见大片的团块状炎症浸润和纤维化灶，肺泡断裂、肺泡结构破坏。28天时肺泡壁显著增厚，肺泡间隔明显增宽，间质内成纤维细胞和胶原基质明显增多，仍有大量有巨噬细胞、淋巴细胞、嗜酸细胞的浸润，病灶内肺泡断裂、融合、闭塞，肺泡结构破坏明显，肺泡萎缩。7天时强的松组和本发明药物组合物大、中、小治疗组肺泡炎比模型组减轻。14天、28天时强的松组和本发明药物组合物大、中、小治疗组肺纤维化均减轻，肺泡隔轻度增厚，肺泡结构破坏轻，肺泡纤维增生较轻。
3.2.2HE染色：
模型组第7天时肺泡隔增宽与炎症细胞浸润最重：肺泡隔增宽，其中大量巨噬细胞、淋巴细胞、嗜酸细胞的浸润(+++～++++)。模型组14天时肺泡隔增宽与炎症细胞浸润较7天时减轻，炎症细胞消散：肺泡隔增宽，有巨噬细胞、淋巴细胞、嗜酸细胞的浸润(++～++++)。强的松组与本发明药物组合物组较模型组病变程度轻。结果见表八、表九和附图
五、附图六。
表八四组大鼠各时间点肺泡炎程度(HE染色)比较
#：与假手术组对照，P＜0.05##：与假手术组对照，P＜0.01*：与模型组对照，P＜0.05
从表八和附图五可以看出：与假手术组相比，7、14、28天时模型组大鼠肺泡炎明显加重(P＜0.01或P＜0.05)。与模型组相比，本发明药物组合物大、中、小治疗组均较模型组肺泡炎减轻(P＜0.05)。
表九四组大鼠各时间点肺纤维化程度(HE染色)比较
#：与假手术组对照，P＜0.05##：与假手术组对照，P＜0.01*：与模型组对照，P＜0.05从表九和附图六可以看出：与假手术组相比，7、14、28天时模型组大鼠肺纤维化明显加重(P＜0.01或P＜0.05)。与模型组相比，本发明药物组合物大、中、小治疗组均较模型组肺纤维化减轻(P＜0.05)。
实验例三本发明药物组合物对肺纤维化大鼠肺组织转化生长因子β1(TGF β1)的影响
1实验材料
1.1实验动物
同实验一
1.2实验药物及试剂
实验药物(本发明药物组合物)同实验例一。醋酸强的松(实验中作为阳性对照药)，广东华南制药厂生产，批号011201。注射用盐酸博莱霉素，日本化药株式会社制造，批号X12100。兔抗人、鼠TGFβ1多克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司产品，即用型SABC免疫组化试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司产品，DAB显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司产品。
1.3实验主要仪器
电泳系统：美国LTI-MODEL，250型匀浆机：中大仪器厂FS-1离心机：HITACHI himacCF15D，紫外分光光度计：UV-1601电转仪：北京六一DYY7C。
2实验方法
2.1大鼠造模方法
同实验例一
2.2实验动物分组
同实验例一
2.3给药方法
同实验例一
2.4指标检测
免疫组化法检测肺组织中TGF-β1表达
免疫组化法[2]：①载玻片防脱片处理。②肺组织常规固定，切片。③切片脱蜡、水洗，去除内源性过氧化物酶后水洗、修复。④滴加正常山羊血清封闭液。⑤滴加最佳稀释度的一抗于湿盒中。⑥0.1mol/L PBS洗，滴加生物素标记二抗，PBS洗5min×3次。⑦滴加SABC，PBS洗5min×3次。⑧DAB显色，光镜下控制显色程度中止反应，蒸馏水冲洗切片。⑨苏木素轻度复染，盐酸酒精分化，自来水冲洗还蓝。梯度酒精逐级脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。
用HPIAS-1000计算机图像分析系统对染色后的切片进行定量分析，计算每张切片阳性细胞染色程度，免疫组化切片以细胞胞浆中呈清晰棕黄色为阳性。高倍镜(×400)下观察，随机选上、下、左、右、中央5个视野，以病灶边缘正好进入检测光栏为准，在40倍物镜下测定标准测量光栏中阳性区域百分比、平均灰度和积分光密度。平均灰度表示图像透光率，与免疫组化阳性染色程度呈负相关(平均灰度值大则阳性表达弱)；积分光密度又称积分吸光度，与免疫组化染色程度呈正相关。
2.5统计学处理
全部数据经SPSS11.5软件处理后，TGFβ1平均阳性表达率结果采用进行单因素方差分析，P＜0.05认为组间有显著性差异。
3实验结果
3.1免疫组化法检测肺组织中TGF-β1表达
180只大鼠肺组织切片，每例分别随机选取40个高倍视野(×400)，运用图像分析软件(HPIAS一1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统)对选取视野内TGF1的阳性信号进行半定量分析，测定阳性细胞的积分光密度(IOD)。
详见表十和附图七。
表十各组大鼠肺组织中TGF-β1蛋白免疫组化图像分析结果(n＝10)
注：与假手术组比较▲P＜0.01，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，与大剂量组比较1)P＜0.05，与小剂量组比较2)P＜0.05
从表十和附图七中可以看出：肺组织中TGF-β1的阳性部位主要在细胞质表达，主要分布于支气管上皮细胞、肺泡巨噬细胞、血管内皮细胞和肺成纤维细胞。与假手术组相比，7、14、28天时模型组大鼠肺组织中TGF-β1表达均明显升高(P＜0.01)，其中7天时大鼠肺组织中TGF-β1表达最少。与模型组相比，本发明药物组合物大、中、小剂量组均可减少肺纤维化大鼠肺组织中TGF-β1表达，其中7d，14d、28d时本发明药物组合物中剂量的降低作用较为显著(P＜0.01)，并与大、小剂量组比较具有差异性(P＜0.05)。
下述实施例均能实现上述实验例的效果。
具体实施方式
实施例一：本发明颗粒剂的制备
生黄芪30g  金银花20g  当归20g  丹参15g  浙贝母10g  生甘草6g  石韦15g  穿山龙15g
取当归、丹参分别用75％乙醇回流提取2次，每次加乙醇6重量倍，每次1小时；合并醇提液，在70℃，回收乙醇至相对密度为1.02～1.06的药液，备用；生黄芪、金银花、浙贝母、石韦、穿山龙、生甘草加水煎煮3次，经过乙醇回流提取的当归、丹参药渣单独加水煎煮3次，每次加水8重量倍，滤过，在70℃，合并滤液并浓缩至相对密度为1.02～1.06的药液，与上述备用药液合并，在50℃，减压浓缩至相对密度为1.12～1.17的稠膏，减压干燥，粉碎成细粉，加入常规辅料，按照常规工艺，制成颗粒剂。
实施例二：本发明片剂的制备
生黄芪20g    金银花25g    当归25g   丹参12g  浙贝母8g   生甘草8g  石韦20g  穿山龙12g
取当归、丹参分别用75％乙醇回流提取2次，每次加乙醇6重量倍，每次1小时；合并醇提液，在70℃，回收乙醇至相对密度为1.02～1.06的药液，备用；生黄芪、金银花、浙贝母、石韦、穿山龙、生甘草加水煎煮3次，经过乙醇回流提取的当归、丹参药渣单独加水煎煮3次，每次加水8重量倍，滤过，在70℃，合并滤液并浓缩至相对密度为1.02～1.06的药液，与上述备用药液合并，在50℃，减压浓缩至相对密度为1.12～1.17的稠膏，减压干燥，粉碎成细粉，加入常规辅料，按照常规工艺，制成片剂。
实施例三：本发明散剂的制备
生黄芪40g   金银花15g  当归15g  丹参18g  浙贝母12g    生甘草4g  石韦10g  穿山龙18g
取当归、丹参分别用78％乙醇回流提取1次，每次加乙醇5重量倍，每次1.5小时；合并醇提液，在75℃，回收乙醇至相对密度为1.02～1.06的药液，备用；生黄芪、金银花、浙贝母、石韦、穿山龙、生甘草加水煎煮2次，经过乙醇回流提取的当归、丹参药渣单独加水煎煮3次，每次加水9重量倍，滤过，在65℃，合并滤液并浓缩至相对密度为1.02～1.06的药液，与上述备用药液合并，在45℃，减压浓缩至相对密度为1.12-1.17的稠膏，减压干燥，粉碎成细粉，加入常规辅料，按照常规工艺，制成散剂。
实施例四：本发明丸剂的制备
生黄芪20g   金银花25g  当归25g  丹参12g   浙贝母8g   生甘草8g  石韦20g  穿山龙12g
取当归、丹参分别用72％乙醇回流提取3次，每次加乙醇7重量倍，每次1小时；合并醇提液，在65℃，回收乙醇至相对密度为1.02～1.06的药液，备用；生黄芪、金银花、浙贝母、石韦、穿山龙、生甘草加水煎煮4次，经过乙醇回流提取的当归、丹参药渣单独加水煎煮3次，每次加水7重量倍，滤过，在75℃，合并滤液并浓缩至相对密度为1.02～1.06的药液，与上述备用药液合并，在55℃，减压浓缩至相对密度为1.12～1.17的稠膏，减压干燥，粉碎成细粉，加入常规辅料，按照常规工艺，制得丸剂。
实施例五：本发明胶囊的制备
生黄芪15g  金银花20g  当归25g  丹参18g   浙贝母10g   生甘草5g  石韦20g  穿山龙15g
取当归、丹参分别用72％乙醇回流提取3次，每次加乙醇7重量倍，每次1小时；合并醇提液，在65℃，回收乙醇至相对密度为1.02-1.06的药液，备用；生黄芪、金银花、浙贝母、石韦、穿山龙、生甘草加水煎煮4次，经过乙醇回流提取的当归、丹参药渣单独加水煎煮3次，每次加水7重量倍，滤过，在75℃，合并滤液并浓缩至相对密度为1.02～1.06的药液，与上述备用药液合并，在55℃，减压浓缩至相对密度为1.12～1.17的稠膏，减压干燥，粉碎成细粉，加入常规辅料，按照常规工艺，制得胶囊。
实施例六：本发明口服液的制备
生黄芪30g  金银花20g  当归20g  丹参15g  浙贝母10g  生甘草6g石韦15g   穿山龙15g
取上述原料药，按照常规工艺，加入常规辅料制成口服液。

Claims (13)

1.一种治疗肺间质纤维化的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料药组成为：
生黄芪10～50重量份  金银花10～30重量份  当归10～30重量份  丹参10～20重量份  浙贝母5～15重量份  生甘草1～10重量份  石韦5～25重量份  穿山龙10～20重量份。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料药组成为：
生黄芪30重量份  金银花20重量份  当归20重量份  丹参15重量份浙贝母10重量份  生甘草6重量份  石韦15重量份  穿山龙15重量份。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料药组成为：
生黄芪20重量份  金银花25重量份  当归25重量份  丹参12重量份浙贝母8重量份  生甘草8重量份  石韦20重量份  穿山龙12重量份。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料药组成为：
生黄芪40重量份  金银花15重量份  当归15重量份  丹参18重量份浙贝母12重量份  生甘草4重量份  石韦10重量份  穿山龙18重量份。
5.如权利要求1-4任一所述的药物组合物，其特征在于取原料药，加入常规辅料，按照常规工艺，制成片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述胶囊剂为软胶囊剂。
7.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述丸剂为滴丸或蜜丸。
8.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述注射制剂为冻干粉针剂。
9.如权利要求1-4任一所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法为：
取当归、丹参分别用70%～80%乙醇回流提取1～3次，每次加乙醇4～8重量倍，每次0.5～2小时；合并醇提液，在60℃～80℃，回收乙醇至相对密度为1.02～1.06的药液，备用；生黄芪、金银花、浙贝母、石韦、穿山龙、生甘草加水煎煮2～4次，经过乙醇回流提取的当归、丹参药渣单独加水煎煮3次，每次加水6～10重量倍，滤过，在60℃～80℃，合并滤液并浓缩至相对密度为1.02～1.06的药液，与上述备用药液合并，在40℃～60℃，减压浓缩至相对密度为1.12～1.17的稠膏，减压干燥，粉碎,加入常规辅料，按照常规工艺，制得药物组合物。
10.如权利要求6所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法为：
取当归、丹参分别用75%乙醇回流提取2次，每次加乙醇6重量倍，每次1小时；合并醇提液，在70℃，回收乙醇至相对密度为1.02—1.06的药液，备用；生黄芪、金银花、浙贝母、石韦、穿山龙、生甘草加水煎煮3次，经过乙醇回流提取的当归、丹参药渣单独加水煎煮3次，每次加水8重量倍，滤过，在70℃，合并滤液并浓缩至相对密度为1.02～1.06的药液，与上述备用药液合并，在50℃，减压浓缩至相对密度为1.12～1.17的稠膏，减压干燥，粉碎,加入常规辅料，按照常规工艺，制得药物组合物。
11.如权利要求6所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法为：
取当归、丹参分别用78%乙醇回流提取1次，每次加乙醇5重量倍，每次1.5小时；合并醇提液，在75℃，回收乙醇至相对密度为1.02～1.06的药液，备用；生黄芪、金银花、浙贝母、石韦、穿山龙、生甘草加水煎煮2次，经过乙醇回流提取的当归、丹参药渣单独加水煎煮3次，每次加水9重量倍，滤过，在65℃，合并滤液并浓缩至相对密度为1.02～1.06的药液，与上述备用药液合并，在45℃，减压浓缩至相对密度为1.12～1.17的稠膏，减压干燥，粉碎,加入常规辅料，按照常规工艺，制得药物组合物。
12.如权利要求6所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法为：
取当归、丹参分别用72%乙醇回流提取3次，每次加乙醇7重量倍，每次1小时；合并醇提液，在65℃，回收乙醇至相对密度为1.02～1.06的药液，备用；生黄芪、金银花、浙贝母、石韦、穿山龙、生甘草加水煎煮4次，经过乙醇回流提取的当归、丹参药渣单独加水煎煮3次，每次加水7重量倍，滤过，在75℃，合并滤液并浓缩至相对密度为1.02～1.06的药液，与上述备用药液合并，在55℃，减压浓缩至相对密度为1.12～1.17的稠膏，减压干燥，粉碎,加入常规辅料，按照常规工艺，制得药物组合物。
13.如权利要求1-4任一所述的药物组合物在制备治疗肺间质纤维化药物中的应用。
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