CN102746375A

CN102746375A - 一种具有抗肿瘤作用的大豆乳清蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN102746375A
Application number: CN2012102412882A
Authority: CN
Inventors: 王常青; 王菲
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Shanxi University
Priority date: 2012-07-12
Filing date: 2012-07-12
Publication date: 2012-10-24

Abstract

本发明提供了一种具有抗肿瘤作用的大豆乳清蛋白的制备方法。将大豆乳清水经絮凝、离心，取上清调pH到4.3-4.5；先用截留分子量为20000-25000Da的超滤膜超滤，取滤出液再用截留分子量6000-8000Da超滤膜超滤，得到大豆乳清蛋白浓缩液；将大豆乳清蛋白浓缩液以2450MHz微波加热到55-80℃取出，放入60-85℃的恒温水浴中保温5min-20min，然后在50℃以下真空干燥，得到大豆乳清蛋白。动物试验表明，以上大豆乳清蛋白的抗肿瘤功效提高50-80％，且免疫功能明显增强。正常人群每天摄入该低变性大豆乳清蛋白30-60g，无不良反映，可以作为抗肿瘤和提高免疫力的功能食品和药品的原料。

Description

一种具有抗肿瘤作用的大豆乳清蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及大豆乳清蛋白的制备方法，具体是一种具有抗肿瘤作用和增强免疫功能的大豆乳清蛋白的制备方法。

背景技术

大豆乳清水是豆制品加工企业生产大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白和豆制品过程中产生的废水，其中主要成分为大豆乳清蛋白、低聚糖等。以前，大豆乳清水一直被当作废水排放。近年来，随着世界各国对大豆乳清研究的不断深入，开发利用大豆乳清水中的生理活性物质正逐渐成为研究热点。大豆乳清蛋白占大豆蛋白的6-7％，是非酸沉蛋白，其中的主要成分是分子量在8000-22000的胰蛋白酶抑制剂(SBTI)，过去SBTI被认为是大豆中的抗营养因子，可以抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，降低蛋白质的消化和吸收利用，同时它还可作用于胰腺本身，造成机能亢进，胰腺分泌过多，还可造成胰腺肥大或增生。但是近年来国内外研究发现，低浓度的SBTI具有降低多种癌症发病率的作用，可应用为抗肿瘤药品的原料。由于SBTI的抗营养性，如何对大豆乳清蛋白进行处理，使其既保持抗癌活性，又提高大豆乳清蛋白的利用率，一直是人们关注的焦点。

已有大量文献报道了乳清蛋白的回收方法。例如CN1537865公开的从大豆黄浆水提取乳清蛋白、核酸等成分；CN1954689和CN1364765公开的膜分离制备和提取大豆乳清蛋白的方法。但他们均未对SBTI的活性与抗肿瘤的关系进行研究，也没有探讨免疫功能与抗肿瘤功效的相关性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤作用的大豆乳清蛋白的制备方法。

本发明提供的一种具有抗肿瘤作用的大豆乳清蛋白的制备方法，包括如下步骤：

（1）制备大豆乳清浓缩液：将生产大豆分离蛋白和豆制品的大豆乳清水用常规的絮凝离心法除杂，取上清调节pH到4.3-4.5；先用截留分子量为20000-25000Da的超滤膜超滤，取滤出液再用截留分子量6000-8000Da超滤膜超滤，得到分子量为6000-25000Da的大豆乳清蛋白浓缩液；

（2）抗肿瘤大豆乳清蛋白的制备：将大豆乳清蛋白浓缩液放入微波炉中，以2450MHz微波加热到55-80℃取出，放入60-85℃的恒温水浴中保温5min-20min，然后在50℃以下真空干燥，得到大豆乳清蛋白；该大豆乳清蛋白的胰蛋白酶抑制活性降低了40-60％。

所述的步骤（2）中微波加热温度优选60-75℃；所述恒温水浴的温度优选65-80℃；所述的水浴保温时间优选10min-20min。

将大豆乳清蛋白复溶，按照3-10g/Kg·d剂量喂食试验小鼠或大鼠，能够显著增强抗肿瘤效果，并提高体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能。作为优质蛋白补充剂，正常人体按照30-60g/d剂量摄入该大豆乳清蛋白，具有增强体质的作用。该大豆乳清蛋白可以作为一种抗肿瘤和增强机体免疫的药品和食品的原料。

与现有技术相比，本发明的特点是，经两次超滤得到分子量为6000-25000的大豆乳清蛋白浓缩液，将大豆乳清蛋白浓缩液经微波加热到55-80℃后，再在60-85℃的水浴保温5min-20min，使乳清蛋白中SBTI适度变性，活性下降了40-60％，同时使具有增强免疫或抗肿瘤活性基团的外展更充分，得到的低变性大豆乳清蛋白，抗肿瘤功效可以提高50-80％。

具体实施方式

实施例1

将生产黄豆分离蛋白的乳清废水调pH至7.5，加入1mlo/LCaCl₂15ml/L，55℃低速搅拌20min，离心除杂后，调pH至4.3；先用截留分子量为20000-25000Da的超滤膜超滤，取滤出液用截留分子量6000-8000Da超滤膜超滤，得到乳清蛋白含量为30％、分子量为6000-25000Da的大豆乳清浓缩液。浓缩液经2450MHz微波加热到70℃取出，放入75℃的恒温水浴器中保温15min，45℃真空干燥得到低变性黄豆乳清蛋白，经BAPNA（Na-苯甲酰DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐）法检测，该低变性乳清蛋白中胰蛋白酶抑制活性降低了50％。

取昆明小鼠，建立S₁₈₀动物模型。将小鼠随机分为基础组、肿瘤模型组、环磷酰胺阳性对照组（给药20mg/Kg·d）、低变性黄豆乳清蛋白组（喂食3g、5g、10g/Kg·d），每组10只小鼠。连续给药20d，试验结束后24h，测量瘤直径，眼眶取血计数白细胞数；处死动物后剥离瘤、肝脏、胰脏和脾脏，称重后计算抑瘤率、瘤重比、免疫器官指数。试验第16d，用生理盐水将压积SRBC（绵羊红细胞）配成2％的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫，第20d试验结束后24h测定血清溶血素。试验第15d用1DNCB（2，4-二硝氯苯）溶液50μL均匀涂抹于小鼠脱毛处致敏。第20d用1％DNCB溶液10μL攻击小鼠右耳。基础组同样涂耳，攻击24h后，测定迟发型免疫变态反应（细胞免疫）的指数--小鼠耳廓肿胀度。

试验表明，口服3g、5g、10g/Kg·d低变性黄豆乳清蛋白对S₁₈₀肿瘤细胞都有显著的抑制作用，抑瘤率分别为38.3％、46.8％、51.8％，具体试验结果见表1。脏器指数表明，各蛋白组胰脏指数没有明显增加，证实其不存在明显的抗营养性。低变性乳清蛋白组的胸腺指数、脾脏指数显著提高（P＜0.05，见表2），说明非特异性免疫能力显著增强。血清溶血素检测和迟发型免疫变态反应试验结果表明（见表3），蛋白组的体液免疫和细胞免疫指数显著提高（P＜0.05），说明低变性乳清蛋白可以显著提高体液免疫和细胞免疫能力。由于低变性乳清蛋白可以显著提高非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫能力，参照中华人民共和国卫生部《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）评价，判定它具有增强机体免疫功能的作用。以上实验中，抑瘤率直接反映了低变性乳清蛋白的抗肿瘤作用，同时低变性乳清蛋白还可以通过增强机体的免疫功能来提高抗肿瘤能力。

选52名18-25岁的健康志愿者，按40g/d剂量试食该低变性豆乳清蛋白干燥品30天，试食前称量身高、体重、体内脂肪含量，并测血压、心率，有10％的人群运铁蛋白含量轻度缺乏，5％人群总胆固醇含量偏高；试食过程中，每天记录体力情况、精神状态和进食情况。试食结束后，测量试食人群的血压、心率均无异常，无体重下降、无腹泻和精神不振等现象，无任何体征不适，说明该低变性豆乳清蛋白无副作用。同时，试食结束后检测到运铁蛋白轻度缺乏的人群运铁蛋白含量有明显改善，恢复到正常水平；总胆固醇含量高的人群恢复到正常值，说明低变性豆乳清蛋白有一定增强体质的作用，是一种安全的健康食品。

表1黄豆乳清蛋白对S₁₈₀肿瘤的抑制作用（

n=10）

Figure 2012102412882100002DEST_PATH_IMAGE001

注：(1)a和b表示与模型组相比差异显著，P＜0.05和P＜0.01

表2黄豆乳清蛋白对S₁₈₀小鼠脏器指数的影响（

n=10）

Figure 2012102412882100002DEST_PATH_IMAGE002

注：(1)a指与模型组相比，差异显著（P＜0.05）；(2)b指与模型组相比，差异极显著（P＜0.01）。

表3黄豆乳清蛋白对S₁₈₀小鼠免疫细胞及免疫功能的影响（

n=10）

Figure 2012102412882100002DEST_PATH_IMAGE003

注：(1)a和b表示与模型组相比差异显著，P＜0.05和P＜0.01。

实施例2

生产小黑豆制品的乳清废水调pH至7.5，加入1mlo/LCaCl₂15ml/L，55℃低速搅拌20min，离心除杂后，调pH至4.5，先用截留分子量为20000-25000Da的超滤膜超滤，取滤出液再用截留分子量6000-8000Da超滤膜超滤，得到乳清蛋白含量为25％的小黑豆乳清浓缩液。浓缩液经2450MHz微波加热到60℃取出，放入65℃的恒温水浴器中保温20min，40℃真空干燥得到小黑豆乳清蛋白干燥品，经BAPNA法检测，该低变性乳清蛋白中胰蛋白酶抑制活性降低了40％。

取SD雌性大鼠，建立二甲基苯蒽/巴豆油诱导的皮肤乳头瘤动物模型。将大鼠随机分为基础组、肿瘤模型组、环磷酰胺阳性对照组（20mg/kg·d）、低变性乳清蛋白大，小剂量组（5g、10g/Kg·d），每组12只鼠。连续用药100d，停药后24h眼眶取血分离血清，处死动物后剥离胰脏和脾脏，计算免疫器官指数。试验第16d，用生理盐水将压积SRBC配成2％的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫，第20d试验结束后24h测定血清溶血素。试验第15d用1％DNCB溶液50μL均匀涂抹于大鼠脱毛处致敏。第20d用1DNCB溶液10μL攻击大鼠右耳。基础组同样涂耳，攻击24h后，测定迟发型免疫变态反应（细胞免疫）的指数-大鼠耳廓肿胀度。

试验表明，低变性乳清蛋白对二甲基苯蒽/巴豆油诱导的大鼠皮肤乳头瘤有显著抑制作用（P＜0.5，见表4），低变性乳清蛋白大、小剂量组的抑瘤率分别为80.45和70.91％，所以小黑豆低变性乳清蛋白有显著的抗肿瘤作用。小黑豆乳清蛋白可以显著提高大鼠的体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫能力（见表5），按照中华人民共和国卫生部《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）的方法评价，它具有提高机体免疫的功能的作用。由于低变性乳清蛋白可以促进机体的抗肿瘤作用，同时可以通过增强免疫功能来促进抗肿瘤作用，所以该低变性乳清蛋白可以作为抗肿瘤功能食品。

表4 12w后，小黑豆乳清蛋白对二甲基苯蒽/巴豆油诱发大鼠皮肤乳头状瘤的影响

Figure 2012102412882100002DEST_PATH_IMAGE004

注：a表示与模型组相比差异显著，P＜0.05。

表5小黑豆乳清蛋白对皮肤乳头瘤试验大鼠脏器指数及免疫功能的影响（

n=10）

注：a表示与模型组相比差异显著，P＜0.05。

实施例3

将生产小黑豆分离蛋白的乳清废水调pH至7.5，加入1mlo/LCaCl₂15ml/L，55℃低速搅拌20min，离心除杂后，调pH至4.3，先用截留分子量为20000-25000Da的超滤膜超滤，取滤出液再用截留分子量6000-8000Da超滤膜超滤，得到乳清蛋白含量为40％、蛋白分子量为6000-25000Da的大豆乳清浓缩液。浓缩液经2450MHz微波加热到75℃取出，放入80℃的恒温水浴器中保温10min，48℃真空干燥得到低变性小黑豆乳清蛋白干燥品，经BAPNA法检测，该低变性蛋白的胰蛋白酶抑制剂活性降低了58％。

分别选取对数生长期的H₂₂肿瘤细胞、S₁₈₀肿瘤细胞调整细胞密度至5×10⁵/ml，在96孔培养板中，加入环磷酰胺和不同浓度的乳清蛋白，37℃，5％CO₂培养24h后每孔加10μl四甲基偶氮唑盐溶液（MTT溶液，5mg/ml），继续孵育4h后每孔加200μl二甲基亚砜（DMSO）溶解MTT沉淀，用振荡器混匀后，在酶标仪上测定光密度值。计算肿瘤细胞生长抑制率。

试验表明，低变性小黑豆乳清蛋白对S₁₈₀、H₂₂细胞有显著的抑制作用，结果见表6。说明低变性小黑豆乳清蛋白可以作为一种具有抗肿瘤作用的食品原料。

表6MTT法测定小黑豆乳清蛋白对S₁₈₀、H₂₂肿瘤细胞的抑制率

Figure 2012102412882100002DEST_PATH_IMAGE006

Claims

1.一种具有抗肿瘤作用的大豆乳清蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）制备大豆乳清浓缩液：将大豆乳清水经絮凝、离心，取上清调pH到4.34.5；先用截留分子量为20000-25000Da的超滤膜超滤，取滤出液再用截留分子量6000-8000Da超滤膜超滤，得到大豆乳清蛋白浓缩液；

（2）抗肿瘤大豆乳清蛋白的制备：将大豆乳清蛋白浓缩液以2450MHz微波加热到55-80℃取出，放入60-85℃的恒温水浴中保温5min-20min，然后在50℃以下真空干燥，得到大豆乳清蛋白。

2.如权利要求1所述的一种具有抗肿瘤作用的大豆乳清蛋白的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）中微波加热温度为60-75℃。

3.如权利要求1所述的一种具有抗肿瘤作用的大豆乳清蛋白的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）中恒温水浴的温度为65-80℃。

4.如权利要求1所述的一种具有抗肿瘤作用的大豆乳清蛋白的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）中水浴保温时间为10min-20min。