CN102766179A - 灯盏细辛酚有关物质的提取分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种灯盏细辛酚有关物质的提取分离方法，包括取灯盏细辛酚，加乙醇溶液溶解，制成供试品；将供试品用大孔吸附树脂进行柱层析，分别得到A组分和B组分；再分别采用高压液相色谱仪进行分离，得到六个化合物，分别为灯盏甲素、芹菜素、3,4-二咖啡酰基奎宁酸、1,3,5-三咖啡酰基奎宁酸、3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸、飞蓬酯乙乙酯。所述六个化合物在灯盏细辛酚中的质量百分比含量分别为：灯盏甲素1.51%以下、芹菜素1.30%以下、3,4-二咖啡酰基奎宁酸0.95%以下、1,3,5-三咖啡酰基奎宁酸0.55%以下、3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸0.33%以下、飞蓬酯乙乙酯0.42%以下。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物中所含物质的提取分离方法，尤其涉及一种灯盏细辛酚有关物质的提取分离方法，属于医药技术领域。
背景技术
灯盏细辛是菊科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus(Vant.)Hand-Mazz的干燥全草，又名灯盏花、东菊，主要分布于我国西南地区，尤以云南较多。首载于《滇南本草》，《中国药典》1977年版一部曾予收载。灯盏细辛性寒、微苦、甘温辛，具有微寒解毒、祛风除湿、活血化瘀、通经活络、消炎止痛的功效。灯盏细辛在临床上除主要用于心脑血管系统疾病外，在糖尿病、肾病、颈性眩晕、老年性疾病的治疗上也有较好的疗效。基于其确切的药理作用及广泛的临床应用，因此灯盏细辛具有良好的开发前景。
灯盏细辛酚是以灯盏细辛为基础研究开发的一种中成药，经过大量的药理实验及临床实验证明其在脑血管疾病方面具有确切的疗效。作为药品，除了应具有确切的疗效外，其安全性也是不容忽视的一个方面。把其中所含的成分弄清楚是保证其安全性的首要前提。我们建立了灯盏细辛酚标准指纹图谱（参见专利“灯盏细辛酚原料药和制剂标准指纹图谱、建立方法及应用”，申请号：201110315301.X），对其中的物质进行了详细的分析和指认。
本发明在已建立的指纹图谱基础上，对其中除五个主要成分（灯盏乙素、3,5-二咖啡酰基奎宁酸、1,5-二咖啡酰基奎宁酸、飞蓬酯乙、4,5-二咖啡酰基奎宁酸）以外的六个化合物进行提取分离、结构鉴定及控制方法研究，进一步明确了灯盏细辛酚中所含物质及其基本性质，以及其在灯盏细辛酚中的控制方法，为灯盏细辛酚的安全性评价及质量控制体系做了进一步的补充和完善。
发明内容
因此，本发明的目的是为了进一步明确灯盏细辛酚有关物质及其基本性质，提供一种灯盏细辛酚有关物质的提取分离方法，从而能够最大限度地弄清灯盏细辛酚中所含成分，并更好地对灯盏细辛酚的质量进行评价和控制。
除非特别指明，本文中的“灯盏细辛酚有关物质”是指：3,4-二咖啡酰基奎宁酸、灯盏甲素、1,3,5-三咖啡酰基奎宁酸、3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸、芹菜素和飞蓬酯乙乙酯。
针对上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种灯盏细辛酚有关物质的提取分离方法，所述方法包括以下步骤：
1）提取工艺：取灯盏细辛酚，加乙醇溶液溶解，制成供试品；
2）分离工艺：将步骤1）中制得的供试品进行柱层析，先用水洗脱，再用乙醇溶液洗脱，然后再用乙酸乙酯萃取，分别得到下层的乙醇提取液即A组分和上层的乙酸乙酯萃取液即B组分；
3）再将步骤2）制得的A组分和B组分分别通过高压液相色谱仪分离，其中A组分得到1、2号化合物，B组分得到3、4、5、6号化合物；
4）利用核磁共振氢谱和碳谱鉴定1-6号化合物，所述1号化合物为灯盏甲素；所述2号化合物为芹菜素；所述3号化合物为3,4-二咖啡酰基奎宁酸；所述4号化合物为1,3,5-三咖啡酰基奎宁酸；所述5号化合物为3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸；所述6号化合物为飞蓬酯乙乙酯；
5）根据已建立的灯盏细辛酚的指纹图谱，计算步骤4）鉴定的所述六个化合物的峰分别占总峰面积的百分比，从而分别得出所述六个化合物在灯盏细辛酚中的质量百分比含量的步骤，其中灯盏甲素为1.51%、芹菜素为1.30%、3,4-二咖啡酰基奎宁酸为0.95%、1,3,5-三咖啡酰基奎宁酸为0.55%、3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸为0.33%和飞蓬酯乙乙酯为0.42%。
优选地，在步骤2）中，所述分离工艺通过包括以下步骤的方法进行：
将步骤1）中制得的供试品用大孔吸附树脂进行柱层析，先用水洗脱，弃去洗脱液，再用乙醇溶液洗脱；收集乙醇溶液洗脱液后，用乙酸乙酯萃取，分别得到下层的乙醇提取液即A组分和上层的乙酸乙酯萃取液即B组分；
优选地，在步骤3）中，通过包括以下步骤的方法进行：
将步骤2）中得到的A组分用盐酸调节pH值至有沉淀析出，将沉淀 滤出，并用四氢呋喃-甲醇溶液溶解后，再通过高压液相色谱仪进行分离，其中以乙醇-水为流动相，梯度洗脱，得到1、2号化合物；及
将步骤2）中得到的B组分减压蒸干后的固体物，用丙酮溶解后，再通过高压液相色谱仪进行分离，其中以石油醚-丙酮为流动相，梯度洗脱，得到3、4、5、6号化合物。
优选地，所述步骤1）所述乙醇溶液的浓度为50体积%。
优选地，在步骤2）中，所述大孔树脂为DM-130。
优选地，在步骤2）中，所述乙醇溶液的浓度为50体积%。
优选地，在步骤3）中，调节pH至4。
优选地，在步骤3）中，所述四氢呋喃-甲醇溶液中四氢呋喃和甲醇的体积比为1：1。
优选地，在步骤3）中，以乙醇-水为流动相，梯度洗脱的条件如下：
0~30分钟内，流动相中乙醇的浓度为50体积%，水的浓度为50体积%；于另外的10分钟内，乙醇的浓度匀速变为70体积%，水的浓度匀速变为30体积%，得到1号化合物；再于另外的20分钟内，乙醇的浓度匀速变为95体积%，水的浓度匀速变为5体积%，得到2号化合物。
优选地，在步骤3）中，以石油醚-丙酮为流动相，梯度洗脱的条件如下：
0~25分钟内，流动相中石油醚的浓度为80体积%，丙酮的浓度为20体积%；于另外的5分钟内，石油醚的浓度匀速变为60体积%，丙酮的浓度匀速变为40体积%，得到3号化合物；再于另外的20分钟内，石油醚的浓度匀速变为50体积%，丙酮的浓度匀速变为50体积%；还于另外的5分钟内，石油醚的浓度匀速变为40体积%，丙酮的浓度匀速变为60体积%，得到4号化合物；再于另外的5分钟内，石油醚的浓度匀速变为30体积%，丙酮的浓度匀速变为70体积%，得到5号化合物；及于另外的5分钟内，石油醚的浓度匀速变为20体积%，丙酮的浓度匀速变为80体积%，得到5号化合物。
另一方面，本发明提供一种由本发明提取分离方法得到的灯盏细辛酚有关物质，所述灯盏细辛酚有关物质包括在灯盏细辛酚中的质量百分比含量分别如下的六个化合物：灯盏甲素为1.51%以下、芹菜素为1.30%以下、3,4-二咖啡酰基奎宁酸为0.95%以下、1,3,5-三咖啡酰基奎宁酸为0.55%以下、3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸为0.33%以下、飞蓬酯乙乙酯为0.42%以下。
上述六个化合物的含量总和占灯盏细辛酚质量百分比含量的5.06%以下。
具体的提取分离流程如图2所示。
本发明所述方法，在已建立的指纹图谱基础上，对其中除五个主要成分（灯盏乙素、3,5-二咖啡酰基奎宁酸、1,5-二咖啡酰基奎宁酸、飞蓬酯乙、4,5-二咖啡酰基奎宁酸）以外的六个化合物进行提取分离及结构鉴定，进一步明确了灯盏细辛酚有关物质及其基本性质，为灯盏细辛酚的安全性评价及质量控制体系做了进一步的补充和完善。对灯盏细辛酚有关物质的研究对于进一步明确灯盏细辛酚的化学成分及其安全性等具有重要意义，并可作为灯盏细辛酚质量控制的辅助手段，以及质量评价的依据之一。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为所述的灯盏细辛酚的指纹图谱；
图2为本发明的灯盏细辛酚的有关物质的提取分离方法的流程图；
图3为实施例2所述的本发明灯盏细辛酚的有关物质的提取分离方法的流程图。
具体实施方式
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂，可且从常规渠道获得。
除非特别指明，以下实施例中所用的高压液相色谱的型号为“岛津LC-8A”。
除非特别指明，以下实施例中所用的核磁共振仪型号为布鲁克公司（Bruker）公司的Am-400。
实施例1灯盏细辛酚有关物质的界定
根据10批样品20个测试数据建立了灯盏细辛酚指纹图谱（见图1）（具体参见专利“灯盏细辛酚原料药和制剂标准指纹图谱、建立方法及应用”，申请号：201110315301.X）。该指纹图谱中共有11个色谱峰，分别为：9号峰——野黄芩苷、10号峰——3,4-二咖啡酰基奎宁酸、11号峰——3,5-二咖啡酰基奎宁酸、12号峰——1,5-二咖啡酰基奎宁酸、13号峰——飞蓬酯乙、14号峰——灯盏甲素、15号峰——4,5-二咖啡酰基奎宁酸、18号峰——1,3,5-三咖啡酰基奎宁酸、19号峰——3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸、20号峰——芹菜素、21号峰——飞蓬酯乙乙酯。
其中9号峰——野黄芩苷，11号峰——3,5-二咖啡酰基奎宁酸，12号峰——1,5-二咖啡酰基奎宁酸，13号峰——飞蓬酯乙，15号峰——4,5-二咖啡酰基奎宁酸为灯盏细辛酚中五个主要有效成分。除以上五个主要成分以外，尚有10、14、18、19、20、21六个色谱峰，此六个色谱峰所代表的基础物质即为本发明所述的灯盏细辛酚有关物质。
实施例2灯盏细辛酚有关物质的分离
1、供试品制备及拆分
取灯盏细辛酚，加50体积%乙醇溶液溶解，制成供试品；将供试品用大孔吸附树脂（DM-130，购自山东鲁抗医药股份有限公司树脂分厂）进行柱层析，先用水洗脱，再用50体积%乙醇洗脱。收集50体积%乙醇洗脱液，用乙酸乙酯萃取，分别得到乙醇提取液（A组分）和乙酸乙酯萃取液（B组分）。
2、灯盏细辛酚有关物质分离、精制
将A组分用盐酸调至pH=4，即有沉淀析出，将沉淀滤出，用四氢呋喃-甲醇（1:1）溶液溶解后，采用高压液相色谱仪进行分离，得到1、2号化合物。流动相采用乙醇-水梯度洗脱，具体洗脱条件如表1所示：
表1梯度洗脱条件
| 时间（min） | 乙醇（体积%） | 水（体积%） | |
| 0~30 | 50 | 50 | 弃去 |
| 31~40 | 70 | 30 | 1号化合物 |
| 40~60 | 95 | 5 | 2号化合物 |
将B组分减压蒸干后的固体物，用丙酮溶解后，采用高压液相色谱仪进行分离，得到3、4、5、6号化合物。流动相采用石油醚-丙酮梯度洗脱，具体洗脱条件如表2所示：
表2梯度洗脱条件
| 时间（min） | 石油醚（体积%） | 丙酮（体积%） | |
| 0~25 | 80 | 20 | 弃去 |
| 26~30 | 60 | 40 | 3号化合物 |
| 31~50 | 50 | 50 | 弃去 |
| 51~55 | 40 | 60 | 4号化合物 |
| 56~60 | 30 | 70 | 5号化合物 |
| 61~65 | 20 | 80 | 6号化合物 |
提取分离流程如图3所示。
实施例3灯盏细辛酚有关物质的结构鉴定
利用核磁共振氢谱、碳谱等手段，鉴定出6个化合物分别如下：
1、1号化合物——灯盏甲素
表3灯盏甲素基本性质
表4灯盏甲素核磁共振氢谱（1H-NMR）
表5灯盏甲素核磁共振碳谱（13C-NMR）
2、2号化合物——芹菜素
表6芹菜素基本性质
表7芹菜素核磁共振氢谱（1H-NMR）
表8芹菜素核磁共振碳谱（13C-NMR）
3、3号化合物——3,4-二咖啡酰基奎宁酸
表93,4-二咖啡酰基奎宁酸基本性质
表103,4-二咖啡酰基奎宁酸核磁共振氢谱（1H-NMR）、碳谱（13C-NMR）
4、4号化合物——1,3,5-三咖啡酰基奎宁酸
表111,3,5-三咖啡酰基奎宁酸基本性质
表121,3,5-三咖啡酰基奎宁酸核磁共振氢谱（1H-NMR）、碳谱（13C-NMR）
5、5号化合物——3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸
表133,4,5-三咖啡酰基奎宁酸基本性质
表143,4,5-三咖啡酰基奎宁酸核磁共振氢谱（1H-NMR）、碳谱（13C-NMR）
6、6号化合物——飞蓬酯乙乙酯
表15飞蓬酯乙乙酯基本性质
表16飞蓬酯乙乙酯核磁共振氢谱（1H-NMR）、碳谱（13C-NMR）
实施例4灯盏细辛酚有关物质中各物质的质量百分比含量的确定
从图1所示的灯盏细辛酚指纹图谱中，计算各色谱峰占总峰面积的百分比分别为，9号峰：39.79%、10号峰：0.95%、11号峰：32.39%、12号峰：5.90%、13号峰：6.48%、14号峰：1.51%、15号峰：8.16%、18号峰：0.55%、19号峰：0.33%、20号峰：1.30%及21号峰：0.42%。
其中，10号峰——3,4-二咖啡酰基奎宁酸、14号峰——灯盏甲素、18号峰——1,3,5-三咖啡酰基奎宁酸、19号峰——3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸、20号峰——芹菜素、21号峰——飞蓬酯乙乙酯六个化合物为本发明所述的灯盏细辛酚有关物质，其占比分别为：10号峰：0.95%、14号峰：1.51%、18号峰：0.55%、19号峰：0.33%、20号峰：1.30%及21号峰：0.42%。
以灯盏细辛指纹图谱为依据制定所述六个化合物在灯盏细辛酚中质量百分比的控制标准分别为，灯盏甲素：1.51%以下、芹菜素：1.30%以下、3,4-二咖啡酰基奎宁酸：0.95%以下、1,3,5-三咖啡酰基奎宁酸：0.55%以下、3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸：0.33%以下、飞蓬酯乙乙酯：0.42%以下。六个化合物的含量总和占灯盏细辛酚质量百分比在5.06%以下，为灯盏细辛酚的安全性评价及质量控制体系做了进一步的补充和完善。
Claims (9)
1.一种灯盏细辛酚有关物质的提取分离方法，所述提取分离方法包括以下步骤：
1）提取工艺：取灯盏细辛酚，加乙醇溶液溶解，制成供试品；
2）分离工艺：将步骤1）中制得的供试品进行柱层析，先用水洗脱，再用乙醇溶液洗脱，然后再用乙酸乙酯萃取，分别得到下层的乙醇提取液即A组分和上层的乙酸乙酯萃取液即B组分；
3）再将步骤2）制得的A组分和B组分分别通过高压液相色谱仪分离，其中A组分得到1、2号化合物，B组分得到3、4、5、6号化合物；
4）利用核磁共振氢谱和碳谱鉴定1-6号化合物，所述1号化合物为灯盏甲素；所述2号化合物为芹菜素；所述3号化合物为3,4-二咖啡酰基奎宁酸；所述4号化合物为1,3,5-三咖啡酰基奎宁酸；所述5号化合物为3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸；所述6号化合物为飞蓬酯乙乙酯；
5）根据已建立的灯盏细辛酚的指纹图谱，计算步骤4）鉴定的所述六个化合物的峰分别占灯盏细辛酚的指纹图谱总峰面积的百分比，从而分别得出所述六个化合物在灯盏细辛酚中质量百分比分别为，灯盏甲素：1.51%以下、芹菜素：1.30%以下、3,4-二咖啡酰基奎宁酸：0.95%以下、1,3,5-三咖啡酰基奎宁酸：0.55%以下、3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸：0.33%以下、飞蓬酯乙乙酯：0.42%以下。
2.根据权利要求1所述的灯盏细辛酚有关物质的提取分离方法，其特征在于，在步骤2）中，所述分离工艺通过包括以下步骤的方法进行：
将步骤1）中制得的供试品用大孔吸附树脂进行柱层析，优选地，所述大孔树脂为DM-130，先用水洗脱，弃去洗脱液，再用乙醇溶液洗脱，收集乙醇溶液洗脱液，再用乙酸乙酯萃取，分别得到下层的乙醇提取液即A组分和上层的乙酸乙酯萃取液即B组分。
3.根据权利要求1或2所述的灯盏细辛酚有关物质的提取分离方法，其特征在于，在步骤3）中，通过包括以下步骤的方法进行：
将步骤2）中得到的A组分用盐酸调节pH至有沉淀析出，将沉淀滤出，并用四氢呋喃-甲醇溶液溶解后，再通过高压液相色谱仪进行分离，其中以乙醇-水为流动相，梯度洗脱，得到1、2号化合物；及
将步骤2）中得到的B组分减压蒸干后的固体物，用丙酮溶解后，再通过高压液相色谱仪进行分离，其中以石油醚-丙酮为流动相，梯度洗脱，得到3、4、5、6号化合物。
4.根据权利要求1至3任一项所述的提取分离方法，其特征在于，在步骤1）中，所述乙醇溶液的浓度为50体积%。
5.根据权利要求1至4任一项所述的提取分离方法，其特征在于，在步骤2）中，所述乙醇溶液的浓度为50体积%。
6.根据权利要求1至5任一项所述的提取分离方法，其特征在于，在步骤3）中，调节pH值至4；优选地，所述四氢呋喃-甲醇溶液中四氢呋喃和甲醇的体积比为1：1。
7.根据权利要求1至6任一项所述的提取分离方法，其特征在于，在步骤3）中，以乙醇-水为流动相，梯度洗脱的条件如下：
0~30分钟内，乙醇-水流动相中乙醇的浓度为50体积%，水的浓度为50体积%；于另外的10分钟内，乙醇的浓度匀速变为70体积%，水的浓度匀速变为30体积%，得到1号化合物；再于另外的20分钟内，乙醇的浓度匀速变为95体积%，水的浓度匀速变为5体积%，得到2号化合物。
8.根据权利要求1至7任一项所述的提取分离方法，其特征在于，在步骤3）中，以石油醚-丙酮为流动相，梯度洗脱的条件如下：
0~25分钟内，石油醚-丙酮流动相中石油醚的浓度为80体积%，丙酮的浓度为20体积%；于另外的5分钟内，石油醚的浓度匀速变为60体积%，丙酮的浓度匀速变为40体积%，得到3号化合物；再于另外的20分钟内，石油醚的浓度匀速变为50体积%，丙酮的浓度匀速变为50体积%；还于另外的5分钟内，石油醚的浓度匀速变为40体积%，丙酮的浓度匀速变为60体积%，得到4号化合物；再于另外的5分钟内，石油醚的浓度匀速变为30体积%，丙酮的浓度匀速变为70体积%，得到5号化合物；及于另外的5分钟内，石油醚的浓度匀速变为20体积%，丙酮的浓度匀速变为80体积%，得到6号化合物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的提取分离方法得到的灯盏细辛酚有关物质，所述灯盏细辛酚有关物质包括在灯盏细辛酚中质量百分比含量分别如下的六个化合物：灯盏甲素为1.51%以下、芹菜素为1.30%以下、3,4-二咖啡酰基奎宁酸为0.95%以下、1,3,5-三咖啡酰基奎宁酸为0.55%以下、3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸为0.33%以下、飞蓬酯乙乙酯为0.42%。
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