CN102749243B - 一种虾类胚胎的细胞核染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种虾类胚胎的细胞核染色方法。本发明方法首先取虾类胚胎置于3～5倍胚胎体积的A溶液中,静置分层后移除上层液相；加入2倍胚胎体积的正庚烷和4倍胚胎体积的甲醇，静置分层后移除上层溶液和中间层膜状组织；加入3～5倍胚胎体积的甲醇进行洗涤，重复洗涤3～5次；加入3～5倍胚胎体积的缓冲液进行洗涤，重复洗涤3～5次；避光浸泡在1～2倍胚胎体积的浓度为5～10ug/ml的DAPI溶液中进行细胞核染色，静置分层后移除液相；加入3～5倍胚胎体积的磷酸缓冲液进行洗涤，重复洗涤3～5次，得到最终的胚胎。本发明操作方法简单，实施步骤快捷，染色效果清晰。
Description
技术领域
本发明涉及一种胚胎的细胞核染色方法,具体涉及一种虾类胚胎的细胞核染色方法。
背景技术
DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记作用，常用于细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。
虾属节肢动物，体外由甲壳覆盖，种类繁多，具有很好的养殖效益和产业前景。在水产苗种繁育领域，常常需要对胚胎的发育过程进行检测和监控，观察胚胎发育的实时进展。
目前，虾类的胚胎发育观测主要是利用显微镜对胚胎外部形态变化和发育情况进行观察，还未有合适的检测手段对胚胎细胞的分裂和分化情况进行检测。其主要原因是虾类胚胎外部包裹的初级卵黄膜干扰了染料穿透，从而妨碍了其对细胞核及双链DNA的染色效果。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种虾类胚胎的细胞核染色方法，实现虾类胚胎发育各个阶段的细胞分裂和分化的观测要求。
本发明为解决其技术问题所采取的技术方案是：
步骤(1).取虾类胚胎，置于3～5倍胚胎体积的A溶液中,常温条件下振荡20～40分钟，得到第一次处理后的胚胎液；
所述的A溶液为体积比为1:1的正庚烷和多聚甲醛溶液的混合液，其中多聚甲醛溶液中多聚甲醛的质量含量为4﹪；
步骤(2).待第一次处理后的胚胎液静置分层后用移液枪移除上层液相，得到的固相为第一次处理后的胚胎；
此时的液相包括水相和正庚烷；
步骤(3).将第一次处理后的胚胎重新加入2倍胚胎体积的正庚烷和4倍胚胎体积的甲醇，充分混合后得到第二次处理后的胚胎液；
步骤(4).待第二次处理后的胚胎液静置分层后用移液枪移除上层溶液和中间层膜状组织，得到第二次处理后的胚胎；
步骤(5).将第二次处理后的胚胎加入3～5倍胚胎体积的甲醇进行洗涤，静置分层后用移液枪移除液相，重复洗涤3～5次，得到第三次处理后的胚胎；
此时的液相为甲醇；
步骤(6).将第三次处理后的胚胎加入3～5倍胚胎体积的缓冲液进行洗涤，静置分层后用移液枪移除液相，重复洗涤3～5次，得到第四次处理后的胚胎；
所述的缓冲液为含有曲拉通X-100的磷酸缓冲液，缓冲液中曲拉通X-100的体积含量为0.3﹪；
此时的液相为缓冲液；
步骤(7).将第四次处理后的胚胎避光浸泡在1～2倍胚胎体积的浓度为5～10ug/ml的DAPI溶液中15～30分钟，进行细胞核染色，得到染色后的胚胎液；
步骤(8).待染色后的胚胎液静置分层后用移液枪移除液相，得到染色后的胚胎；
此时的液相为DAPI溶液；
步骤(9).将染色后的胚胎加入3～5倍胚胎体积的磷酸缓冲液进行洗涤，静置分层后用移液枪移除液相，重复洗涤3～5次，得到最终的胚胎；
此时的液相为磷酸缓冲液。
本发明方法解决了水产养殖领域虾类胚胎发育过程中细胞分裂和分化观察时遇到的技术难题。通过有机溶剂的预处理作用，去除虾类胚胎外部的初级卵黄膜，再结合DAPI对细胞核的染色方法，实现虾类胚胎细胞核物质的快速简便染色。本发明操作方法简单，实施步骤快捷，染色效果清晰。
具体实施方式
实施例1
步骤(1).取虾类胚胎，置于3倍胚胎体积的A溶液中,常温条件下振荡20分钟，得到第一次处理后的胚胎液；
所述的A溶液为体积比为1:1的正庚烷和多聚甲醛溶液的混合液，其中多聚甲醛溶液中多聚甲醛的质量含量为4﹪；
步骤(2).待第一次处理后的胚胎液静置分层后用移液枪移除上层液相，得到的固相为第一次处理后的胚胎；
步骤(3).将第一次处理后的胚胎重新加入2倍胚胎体积的正庚烷和4倍胚胎体积的甲醇，充分混合后得到第二次处理后的胚胎液；
步骤(4).待第二次处理后的胚胎液静置分层后用移液枪移除上层溶液和中间层膜状组织，得到第二次处理后的胚胎；
步骤(5).将第二次处理后的胚胎加入3倍胚胎体积的甲醇进行洗涤，静置分层后用移液枪移除液相，重复洗涤3次，得到第三次处理后的胚胎；
步骤(6).将第三次处理后的胚胎加入3倍胚胎体积的缓冲液进行洗涤，静置分层后用移液枪移除液相，重复洗涤3次，得到第四次处理后的胚胎；
所述的缓冲液为含有曲拉通X-100的磷酸缓冲液，缓冲液中曲拉通X-100的体积含量为0.3﹪；
步骤(7).将第四次处理后的胚胎避光浸泡在1倍胚胎体积的浓度为5ug/ml的DAPI溶液中30分钟，进行细胞核染色，得到染色后的胚胎液；
步骤(8).待染色后的胚胎液静置分层后用移液枪移除液相，得到染色后的胚胎；
步骤(9).将染色后的胚胎加入3倍胚胎体积的磷酸缓冲液进行洗涤，静置分层后用移液枪移除液相，重复洗涤3次，得到最终的胚胎。
实施例2
步骤(1).取虾类胚胎，置于5倍胚胎体积的A溶液中,常温条件下振荡30分钟，得到第一次处理后的胚胎液；
所述的A溶液为体积比为1:1的正庚烷和多聚甲醛溶液的混合液，其中多聚甲醛溶液中多聚甲醛的质量含量为4﹪；
步骤(2).待第一次处理后的胚胎液静置分层后用移液枪移除上层液相，得到的固相为第一次处理后的胚胎；
步骤(3).将第一次处理后的胚胎重新加入2倍胚胎体积的正庚烷和4倍胚胎体积的甲醇，充分混合后得到第二次处理后的胚胎液；
步骤(4).待第二次处理后的胚胎液静置分层后用移液枪移除上层溶液和中间层膜状组织，得到第二次处理后的胚胎；
步骤(5).将第二次处理后的胚胎加入5倍胚胎体积的甲醇进行洗涤，静置分层后用移液枪移除液相，重复洗涤5次，得到第三次处理后的胚胎；
步骤(6).将第三次处理后的胚胎加入5倍胚胎体积的缓冲液进行洗涤，静置分层后用移液枪移除液相，重复洗涤5次，得到第四次处理后的胚胎；
所述的缓冲液为含有曲拉通X-100的磷酸缓冲液，缓冲液中曲拉通X-100的体积含量为0.3﹪；
步骤(7).将第四次处理后的胚胎避光浸泡在2倍胚胎体积的浓度为10ug/ml的DAPI溶液中15分钟，进行细胞核染色，得到染色后的胚胎液；
步骤(8).待染色后的胚胎液静置分层后用移液枪移除液相，得到染色后的胚胎；
步骤(9).将染色后的胚胎加入5倍胚胎体积的磷酸缓冲液进行洗涤，静置分层后用移液枪移除液相，重复洗涤5次，得到最终的胚胎。
实施例3
步骤(1).取虾类胚胎，置于4倍胚胎体积的A溶液中,常温条件下振荡40分钟，得到第一次处理后的胚胎液；
所述的A溶液为体积比为1:1的正庚烷和多聚甲醛溶液的混合液，其中多聚甲醛溶液中多聚甲醛的质量含量为4﹪；
步骤(2).待第一次处理后的胚胎液静置分层后用移液枪移除上层液相，得到的固相为第一次处理后的胚胎；
步骤(3).将第一次处理后的胚胎重新加入2倍胚胎体积的正庚烷和4倍胚胎体积的甲醇，充分混合后得到第二次处理后的胚胎液；
步骤(4).待第二次处理后的胚胎液静置分层后用移液枪移除上层溶液和中间层膜状组织，得到第二次处理后的胚胎；
步骤(5).将第二次处理后的胚胎加入4倍胚胎体积的甲醇进行洗涤，静置分层后用移液枪移除液相，重复洗涤4次，得到第三次处理后的胚胎；
步骤(6).将第三次处理后的胚胎加入4倍胚胎体积的缓冲液进行洗涤，静置分层后用移液枪移除液相，重复洗涤4次，得到第四次处理后的胚胎；
所述的缓冲液为含有曲拉通X-100的磷酸缓冲液，缓冲液中曲拉通X-100的体积含量为0.3﹪；
步骤(7).将第四次处理后的胚胎避光浸泡在1.5倍胚胎体积的浓度为7ug/ml的DAPI溶液中20分钟，进行细胞核染色，得到染色后的胚胎液；
步骤(8).待染色后的胚胎液静置分层后用移液枪移除液相，得到染色后的胚胎；
步骤(9).将染色后的胚胎加入4倍胚胎体积的磷酸缓冲液进行洗涤，静置分层后用移液枪移除液相，重复洗涤4次，得到最终的胚胎。
Claims (1)
1.一种虾类胚胎的细胞核染色方法，其特征在于该方法的具体步骤：
步骤(1).取虾类胚胎，置于3～5倍胚胎体积的A溶液中,常温条件下振荡20～40分钟，得到第一次处理后的胚胎液；
所述的A溶液为体积比为1:1的正庚烷和多聚甲醛溶液的混合液，其中多聚甲醛溶液中多聚甲醛的质量含量为4﹪；
步骤(2).待第一次处理后的胚胎液静置分层后用移液枪移除上层液相，得到的固相为第一次处理后的胚胎；
步骤(3).将第一次处理后的胚胎重新加入2倍胚胎体积的正庚烷和4倍胚胎体积的甲醇，充分混合后得到第二次处理后的胚胎液；
步骤(4).待第二次处理后的胚胎液静置分层后用移液枪移除上层溶液和中间层膜状组织，得到第二次处理后的胚胎；
步骤(5).将第二次处理后的胚胎加入3～5倍胚胎体积的甲醇进行洗涤，静置分层后用移液枪移除液相，重复洗涤3～5次，得到第三次处理后的胚胎；
步骤(6).将第三次处理后的胚胎加入3～5倍胚胎体积的缓冲液进行洗涤，静置分层后用移液枪移除液相，重复洗涤3～5次，得到第四次处理后的胚胎；
所述的缓冲液为含有曲拉通X-100的磷酸缓冲液，缓冲液中曲拉通X-100的体积含量为0.3﹪；
步骤(7).将第四次处理后的胚胎避光浸泡在1～2倍胚胎体积的浓度为5～10ug/ml的4',6-二脒基-2-苯基吲哚溶液中15～30分钟，进行细胞核染色，得到染色后的胚胎液；
步骤(8).待染色后的胚胎液静置分层后用移液枪移除液相，得到染色后的胚胎；
步骤(9).将染色后的胚胎加入3～5倍胚胎体积的磷酸缓冲液进行洗涤，静置分层后用移液枪移除液相，重复洗涤3～5次，得到最终的胚胎。
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