CN102718854A

CN102718854A - 在中性及碱性条件下萃取转移血清蛋白的方法

Info

Publication number: CN102718854A
Application number: CN2012102244321A
Authority: CN
Inventors: 郭霞; 肖静; 蔡娟
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2012-07-02
Filing date: 2012-07-02
Publication date: 2012-10-10

Abstract

在中性及碱性条件下萃取转移血清蛋白的方法，属于生物工程中反胶束萃取技术领域。包括以下步骤：配制血清蛋白溶液；前萃取；后萃取；真空冷冻干燥得到血清蛋白产品。本发明在后萃取阶段，即将血清蛋白从反胶束再次转移至水相的过程中，在中性及碱性条件下均可使血清蛋白高效地富集在水相中，效率与酸性条件下相近。本方法操作简单，表面活性剂用量少，实验条件极其温和，血清蛋白的天然结构不受影响。

Description

在中性及碱性条件下萃取转移血清蛋白的方法

技术领域

本发明属于生物工程中反胶束萃取技术领域，特别涉及萃取转移血清蛋白的方法。

背景技术

反胶束是表面活性剂在非极性溶剂中形成的一种分子有序组合体，具有光学透明性和热力学稳定性。由于反胶束具有特殊的水核结构，可用来分离、转移、富集和纯化蛋白质。反胶束对蛋白质的液-液萃取包括前萃取（即将血清蛋白萃取至反胶束中）和后萃取（即将血清蛋白从反胶束中再次转移至水相）两步。目前，在反胶束萃取血清蛋白技术中用到的表面活性剂一般为1,4-二(2-乙基己基)丁二酸酯磺酸钠 (AOT) 和十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)。反胶束对血清蛋白的前萃取可在中性及碱性条件下进行，但是后萃取过程只能在酸性条件下进行；且表面活性剂用量大（AOT: 0.16 M，即70 g/L; CTAB: >0.04 M，即14.5 g/L）。此外，AOT浓度高时易于使水相乳化，CTAB在萃取过程中容易与血清蛋白形成白色不溶的复合物；待萃取的血清蛋白含量不得高于6 g/L，否则萃取率会急剧降低。本发明将一种新型表面活性剂-双子型表面活性剂用于血清蛋白的萃取转移，可在中性及碱性条件下将蛋白质高效的由反胶束中转移至水相，且表面活性剂用量少(不小于3 g/L即可)，待萃取血清蛋白含量可高至40 g/L。当表面活性剂浓度达到90 g/L时未导致水相乳化，亦没有与血清蛋白形成不溶复合物。

发明内容

本发明的目的是提供一种萃取效率高、萃取条件极其温和、操作简单、表面活性剂用量少的在中性或碱性条件下萃取转移血清蛋白的方法。

本发明包括将血清蛋白配制成待萃取血清蛋白溶液后以反胶束进行前萃取，取得有机相后再用缓冲液进行后萃取，离心取得血清蛋白水溶液，再通过真空冷冻干燥得到血清蛋白干粉；其特征在于所述反胶束由双子型表面活性剂、正构烷烃、短链醇和水组成，所述反胶束中双子型表面活性剂的浓度为3 g/L ~ 90 g/L；所述缓冲液中含有浓度为0.1～2 M的无机盐；所述双子型表面活性剂结构式为：

上式中，m为12～16的整数，s为2～12的整数。

以上双子型表面活性剂简写为C_mC_sC_m。

本发明用双子型表面活性剂形成的反胶束对血清蛋白进行前萃取和后萃取，在中性和碱性条件下均能使血清蛋白高效的转移富集至水中，其效率与酸性条件下相近。本方法操作简单，表面活性剂用量少，条件极其温和，血清蛋白的天然结构不受影响。

当所述双子型表面活性剂的m=12，s为8～12的整数时，双子型表面活性剂最佳。

由于适当增大表面活性剂浓度有利于提高前萃取效率，但是浓度太大可能会导致反胶束结构变形，阻碍蛋白质的扩散，使前萃取效率反而降低。故本发明反胶束中双子型表面活性剂的浓度为3 g/L～90 g/L。

本发明所述无机盐可以为氯化钠、溴化钠、氯化钾或氯化钙。

少量的助溶剂（即短链醇）有助于反胶束的形成，但助溶剂过多会影响溶液的极性以及反胶束的大小，导致前萃取效率降低。故本发明所述反胶束中正构烷烃和短链醇的体积比为12～5 : 1。

另外，本发明所述反胶束中水与双子型表面活性剂的摩尔比为5～20 : 1。

所述正构烷烃为正戊烷、正己烷、异辛烷或正辛烷中的任意一种。

所述短链醇为正戊醇、正己醇、异辛醇或正辛醇中的任意一种。

本发明是在中性及碱性条件下完成蛋白质的富集与转移。pH值太高不利于血清蛋白的稳定，故本发明以pH值为7～10的缓冲液溶解血清蛋白，配制成待萃取血清蛋白溶液。

另，所述后萃取所用的缓冲液的pH值为7～10。

附图说明

图1为后萃取后血清蛋白的圆二谱图。

具体实施方式

（1）配制反胶束：

先将正构烷烃和短链醇以12～5 : 1的体积比混合，形成非极性溶剂。

正构烷烃可选自正戊烷、正己烷、异辛烷或正辛烷中的任意一种。

短链醇可选自正戊醇、正己醇、异辛醇或正辛醇中的任意一种。

再将15～20 g不同的双子型表面活性剂溶于1 L 非极性溶剂中，再加入1.2～35.1 mL水，充分振荡至溶液澄清透明，即为含有0.013～0.065 M不等的双子型表面活性剂的反胶束。

为了进一步证明双子型表面活性剂在蛋白质萃取中的优越性能，也配置了单链表面活性剂CTAB（即十六烷基三甲基溴化铵）和DTAB（即十二烷基三甲基溴化铵）反胶束作为对比试验，见表1。

表1 反胶束中各原料的配比及浓度表

	表面活性剂	表面活性剂用量	非极性溶剂用量	水	表面活性剂浓度
						方案一	C₁₂C₈C₁₂	10 g	1 L	3.9 mL	0.014 M
方案二	C₁₂C₈C₁₂	20 g	1 L	7.7 mL	0.028 M
						方案三	C₁₂C₁₂C₁₂	10 g	1 L	1.2 mL	0.013 M
方案四	C₁₂C₁₂C₁₂	15 g	1 L	1.8 mL	0.020 M
						方案五	C₁₂C₁₂C₁₂	20 g	1 L	2.4 mL	0.026 M
方案六	C₁₂C₂C₁₂	15 g	1 L	35.1mL	0.024 M
						方案七	C₁₂C₅C₁₂	20 g	1 L	11.0mL	0.030 M
方案八	C₁₆C₅C₁₆	20 g	1 L	7.0mL	0.026 M
						方案九	C₁₆C₈C₁₆	20 g	1 L	6.7mL	0.025 M
方案十	CTAB	20 g	1 L	19.8mL	0.055 M
						方案十一	DTAB	20 g	1 L	23.4mL	0.065 M

（2）配制待萃取的血清蛋白溶液：

缓冲液的配制：

用磷酸氢二钠和柠檬酸、或醋酸和醋酸钠、或磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，配pH范围为7～8的缓冲液(0.01 M)。

用甘氨酸和氢氧化钠，配pH范围为8～10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(0.01 M)。

取以上两种缓冲液分别溶解血清蛋白，形成待萃取的血清蛋白溶液。

（3）前萃取

将以上配制的反胶束与待萃取的血清蛋白溶液经涡旋震荡10 min以及14000 rpm下离心15 min后，取上层反胶束清液。

（4）后萃取

后萃液的配制：用磷酸氢二钠和柠檬酸或醋酸和醋酸钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，配pH范围为7～8的缓冲液(0.01 M)。用甘氨酸和氢氧化钠，配pH范围为8～10的缓冲液(0.01 M)。之后在后萃液中加入0.1～2 M的无机盐氯化钠、溴化钠、氯化钾或氯化钙。

按体积比为1:1，将后萃液与步骤（3）所得的反胶束溶液相混合，涡旋震荡10 min并于14000 rpm下离心15 min后，取下层血清蛋白溶液。

通过以下公式计算血清蛋白的萃取效率：

不同反胶束对血清蛋白的萃取效率与后萃液pH值的关系列表，见表2。

表2表面活性剂反胶束对血清蛋白的萃取效率

由表2可看出，双子型表面活性剂C₁₂C₈C₁₂和C₁₂C₁₂C₁₂反胶束可实现中性及碱性条件下蛋白质的高效富集与转移。

（5）冷冻干燥

将步骤（4）所得的血清蛋白溶液，在压强为50 Pa、温度为-60℃下冷冻干燥36 h，得到纯血清蛋白干粉。

后萃取后取得的血清蛋白的圆二谱图及商品化血清蛋白的圆二谱图如图1所示，图中，曲线a表示商品化血清蛋白；曲线b表示C₁₂C₈C₁₂反胶束后萃取后血清蛋白；曲线c表示C₁₂C₁₂C₁₂反胶束后萃取后血清蛋白。

由图1可知，双子型表面活性剂C₁₂C₈C₁₂和C₁₂C₁₂C₁₂反胶束体系后萃取之后的血清蛋白的圆二谱图和商品化血清蛋白的圆二谱图几乎重合，说明本萃取方法保持了血清蛋白的天然结构。

Claims

1.在中性及碱性条件下萃取转移血清蛋白的方法，包括将血清蛋白配制成待萃取血清蛋白溶液后以反胶束进行前萃取，取得有机相后再用缓冲液进行后萃取，离心取得血清蛋白水溶液，再通过真空冷冻干燥得到血清蛋白干粉；其特征在于所述反胶束由双子型表面活性剂、正构烷烃、短链醇和水组成，所述反胶束中双子型表面活性剂的浓度为3 g/L ~ 90 g/L；所述缓冲液中含有浓度为0.1～2 M的无机盐；所述双子型表面活性剂结构式为：

上式中，m为12～16的整数，s为2～12的整数。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述双子型表面活性剂的m=12，s为8～12的整数。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述无机盐为氯化钠、溴化钠、氯化钾或氯化钙。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述反胶束中正构烷烃和短链醇的体积比为12～5 : 1。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述反胶束中水与双子型表面活性剂的摩尔比为5～20 : 1。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述正构烷烃为正戊烷、正己烷、异辛烷或正辛烷中的任意一种。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述短链醇为正戊醇、正己醇、异辛醇或正辛醇中的任意一种。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于以pH值为7～10的缓冲液溶解血清蛋白，配制成待萃取血清蛋白溶液。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述后萃取所用的缓冲液的pH值为7～10。