CN102745683A - 一种生物氧化石墨及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物氧化石墨及其制备方法。将石墨分散在水中形成分散较好的石墨混合液加入到氧化亚铁硫杆菌培养基中，灭菌、冷却、接种氧化亚铁硫杆菌，培养数天，分散的石墨在微生物氧化亚铁硫杆菌的作用下引入含氧基团而被氧化；培养完毕，去除氧化过程中生成的矿物及其它离子，至pH中性为止；真空干燥得到纯净生物氧化石墨。本发明以具有氧化矿物能力的微生物氧化亚铁硫杆菌为菌种，对超声分散的石墨进行生物氧化，相对传统化学氧化石墨的方法，具有反应条件温和可控，反应过程绿色无污染，制备得到的生物氧化石墨缺陷较少等优点。

Description

一种生物氧化石墨及其制备方法

技术领域

本发明属于氧化石墨的绿色生物可控制备技术，特别是一种生物氧化石墨及其制备方法。

背景技术

目前，化学氧化法制备氧化石墨烯的方法主要有Staudenmaier、Brodie和Hummers三大方法。其制备的基本原理均为先用强质子酸处理石墨，形成石墨层间化合物，然后加入强氧化剂对其进行氧化，在石墨层间插入大量羧基、羟基、环氧基等含氧基团。化学氧化法制备氧化石墨过程中，排放大量强酸性和强氧化性物质，较难处理，对环境污染较大。此外，化学氧化-还原法制备石墨烯过程易导致缺陷产生（Florian B., Jani K. and Arkady V. K. Structural Defects in Graphene. ACS NANO, 2011, 5(1): 26-41），π-π共轭键被大量破坏，碳骨架在原子层面上产生了明显的晶格扭曲和畸变，丧失了许多优异性能。

因此，化学氧化-还原法制备石墨烯具有不可避免的缺点：化学氧化-还原法制备石墨烯过程中排放大量强酸性及强氧化性物质，容易导致环境污染；化学法制备的石墨烯具有较多结构缺陷，导致其化学、电子、机械等方面优异特性大为降低，严重限制了石墨烯的研究进展和应用领域。

生物氧化法制备氧化石墨相对化学氧化具有明显的优势。首先，在生物氧化过程中不需要加入强酸（浓硫酸）即可把石墨氧化为氧化石墨，反应在微生物适宜的温度、pH等条件下即可进行，在工艺上简单易行，对环境无污染，贯彻了绿色化学的理念；其次，生物氧化法氧化过程温和，得到的氧化石墨含氧比例较低，能够最大程度地保留原石墨的优异性能，减少缺陷的产生。同时，由于生物反应过程易于放大，待生物氧化石墨的可控制备工艺及关键问题解决后，可较快地进行生物氧化法制备氧化石墨的放大试验及生产。

氧化亚铁硫杆菌（Thiobacillus ferrooxidans，简称T. f）——1947年，首先由美国人Colmer和Hinkle从矿山酸性废水中分离出的一种极端嗜酸杆菌。嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans，简称A. f）属原核生物界，为无机化能自养菌，杆状，革兰氏阴性。A. f菌在有氧条件下以CO₂为碳源，依靠氧化亚铁、还原性硫化物以及氢来获得能量，供生命活动需要。它广泛存在于土壤、海水、淡水、垃圾、硫磺泉和沉积硫内，尤以金属硫化矿和煤矿等酸性矿坑水中最为常见。由于该菌的特殊生理特性，目前主要应用在生物浸矿、有用金属的回收、生物淋滤、矿物材料的微生物加工、脱除H₂S和SO₂等气体及酸性废水处理等领域。

本发明基于A. f菌具有优良的生物浸矿作用及独特的氧化能力，对天然石墨进行生物氧化，绿色制备低缺陷生物氧化石墨、减少环境污染。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绿色低缺陷的生物氧化石墨及其制备方法。

一种生物氧化石墨，相对于化学氧化法制备得到的氧化石墨，具有含氧基团比例较低、缺陷较少、石墨的优异特性得以最大程度保持等结构特点和优点，有利于其开发研究；而化学法制备的氧化石墨中，氧化程度过高，含有大量的含氧基团，容易导致结构缺陷，因而降低了其原本具有的优异性能，大大限制了其应用范围。 

实现本发明的技术解决方案为：一种生物氧化石墨的制备方法，包括以下步骤：

第一步，将石墨分散到水中，超声分散，形成均匀的石墨混合液；

第二步，将第一步所得石墨混合液加入到氧化亚铁硫杆菌培养基中，灭菌，冷却，接种，于恒温振荡培养箱中培养，进行生物氧化；

第三步，将第二步所得生物氧化石墨静置、离心，采用稀盐酸、水多次反复清洗、离心沉淀，溶解去除氧化过程中生成的矿物及其它离子，至pH中性为止；

第四步，将第三步得到的生物氧化石墨沉淀于水中超声，静置或离心，分别对上清液及沉淀进行真空干燥，得到生物氧化石墨。

本发明一种生物氧化石墨的制备方法，第一步中石墨质量浓度为0.1%-10%，超声时间为20-240 min，超声温度为室温。

本发明一种生物氧化石墨的制备方法，第二步中在氧化亚铁硫杆菌培养基中的石墨含量为0.02-0.5mg/mL，氧化亚铁硫杆菌培养基为9K培养基，包括FeSO₄·7H₂O 44.5 g/L，(NH₄)SO₄ 3.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，K₂HPO₄ 0.5 g/L，KCl 0.1 g/L，Ca(NO₃)₂ 0.01 g/L，pH1.5-2.5，接种量为1%-20%，培养温度25-35℃，转速为60-250r/min，生物培养时间为3-21天。

本发明一种生物氧化石墨的制备方法，第三步中稀盐酸质量浓度为0.1-6mol/L，离心转速为8000-13000r/min，离心时间为15-60min。

本发明一种生物氧化石墨的制备方法，第四步中超声处理时间为20-120min， 离心转速为1500-8000r/min，离心时间为5-30min。

本发明一种生物氧化石墨的制备方法，第四步中真空干燥采用普通真空干燥或真空冷冻干燥，普通真空干燥温度为25-100℃，真空冷冻干燥温度为-20-（-80）℃，真空度≦150Pa，干燥时间2-24h。

本发明一种生物氧化石墨的制备方法，所得到的氧化石墨可进行多次生物氧化，以提高其生物氧化程度。

    本发明与现有技术相比，其显著优点为：（1）利用氧化亚铁硫杆菌的生物氧化作用对石墨进行生物氧化，通过生物氧化酶及电子载体的作用进行电子传输，实现石墨的生物氧化，避免化学法中使用强酸及强氧化剂而导致的氧化石墨烯及石墨烯的缺陷；（2）生物氧化法制备氧化石墨相对化学法可降低其氧化程度，保持石墨原有优异特性；（3）本发明一种生物氧化石墨及其制备方法反应条件温和，制备过程绿色无污染，并具有较好的工业应用前景和价值。

    下面结合附图对本发明进行详细说明。

附图说明

附图1是本发明一种生物氧化石墨制备方法的流程示意图。

附图2是本发明实施例1一种生物氧化石墨和化学氧化石墨的拉曼光谱对比图。

附图3是本发明实施例1一种生物氧化石墨的场发射扫描电镜图。

具体实施方式

结合附图1，本发明一种生物氧化石墨，由以下制备方法得到：

第一步，将石墨分散到水中，超声分散，形成均匀的石墨混合液；

第二步，将第一步所得石墨混合液加入到氧化亚铁硫杆菌培养基中，灭菌，冷却，接种，于恒温振荡培养箱中培养，进行生物氧化；

第三步，将第二步所得生物氧化石墨静置、离心，采用稀盐酸、水多次反复清洗、离心沉淀，溶解去除氧化过程中生成的矿物及其它离子，至pH中性为止；

第四步，将第三步得到的生物氧化石墨沉淀于水中超声，静置或离心，分别对上清液及沉淀进行真空干燥，得到生物氧化石墨。

实施例1：本发明一种生物氧化石墨的制备方法，包括以下步骤：     第一步，石墨预处理。在250mL三角瓶中加入1.0g石墨，向三角瓶中加去离子水至100g，放入250W超声波清洗机中，于室温下超声处理2h，得到分散性能较好的石墨混合液；

第二步，配制9K液体培养基1.0L，以1/9（v/v）稀硫酸调至培养基pH为2.0，向培养基中加入10g第一步分散好的1%石墨混合液，分装至4个1.0L三角瓶中，每瓶装液量为250mL，所含石墨浓度为0.1mg/mL。其中，1.0L的9K液体培养基中包括FeSO₄·7H₂O 44.5g，(NH₄)SO₄ 3.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，K₂HPO₄ 0.5g，KCl 0.1g，Ca(NO₃)₂ 0.01g；FeSO₄·7H₂O采用0.22μm混合纤维滤膜过滤除菌，其它9K培养基成分的灭菌方式为高压蒸汽湿热灭菌，灭菌温度121℃，蒸汽压力0.1MPa，灭菌时间30min；灭菌完毕后，冷却至室温，以8%接种量接种新鲜的氧化亚铁硫杆菌种子液；放置于30℃恒温培养振荡箱中，150r/min振荡培养7天，进行生物氧化；

第三步，将第二步生物氧化完毕的发酵培养液静置，12000r/min转速离心30min；向获得的混合物沉淀中加入2mol/L稀盐酸80mL，搅拌均匀，室温下静置4h；待矿物沉淀完全溶解后，以12000r/min转速离心30min，倾去上清液，去离子水清洗沉淀，离心；向生物氧化石墨沉淀中加入0.5mol/L稀盐酸40mL，再次酸洗、离心、水洗；用去离子水清洗、离心至pH为中性为止；

第四步，将第三步获得的纯净生物氧化石墨分散于100mL去离子水中，用250W超声波清洗机超声处理2h，静置过夜，分别对上清液和沉淀进行离心分离，离心转速为8000r/min，离心时间为5min；分别放置于普通真空干燥箱中，80℃，真空度≦100Pa，干燥24h，制备得到纯净生物氧化石墨。

对得到的生物氧化石墨进行拉曼光谱测试，并与化学法比较，如附图2所示。生物氧化石墨和化学氧化石墨在1350cm^-1和1580cm^-1左右分别出现了D峰和G峰两个特征峰，生物氧化法获得的D/G明显小于化学氧化法，表明生物氧化程度相对化学法较低；同时，D峰也为缺陷峰，反映石墨层片的无序性，生物氧化法获得的D峰较弱，其存在的缺陷较少。生物氧化石墨在2700 cm^-1左右存在较强的2D峰，表明其石墨化程度相对较高，保持了石墨原有优异特性，而化学氧化法的2D峰则相对较弱。

对得到的生物氧化石墨进行场发射扫描电镜观察，如附图3所示。可以明显看出生物氧化石墨片层结构变薄，具有明显的较少层数的分层结构。

实施例2：本发明一种生物氧化石墨的制备方法，包括以下步骤：     第一步，石墨预处理。在250mL三角瓶中加入2.0g石墨，向三角瓶中加去离子水至100g，放入250W超声波清洗机中，于室温下超声处理4h，得到分散性能较好的石墨混合液；

第二步，配制9K液体培养基1.0L，以1/9（v/v）稀硫酸调至pH为1.5，向培养基中加入10g第一步分散好的石墨混合液，分装至4个1.0L三角瓶中，每瓶装液量为250mL，所含石墨浓度为0.2mg/mL。其中，1.0L的9K液体培养基中包括FeSO₄·7H₂O 44.5g，(NH₄)SO₄ 3.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，K₂HPO₄ 0.5g，KCl 0.1g，Ca(NO₃)₂ 0.01g，FeSO₄·7H₂O采用0.22μm混合纤维滤膜过滤除菌，其它9K培养基成分的灭菌方式为高压蒸汽湿热灭菌，灭菌温度121℃，蒸汽压力0.1MPa，灭菌时间30min；灭菌完毕后，冷却至室温，以20%接种量接种新鲜的氧化亚铁硫杆菌种子液；放置于30℃恒温培养振荡箱中，180r/min振荡培养10天，进行生物氧化；

第三步，将第二步生物氧化完毕的发酵培养液静置，13000r/min转速离心15min；向获得的混合物沉淀中加入6mol/L稀盐酸60mL，搅拌均匀，室温下静置4h；待矿物沉淀完全溶解后，以10000r/min转速离心30min，倾去上清液，去离子水清洗沉淀，离心；向生物氧化石墨沉淀中加入0.3mol/L稀盐酸40mL，再次酸洗、离心、水洗；用去离子水清洗、离心至pH为中性为止；

第四步，将第三步获得的纯净生物氧化石墨分散于100mL去离子水中，用250W超声波清洗机超声处理2h，静置过夜，分别对上清液和沉淀进行离心分离，离心转速为1500r/min，离心时间为30min；分别放置于真空冷冻干燥仪中，-45℃，真空度≦50Pa，干燥24h，制备得到纯净生物氧化石墨。

实施例3：本发明一种生物氧化石墨的制备方法，包括以下步骤：     第一步，石墨预处理。在250mL三角瓶中加入0.5g石墨，向三角瓶中加去离子水至100g，放入250W超声波清洗机中，于室温下超声处理20min，得到分散性能较好的石墨混合液；

第二步，配制9K液体培养基1.0L，1/8（v/v）稀硫酸调节pH为2.5，向培养基中加入10g第一步分散好的石墨混合液，分装至4个1.0L三角瓶中，每瓶装液量为250mL，所含石墨浓度为0.05mg/mL。其中，1.0L的9K液体培养基中包括FeSO₄·7H₂O 44.5g，(NH₄)SO₄ 3.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，K₂HPO₄ 0.5g，KCl 0.1g，Ca(NO₃)₂ 0.01g，FeSO₄·7H₂O采用0.22μm混合纤维滤膜过滤除菌，其它9K培养基成分的灭菌方式为高压蒸汽湿热灭菌，灭菌温度121℃，蒸汽压力0.1MPa，灭菌时间20min；灭菌完毕后，冷却至室温，以10%接种量接种新鲜的氧化亚铁硫杆菌种子液；放置于29℃恒温培养振荡箱中，130r/min振荡培养5天，进行生物氧化；

第三步，将第二步生物氧化完毕的发酵培养液静置，12000r/min转速离心30min；向获得的混合物沉淀中加入0.5mol/L稀盐酸100mL，搅拌均匀，室温下静置3h；待矿物沉淀完全溶解后，以12000r/min转速离心30min，倾去上清液，去离子水清洗沉淀，离心；向生物氧化石墨沉淀中加入0.2mol/L稀盐酸40mL，再次酸洗、离心、水洗；用去离子水清洗、离心至pH为中性为止；

第四步，将第三步获得的纯净生物氧化石墨分散于100mL去离子水中，用250W超声波清洗机超声处理1h，3000r/min离心10min，分别对得到的上清液和沉淀进行离心分离，离心转速为6000r/min，离心时间为20min；分别放置于真空冷冻干燥仪中，-45℃，真空度≦80Pa，干燥24h，制备得到纯净生物氧化石墨。

实施例4：本发明一种生物氧化石墨的制备方法，包括以下步骤：

第一步，石墨预处理。在250mL三角瓶中加入10g石墨，向三角瓶中加去离子水至100g，放入250W超声波清洗机中，于室温下超声处理4h，得到分散性能较好的石墨混合液；

第二步，配制9K液体培养基1.0L，1/7（v/v）稀硫酸调节pH为2.0，向培养基中加入5g第一步分散好的石墨混合液，分装至4个1.0L三角瓶中，每瓶装液量为250mL，所含石墨浓度为0.5mg/mL。其中，1.0L的9K液体培养基中包括FeSO₄·7H₂O 44.5g，(NH₄)SO₄ 3.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，K₂HPO₄ 0.5g，KCl 0.1g，Ca(NO₃)₂ 0.01g，FeSO₄·7H₂O采用0.22μm混合纤维滤膜过滤除菌，其它9K培养基成分的灭菌方式为高压蒸汽湿热灭菌，灭菌温度121℃，蒸汽压力0.1MPa，灭菌时间25min；灭菌完毕后，冷却至室温，以15%接种量接种新鲜的氧化亚铁硫杆菌种子液；放置于31℃恒温培养振荡箱中，180r/min振荡培养5天，进行生物氧化；

第三步，将第二步生物氧化完毕的发酵培养液静置，13000r/min转速离心30min；向获得的混合物沉淀中加入4mol/L稀盐酸100mL，搅拌均匀，室温下静置3h；待矿物沉淀完全溶解后，以12000r/min转速离心30min，倾去上清液，去离子水清洗沉淀，离心；向生物氧化石墨沉淀中加入0.2mol/L稀盐酸40mL，再次酸洗、离心、水洗；用去离子水清洗、离心至pH为中性为止；

第四步，将第三步获得的纯净生物氧化石墨分散于100mL去离子水中，用250W超声波清洗机超声处理2h，3000r/min离心10min，分别对得到的上清液和沉淀进行离心分离，离心转速为6000r/min，离心时间为20min；分别放置于真空冷冻干燥仪中，-50℃，真空度≦60Pa，干燥24h，制备得到纯净生物氧化石墨。

实施例5：本发明一种生物氧化石墨的制备方法，包括以下步骤：

第一步，同实施例4第一步；

第二步，配制9K液体培养基1.0L，1/10（v/v）稀硫酸调节pH为1,8，向培养基中加入0.2g第一步分散好的石墨混合液，分装至4个1.0L三角瓶中，每瓶装液量为250mL，所含石墨浓度为0.02mg/mL。其余同实施例4第二步；

第三步，同实施例4第三步；

第四步，同实施例4第四步。

实施例6：本发明一种生物氧化石墨的制备方法，包括以下步骤：

第一步，同实施例4第一步；

第二步，同实施例4第二步；

第三步，将第二步生物氧化完毕的发酵培养液静置，8000r/min转速离心15min；向获得的混合物沉淀中加入6mol/L稀盐酸100mL，搅拌均匀，室温下静置3h；待矿物沉淀完全溶解后，以13000r/min转速离心30min，倾去上清液，去离子水清洗沉淀，离心；向生物氧化石墨沉淀中加入0.1mol/L稀盐酸40mL，再次酸洗、离心、水洗；用去离子水清洗、离心至pH为中性为止；

第四步，同实施例4第四步。

实施例7：本发明一种生物氧化石墨的制备方法，包括以下步骤：

第一步，同实施例4第一步；

第二步，同实施例4第二步；

第三步，同实施例4第三步；

第四步，将第三步获得的纯净生物氧化石墨分散于100mL去离子水中，用250W超声波清洗机超声处理20min，1500r/min离心10min，分别对得到的上清液和沉淀进行离心分离，离心转速为8000r/min，离心时间为20min；分别放置于真空干燥器中，100℃，抽真空干燥12h，制备得到纯净生物氧化石墨。

Claims (10)

1.一种生物氧化石墨，其特征在于所述氧化石墨通过以下步骤制备：

第一步，将石墨分散到水中，超声分散，形成均匀的石墨混合液；

第二步，将第一步所得石墨混合液加入到氧化亚铁硫杆菌培养基中，灭菌，冷却，接种，于恒温振荡培养箱中培养，进行生物氧化；

第三步，将第二步所得生物氧化石墨静置、离心，采用稀盐酸、水多次反复清洗、离心沉淀，溶解去除氧化过程中生成的矿物及其它离子，至pH中性为止；

第四步，将第三步得到的生物氧化石墨沉淀于水中超声，静置或离心，分别对上清液及沉淀进行真空干燥，得到生物氧化石墨。

2.根据权利要求1所述的生物氧化石墨，其特征在于第一步中所述的石墨质量浓度为0.1%-10%，超声时间为20-240 min，超声温度为室温。

3.根据权利要求1所述的生物氧化石墨，其特征在于第二步中在氧化亚铁硫杆菌培养基中的石墨含量为0.02-0.5mg/mL，氧化亚铁硫杆菌培养基为9K培养基，其成分包括FeSO₄·7H₂O 44.5 g/L，(NH₄)SO₄ 3.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，K₂HPO₄ 0.5 g/L，KCl 0.1 g/L，Ca(NO₃)₂ 0.01 g/L，pH为1.5-2.5，接种量为1%-20%，培养温度25-35℃，转速为60-250r/min，生物培养时间为3-21天。

4.根据权利要求1所述的生物氧化石墨，其特征在于第三步中所述的稀盐酸质量浓度为0.1-6mol/L，离心转速为8000-13000r/min，离心时间为15-60min。

5.根据权利要求1所述的生物氧化石墨，其特征在于第四步中所述的超声处理时间为20-120min， 离心转速为1500-8000r/min，离心时间为5-30min；真空干燥采用普通真空干燥或真空冷冻干燥，普通真空干燥温度为25-100℃，真空冷冻干燥温度为-20-（-80）℃，真空度≦150Pa，干燥时间2-24h。

6.一种生物氧化石墨的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

第一步，将石墨分散到水中，超声分散，形成均匀的石墨混合液；

第二步，将第一步所得石墨混合液加入到氧化亚铁硫杆菌培养基中，灭菌，冷却，接种，于恒温振荡培养箱中培养，进行生物氧化；

第三步，将第二步所得生物氧化石墨静置、离心，采用稀盐酸、水多次反复清洗、离心沉淀，溶解去除氧化过程中生成的矿物及其它离子，至pH中性为止；

第四步，将第三步得到的生物氧化石墨沉淀于水中超声，静置或离心，分别对上清液及沉淀进行真空干燥，得到生物氧化石墨。

7.根据权利要求6所述的生物氧化石墨的制备方法，其特征在于第一步中所述的石墨质量浓度为0.1%-10%，超声时间为20-240 min，超声温度为室温。

8.根据权利要求6所述的生物氧化石墨的制备方法，其特征在于第二步中在氧化亚铁硫杆菌培养基中的石墨含量为0.02-0.5mg/mL，氧化亚铁硫杆菌培养基为9K培养基，包括FeSO₄·7H₂O 44.5 g/L，(NH₄)SO₄ 3.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，K₂HPO₄ 0.5 g/L，KCl 0.1 g/L，Ca(NO₃)₂ 0.01 g/L，pH1.5-2.5，接种量为1%-20%，培养温度25-35℃，转速为60-250r/min，生物培养时间为3-21天。

9.根据权利要求6所述的生物氧化石墨的制备方法，其特征在于第三步中所述的稀盐酸质量浓度为0.1-6mol/L，离心转速为8000-13000r/min，离心时间为15-60min。

10.根据权利要求6所述的生物氧化石墨的制备方法，其特征在于第四步中所述的超声处理时间为20-120min， 离心转速为1500-8000r/min，离心时间为5-30min；真空干燥采用普通真空干燥或真空冷冻干燥，普通真空干燥温度为25-100℃，真空冷冻干燥温度为-20-（-80）℃，真空度≦150Pa，干燥时间2-24h。

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