CN102695796A

CN102695796A - 细胞、核酸、酶和它们用于生产槐糖脂的用途以及方法

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Publication number: CN102695796A
Application number: CN2010800616564A
Authority: CN
Inventors: S.沙费尔; M.韦塞尔; A.蒂森胡森
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2009-11-18
Filing date: 2010-10-19
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2030-10-19
Also published as: CN102695796B; US20150056661A1; JP5936548B2; BR112012012008A2; WO2011061032A3; US9068211B2; US20150056658A1; WO2011061032A2; US20150056660A1; US20150056659A1; EP2501813A2; US9102968B2; DE102010014680A1; EP2501813B1; JP2013511266A; US8911982B2; US9157108B2; US20130035403A1; US9085787B2

Abstract

本发明涉及细胞、核酸和酶，涉及它们用于生产槐糖脂的用途，也涉及用于生产槐糖脂的方法。

Description

细胞、核酸、酶和它们用于生产槐糖脂的用途以及方法

技术领域

本发明涉及核酸、酶和细胞以及它们用于生产槐糖脂的用途，也涉及用于生产槐糖脂的方法。

背景技术

目前，表面活性剂基本上基于石化原料的基础来生产。由于可预见的石化原料的短缺以及日益增加的对基于可再生原料的和/或生物可降解的产品的需求，基于可再生原料的表面活性剂的使用是一种合适的替代方案。

槐糖脂具有用作表面活性剂所需要的表面活性性质。

这些脂类目前使用多种酵母菌、特别是假丝酵母菌（Candida bombicola）的野生型分离物来生产。

迄今为止，仅通过过程控制（pH值、氧供应、培养基组成、饲喂策略、氮供应、温度、底物的选择等）的优化进行产物形成的性能参数的改善，所述性能参数诸如碳产率、空间时间产率、产物浓度、产物同质性（乙酰化程度, 脂肪酸种类, 内酯形式对开链形式）。

唯一的例外是如下的假丝酵母菌的遗传修饰，其中β-氧化已经被排除，使得作为底物而补料的甘油三酯、脂肪酸、脂肪醇等不能够再被用作碳源，换而言之，被降解（Van Bogaert等人FEMS Yeast Res. 2009年6月;9（4）:610-7）。以此方式，通过选择底物，应该能够有针对性地控制槐糖脂的脂肪酸比例，从而影响产物性质。

由于通过优化过程控制仅能有限地改善槐糖脂的生物技术生产的性能参数，所以还必须进行遗传修饰。所述遗传修饰一方面包括增强参与槐糖脂合成的酶：细胞色素P450单加氧酶、糖基转移酶I、糖基转移酶II、乙酰基转移酶、槐糖脂输出体（Exporter），目的是改善产物形成的性能参数，诸如碳产率、空间时间产率、产物浓度、产物同质性（乙酰化程度、脂肪酸物质）等。所述遗传修饰另一方面包括减弱一些参与槐糖脂合成的酶：糖基转移酶II、乙酰基转移酶，目的是修饰生产的槐糖脂的结构和性质：糖基转移酶II：生产单糖基槐糖脂；乙酰基转移酶：生产未乙酰化的槐糖脂。

如果要在清洁用途、化妆品用途和其它用途中大规模地使用槐糖脂作为表面活性剂，它们必须与目前使用的表面活性剂相竞争。目前使用的表面活性剂是可以以非常低的成本生产的大宗化学品。因此，必须以尽可能最低的成本来生产槐糖脂。这不能仅仅通过过程优化来优化性能参数来实现。

因此，存在日益增加的对具有高产品产率的槐糖脂有效生产的需求。

因此，本发明以这样的目的为基础，即提供工具和/或方法，借助于所述工具和/或方法，可以以简单且大量地合成特定槐糖脂。

发明内容

令人惊奇地，已经发现，在下文中所述的细胞、核酸、多肽和方法能够达成上述目的。

因此，本发明的主题是，具有经改变的酶装置的遗传修饰的细胞，所述细胞用于合成槐糖脂。

本发明的另一个主题是，如在权利要求11和12中所述的新的核酸和载体。

本发明还有一个主题是，可用于槐糖脂生物合成中的新的酶。

本发明的优点是，不仅改善了槐糖脂形成的性能参数，诸如碳产率和空间时间产率，而且也可以改善例如乙酰化程度和脂肪酸种类方面的产物同质性。

本发明的一个主题是能够形成槐糖脂的细胞，对所述细胞已如此进行了遗传工程改变，使得所述细胞相对较于它的野生型而言具有一种经改变的如分别在下文中列举的选自下列所述组的至少一种酶的活性：

至少一种酶E₁，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 7、Seq ID Nr. 53、Seq ID Nr. 55、Seq ID Nr. 57、Seq ID Nr. 59、Seq ID Nr. 61或Seq ID Nr. 63，尤其是Seq ID Nr. 7，或具有这样的多肽序列：其中相对于各个参照序列Seq ID Nr. 7、Seq ID Nr. 53、Seq ID Nr. 55、Seq ID Nr. 57、Seq ID Nr. 59、Seq ID Nr. 61或Seq ID Nr. 63、尤其是Seq ID Nr. 7，最多25%、优选最多20%、特别优选最多15%、尤其最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有带有各参照序列Seq ID Nr. 7、Seq ID Nr. 53、Seq ID Nr. 55、Seq ID Nr. 57、Seq ID Nr. 59、Seq ID Nr. 61或Seq ID Nr. 63的酶的至少50%、优选65%、特别优选80%、尤其多于90%的酶的活性，其中将酶E₁的酶的活性理解为将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸的能力，

至少一种酶E₂，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 8或Seq ID Nr. 11，或具有这样的多肽序列：其中相对于Seq ID Nr. 8或Seq ID Nr. 11，最多60%、优选最多25%、特别优选最多15%、尤其最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有带有各参照序列Seq ID Nr. 8或Seq ID Nr. 11的酶的至少50%、优选65%、特别优选80%、尤其多于90%的酶的活性，其中将酶E₂的酶的活性理解为将UDP-葡萄糖和17-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸的能力，

至少一种酶E₃，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 11，或具有这样的多肽序列：其中相对于Seq ID Nr. 11，最多60%、优选最多25%、特别优选最多15%、尤其最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有带有参照序列Seq ID Nr. 11的酶的至少50%、优选地65%、特别优选地80%、尤其多于90%的酶的活性，其中将酶E₃的酶的活性理解为将17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸和UDP-葡萄糖转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸的能力，

至少一种酶E₄，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 9，或具有这样的多肽序列：其中相对于Seq ID Nr. 9，最多50%、优选最多25%、特别优选最多15%、尤其最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有带有Seq ID Nr. 9的酶的至少50%、优选65%、特别优选80%、尤其多于90%的酶活性，其中将酶E₄的酶的活性理解为将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸1',4''-内酯单乙酸酯，或将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯单乙酸酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯二乙酸酯，或将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸1',4''-内酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯二乙酸酯的能力，其中第一个选项是优选的，

至少一种酶E₅，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 10，或具有这样的多肽序列：其中相对于Seq ID Nr. 10，最多45%、优选最多25%、特别优选最多15%、尤其最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有带有Seq ID Nr. 10的酶的至少50%、优选65%、特别优选80%、尤其多于90%的酶活性，其中酶E₅的酶活性理解为将槐糖脂从细胞转移到周围的培养基中的能力。

在本发明的上下文中，表述“槐糖脂”理解为通式（Ia）和（Ib）的化合物

式（Ia）

式（Ib）

其中

R¹ = H或CO-CH₃，

R² = H或CO-CH₃，

R³ =含有6-32个碳原子的，未置换或具有羟基官能置换的，无分支的，任选包含1-3个双键或三键的二价有机残基，

R⁴ = H、CH₃或包含2-10个碳原子的，未置换或具有羟基官能置换的，无分支的，任选包含1-3个双键或三键的一价有机残基，且

n = 1或0。

在本发明上下文中，细胞的“野生型”优选理解为起始菌株，由所述起始菌株通过遗传工程操纵遗传元素产生根据本发明的细胞，所述细胞对上述Seq ID Nr.的酶的活性负责。

表述“酶的经改变的活性”优选地理解为表示，经改变的细胞内活性。

不导致给定多肽的性质和功能显著改变的给定多肽序列的氨基酸残基的改变是本领域技术人员已知的。因而，例如，可将所谓的保守氨基酸彼此交换；这样的合适的氨基酸置换的实例是：Ala替换Ser；Arg替换Lys；Asn替换Gln或His；Asp替换Glu；Cys替换Ser；Gln替换Asn；Glu替换Asp；Gly替换Pro；His替换Asn或Gln；Ile替换Leu或Val；Leu替换Met或Val；Lys替换Arg或Gln或Glu；Met替换Leu或Ile；Phe替换Met或Leu或Tyr；Ser替换Thr；Thr替换Ser；Trp替换Tyr；Tyr替换Trp或Phe；Val替换Ile或Leu。同样已知，尤其在多肽的N-或C-端例如以氨基酸插入或删除形式的改变通常对多肽的功能没有显著影响。

可以通过如下方法测定酶E₁的活性：以技术人员已知的方式，破碎包含该活性的细胞，例如借助于球磨机、弗氏压碎器或超声波粉碎器，随后将完整的细胞、细胞碎片和破碎辅助物（例如，玻璃珠）通过在13 000 rpm和4℃下的10分钟的离心分离去除。然后，可以用得到的无细胞的粗提取物进行酶测定，并继之以产物的LC-ESI-MS检测。或者以本领域技术人员已知的方式，通过色谱法（诸如镍/次氮基三乙酸亲和色谱法、抗生蛋白链菌素亲和色谱法、凝胶过滤色谱法或离子交换色谱法）可以富集或者也可以纯化酶最高到均质。在总体积为200µl的200 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.4）、0.5 mM NADPH、0.5 mM二硫苏糖醇、3 mM葡萄糖6-磷酸和0.5 U葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和50 μl蛋白质粗提物（约1 mg总蛋白质）或纯化的蛋白质溶液（10µg纯化的蛋白质）中，可以进行标准测定。通过加入下述物质，开始反应：a）5 μl底物（Z-9-十八碳烯酸）在乙醇中的10 mM溶液，或b）5µl底物（Z-9-十八碳烯酸）在0.1% Triton X-100中的10 mM溶液，所述溶液事先已经通过2次超声波处理（每次30秒）进行预处理，并在30℃温育30分钟。此后，将该反应用200µl乙酸乙酯萃取。沉淀未溶解的组分，这里通过短暂离心（在16 100 g ，5分钟）进行相分离，并借助于LC-ESI-MS来分析乙酸乙酯相。产物的鉴别通过分析相应的质量痕迹和MS²波谱进行。

可以通过如下方法测定酶E₂的活性：以技术人员已知的方式，破碎包含该活性的细胞，例如借助于球磨机、弗氏压碎器或超声波粉碎器，随后将完整的细胞、细胞碎片和破碎辅助物（例如，玻璃珠）通过在13 000 rpm和4℃下的10分钟的离心分离去除。然后，可以用得到的无细胞的粗提取物进行酶测定，并继之以产物的LC-ESI-MS检测。或者以本领域技术人员已知的方式，通过色谱法（诸如镍/次氮基三乙酸亲和色谱法、抗生蛋白链菌素亲和色谱法、凝胶过滤色谱法或离子交换色谱法）可以富集或者也可以纯化酶最高到均质。标准测定可以由185 μl 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 μl 125 mM UDP-葡萄糖和50 μl蛋白质粗提物（约1 mg总蛋白）或纯化的蛋白溶液（10µg纯化的蛋白）组成。通过加入下述物质，开始反应：a）5 μl底物（例如，18-羟基-Z-9-十八碳烯酸）在乙醇中的10 mM溶液，或b）5µl底物（例如，18-羟基-Z-9-十八碳烯酸）在0.1% Triton X-100中的10 mM溶液，所述溶液事先已经通过2次超声波处理（每次30秒）进行预处理，并在30℃温育30分钟。此后，将该反应用200µl乙酸乙酯萃取。沉淀未溶解的组分，这里通过短暂离心（在16 100 g ，5分钟）进行相分离，并借助于LC-ESI-MS来分析乙酸乙酯相。产物的鉴别通过分析相应的质量迹线和MS²波谱进行。在该测定中，优选使用18-羟基-Z-9-十八碳烯酸作为底物，因为它是商业可得到的，也因为已经在不同地方证实，在槐糖脂生物合成过程中，槐糖脂生物合成的酶不仅接受18-羟基-Z-9-十八碳烯酸、17-羟基-Z-9-十八碳烯酸也接受其它链长的（饱和的或不饱和的）和在ω-或ω-1-碳上羟基化的羟基脂肪酸作为底物，如同也接受在槐糖脂生物合成进程中从它们产生的单葡糖苷和二葡糖苷作为底物（Asmer, H.J., Lang, S., Wagner, F., Wray, V. (1988). Microbial production, structure elucidation and bioconversion of sophorose lipids. J. Am. Oil Chem. Soc. 65:1460–1466; Nunez, A., Ashby, R., Foglia, T.A. 等人(2001). Analysis and characterization of sophorolipids by liquid chromatography with atmospheric pressure chemical ionization. Chromatographia 53:673–677; Ashby, R.D., Solaiman, D.K., Foglia, T.A. (2008). Property control of sophorolipids: influence of fatty acid substrate and blending. Biotechnology Letters 30:1093-1100）。

可以通过如下方法测定酶E₃的活性：以技术人员已知的方式，破碎包含该活性的细胞，例如借助于球磨机、弗氏压碎器或超声波粉碎器，随后将完整的细胞、细胞碎片和破碎辅助物（例如，玻璃珠）通过在13 000 rpm和4℃下的10分钟的离心分离去除。然后，可以用得到的无细胞的粗提取物进行酶测定，并继之以产物的LC-ESI-MS检测。或者以本领域技术人员已知的方式，通过色谱法（诸如镍/次氮基三乙酸亲和色谱法、抗生蛋白链菌素亲和色谱法、凝胶过滤色谱法或离子交换色谱法）可以富集或者也可以纯化酶最高到均质。标准测定可以由185 μl 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 μl 125 mM UDP-葡萄糖和50 μl蛋白质粗提物（约1 mg总蛋白）或纯化的蛋白溶液（10µg纯化的蛋白）组成。通过加入下述物质，开始反应：a）5 μl底物（例如，18-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸）在乙醇中的10 mM溶液，或b）5µl底物（18-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸）在0.1% Triton X-100中的10 mM溶液，所述溶液事先已经通过2次超声波处理（每次30秒）进行预处理，或c）通过加入关于酶E₂的活性测定所述的反应混合物，并在30℃温育30分钟。此后，将反应用200µl（如在a）和b）中所述，加入的底物）或400µl（如在c）中所述，加入的底物）的乙酸乙酯萃取反应物。沉淀未溶解的组分，这里通过短暂离心（在16 100 g ，5分钟）进行相分离，并借助于LC-ESI-MS来分析乙酸乙酯相。产物的鉴别通过分析相应的质量迹线和MS²波谱进行。在该测定中，优选使用18-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸作为底物，因为它的前体分子18-羟基-Z-9-十八碳烯酸是商业可得到的，也因为已经在不同地方证实，在槐糖脂生物合成过程中，槐糖脂生物合成的酶不仅接受18-羟基-Z-9-十八碳烯酸、17-羟基-Z-9-十八碳烯酸也接受其它链长的（饱和的或不饱和的）和在ω-或ω-1-碳上羟基化的羟基脂肪酸作为底物，如同也接受在槐糖脂生物合成进程中从它们产生的单葡糖苷和二葡糖苷作为底物。

可以通过如下方法测定酶E₄的活性：以技术人员已知的方式，破碎包含该活性的细胞，例如借助于球磨机、弗氏压碎器或超声波粉碎器，随后将完整的细胞、细胞碎片和破碎辅助物（例如，玻璃珠）通过在13 000 rpm和4℃下的10分钟的离心分离去除。然后，可以用得到的无细胞的粗提取物进行酶测定，并继之以产物的LC-ESI-MS检测。或者以本领域技术人员已知的方式，通过色谱法（诸如镍/次氮基三乙酸亲和色谱法、抗生蛋白链菌素亲和色谱法、凝胶过滤色谱法或离子交换色谱法）可以富集或者也可以纯化酶最高到均质。标准测定可以由185 μl 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、2.5 μl 100 mM乙酰基-辅酶A和50 μl蛋白质粗提物（约1 mg总蛋白）或纯化的蛋白溶液（10µg纯化的蛋白）组成。通过加入下述物质，开始反应：a）5 μl底物（化学上去乙酰化的槐糖脂）在乙醇中的10 mM溶液，或b）5µl底物（化学上去乙酰化的槐糖脂）在0.1% Triton X-100中的10 mM溶液，所述溶液事先已经通过2次超声波处理（每次30秒）进行预处理，或c）通过加入用于测定酶E₃的活性所述的反应混合物（按照该处在c以下）所述的底物加入的方式，随后在30℃温育30分钟。此后，将反应用200µl（如在a）和b）中所述，加入的底物）或600µl（如在c）中所述，加入的底物）的乙酸乙酯萃取反应物。沉淀未溶解的组分，这里通过短暂离心（在16 100 g ，5分钟）进行相分离，并借助于LC-ESI-MS来分析乙酸乙酯相。产物的鉴别通过分析相应的质量迹线和MS²波谱进行。根据本发明优选的是，酶E₄不仅接受槐糖脂的内酯形式（如在这里选作参照活性）作为底物，而且也能够在合适的位置至少一次将槐糖脂的酸形式乙酰化，如式（Ia）一般地所示，其中R¹和R² = H。

通过每个细胞的酶E₅的绝对量，可以以最简单的方式间接地测定酶E₅与它的野生型相比改变的活性，因为可以认为，基于细胞，存在增加会造成活性增加，存在减少会造成活性减少，并且这些关系直接地彼此依赖。与野生型相比改变的酶E₅的存在可以用常规方法测定。因而，可以使用对待检测蛋白质特异性的抗体通过蛋白印迹杂交（Sambrook等人, Molecular Cloning: a laboratory manual, 第2版Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989），随后用适合的用于浓度测定的软件进行光学评价（Lohaus和Meyer（1989）Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich（1999）, Angewandte Chemie 111: 2630-2647）来分析蛋白质浓度。

根据本发明优选的细胞是微生物，优选细菌细胞、酵母菌细胞或真菌细胞，其中假丝酵母属和Wickerhamiella属的子囊菌，尤其是假丝酵母菌、Candida bogoriensis、Candida batistae、Candida apicola和拟威 克酵母（Wickerhamiella domericqiae ），是特别优选的。

尤其是菌株假 丝酵母菌ATCC 22214、Candida bogoriensis NRRL Y-5980、Candida batistae CBS 8550、Candida apicola IMET 42747和拟威 克酵母是特别合适的细胞。

由于槐糖脂由根据本发明的细胞从葡萄糖和脂肪酸形成，所以如果根据本发明的细胞在其β-氧化中被至少部分地阻断，则是有利的，因为这会防止底物的流失，并从而使得更高的产物浓度和碳产率成为可能。例如在WO 03/100013中描述了在β-氧化中被阻断的假丝酵母属细胞，在Van Bogaert等人FEMS Yeast Res. 2009年6月;9(4):610-7中描述了β-氧化被阻断的假丝酵母菌细胞。

在根据本发明优选的细胞中，改变的酶的活性优选是酶的活性增加。

根据本发明，优选具有活性增加的下列酶的组合的细胞：

E₁E₂、E₁E₃、E₁E₄、E₁E₅、E₂E₃、E₂E₄、E₂E₅、E₃E₄、E₃E₅、E₄E₅、E₁E₂E₃、E₁E₂E₄、E₁E₂E₅、E₁E₃E₄、E₁E₃E₅、E₁E₄E₅、E₂E₃E₄、E₂E₄E₅、E₃E₄E₅、E₁E₂E₃E₄、E₂E₃E₄E₅、E₁E₃E₄E₅、E₁E₂E₄E₅、E₁E₂E₃E₅、E₁E₂E₃E₄和E₁E₂E₃E₄E₅，

其中组合

E₁E₂、E₁E₃、E₁E₄、E₁E₅、E₂E₃、E₂E₄、E₂E₅、E₃E₄、E₃E₅、E₄E₅、E₁E₂E₃、E₁E₂E₄、E₁E₂E₅、E₁E₃E₄、E₁E₃E₅、E₁E₄E₅、E₂E₃E₄、E₂E₄E₅、E₃E₄E₅和E₁E₂E₃E₄E₅，

特别是

E₁E₂、E₁E₃、E₁E₄、E₁E₅、E₂E₃、E₂E₄、E₂E₅、E₃E₄、E₃E₅、E₄E₅和E₁E₂E₃E₄E₅

是优选的。

为了制备通式（Ia）（其中n = 0）的槐糖脂，在细胞中应当存在尽可能少的酶E₃的酶的活性。因而，在根据本发明的细胞的一个确定的实施方式中，改变的酶E₃的活性是减少的活性。

在这样的情况下，根据本发明优选的细胞是这样的细胞：其具有的酶E₃的活性减少，并任选同时具有酶E₁、E₂、E₄和E₅的至少一种的活性增加，且其特别地除了酶E₃的活性减少以外，具有下述酶组合的活性增加：

E₁E₂、E₁E₄、E₁E₅、E₂E₄、E₂E₅、E₄E₅、E₁E₂E₄、E₁E₂E₅、E₁E₄E₅和E₁E₂E₄E₅，

特别优选

E₁E₂、E₁E₄、E₁E₅、E₂E₄、E₂E₅、E₄E₅和E₁E₂E₄E₅。

在这样的情况下，根据本发明的细胞优选是假丝酵母菌 -、Candida bogoriensis-、Candida batistae-、Candida apicola-或拟威克 酵母细胞。

此外这里优选的是这样的根据本发明的细胞，其中通过基因的修饰来实现酶的活性的降低，所述基因包含选自下述的核酸序列：Seq ID Nr. 6，和与参照序列Seq ID Nr. 6至少80%、特别优选至少90%、此外优选至少95%和最优选至少99%相同的序列，

其中所述修饰选自优选由下述修饰组成的组：

在所述基因中插入外源DNA、所述基因的至少部分删除、所述基因序列中的点突变、RNA干扰（siRNA）、反义RNA或侧接所述基因的调节序列的修饰（插入、删除或点突变）。

适用于制备这样的细胞的核酸例如是具有Seq ID Nr. 16的核酸，其也是本发明的主题。

为了制备通式（Ia）或（Ib）（其中R¹和R²为H）的槐糖脂，在细胞中应当存在尽可能少的酶E₄的酶的活性。因而，在根据本发明的细胞的一个确定的实施方式中，改变的酶E₄的活性是减少的活性。

在这种情况下，根据本发明优选的细胞是这样的细胞：其具有的至少一种酶E₄的活性减少，并任选同时具有的酶E₁、E₂、E₃和E₅的至少一种的活性增加，且其特别地除了具有酶E₄活性减少以外，还具有下述酶组合的活性增加：

E₁E₂、E₁E₃、E₁E₅、E₂E₃、E₂E₅、E₃E₅、E₁E₂E₃、E₁E₂E₅、E₁E₃E₅和E₁E₂E₃E₅，

特别优选

E₁E₂、E₁E₃、E₁E₅、E₂E₃、E₂E₅、E₃E₅和E₁E₂E₃E₅。

在这种情况下，根据本发明的细胞优选是假丝酵母菌 -、Candida bogoriensis-、Candida batistae-、Candida apicola-或拟威克酵母细胞。

此外这里优选的是这样的根据本发明的细胞，其中通过基因的修饰来实现酶的活性的降低，所述基因包含选自下述的核酸序列：Seq ID Nr. 4，和与Seq ID Nr. 4至少80%、特别优选至少90%、此外优选至少95%和最优选至少99%相同的序列，

其中所述修饰选自优选由下述修饰组成的组：

适用于制备这样的细胞的核酸例如是具有Seq ID Nr. 14的核酸，其也是本发明的主题。

为了制备通式（Ia）（其中n = 0和R¹为H）的槐糖脂，在细胞中应当存在尽可能少的酶E₃和E₄的酶的活性。因而，在根据本发明的细胞的一个确定的实施方式中，修饰的酶E₃和E₄的活性是减少的活性。

在这种情况下，根据本发明优选的细胞是这样的细胞：其具有的酶E₃和E₄的各至少一种的活性减少，并同时具有的酶E₁、E₂和E₅的至少一种的活性增加，且其尤其除了酶E₃和E₄的各至少一种的活性减少以外，还具有下述酶组合的活性增加：

E₁E₂、E₁E₅、E₂E₅、E₁E₂E₅，

特别优选

E₁E₂、E₁E₅和E₂E₅。

和

包含选自下述的核酸序列的基因：Seq ID Nr. 6，和与参照序列Seq ID Nr. 6至少80%、特别优选至少90%、此外优选至少95%和最优选至少99%相同的序列，

其中所述修饰选自优选由下述修饰组成的组：

适用于制备这样的细胞的核酸是例如具有Seq ID Nr. 14和16的那些。

在下文中用于增加细胞中酶的活性所述的内容，既适用于增加酶E₁至E₅的活性，也适用于在下文中所有提及的其活性可以任选增加的酶。

原则上，可以这样实现酶的活性的增加：增加编码所述酶的一个或多个基因序列的拷贝数、使用强启动子、改变所述基因的密码子使用、以不同的方式增加mRNA或酶的半衰期、修饰基因表达的调节或使用编码具有增加的活性的合适酶的基因或等位基因，和任选地组合这些措施。例如，使用载体通过转化、转导、接合或这些方法的组合制备根据本发明遗传修饰的细胞，所述载体包含希望的基因、该基因的等位基因或其部分和启动子，所述启动子使得该基因的表达成为可能。特别地，通过将所述基因或所述等位基因整合进细胞的染色体中或染色体外复制的载体中，实现异源表达。

关于增加细胞中酶（例如酶异柠檬酸裂合酶）的活性的可能性的综述由EP0839211（这里将它作为引用并入本文）给出，且它的关于增加细胞中酶的活性的可能性的公开内容，形成本发明的公开内容的一部分。

上文所述的以及下文提及的所有酶或基因的表达可以借助于1维和2维蛋白凝胶分离，和随后使用合适的评价软件在凝胶中对蛋白质浓度进行光学识别。如果酶的活性的增加仅基于相应基因的表达的增加，则以简单的方式通过在野生型和经遗传工程改变的细胞之间对比1维和2维的蛋白质分离，可以定量测定酶的活性增加。制备棒状杆菌的蛋白质凝胶和鉴定蛋白质的常规方法，是由Hermann等人（Electrophoresis, 22: 1712.23（2001））所述的做法。同样可以使用对待检测蛋白质特异性的抗体通过蛋白印迹杂交（Sambrook等人, Molecular Cloning: a laboratory manual, 第2版Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989），随后用适合的用于浓度测定的软件进行光学评价（Lohaus和Meyer（1989）Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich（1999）, Angewandte Chemie 111: 2630-2647）来分析蛋白质浓度。借助于DNA条带移位分析（也称作凝胶阻滞）（Wilson等人（2001）Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155），可以测量DNA结合蛋白的活性。通过不同的充分描述的报高基因分析的方法（Sambrook等人, Molecular Cloning: a laboratory manual, 第2版Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989），可以证明DNA结合蛋白对其它基因的表达的影响。可以根据不同的描述的方法（Donahue等人（2000）Journal of Bacteriology 182（19）: 5624-5627; Ray等人（2000）Journal of Bacteriology 182（8）: 2277-2284; Freedberg等人（1973）Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823）测定细胞内酶的（比）活性。只要在下文中没有阐明用于测定某种酶的活性的具体方法，优选通过在下述文献中描述的方法，测定酶的活性的增加以及酶的活性的减少：Hermann等人, Electrophoresis, 22: 1712-23（2001）, Lohaus等人, Biospektrum 5 32-39（1998）, Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647（1999）和Wilson等人, Journal of Bacteriology 183: 2151-2155（2001）。

如果通过内源基因的突变来增加酶的活性，则可以如下产生这样的突变：使用传统的方法以非定向方式产生，例如，通过紫外线辐照或通过触发诱变的化学试剂，或者，有针对性地借助于遗传工程方法，诸如删除、插入和/或核苷酸替代。通过这些突变得到改变的细胞。特别优选的酶的突变体尤其也是这样的酶：其不能再进行反馈抑制，或与野生型酶相比至少可减少反馈抑制。

如果要通过增加酶的合成来实现酶的活性的增加，则例如可以增加相应基因的拷贝数，或者突变位于结构基因上游的启动子区和调节区或核糖体结合位点。构建在结构基因上游的表达盒以同样的方式起作用。另外，通过可诱导的启动子可以在每一个任何意的时间点增加表达。此外，还可以将酶基因归入为调节序列（也称作“增强子”），其通过改善RNA聚合酶和DNA之间的相互作用，同样起增加基因表达的作用。通过延长mRNA的寿命的措施同样改善表达。此外，通过防止酶降解，同样增加酶的活性。在这里，基因或基因构建存在于具有不同拷贝数的质粒中，或者整合在染色体中并扩增。此外，作为一个替代方案，可以通过改变培养基组成和培养管理，可以实现相关基因的过表达。为此，本领域技术人员尤其在下述文献中找到说明：Martin等人（Bio/Technology 5, 137-146（1987）），Guerrero等人（Gene 138, 35-41（1994））, Tsuchiya和Morinaga（Bio/Technology 6, 428-430（1988）），Eikmanns等人（Gene 102, 93-98（1991）），在EP-A-0 472 869中，在US 4,601,893中，Schwarzer和Pühler（Bio/Technology 9, 84-87（1991）），Reinscheid等人（Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132（1994）），LaBarre等人（Journal of Bacteriology 175, 1001-1007（1993）），在WO-A-96/15246中，Malumbres等人（Gene 134, 15-24（1993）），JP-A-10-229891，Jensen和Hammer（Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195（1998）），以及遗传学和分子生物学的已知教科书中。上述的措施与突变一样导致遗传工程改变的细胞。

例如，使用附加体质粒来增加各基因的表达。原则上，所有供本领域技术人员用于此目的的实施方式都适合作为质粒和载体。这样的质粒和载体可以由例如Novagen、Promega、Promega、New England Biolabs、Clontech或Gibco BRL公司的小册子获知。其它优选的质粒和载体可以见于：Glover, D. M. （1985）, DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. 和Denhardt, D. T（编）（1988）, Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. （1990）, Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. 和Maniatis, T. （1989）, Molecular cloning: a laboratory manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York。

随后通过转化，将包含要扩增的基因或要灭活的基因的部分的载体（诸如表达载体、基因删除盒、基因插入盒或基因过表达盒）转移进希望的菌株中。用于转化的方法，尤其是电穿孔、乙酸锂介导的转化、冻融转化例如描述在下列文献中：在Gietz, R.D., Schiestl, R.H. （2007）.Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2:1-4; Suga, M., Hatakeyama, T. (2003). High-efficiency electroporation by freezing intact yeast cells with addition of calcium. Curr Genet. 43:206-211; Hubberstey, A.V., Wildeman, A.G. (1991). Transformation of Saccharomyces cerevisiae by use of frozen spheroplasts. Trends Genet. 7:41; Bröker, M. (1993). Rapid transformation of cryopreserved competent Schizosaccharomyces pombe cells. Biotechniques. 15:598 - 600; Gietz, R.D., Schiestl, R.H. (1989). High efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier. Curr Genet. 16:339-346中和在“Nonconventional yeast in biotechnology”(Klaus Wolf编, Springer-Verlag Berlin, 1996)中。转化以后，载体、尤其是基因删除盒、基因插入盒或基因过表达盒借助于交换（“crossover”-Ereigniss）通过同源的或异源的、优选通过同源的重组整合进希望的菌株的染色体中。作为一个替代方案，载体、尤其是表达载体也可以是附加型，即作为独立的复制单元在希望的菌株的细胞中复制。在所有情况下，这样来确保载体（诸如表达载体、基因删除盒、基因插入盒或基因过表达盒）在细胞分裂时也传递给子细胞。

在上文中和在下文中使用的措辞“与它的野生型相比增加的酶E_x的活性”优选总是理解为，至少1.5、特别优选至少10、此外优选至少100、此外还更优选至少1000和最优选至少10 000的因数的增加的各种酶E_x的活性。此外，根据本发明的具有“与它的野生型相比增加的酶E_x的活性”的细胞尤其也包括这样的细胞：其野生型不具有或至少不具有可检测的酶E_x的活性，且其仅在增加酶的活性（例如通过过表达）以后才显示出可检测的酶E_x的活性。在这种情况下，术语“过表达”或在下文中使用的措辞“表达的增加”也包括这样的情况：其中起始细胞（例如野生型细胞）不具有或至少不具有可检测的表达，且仅通过重组方法来诱导可检测的酶E_x的合成。

与此相应的，使用的措辞“减少的酶E_x的活性”优选理解为，至少0.5、特别优选至少0.1、此外优选至少0.01、此外还更优选至少0.001和最优选至少0.0001的因数的减少的活性。措辞“减少的活性”也包括不可检测的活性（“零活性”）。某种酶的活性的减少例如可以通过定向突变，或通过其它的本领域技术人员已知的用于减少某种酶的活性的措施来进行。

减少微生物中的酶的活性的方法是本领域技术人员已知的。

分子生物学的技术在这里尤其适合。本领域技术人员在WO91/006660和WO03/100013中，可以找到用于修饰和减少蛋白质表达以及由此随之出现的酶的活性的减少（特别对于假丝酵母属）、尤其是用于中断某种基因的说明。

根据本发明优选的细胞的特征在于，通过修饰包含上述核酸序列之一的基因来实现酶的活性的减少，其中所述修饰选自优选由下述修饰组成的组：在所述基因中插入外源DNA、所述基因的至少部分删除、所述基因序列中的点突变、RNA干扰（siRNA）、反义RNA或侧接所述基因的调节序列的修饰（插入、删除或点突变）。

在这种情况下，外源DNA可理解为，对于所述基因而言（并非对于所述生物体而言）是“外来”的任意DNA序列，换而言之，在这种情况下Candida-bombicola-内源DNA序列也可以作为“外源DNA”起作用。

在这种情况下，特别优选的是，将所述基因通过选择标记基因的插入来中断，因而所述外源DNA是选择标记基因，其中所述插入优选通过同源重组进基因座中来进行。

根据本发明优选的细胞的特征在于，它们已经被至少一种在下文中所述的根据本发明的核酸和/或在下文中所述的根据本发明的载体转化。

根据本发明的细胞可以有利地用于生产槐糖脂。

因而，本发明的另一个主题是，根据本发明的细胞用于生产通式（Ia）和（Ib）的化合物的用途，

其中

R¹ = H或CO-CH₃，

R² = H或CO-CH₃，

R³ =含有6-32个碳原子的，优选7-19个碳原子的，未取代或具有羟基官能取代的，无分支的，任选包含1-3个双键或三键的二价有机残基，

R⁴ =H、CH₃或包含2-10个碳原子的，未取代或具有羟基官能取代的，无分支的，任选包含1-3个双键或三键的一价有机残基，

n = 0或1，

用于生产尤其是这样的通式（Ia）和（Ib）的化合物的用途，

其中

R¹ = H或CO-CH₃，

R² = H或CO-CH₃，

R⁴ = H、CH₃或C₉H₁₉，且

n = 0或1，

和用于生产最特别优选的通式（Ia）和（Ib）的化合物的用途，

其中

R¹ = H或CO-CH₃，

R² = H或CO-CH₃，

R³ =含有6-32个碳原子的，优选7-19个碳原子的，未取代或具有羟基官能取代的，无分支的，任选包含1-3个双键或三键的二价有机残基，尤其是C₈H₁₅=C₇H₁₄，

R⁴ = H、CH₃或C₉H₁₉，尤其是H或CH₃，且

n = 1。

本发明的另一个主题是用于生产槐糖脂、优选通式（Ia）和（Ib）的化合物的方法，

其中

R¹ = H或CO-CH₃，

R² = H或CO-CH₃，

R⁴ = H、CH₃或包含2-10个碳原子的，未取代或具有羟基官能取代的，无分支的，任选包含1-3个双键或三键的一价有机残基，且

n = 0或1，

用于生产尤其是这样的通式（Ia）和（Ib）的化合物的方法，

其中

R¹ = H或CO-CH₃，

R² = H或CO-CH₃，

R⁴ = H、CH₃或C₉H₁₉，且

n = 0或1，

和用于生产最特别优选的通式（Ia）和（Ib）的化合物的方法，

其中

R¹ = H或CO-CH₃，

R² = H或CO-CH₃，

R⁴ = H、CH₃或C₉H₁₉，尤其是H或CH₃，且

n = 1，

所述方法包括下述工艺步骤：

I）使根据本发明的细胞与包含碳源的培养基接触，

II）在使所述细胞能够从所述碳源形成槐糖脂的条件下，培养所述细胞，且

III）任选分离形成的槐糖脂。

为了生产上述产物的目的，可以连续地或不连续地以分批方法（分批培养）或分批补料方法（进料法（Zulaufverfahren））或重复分批补料法（重复进料法（repetitives Zulaufverfahren））使根据本发明的遗传改变的细胞与营养培养基接触，并从而进行培养。如在GB-A-1009370中描述的半连续方法也可行的。已知的培养方法的综述，可以参见：Chmiel的教科书（“Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik”（Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991））或Storhas的教科书（“Bioreaktoren und periphere Einrichtungen”, Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994）。

要使用的培养基必须以合适的方式满足各菌株的要求。在“Nonconventional yeast in biotechnology”中（Klaus Wolf编, Springer-Verlag Berlin, 1996）含有用于不同酵母菌株的培养基的描述。

作为碳源可以使用的例如是：碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素和半纤维素，植物油和动物油和脂肪例如豆油、红花油、花生油、大麻油、麻风树油、椰子脂、南瓜子油、亚麻子油、玉米油、罂粟子油、月见草油、橄榄油、棕榈核油、棕榈油、菜籽油、芝麻油、葵花籽油、葡萄籽油、核桃油、小麦胚芽油和椰子油，脂肪酸例如辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、花生四烯酸、山萮酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、γ-亚麻酸和它们的甲基-或乙基酯，和脂肪酸混合物，具有前述脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯，醇类例如甘油、乙醇和甲醇，烃类诸如甲烷、含碳的气体和气体混合物，诸如CO、CO₂、合成气、烟道气，氨基酸诸如L-谷氨酸盐或L-缬氨酸，或有机酸例如醋酸。这些物质可以单独地或作为混合物使用。特别优选使用碳水化合物、尤其是单糖、寡糖或多糖作为碳源（如在US 6,01,494和US 6,136,576中所述），和烃类、尤其是烷烃、烯烃和炔烃和它们衍生的单羧酸和由这些单羧酸衍生的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯以及甘油和乙酸酯。最特别优选的是包含甘油与辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、花生四烯酸、山萮酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和/或γ-亚油酸的酯化产物的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。

作为氮源可以使用的是包含氮的有机化合物，诸如蛋白胨、酵母萃取物、肉膏、麦芽膏、玉米浆、大豆粉和尿素，或无机化合物诸如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵、氨、氢氧化铵或氨水。氮源可以单独地或作为混合物使用。

作为磷源可以使用：磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。此外，所述培养基必须包含所生长必需的金属盐，例如，硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质以外，可以使用必需的生长物质诸如氨基酸和维生素。此外，可以将合适的前体加入培养基中。可以将所述的原料作为单批加入培养物中，或在培养过程中以合适的方式补料。

以合适的方式使用碱性化合物（诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水）或酸性化合物（诸如磷酸和硫酸）以控制培养物的pH。使用消泡剂（例如，脂肪酸聚乙二醇酯）以控制泡沫产生。为了维持质粒的稳定性，可以向培养基中加入合适的选择物质，例如，抗生素。为了维持好氧条件，将氧或含氧的气体混合物（例如，空气）导入培养物中。

培养物的温度通常是高于20℃，优选高于25℃，它也可以是高于40℃，其中不超过95℃、特别优选不超过90℃和最优选不超过80℃的培养温度是有利的。

在根据本发明的方法的步骤III）中，可以任选地从细胞和/或营养培养基中分离出通过细胞形成的槐糖脂，其中本领域技术人员已知的从复杂组合物中分离出低分子量物质的所有方法均适用于分离，例如，过滤、萃取、吸附（色谱法）或结晶。通常，取决于产物形式进行槐糖脂的后处理。在槐糖脂以水不溶性的内酯形式存在的情况下，适合的是下述方法：从水相中分离内酯形式的产物通过离心进行。

另外，产物相包括生物质和不同杂质的残余物，诸如油、脂肪酸和其它营养培养基组分。例如，通过使用合适的溶剂萃取，可以有利地借助于有机溶剂分离油残余物。烷烃（例如，正己烷）是优选的溶剂。从水相分离产物可以例如使用合适的酯，例如借助于乙酸乙酯进行。上述萃取步骤可以以任意次序进行。

或者，从营养培养基中分离槐糖脂可以通过将内酯形式转化成水溶性的开链酸形式进行。例如，借助于水解，有利地通过碱性水解，进行向开链酸形式的转化。此后，将开链的槐糖脂溶解在酸的水溶液（例如硫酸的水溶液）中，以便分离在溶液中可能已经形成的盐。借助于萃取，进行产物的进一步纯化。在这里，优选使用溶剂，尤其是有机溶剂。正戊醇是优选的溶剂。为了去除溶剂，例如进行蒸馏。此后，例如借助于色谱法，可以进一步纯化低压冻干的产物。在这里可以提及的实例是：借助于合适的溶剂进行沉淀、借助于合适的溶剂进行萃取、络合（例如借助于环糊精或环糊精衍生物）、结晶、借助于色谱法进行纯化或分离或者将槐糖脂转化成可以容易分离的衍生物。

用根据本发明的方法生产的槐糖脂可以有利地用于清洁剂、化妆品制剂或药物制剂以及作物保护制剂中。

因而，本发明的另一个主题是，用根据本发明的方法得到的槐糖脂制备化妆品制剂、皮肤病学制剂或药物制剂、作物保护制剂和护理剂及清洁剂和表面活性剂浓缩物的用途。

术语“护理剂”在这里理解为，满足下述目的的制剂：使物品保持在它的初始形式，减少或避免外部影响（例如时间、光、温度、压力、污损、与所述物品接触的其它反应性化合物的化学反应）的作用（例如，老化、污损、材料疲劳、漂白），或甚至改善对象的希望的有利的性质。对于最后一点，可以提及例如，被考虑的对象的改善的毛发光泽或更大的弹性。

“作物保护制剂”应当理解为这样的制剂，其明显地用于保护植物的制剂，这取决于它们的制品的性质；如果在所述制剂中包含至少一种选自下述类别的化合物：除草剂、杀真菌剂、杀虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、驱鸟剂、植物营养物和土壤改良剂，则其尤其属于这种情况。

根据本发明，优选将根据本发明的方法制备的槐糖脂用于家务、工业、尤其是用于硬表面、皮革或纺织品的护理剂及清洁剂中。

一种分离的DNA为达成该目的作出了贡献，所述DNA选自下述序列：

A1a）根据Seq ID Nr. 2、Seq ID Nr. 52或Seq ID Nr. 54，尤其是Seq ID Nr. 2的序列，其中该序列编码能够将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质，

B1a）一种不含内含子的序列，其源自根据A1a）的序列，且其与根据Seq ID Nr. 2、Seq ID Nr. 52或Seq ID Nr. 54，尤其是根据Seq ID Nr. 2的序列编码同样的蛋白质或肽，

C1a）一种序列，其编码蛋白质或肽，所述蛋白质或肽包含根据Seq ID Nr. 7、Seq ID Nr. 53或Seq ID Nr. 55，尤其是Seq ID Nr. 7的氨基酸序列，且优选能够将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸，

D1a）一种序列，其与根据组A1a）至C1a）中的任一组的、特别优选根据组A1a）的序列具有至少80%、特别优选至少90%、更优选至少95%和最优选至少99%相同，其中该序列优选编码能够将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质或肽，

E1a）一种序列，其与根据组A1a）至D1a）中的任一组的、特别优选根据组A1a）的序列的反链杂交，或在考虑遗传密码的简并性的情况下与所述反链杂交，其中所述序列优选编码能够将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质或肽，

F1a）根据组A1a）至E1a）中的任一组的、特别优选根据组A1a）的序列的衍生物，所述衍生物通过置换、加成、反转和/或删除至少1个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基、但是优选不多于100个碱基、特别优选不多于50个碱基和最优选不多于25个碱基而得到，其中该衍生物优选编码能够将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质或肽，和

G1a）与根据组A1a）至F1a）中的任一组的、特别优选根据组A1a）的序列互补的序列。

一种分离的DNA为达成该目的作出了进一步的贡献，所述DNA选自下述序列：A1b）根据Seq ID Nr. 56、Seq ID Nr. 58或Seq ID Nr. 60的序列，其中该序列编码能够将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质，

B1b）一种不含内含子的序列，其源自根据A1b）的序列，且其与根据Seq ID Nr. 56、Seq ID Nr. 58或Seq ID Nr. 60的序列编码同样的蛋白质或肽，

C1b）一种序列，其编码蛋白质或肽，所述蛋白质或肽包含根据Seq ID Nr. 57、Seq ID Nr. 59或Seq ID Nr. 61的氨基酸序列，且所述蛋白质或肽优选能够将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸，

D1b）一种序列，其与根据组A1b）至C1b）中的任一组的、特别优选根据组A1b）的序列至少80%、特别优选至少86%、更优选至少95%和最优选至少99% 相同，其中该序列优选编码能够将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质或肽，

E1b）一种序列，其与根据组A1b）至D1b）中的任一组的、特别优选根据组A1b）的序列的反链杂交，或在考虑遗传密码的简并性的情况下与所述反链杂交，其中该序列优选编码能够将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质或肽，

F1b）根据组A1b）至E1b）中的任一组的、特别优选根据组A1b）的序列的衍生物，所述衍生物通过置换、加成、反转和/或删除至少1个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基、但是优选不多于100个碱基、特别优选不多于50个碱基和最优选不多于25个碱基而得到，其中该衍生物优选编码能够将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质或肽，和

G1b）与根据组A1b）至F1b）中的任一组的、特别优选根据组A1b）的序列互补的序列。

一种分离的DNA为达成该目的作出了进一步的贡献，所述DNA选自下述序列：A1c）根据Seq ID Nr. 62的序列，其中该序列编码能够将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质，

B1c）一种不含内含子的序列，其源自根据A1c）的序列，且其与根据Seq ID Nr. 62的序列编码同样的蛋白质或肽，

C1c）一种序列，其编码蛋白质或肽，所述蛋白质或肽包含根据Seq ID Nr. 63的氨基酸序列，且所述蛋白质或肽优选能够将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸，

D1c）一种序列，其与根据组A1c）至C1c）中的任一组的、特别优选根据组A1c）的序列至少60%、特别优选至少85%、更优选至少90%和最优选至少99% 相同，其中该序列优选编码能够将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质或肽，

E1c）一种序列，其与根据组A1c）至D1c）中的任一组的、特别优选根据组A1c）的序列的反链杂交，或在考虑遗传密码的简并性的情况下与所述反链杂交，其中该序列优选编码能够将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质或肽，

F1c）根据组A1c）至E1c）中的任一组的、特别优选根据组A1c）的序列的衍生物，所述衍生物通过置换、加成、反转和/或删除至少1个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基、但是优选不多于100个碱基、特别优选不多于50个碱基和最优选不多于25个碱基而得到，其中该衍生物优选编码能够将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质或肽，和

G1c）与根据组A1c）至F1c）中的任一组的、特别优选根据组A1c）的序列互补的序列。

本发明的另一个主题是，一种分离的DNA，所述DNA选自下述序列：

A2）根据Seq ID Nr. 3的序列，其中该序列编码能够将UDP-葡萄糖和17-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质，

B2）一种不含内含子的序列，其源自根据A2）的序列，且其与根据Seq ID Nr. 3的序列编码同样的蛋白质或肽，

C2）一种序列，其编码蛋白质或肽，所述蛋白质或肽包含根据Seq ID Nr. 8的氨基酸序列，且其优选能够将UDP-葡萄糖和17-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸，

D2）一种序列，其与根据组A2）至C2）中的任一组、特别优选根据组A2）的序列至少80%、特别优选至少90%、更优选至少95%和最优选至少99%相同，其中该序列优选编码能够将UDP-葡萄糖和17-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质或肽，

E2）一种序列，其与根据组A2）至D2）中的任一组、特别优选根据组A2）的序列的反链杂交，或在考虑遗传密码的简并性的情况下与所述反链杂交，其中该序列优选编码能够将UDP-葡萄糖和17-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质或肽，

F2）根据组A2）至E2）中的任一组的、特别优选根据组A2）的序列的衍生物，所述衍生物通过置换、加成、反转和/或删除至少1个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基、但是优选不多于100个碱基、特别优选不多于50个碱基和最优选不多于25个碱基而得到，其中该衍生物优选编码能够将UDP-葡萄糖和17-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质或肽，和

G2）与根据组A2）至F2）中的任一组的、特别优选根据组A2）的序列互补的序列。

A3）根据Seq ID Nr. 4的序列，其中该序列编码

能够将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯单乙酸酯，

或能够将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯单乙酸酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯二乙酸酯，

或能够将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯二乙酸酯的蛋白质，其中第一个选项是优选的，

B3）一种不含内含子的序列，其源自根据A3）的序列，且其与根据Seq ID Nr. 4的序列编码同样的蛋白质或肽，

C3）一种序列，其编码蛋白质或肽，所述蛋白质或肽包含根据Seq ID Nr. 9的氨基酸序列，且其优选

或能够将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯二乙酸酯的蛋白质或肽，其中第一个选项是优选的，

D3）一种序列，其与根据组A3）至C3）中的任一组、特别优选根据组A3）的序列至少80%、特别优选至少90%、更优选至少95%和最优选至少99%相同，其中该序列优选编码

E3）一种序列，其与根据组A3）至D3）中的任一组、特别优选根据组A3）的序列的反链杂交，或在考虑遗传密码的简并性的情况下与所述反链杂交，其中该序列优选编码

F3）根据组A3）至E3）中的任一组的、特别优选根据组A3）的序列的衍生物，所述衍生物通过置换、加成、反转和/或删除至少1个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基、但是优选不多于100个碱基、特别优选不多于50个碱基和最优选不多于25个碱基而得到，其中该衍生物优选编码

或能够将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯二乙酸酯的蛋白质或肽，其中第一个选项是优选的，和

G3）与根据组A3）至F3）中的任一组的、特别优选根据组A3）的序列互补的序列。

A4）根据Seq ID Nr. 5的序列，其中该序列编码能够将槐糖脂从细胞转移到周围的培养基中的蛋白质，

B4）一种不含内含子的序列，其源自根据A4）的序列，且其与根据Seq ID Nr. 5的序列编码同样的蛋白质或肽，

C4）一种序列，其编码蛋白质或肽，所述蛋白质或肽包含根据Seq ID Nr. 10的氨基酸序列，且其优选能够将槐糖脂从细胞转移到周围的培养基中，

D4）一种序列，其与根据组A4）至C4）中的任一组的、特别优选根据组A4）的序列至少80%、特别优选至少90%、更优选至少95%和最优选至少99%相同，其中该序列优选编码能够将槐糖脂从细胞转移到周围的培养基中的蛋白质或肽，

E4）一种序列，其与根据组A4）至D4）中的任一组的、特别优选根据组A4）的序列的反链杂交，或在考虑遗传密码的简并性的情况下与所述反链杂交，其中该序列优选编码能够将槐糖脂从细胞转移到周围的培养基中的蛋白质或肽，

F4）根据组A4）至E4）中的任一组的、特别优选根据组A4）的序列的衍生物，其已经通过置换、加成、反转和/或删除至少1个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基、但是优选不多于100个碱基、特别优选不多于50个碱基和最优选不多于25个碱基而得到，其中该衍生物优选编码能够将槐糖脂从细胞转移到周围的培养基中的蛋白质或肽，和

G4）与根据组A4）至F4）中的任一组的、特别优选根据组A4）的序列互补的序列。

A5）根据Seq ID Nr. 6的序列，其中该序列编码能够将UDP-葡萄糖和17-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸，或将17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸和UDP-葡萄糖转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质，其中后一种选项是优选的，

B5）一种不含内含子的序列，其源自根据A5）的序列，且其与根据Seq ID Nr. 6的序列编码相同的蛋白质或肽，

C5）一种序列，其编码蛋白质或肽，所述蛋白质或肽包含根据Seq ID Nr. 11的氨基酸序列，且其优选能够将UDP-葡萄糖和17-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸，或将17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸和UDP-葡萄糖转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸，其中后一种选项是优选的，

D5）一种序列，其与根据组A5）至C5）中的任一组的、特别优选根据组A5）的序列至少80%、特别优选至少90%、更优选至少95%和最优选至少99%相同，其中该序列优选编码能够将UDP-葡萄糖和17-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸，或将17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸和UDP-葡萄糖转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质或肽，其中后一种选项是优选的，

E5）一种序列，其与根据组A5）至D5）中的任一组的、特别优选根据组A5）的序列的反链杂交，或在考虑遗传密码的简并性的情况下与所述反链杂交，其中该序列优选编码能够将UDP-葡萄糖和17-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸，或将17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸和UDP-葡萄糖转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质或肽，其中后一种选项是优选的，

F5）根据组A5）至E5）中的任一组的、特别优选根据组A5）的序列的衍生物，其已经通过置换、加成、反转和/或删除至少1个碱基、优选至少2个碱基、更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基、但是优选不多于100个碱基、特别优选不多于50个碱基和最优选不多于25个碱基而得到，其中该衍生物优选编码能够将UDP-葡萄糖和17-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸，或将17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸和UDP-葡萄糖转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质或肽，其中后一种选项是优选的，和

G5）与根据组A5）至F5）中的任一组的、特别优选根据组A5）的序列互补的序列。

在这里，借助于已知的方法来测定“核苷酸一致性”或“氨基酸一致性”。一般而言，考虑到具体要求，使用具有算法的特殊的计算机程序。

优选的测定一致性的方法首先在要对比的序列之间产生最大匹配。用于测定一致性的计算机程序包括、但不限于于此：GCG软件包，包括GAP（Deveroy, J. 等人, Nucleic Acid Research 12（1984）, 第387页, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine（Wi），和BLASTP、BLASTN和FASTA（Altschul, S. 等人, Journal of Molecular Biology 215（1990）, 第403-410页）。BLAST程序可以从国家生物技术信息中心（NCBI）和其它来源（BLAST Handbuch, Altschul S. 等人, NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; Altschul S. 等人, 出处同上）得到。

同样地，已知的Smith-Waterman算法可以用于测定核苷酸一致性。

在使用BLASTN程序（Altschul, S. 等人, Journal of Molecular Biology 215（1990）, 第403-410页）时，用于测定“核苷酸一致性”的优选参数是：

期望阈值: 10

字长: 28

匹配评分: 1

错配评分: -2

空位权重（Gap Costs）: 线性的

上述参数是用于核苷酸序列比对的默认参数。

GAP程序同样适合使用上述参数。

在使用BLASTP程序（Altschul, S. 等人, Journal of Molecular Biology 215（1990）, 第403-410页）时，用于测定“氨基酸一致性”的优选参数是：

期望阈值: 10

字长: 3

矩阵: BLOSUM62

空位权重: 存在: 11；延伸: 1

组合调整（Compositional adjustments）: 有条件的组合评分矩阵调整

上述参数是用于对比氨基酸序列的默认参数。

GAP程序同样适合使用上述参数。

根据上述算法，80%的一致性意味着与本发明80%的一致性。同样适用于更高的一致性。

所述特征“与某一序列的反链杂交或在考虑遗传密码的简并性的情况下与所述反链杂交的序列”指，在优选严格的条件下，与参照序列的反链杂交或在考虑遗传密码的简并性的条件下与所述反链杂交的序列。例如，所述杂交可以在2 x SSC中在68℃进行，或根据Boehringer公司（Mannheim）的地高辛标记试剂盒的方案进行。优选的杂交条件是，例如，在7% SDS、1% BSA、1 mM EDTA、250 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.2）中在65℃温育过夜，随后用2 x SSC、0.1% SDS在65℃洗涤。

根据本发明的分离的DNA的衍生物，尤其包括这样的序列：所述序列在它们编码的蛋白质中，产生保守的氨基酸置换，例如，用甘氨酸置换丙氨酸，或用天冬氨酸置换谷氨酸，所述衍生物可以根据替代的F1a）、F1b）、F1b）、F1c）、F2）、F3）、F4）或F5），通过将根据组A1a）至E1a）、A1b）至E1b）、A1c）至E1c）、A2）至E2）、A3）至E3）、A4）至E4）和A5）至E5）中的任一组的一个序列置换、添加、反转和/或删除一个或多个碱基来得到。这样的功能中性的突变称作有义突变（sense mutation），且不会导致多肽活性的根本性变化。此外已知，多肽的N-和/或C-端末端的变化对它的功能没有显著损害，或者甚至能够使它稳定化，因此相应地，本发明也包括这样的DNA序列：其中在具有根据本发明的核酸的序列的3’-末端处或5’-末端处添加碱基。为此，本领域技术人员尤其可以在下述文献中找到说明：Ben-Bassat等人（Journal of Bacteriology 169:751-757（1987）），O'Regan等人（Gene 77:237-251（1989）），Sahin-Toth等人（Protein Sciences 3:240-247（1994）），Hochuli等人（Bio/Technology 6:1321-1325（1988）），以及已知的遗传学和分子生物学的教科书。

此外，载体，优选表达载体、基因删除盒、基因插入盒或基因过表达盒，为达成开始所述的目的作出了贡献，所述载体包括这样的DNA，所述DNA具有根据上文定义的组A1a）至G1a）、A1b）至G1b）、A1c）至G1c）、A2）至G2）、A3）至G3）、A4）至G4）和A5）至G5）中的任一组的序列。作为载体，本领域技术人员已知的所有通常用于将DNA导入宿主细胞中的载体均是合适的。这些载体不仅能够自主复制（因为它们具有复制起点，例如2µ质粒或ARS（自主复制序列）的复制起点），而且也能够整合进染色体中（非复制质粒）。载体也被理解为绝对没有复制起点的线性DNA片段，例如，基因删除盒、基因插入盒或基因过表达盒。基因删除盒通常由选择标志物和与要删除的区域侧接的DNA片段组成。基因插入盒通常由标志物和要灭活的基因的片段组成，基因过表达盒通常由标志物、要过表达的基因和与所述基因的表达有关的调节区（例如，启动子和终止子）组成。优选的载体选自质粒和盒，例如，大肠杆菌-酵母穿梭质粒；特别优选的是表达载体、基因删除盒、基因插入盒或基因过表达盒，尤其是在下文中所述的具有Seq ID Nr. 12、Seq ID Nr. 13、Seq ID Nr. 14、Seq ID Nr. 15和Seq ID Nr. 16的基因删除盒和具有Seq ID Nr. 70、Seq ID Nr. 71、Seq ID Nr. 72、Seq ID Nr. 73和Seq ID Nr. 74的表达盒。按照根据本发明的载体的一个优选实施方式，具有根据组A1）至F5）中的任一组的序列的DNA处在组成型启动子或可调节启动子的控制下，所述启动子适用于在微生物细胞中表达由这些DNA序列编码的多肽，所述微生物细胞优选是细菌细胞、酵母菌细胞或真菌细胞，特别优选酵母菌细胞、最优选假丝酵母菌 -、Candida bogoriensis- 、 Candida batistae-、Candida apicola-或拟威克酵母细胞。这样的组成型启动子的实例是，例如，TSC3启动子、ENO1启动子、FBA1启动子、GPD启动子、GPM启动子、FBA1启动子、ICL1启动子或ACT1启动子。这样的可调节启动子的实例是，例如，GAL1启动子、GAL2启动子、GAL7启动子、MEL1启动子、GAL10启动子、SBG1启动子、SBG2启动子、SBG3启动子、SBG4启动子、SBG5启动子或MAL2启动子。

除了启动子以外，根据本发明的载体应当优选包含核糖体结合位点和终止子。在这种情况下，特别优选的是，根据本发明的DNA嵌入包含启动子、核糖体结合位点和终止子的载体的表达盒中。除了上述结构元件以外，所述载体可以进一步包含本领域技术人员已知的选择标记基因。

在实施例中描述的核酸Seq ID Nr. 12、Seq ID Nr. 13、Seq ID Nr. 14、Seq ID Nr. 15、Seq ID Nr. 16、IntEx-CbSBG1（Seq ID Nr. 70）、IntEx-CbSBG2（Seq ID Nr. 71）、IntEx-CbSBG3（Seq ID Nr. 72）、IntEx-CbSBG4（Seq ID Nr. 73）和IntEx-CbSBG5（Seq ID Nr. 74），是根据本发明优选的载体。

新的酶E₁至E₅对达成所述目的作出了进一步的贡献。

因而，本发明的另一个主题是，一种分离的多肽，其选自：

酶E₁，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 7、Seq ID Nr. 53、Seq ID Nr. 55、Seq ID Nr. 57、Seq ID Nr. 59、Seq ID Nr. 61或Seq ID Nr. 63、特别是Seq ID Nr. 7，或具有这样的多肽序列：其中相对于各参照序列Seq ID Nr. 7、Seq ID Nr. 53、Seq ID Nr. 55、Seq ID Nr. 57、Seq ID Nr. 59、Seq ID Nr. 61或Seq ID Nr. 63、特别是Seq ID Nr. 7，最多25%、优选最多20%、特别优选最多15%、尤其是最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有各个参照序列的酶的至少50%、优选65%、特别优选80%、尤其是多于90%的酶的活性，其中酶E₁的酶的活性理解为，将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸的能力，

酶E₂，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 8或Seq ID Nr. 11，或具有这样的多肽序列：其中相对于Seq ID Nr. 8或Seq ID Nr. 11，最多60%、优选最多25%、特别优选最多15%、尤其是最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有各个参照序列Nr. 8或11的酶的至少50%、优选65%、特别优选80%、尤其是多于90%的酶的活性，其中酶E₂的酶的活性理解为，将UDP-葡萄糖和17-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸的能力，

酶E₃，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 11，或具有这样的多肽序列：其中相对于Seq ID Nr. 11，最多60%、优选最多25%、特别优选最多15%、尤其是最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有参照序列Seq ID Nr. 11的酶的至少50%、优选65%、特别优选80%、尤其是超过90%的酶的活性，其中酶E₃的酶的活性理解为，将17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸和UDP-葡萄糖转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸的能力，

酶E₄，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 9，或具有这样的多肽序列：其中相对于Seq ID Nr. 9，最多25%、特别优选最多15%、尤其是最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有Seq ID Nr. 9的酶的少50%、优选65%、特别优选80%、尤其是超过90%的酶的活性，其中酶E₄的酶的活性理解为，

将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸1',4''-内酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸1',4''-内酯单乙酸酯，

或将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸1',4''-内酯单乙酸酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸1',4''-内酯二乙酸酯，

或将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸1',4''-内酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸1',4''-内酯二乙酸酯的能力，其中第一个选项是优选的，

和

酶E₅，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 10，或具有这样的多肽序列：其中相对于Seq ID Nr. 10，最多45%、优选最多25%、特别优选最多15%、尤其是最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有Seq ID Nr. 10的酶的至少50%、优选65%、特别优选80%、尤其是超过90%的酶的活性，其中酶E₅的酶的活性理解为，将槐糖脂从细胞转移到周围的培养基中的能力。

在下文给出的实施例中，示例性地描述了本发明，而不应将由整个说明书和权利要求中得到的本发明的应用范围限制在实施例中提及的实施方式中。

下述附图是实施例的组成部分：

图1: 17-L-[(6'-O-乙酰基-2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6''-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八烯4''-O-内酯的精确的质量迹线

图2: 17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八烯4''-O-内酯的精确质量迹线。

实施例：

实施例1: 假丝酵母菌ATCC 22214的尿嘧啶-营养缺陷型突变体的生成

如上文所述（van Bogaert等人Yeast. 2007. 24(3):201-8），生成假 丝酵母菌ATCC 22214的尿嘧啶-营养缺陷型突变体。该菌株被命名为C. bombicola ATCC 22214 ura^- 。

实施例2: 在假丝酵母菌ATCC 22214中参与槐糖脂生物合成的酶的结构基因的灭活

为了能够鉴别参与槐糖脂生物合成的酶，首先借助于GLS Flex钛技术，对假丝酵母菌ATCC 22214的基因组进行测序。在检查假丝酵母菌ATCC 22214的遗传信息时，鉴别出一簇5个基因（Seq ID Nr. 01），它们的编码区（Seq ID Nr. 02、Seq ID Nr. 03、Seq ID Nr. 04、Seq ID Nr. 05、Seq ID Nr. 06）编码基因产物（Seq ID Nr. 07、Seq ID Nr. 08、Seq ID Nr. 09、Seq ID Nr. 10、Seq ID Nr. 11）。

所述5个基因被命名为SBG1（Seq ID Nr. 02）、SBG2（Seq ID Nr. 03）、SBG3（Seq ID Nr. 04）、SBG4（Seq ID Nr. 05）和SBG5（Seq ID Nr. 06）（SBG代表槐糖脂生物合成基因）。

它们编码下述蛋白质：Sbg1p（Seq ID Nr. 07）、Sbg2p（Seq ID Nr. 08）、Sbg3p（Seq ID Nr. 09）、Sbg4p（Seq ID Nr. 10）和Sbg5p（Seq ID Nr. 11）。

表1：Sbg1p、Sbg2p、Sbg3p、Sbg4p和Sbg5p和它们在槐糖脂的生物合成和输出中的功能。

Seq ID Nr.	蛋白质	PFAM 域	NCBI 保守域	功能
					07	Sbg1p	P450 (PFAM PF00067)	cytochrome P450	脂肪酸[ω,ω-1, ω-2, ω-3]-羟基化的单加氧酶
08	Sbg2p	UDP 糖基转移酶 (PFAM PF00201)	糖基转移酶	UDP-葡萄糖: [ω,ω-1, ω-2, ω-3]-羟基脂肪酸葡萄糖转移酶
					09	Sbg3p	无	麦芽糖 O-乙酰基转移酶 (PRK10092)	乙酰辅酶A: 槐糖脂乙酰基转移酶
10	Sbg4p	ABC 运载体 (PFAM 00667)	ABC transporter	槐糖脂输出蛋白
					11	Sbg5p	UDP 糖基转移酶 (PFAM PF00201)	糖基转移酶	UDP-葡萄糖: [ω,ω-1, ω-2, ω-3]-羟基脂肪酸葡萄糖转移酶；UDP-葡萄糖: [ω,ω-1, ω-2, ω-3]-(β-D-吡喃葡萄糖基)氧基脂肪酸葡萄糖基转移酶

将基因SBG1、SBG2、SBG3、SBG4和SBG5逐个灭活，并且表征与槐糖脂生物合成相关的相应突变体的表型。为了在C. bombicola ATCC 22214中构建相应的突变体，首先通过GeneArt AG（Regensburg）合成删除盒。这些删除盒（Seq ID Nr. 12、Seq ID Nr. 13、Seq ID Nr. 14、Seq ID Nr. 15、Seq ID Nr. 16）由前述的基因CbURA3（van Bogaert等人Yeast. 2007. 24(3):201-8）构成，所述基因编码C. bombicola ATCC 22214的乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶，且其在上游和下游分别侧接大约1000碱基对的要灭活的基因的侧接区。分别将loxP-基因座（其任选地通过暂时导入重组酶Cre编码基因及其功能性表达允许删除CbURA3基因）（关于综述，参见Kühn & Torres. Methods Mol Biol. 2002. 180:175-204）嵌入在侧接区和CbURA3基因之间。这里，构建对应于表2中所示数据的各个删除盒：

表2: 编码Sbg1p、Sbg2p、Sbg3p、Sbg4p和Sbg5p的C. bombicola ATCC 22214的结构基因的删除盒的结构。

Seq ID Nr.	基因	5’-侧接区	loxP-基因座1	CbURA3	loxP-基因座2	3’-侧接区
							12	SBG1	1 - 1003	1004 - 1037	1038 - 3106	3107 - 3140	3141 - 4143
13	SBG2	1 - 0999	1000 - 1033	1034 - 3102	3103 - 3136	3137 - 4143
							14	SBG3	1 - 1002	1003 - 1036	1037 - 3105	3106 - 3139	3140 - 4140
15	SBG4	1 - 0997	0998 - 1031	1032 -3100	3101 - 3134	3135 - 4130
							16	SBG5	1 - 1002	1003 - 1036	1037 - 3105	3106 - 3139	3140 - 4141

为了以足够的量提供删除盒用于随后的C. bombicola ATCC 22214 ura^- 的转化，通过PCR扩增所述删除盒。这里使用下述的寡核苷酸：

用于灭活CbSBG1的删除盒的扩增：

SBG1-fw: 5'- AAT TGT TCG ATG GAT AGC TTT GGA GTC -3'

（Seq ID Nr. 17）

SBG1-rv: 5'- TTC GGG GCT CCT GTC GTT GTC -3'

（Seq ID Nr. 18）

用于灭活CbSBG2的删除盒的扩增：

SBG2-fw: 5'- GAA ATC TGA TCA ATT CTG CAA ACC TG -3'

（Seq ID Nr. 19）

SBG2-rv: 5'- ATG ACT CCT AGA AAA GAA ATT GAC CAG -3'

（Seq ID Nr. 20）

用于灭活CbSBG3的删除盒的扩增：

SBG3-fw: 5'- TGC AGA CAA GTT CCT GCA GCT G -3'

（Seq ID Nr. 21）

SBG3-rv: 5'- ATG CTT TAT TCA GGC ACG CTA CG -3'

（Seq ID Nr. 22）

用于灭活CbSBG4的删除盒的扩增：

SBG4-fw: 5'- GGA TGA GTC GCA GTC ACG AAC -3'

（Seq ID Nr. 23）

SBG4-rv: 5'- TCA ATC ATT GGC TCA AGA CTA GGA AC -3'

（Seq ID Nr. 24）

用于灭活CbSBG5的删除盒的扩增：

SBG5-fw: 5'- ATT CTG GTG CTG ACC TCG CCA C -3'

（Seq ID Nr. 25）

SBG5-rv: 5'- ACT CAT GTC GTA CTT GCA AGA ACT G -3'

（Seq ID Nr. 26）。

将下述参数用于PCR：1 x：预变性，98℃，3 min；25 x：变性，98℃，0:10 min，退火，60℃，0:30 min；延伸，72℃，2:00 min；1 x：最后一次延伸，72℃，10 min。按照生产商的推荐，使用New England Biolabs（Frankfurt）的Phusion^TMHigh-Fidelity Master Mix进行扩增。按照生产商的说明书，使用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen, Hilden）纯化PCR产物。PCR的操作、借助于琼脂糖凝胶电泳的成功的PCR扩增的验证、DNA的溴化乙锭染色、测定PCR片段大小、纯化PCR产物和测定DNA浓度，都以技术人员已知的方式进行。

如以前所述进行C. bombicola ATCC 22214 ura ^- 的转化（van Bogaert等人Yeast. 2008. 25:273-278; van Bogaert等人FEMS Yeast Res. 2009. 9:610-617）。

为了验证在用CbSBG1（Seq ID Nr. 12）、CbSBG2（Seq ID Nr. 13）、CbSBG3（Seq ID Nr. 14）、CbSBG4（Seq ID Nr. 15）和CbSBG5（Seq ID Nr. 16）的删除盒转化以后基因SBG1、SBG2、SBG3、SBG4和SBG5在C. bombicola ATCC 22214 ura ^— 转化体中的删除，借助于菌落PCR，分别扩增5个转化体和C. bombicola ATCC 22214 ura^- 的各个基因座。这里使用下述寡核苷酸：

CbSBG1的基因组删除的验证：

SBG1-KO-fw: 5'- GTG TCG ACT CGC CAA ATT CCA TCG GAG -3'

（Seq ID Nr. 27）

SBG1-KO-rv: 5'- GGT TCA TAG CGA GTT TCT TTG CAT GTG C -3'（Seq ID Nr. 28）

CbSBG2的基因组删除的验证：

SBG2-KO-fw: 5'- CTC CTT TAT TAA CTC CGC AGC ATG ACT G -3'（Seq ID Nr. 29）

SBG2-KO-rv: 5'- CTC CTC GAA GGA CCC TCA AAA CAA AGG -3'

（Seq ID Nr. 30）

CbSBG3的基因组删除的验证：

SBG3-KO-fw: 5'- CAA ATT TAT CTG GGA GCA CAG TTA CAT TGC -3'（Seq ID Nr. 31）

SBG3-KO-rv: 5'- CAC ACA TTG CTT TAG TCC AGC AAG AAC C -3'（Seq ID Nr. 32）

CbSBG4的基因组删除的验证：

SBG4-KO-fw: 5'- ATT CTC CTC GCA CGT TTC TCG GGG C -3'

（Seq ID Nr. 33）

SBG4-KO-rv: 5'- GGT TGA AAT ACT TGT TGC CGC ACT AAA G -3'（Seq ID Nr. 34）

CbSBG5的基因组删除的验证：

SBG5-KO-fw: 5'- CGC TTC CTG AAT TGA GTT GGT ATC GTT AAT G -3'（Seq ID Nr. 35）

SBG5-KO-rv: 5'- GAC ATT GTT GGA ATT GGC TGC TTA GTG G -3'（Seq ID Nr. 36）。

将下述参数用于PCR：1 x：预变性，94℃，3 min；25 x：变性，94℃，1:00 min，退火，60℃，1:00 min；延伸，72℃，5:00 min；1 x：最后一次延伸，72℃，10 min。按照生产商的推荐，使用Qiagen（Hilden）的Taq PCR Master Mix试剂盒进行扩增。随后在0.8% 的琼脂糖凝胶上各分离10µl PCR反应物。PCR操作、琼脂糖凝胶电泳操作、DNA的溴化乙锭染色和测定PCR片段大小，都以技术人员已知的方式进行。

在扩增对应的基因座时应产生在表3中给出的PCR片段大小：

表3：在成功删除后和在野生型情形中，在染色体SBG1-、SBG2-、SBG3-、SBG4-和SBG5基因座扩增时预期的PCR片段大小。

基因	在染色体删除后PCR产物的大小	在野生型情形中PCR产物的大小
			SBG1	4201 bp	3678 bp
SBG2	4199 bp	3451 bp
			SBG3	4199 bp	2839 bp
SBG4	4190 bp	5950 bp
			SBG5	4201 bp	3360 bp

在扩增C. bombicola ATCC 22214 ura^- 的CbSBG1-、CbSBG2-、CbSBG3-、CbSBG4-和CbSBG5基因座的情况中，仅得到在野生型情形存在时预期的片段大小，即分别是3.7 kbp、3.5 kbp、2.8 kbp、5.9 kbp和3.4 kbp。

在转化CbSBG1的删除盒以后扩增转化体的SBG1基因座的情况中，仅得到在成功的CbSBG1染色体删除以后预期的片段大小，即大约4.2 kbp。

在转化CbSBG2的删除盒以后扩增转化体的SBG2基因座的情况中，仅得到在成功的CbSBG2染色体删除以后预期的片段大小，即大约4.2 kbp。

在转化CbSBG3的删除盒以后扩增转化体的SBG3基因座的情况中，仅得到在成功的CbSBG3染色体删除以后预期的片段大小，即大约4.2 kbp。

在转化CbSBG4的删除盒以后扩增转化体的SBG4基因座的情况中，仅得到在成功的CbSBG4染色体删除以后预期的片段大小，即大约4.2 kbp。

在转化CbSBG5的删除盒以后扩增转化体的SBG5基因座的情况中，仅得到在成功的CbSBG5染色体删除以后预期的片段大小，即大约4.2 kbp。

因而，在所有5种情况下，能够鉴定出这样的克隆：其中基因CbSBG1、CbSBG2、CbSBG3、CbSBG4或CbSBG5已经发生染色体删除。相应的菌株在下文中被称作C. bombicola ATCC 22214 sbg1、C. bombicola ATCC 22214 sbg2、C. bombicola ATCC 22214 sbg3、C. bombicola ATCC 22214 sbg4和C. bombicola ATCC 22214 sbg5。

实施例3：通过C. bombicola ATCC 22214、C. bombicola ATCC 22214 sbg1、C. bombicola ATCC 22214 sbg2、C. bombicola ATCC 22214 sbg3、C. bombicola ATCC 22214 sbg4和C. bombicola ATCC 22214 sbg5表征槐糖脂的形成。

在YPD琼脂平板上进行菌株C. bombicola ATCC 22214、C. bombicola ATCC 22214 sbg1、C. bombicola ATCC 22214 sbg2、C. bombicola ATCC 22214 sbg3、C. bombicola ATCC 22214 sbg4和C. bombicola ATCC 22214 sbg5的增殖。使用在下文中称作SL生产培养基的培养基用于槐糖脂的生产。所述培养基由0.1% KH₂PO₄、0.5% MgSO₄•7 H₂O、0.01% FeCl₃、0.01% NaCl、0.01% 尿嘧啶、0.4% 酵母浸出物、0.1% 尿素、10.5%菜籽油和10% 葡萄糖构成。将pH调至4.5，然后在高压灭菌釜（121℃, 20 min）中将培养基灭菌。在培养过程中，不需要调节pH。

为了在摇瓶中研究槐糖脂生产，首先制备预培养物。为此，使用一环新鲜涂在YPD琼脂平板上的菌株并给在100 ml锥形瓶中的10 ml YPD培养基接种。在30℃和200 rpm培养过夜。该预培养物在下文中用于接种在1000 ml锥形瓶中的100 ml SL培养基（起始OD₆₀₀ 0.2）。将所述培养物在200 rpm和30℃培养7天，每天取出2 ml培养液样品，其中应当注意，在取样之前彻底混合培养基。

如下制备用于随后的色谱分析的样品：使用正位移移液器（Combitip），将800µl丙酮预先放入2ml反应器中，并立即密封反应器，以使蒸发最小化。随后加入200µl培养液。在涡旋培养液/丙酮混合物以后，以13000 rpm离心所述混合物1 min，并将800µl上清液转移进HPLC容器中。

使用蒸发光散射检测器（ELSD）进行槐糖脂和/或油酸的检测和定量测定。借助于Agilent Technologies 1200系列（Santa Clara, 加利福尼亚）和Zorbax SB-C8快速拆分柱（4.6 x 150 mm, 3.5µm, Agilent），进行实际测量。注射体积是5µl，该方法的运行时间是20 min。作为流动相使用H₂O和0.1% 的TFA（三氟醋酸, 溶液A）和甲醇（溶液B）。柱温是40℃。作为检测器使用ELSD（检测器温度60℃）和DAD（二极管阵列, 210 nm）。在该方法中使用的梯度如表4中所示。

表4：要用于基于HPLC的槐糖脂定量测定的流动相的梯度形式描述。

t [min]	溶液B%	流速[ml/min]
			0.00	70%	1.00
15.00	100%	1.00
			15.01	70%	1.00
20.00	70%	1.00

尽管C. bombicola ATCC 22214生产了槐糖脂，但在菌株C. bombicola ATCC 22214 sbg1、C. bombicola ATCC 22214 sbg2和C. bombicola ATCC 22214 sbg4中没有可检测的槐糖脂形成。这清楚地证实，这些基因参与槐糖脂形成，并且在这种情况中它们满足上述的功能。菌株C. bombicola ATCC 22214 sbg3和C. bombicola ATCC 22214 sbg5能够形成槐糖脂，但它们在HPLC分析中显示出改变的保留时间。

通过LC-MS²可以证实，与由C. bombicola ATCC 22214形成的槐糖脂相反，由C. bombicola ATCC 22214 sbg3形成的槐糖脂仅对应着通式（Ia）和（Ib）的化合物，其中R¹ = H和R² = H。

这证实了Sbg3p在槐糖脂生物合成中作为乙酰基转移酶（E₄）的功能。

同样地，通过LC-MS可以证实，与由C. bombicola ATCC 22214形成的槐糖脂相反，由C. bombicola ATCC 22214 sbg5形成的槐糖脂仅对应着通式（Ia）的化合物，其中n = 0。

这证实了Sbg5p在槐糖脂生物合成中作为糖基转移酶II（E₃）的功能。

实施例4: 过度生产参与槐糖脂生物合成的酶的假丝酵母菌ATCC 22214菌株的构建

为了使过度生产参与槐糖脂生物合成的酶的假丝酵母菌ATCC 22214菌株的构建成为可能，首先通过GeneArt AG合成整合/过表达盒（Seq ID Nr. 75）。

该整合/过表达盒包含了在表5中说明的组分：

表5: 用于研发假 丝酵母菌ATCC 22214的整合/过表达盒中存在的模块和重要的限制性切割位点的概揽。

位置（bp）	组分
		1 - 8	NotI识别位点
9 - 507	C. bombicola ATCC 22214 LEU2基因的上游DNA区段
		508 - 513	PciI识别位点
514 - 1217	C. bombicola ATCC 22214 URA3基因的启动子区
		1217 - 2005	C. bombicola ATCC 22214 URA3基因的编码区
2006 - 2586	C. bombicola ATCC 22214 URA3基因的终止子区
		2587 - 2592	PciI识别位点
2593 - 2600	AsiSI识别位点
		2601 - 3012	C. bombicola ATCC 22214 TSC3基因的启动子区
3011 - 3016	NdeI识别位点
		3025 - 3032	FseI识别位点
3033 - 3210	C. bombicola ATCC 22214 TSC3基因的终止子区
		3211 - 3218	AsiSI识别位点
3219 - 3224	MluI识别位点
		3225 - 3724	C. bombicola ATCC 22214 LEU2基因的下游DNA区段
3725 - 3732	SbfI识别位点

该整合/过表达盒使得通过NdeI和FseI将从起始密码子至终止密码子的任意结构基因插入在C. bombicola ATCC 22214 TSC3基因的启动子区和终止子区之间成为可能，所述TSC3基因编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶（van Bogaert等人; 2008）。甘油醛-3-磷酸脱氢酶是在许多酵母中大量出现的蛋白质，所以可以认为，以此方式可以实现插入的基因的强表达。选择C. bombicola ATCC 22214 URA3基因作为选择标志物，这样该整合/过表达盒可以仅用于转化C. bombicola ATCC 22214的尿嘧啶-营养缺陷型菌株。已经描述了它的生产和C. bombicola ATCC 22214 URA3基因（van Bogaert等人, 2007; van Bogaert等人, 2008）。5’-和3’-端DNA区段允许所述盒插入在C. bombicola ATCC 22214 LEU2基因座（Seq ID Nr. 37）处，其中LEU2基因被灭活。LEU2在C. bombicola ATCC 22214中仅编码异丙基苹果酸脱氢酶。由于异丙基苹果酸脱氢酶是亮氨酸生物合成的重要组分，所以通过它们的亮氨酸营养缺陷现象，可以鉴定具有整合/过表达盒的正确整合的转化体。各种独特的且丰富的识别序列（NotI、PciI、AseSI、MluI、SbfI）允许置换整合/过表达盒的单个模块。所述盒被GeneArt AG克隆进专有的载体pMA中，所述载体不包含上述的切割位点，所以这些切割位点可在它们的完整范围内被使用。

为了将基因CbSBG1、CbSBG3和CbSBG5插入所述的整合/过表达盒中，通过PCR，从C. bombicola ATCC 22214的染色体DNA扩增该基因，并且同时，通过使用的寡核苷酸，将NdeI切割位点导入在起始密码子的上游，和将FseI切割位点导入在终止密码子的下游。为了将基因CbSBG2和CbSBG4插入所述的整合/过表达盒中，首先由GeneArt AG（Regensburg）重新合成所述基因，以便如此修饰它们的序列，使得内部FseI和NotI切割位点（CbSBG2）和NdeI切割位点（CbSBG4）被去除，而没有改变被编码的蛋白质的氨基酸序列。此后，通过PCR，扩增由GeneArt AG（Regensburg）提供的修饰的基因CbSBG2mod和CbSBG4mod，并通过使用的寡核苷酸，同时将NdeI切割位点导入在起始密码子的上游，将FseI切割位点导入在终止密码子的下游。这里使用下述寡核苷酸：

CbSBG1：

SBG1-OE-fw: 5'- ATA TAT ATA CAT ATG TTA ATC AAA GAC ATT ATT CTA ACT CCA ATG-3'（Seq ID Nr. 38）

SBG1-OE-rv: 5'- ATA TAT GGC CGG CCA ACT TAA GAA AAC CGC ACA ACC ACA CCG-3'（Seq ID Nr. 39）

CbSBG2mod：

SBG2-OE-fw: 5'- ATA TAT ATA CAT ATG AGC CCT TCA TCA CAC AAA CCC CTG -3'（Seq ID Nr. 40）

SBG2-OE-rv: 5'- ATA TAT GGC CGG CCA TTC TAA GAA CTC ACC GCT AAG GCC -3'（Seq ID Nr. 41）

CbSBG3：

SBG3-OE-fw: 5'- ATA TAT ATA CAT ATG GTT GTA AAC TCC TCG AAG GAC CC-3'（Seq ID Nr. 42）

SBG3-OE-rv: 5'- ATA TAT GGC CGG CCT ACC TAG ACC TTC TGG TTA GCG GTA TTG -3'（Seq ID Nr. 43）

CbSBG4mod：

SBG4-OE-fw: 5'- ATA TAT ATA CAT ATG GTG GAT GAT ATA CAG GTA GAG AAG C-3'（Seq ID Nr. 44）

SBG4-OE-rv: 5'- ATA TAT GGC CGG CCA CGT CAA ATC TCT CCG AGA CCT TGC AAG -3'（Seq ID Nr. 45）

CbSBG5：

SBG5-OE-fw: 5'- ATA TAT ATA CAT ATG GCC ATC GAG AAA CCA GTG ATA GTT G -3'（Seq ID Nr. 46）

SBG5-OE-rv: 5'- ATA TAT GGC CGG CCA GGT TAA GAA GCT AAT TCA CTA ATT GCC GAC -3'（Seq ID Nr. 47）。

将下述参数用于PCR：1 x：预变性，98℃，3 min；25 x：变性，98℃，0:10 min，退火，60℃，0:30 min；延伸，72℃，2:00 min；1 x：最后一次延伸，72℃，10 min。按照生产商的推荐，使用New England Biolabs（Frankfurt）的Phusion^TM Fidelity Master Mix进行扩增。随后在0.8% 的琼脂糖凝胶上各分离10µl PCR反应物。PCR操作、琼脂糖凝胶电泳操作、DNA的溴化乙锭染色和测定PCR片段大小，都以本领域技术人员已知的方式进行。

在所有情况下，均可以扩增预期大小的PCR片段。这些大小是：对于CbSBG1，为1646 bp；对于CbSBG2，为1421 bp；对于CbSBG3，为809 bp；对于CbSBG4，为3929 bp；和对于CbSBG5，为1328 bp。按照限制性内切核酸酶的生产商（New England Biolabs; Frankfurt/Main）的推荐，用NdeI和FseI消化PCR产物，并连接进NdeI-和FseI-切割的载体pMA-ExCat（Seq ID Nr. 64）中。以技术人员已知的方式，进行化学感受态大肠杆菌DH5α细胞（New England Biolabs; Frankfurt/Main）的连接和转化。通过用NdeI和FseI限制酶切，验证和证实CbSBG1-、CbSBG2-、CbSBG3-、CbSBG4-和CbSBG5片段在pMA-ExCat中的正确插入。得到的载体被命名为pMA_ExCat-CbSBG1（Seq ID Nr. 65）、pMA_ExCat-CbSBG2（Seq ID Nr. 66）、pMA_ExCat-CbSBG3（Seq ID Nr. 67）、pMA_ExCat-CbSBG4（Seq ID Nr. 68）和pMA_ExCat-CbSBG5（Seq ID Nr. 69）。

为了以足够的量提供各整合/过表达盒和对照盒ExCat用于随后的C. bombicola ATCC 22214 ura^- 的转化，将其通过PCR扩增。使用下述寡核苷酸：

OEx-LEU2-fw: 5'- GGA CCT GCG CCC TAA AAT GGG AC -3'

（Seq ID Nr. 48）

OEx-LEU2-rv: 5'- ATC CTA GAA AAC AGC TGG ATA TGG ATA AAC-3'（Seq ID Nr. 49）。

按照生产商的说明，借助于QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen, Hilden），纯化PCR产物。PCR的操作、借助于琼脂糖凝胶电泳验证成功的PCR扩增、DNA的溴化乙锭染色、测定PCR片段大小、纯化PCR产物和测定DNA浓度，都以技术人员已知的方式进行。

得到的整合/过表达盒被命名为IntEx-CbSBG1（Seq ID Nr. 70）、IntEx-CbSBG2（Seq ID Nr. 71）、IntEx-CbSBG3（Seq ID Nr. 72）、IntEx-CbSBG4（Seq ID Nr. 73）和IntEx-CbSBG5（Seq ID Nr. 74）。也得到对照盒ExCat（Seq ID Nr. 75）。

如前所述进行C. bombicola ATCC 22214 ura ^-的转化（van Bogaert等人Yeast. 2008. 25:273-278; van Bogaert等人FEMS Yeast Res. 2009. 9:610-617）。

为了验证整合/过表达盒（用于过表达CbSBG1、CbSBG2、CbSBG3、CbSBG4和CbSBG5）和对照盒ExCat在C. bombicola ATCC 22214 ura^- 的LEU2基因座中的插入，借助于菌落PCR分别扩增5个转化体（在转化CbSBG1、CbSBG2、CbSBG3、CbSBG4和CbSBG5的整合/过表达盒和对照盒ExCat以后）和C. bombicola ATCC 22214 ura^- 的LEU2基因座。这里使用下述寡核苷酸：

LEU2-KI-fw: 5'- GTG CCC GAC CAC CAT GAG CTG TC -3'

（Seq ID Nr. 50）

LEU2-KI-rv: 5'- CCC AAG CAT GAG GGT CGT GCC GG -3'

（Seq ID Nr. 51）。

将下述参数用于PCR：1 x：预变性，94℃，3 min；25 x：变性，94℃，1:00 min，退火，60℃，1:00 min；延伸，72℃，5:00 min；1 x：最后一次延伸，72℃，10 min。按照生产商的推荐，使用Qiagen（Hilden）的Taq PCR Master Mix试剂盒进行扩增。随后在0.8% 的琼脂糖凝胶上各分离10µl PCR反应物。PCR操作、琼脂糖凝胶电泳操作、DNA的溴化乙锭染色和测定PCR片段大小，都以技术人员熟知的方式进行。

对应的基因座的扩增应产生在表6中指出的PCR片段大小：

表6：在SBG1-、SBG2-、SBG3-、SBG4-和SBG5表达盒和对照盒ExCat同源重组进染色体C. bombicola LEU2基因座中以后和在非同源整合以后，在扩增染色体LEU2基因座时预期的PCR片段大小。

基因	在同源整合进CbLEU2基因座以后，PCR产物的大小	在非同源整合在基因组的其它位点处以后，PCR产物的大小
			SBG1	5452 bp	2235 bp
SBG2	5227 bp	2235 bp
			SBG3	4615 bp	2235 bp
SBG4	7735 bp	2235 bp
			SBG5	5125 bp	2235 bp
ExCat	3844 bp	2235 bp

在扩增C. bombicola ATCC 22214 ura^- 的LEU2基因座的情况中，仅得到在野生型情形存在时预期的片段，其具有2.2 kbp的大小。

在用整合/过表达盒（用于过表达CbSBG1、CbSBG2 mod、CbSBG3、CbSBG4 mod和CbSBG5）转化以后扩增C. bombicola ATCC 22214转化体的LEU2基因座的情况中，仅得到在整合/过表达盒IntEx-CbSBG1（Seq ID Nr. 70）、IntEx-CbSBG2（Seq ID Nr. 71）、IntEx-CbSBG3（Seq ID Nr. 72）、IntEx-CbSBG4（Seq ID Nr. 73）和IntEx-CbSBG5（Seq ID Nr. 74）成功的染色体整合情况中预期的片段大小，它们分别是大约5.5 kbp、5.2 kbp、4.6 kbp、7.7 kbp和5.1 kbp。

因而，在所有5种情况下，可能鉴定出这样的克隆：其中可能使基因CbSBG1、CbSBG2、CbSBG3、CbSBG4或CbSBG5受C. bombicola ATCC 22214 TSC3启动子控制，从而能够假定过表达。

相应的菌株在下文中称作C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG1-T_TSC3 、C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG2-T_TSC3 、C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG3-T_TSC3 、C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG4-T_TSC3 和C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG5-T_TSC3 。

实施例5：表征通过C. bombicola ATCC 22214 ExCat、C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG1-T_TSC3、C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG2-T_TSC3、C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG3-T_TSC3、C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG4-T_TSC3和C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG5-T_TSC3的槐糖脂形成

在YPD琼脂平板上繁殖菌株C. bombicola ATCC 22214 ExCat、C. bombicola ATCC 22214P_TSC3-SBG1-T_TSC3、C. bombicola ATCC 22214P_TSC3-SBG2-T_TSC3、C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG3-T_TSC3、C. bombicola ATCC 22214P_TSC3-SBG4-T_TSC3和C. bombicola ATCC 22214P_TSC3-SBG5-T_TSC3。使用在下文中被称作SL生产培养基的培养基用于生产槐糖脂。该培养基由0.1% KH₂PO₄、0.5% MgSO₄•7 H₂O、0.01% FeCl₃、0.01% NaCl、0.01% 尿嘧啶、0.4% 酵母浸出物、0.1% 尿素、10.5%菜籽油和10% 葡萄糖组成。将pH调至4.5，然后用高压灭菌釜（121℃, 20 min）将培养基灭菌。在培养过程中，不需要调节pH。

使用蒸发光散射检测器（ELSD）进行槐糖脂和/或油酸的检测和定量测定。借助于Agilent Technologies 1200系列（Santa Clara, 加利福尼亚）和Zorbax SB-C8快速拆分柱（4.6 x 150 mm, 3.5µm, Agilent），进行实际测量。注射体积是5µl，该方法的运行时间是20 min。作为流动相使用H₂O和0.1% 的TFA（三氟醋酸, 溶液A）和甲醇（溶液B）。柱温是40℃。使用的检测器是ELSD（检测器温度60℃）和DAD（二极管阵列, 210 nm）。在该方法中使用的梯度如表3中所示。

如同对照菌株C. bombicola ATCC 22214 ExCat一样，所有菌株均生产槐糖脂。但是，相对于C. bombicola ATCC 22214 ExCat，菌株C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG1-T_TSC3 、C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG2-T_TSC3 、C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG3-T_TSC3 、C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG4-T_TSC3 和C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG5-T_TSC3 具有增加的槐糖脂形成的空间时间产率。C. bombicola ATCC 22214 ExCat在选择的条件下生产大约2 mg槐糖脂/升•小时•OD₆₀₀，而在菌株C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG1-T_TSC3 、C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG2-T_TSC3 、C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG3-T_TSC3 、C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG4-T_TSC3 和C. bombicola ATCC 22214 P_TSC3-SBG5-T_TSC3 的情况中，该参数是在2.5 mg至6 mg之间。因而，能够证实，增强C. bombicola ATCC 22214中的酶CbSBG1、CbSBG2、CbSBG3、CbSBG4和CbSBG5会导致槐糖脂的形成增加。

实施例 6: 用于过表达具有 N- 端 His- 标签的假丝酵母菌基因 SBG2 的载体 pTZ_E02_His-GlcTrI

为了在大肠杆菌中过表达假丝酵母菌ATCC22214基因SBG2（Seq ID Nr. 03），构建了质粒pTZ_E02_His-GlcTrI。按照生产商的说明，使用假丝酵母菌ATCC22214的染色体DNA作为PCR的模板，所述PCR使用来自Roche Diagnostics（Mannheim）的“Expand^TM High Fidelity”-PCR试剂盒。借助于寡核苷酸1373_GlcTrI_BsmBI_His_fp（Seq ID Nr. 76）和1373_GlcTrI_AscI_rp（Seq ID Nr. 77），从染色体DNA扩增SBG2基因（“PCR protocols. A guide to methods and applications”, 1990, Academic Press），并以此方式在5'末端处配备6重N-端组氨酸标签。另外，导入BsmBI和AscI切割位点。使用下述寡核苷酸：

1373_GlcTrI_BsmBI_His_fp（Seq ID Nr. 76）：

5'-AAACGTCTCAGATGCACCACCACCACCACCACATGGTTGTAAACTCCTCG-3'

1373_GlcTrI_AscI_rp（Seq ID Nr. 77）：

5'-AAAGGCGCGCCCTAGACCTTCTGGTTAGCG-3'。

按照生产商的说明书，借助于QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen, Hilden），纯化PCR产物（1435 bp），用BsmBI和AscI切割，并且随后连接进已经以相同的方式切割的Trenzyme GmbH（Konstanz）的表达载体pTZ_E02（基于pET24d的载体; Merck Chemicals, Darmstadt）中。得到的质粒pTZ_E02_His-GlcTrI（Seq ID Nr. 78）是6700碱基对大的。以技术人员已知的方式，进行化学感受态大肠杆菌DH5α细胞（Gibco-BRL, Karlsruhe）的连接和转化。通过DNA序列分析，验证插入物的可靠性。

借助于转化，将质粒pTZ_E02_His-GlcTrI导入菌株大肠杆菌BL21（DE3）和大肠杆菌Rosetta（DE3）（二者来自Merck Chemicals, Darmstadt）中。得到的菌株被称作大肠杆菌BL21（DE3）/pTZ_E02_His-GlcTrI和大肠杆菌Rosetta（DE3）/pTZ_E02_His-GlcTrI。

实施例7: 用于过表达具有N-端His-标签的假丝酵母菌基因SBG5的载体pTZ_E02_His-GlcTrII

为了在大肠杆菌中过表达假丝酵母菌ATCC22214基因SBG5（Seq ID Nr. 06），构建了质粒pTZ_E02_His-GlcTrII。按照生产商的说明，使用假丝酵母菌ATCC22214的染色体DNA作为PCR的模板，所述PCR使用Roche Diagnostics（Mannheim）的“Expand^TM High Fidelity”-PCR试剂盒。借助于寡核苷酸1373_GlcTrII_BsmBI_His_fp（Seq ID Nr. 79）和1373_GlcTrII_AscI_rp（Seq ID Nr. 80），从染色体DNA扩增SBG5基因（“PCR protocols. A guide to methods and applications”, 1990, Academic Press），并以此方式在5’末端处配备6重N-端组氨酸标签。此外，导入BsmBI和AscI切割位点。使用下述寡核苷酸：

1373_GlcTrII_BsmBI_His_fp（Seq ID Nr. 79）：

5'-AAACGTCTCAGATGCACCACCACCACCACCACATGGCCATCGAGAAACCAG-3'

1373_GlcTrII_AscI_rp（Seq ID Nr. 80）：

5'-AAAGGCGCGCCTTAAGAAGCTAATTCACTAATTGCC-3'。

按照生产商的说明书，借助于QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen, Hilden），纯化PCR产物（1342 bp），用BsmBI和AscI切割，并且随后连接进Trenzyme GmbH，Konstanz的已经以相同的方式切割的表达载体pTZ_E02（基于pET24d的载体; Merck Chemicals, Darmstadt）中。得到的质粒pTZ_E02_His-GlcTrII（Seq ID Nr. 81）是6607碱基对大的。以技术人员已知的方式，进行化学感受态大肠杆菌DH5α细胞（Gibco-BRL, Karlsruhe）的连接和转化。通过DNA序列分析，验证插入物的可靠性。

借助于转化，将质粒pTZ_E02_His-GlcTrII导入菌株大肠杆菌BL21（DE3）和大肠杆菌Rosetta（DE3）（二者来自Merck Chemicals, Darmstadt）中。得到的菌株被称作大肠杆菌BL21（DE3）/pTZ_E02_His-GlcTrII和大肠杆菌Rosetta（DE3）/pTZ_E02_His-GlcTrII。

实施例 8: 用于过表达具有N-端His-标签的假丝酵母菌基因SBG3的载体 pTZ_E02_His-AcTr

为了在大肠杆菌中过表达假丝酵母菌ATCC22214基因SBG3（Seq ID Nr. 04），构建了质粒pTZ_E02_His-AcTr。按照生产商的说明，使用假丝酵母菌ATCC22214的染色体DNA作为PCR的模板，所述PCR使用Roche Diagnostics（Mannheim）的“Expand^TM High Fidelity”-PCR试剂盒。借助于寡核苷酸1373_AcTr_BsmBI_His_fp（Seq ID Nr. 82）和1373_AcTr_AscI_rp（Seq ID Nr. 83），从染色体DNA扩增SBG3基因（“PCR protocols. A guide to methods and applications”, 1990, Academic Press），并以此方式在5’末端处配备6重N-端组氨酸标签。此外，导入BsmBI和AscI切割位点。使用下述寡核苷酸：

1373_AcTr_BsmBI_His_fp（Seq ID Nr. 82）：

5'-AAACGTCTCAGATGCACCACCACCACCACCACATGGTTGTAAACTCCTCG-3'

1373_AcTr_AscI_rp（Seq ID Nr. 83）：

5'-AAAGGCGCGCCCTAGACCTTCTGGTTAGCG-3'。

按照生产商的说明书，借助于QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen, Hilden），纯化PCR产物（823 bp），用BsmBI和AscI切割，并且随后连接进已经以相同的方式切割的Trenzyme GmbH（Konstanz）的表达载体pTZ_E02（基于pET24d的载体; Merck Chemicals, Darmstadt）中。得到的质粒pTZ_E02_His-AcTr（Seq ID Nr. 84）是6088碱基对大的。以技术人员已知的方式，进行化学感受态大肠杆菌DH5α细胞（Gibco-BRL, Karlsruhe）的连接和转化。通过DNA序列分析，验证插入物的可靠性。

借助于转化，将质粒pTZ_E02_His-AcTr导入菌株大肠杆菌BL21（DE3）和大肠杆菌Rosetta（DE3）（二者来自Merck Chemicals, Darmstadt）中。得到的菌株被称作大肠杆菌BL21（DE3）/ pTZ_E02_His-AcTr和大肠杆菌Rosetta（DE3）/ pTZ_E02_His-AcTr。

实施例 9: 参与槐糖脂生物合成的酶 SBG2 、 SBG3 和 SBG5 的异源表达

在每种情况下，首先在5 ml含有50µg/ml卡那霉素的LB培养基（10 g/l胰蛋白质胨、5 g/l酵母浸出物、10 g/l NaCl）中，在37℃和175 rpm，培养在第1-3项下构建的大肠杆菌菌株的单一菌落8小时。此后，给在500 ml摇瓶中的100 ml LB培养基接种第一种预培养物，并在37℃和175 rpm培养过夜。次日早晨，给1 l LB培养基（具有0.1的起始OD₆₀₀）接种第二种预培养物（5-l摇瓶）。在37℃和175 rpm温育所有培养物。通过表观光密度（OD₆₀₀），跟踪培养物的生长。当达到约0.3的OD₆₀₀时，将培养温度从37℃降至20℃。在0.6的OD₆₀₀时，通过加入0.5 mM IPTG（终浓度），诱导各目标基因的表达。在所有培养步骤中，加入合适的抗生素（卡那霉素50µg/ml）。在加入IPTG之前和在诱导以后24 h，采取用于分析的样品。按照生产商的说明书，用Bugbuster（Merck Chemicals, Darmstadt）破碎细胞，以使可溶性的和不溶性的蛋白质彼此分离。借助于SDS-PAGE，分离可比较量的细胞提取物，随后用胶态考马斯对凝胶染色。对于所有3种重组生产的蛋白质（具有His标签的Sbg2p、Sbg3p和Sbg5p）而言，在细胞提取物的可溶性的级分中均可检测到过量生产。

实施例 10 ：参与槐糖脂生物合成的酶 Sbg2p 、 Sbg3p 和 Sbg5p 的纯化

在诱导基因表达24 h后，借助于离心（8000 g, 20 min, 4℃）收获细胞。1升培养物产生约5 g湿生物质。将细胞团块重新悬浮于100 ml缓冲液A（100 mM Tris、pH 7.8、50 mM NaCl、20 mM咪唑）中，所述缓冲液A另外包含蛋白酶抑制剂（Roche, 定货号11 873 580 001）。通过在微射流机（Microfluidizer）中经过6次，破碎重新悬浮的细胞。在另外的离心步骤（10000 g, 20 min, 4℃）以后，过滤（孔径: 0.45µm）上清液，以得到可溶性的蛋白质级分。通过His-标签亲和色谱柱（GE, HisTrap FF 1 ml柱, 定货号17-5319-01），纯化目标蛋白质。流速为1 ml/min。使用缓冲液B（100 mM Tris、pH 7.8、50 mM NaCl、500 mM咪唑）进行0-100%的线性洗脱。为此，采用20倍柱体积的缓冲液B，并收集2 ml级分。合并含有蛋白质的洗脱液级分，并借助于过滤单元（Amicon Ultra-15, NMWL 10 kDa Centricons, Millipore, 定货号UFC901024）进行浓缩。此后，借助于使用Sephadex 25（PD-10柱, GE, 定货号17-0851-01）的凝胶过滤更换缓冲液，将各个蛋白质级分进到最终的缓冲液（100 mM Tris、pH 7.8、50 mM NaCl）中。借助于SDS-PAGE，验证蛋白质纯化。从1 l培养物中纯化出3.3 mg Sbg2p（蛋白质浓度1.0µg/µl）、7.3 mg Sbg5p（蛋白质浓度2.2µg/µl）和6.9 mg Sbg3p（蛋白质浓度2.1µg/µl）。

实施例 11 ：参与槐糖脂生物合成的酶 Sbg2p 、 Sbg3p 和 Sbg5p 的表征

为了证明参与槐糖脂生物合成的酶Sbg2p、Sbg3p和Sbg5p的功能，使用3种纯化的酶Sbg2p、Sbg3p和Sbg5p分别单独地和以所有可能的组合进行酶测定。该测定以350µl的总体积按照下表进行：

表7：酶测定混合物的组成（µl）

通过加入14 μl 13.4 mM的底物（18-羟基-Z-9-十八碳烯酸）在乙醇中的溶液，开始反应，并在振摇下（600 rpm）在30℃温育6 h。此后，通过加入1.4 ml丙酮，终止反应。通过离心（16100 g, 5 min, RT），沉淀出未溶解的组分。随后将上清液转移进新容器中，并通过真空蒸发器（25℃）浓缩至最初的反应体积（350µl）。借助于LC-ESI-MS分析样品，并通过分析相应的质量迹线和MS波谱，鉴定产物。

为了鉴定所形成的产物，将5µl产物注射进UPLC系统Accela（Thermo Scientific, Dreieich）中。用半-UPLC柱“Pursuit XRs ULTRA”（C8, 2.8µm, 2.1 x 100 mm）（Varian, Darmstadt），分析要研究的物质。使用由流动相A1（H₂O, 0.1% （v/v）TFA）和流动相B1（甲醇, 0.1% （v/v）TFA）组成的梯度，以0.3 ml/min的流速，在40℃在25 min内进行分离。梯度随时间的进程示于表8中。

表8：HPLC梯度的进程

时间[min]	流动相A1 [%]	流动相B1 [%]
			0	30	70
15	0	100
			25	0	100
25.01	30	70
			32	30	70

在200 - 600 nm的波长范围内，借助于DAD检测器进行检测，并用高分辨率FT-ICR质谱仪LTQ-FT（Thermo Scientific, Dreieich）在扫描范围m/z 100 - 1000内进行质量选择。用ESI（电喷射离子化）进行离子化。借助于FT-ICR质量分析仪（具有R = 100000的分辨率和≤2 ppm的质量准确度），测定精确的质量和化学经验式。

使用的对照反应是，仅包含底物UDP-葡萄糖、乙酰辅酶A和18-羟基-Z-9-十八碳烯酸、但是没有酶的混合物（参见表7）。在该样品中，通过MS仅能够检测到底物18-羟基-Z-9-十八碳烯酸（C₁₈H₃₄O₃; 298.2502 g/mol）。

混合物2（参见表7）除了包括底物以外，还包含105µg Sbg3p。如同在混合物1中一样，在该样品中仅能够检测到18-羟基-Z-9-十八碳烯酸。

混合物3（参见表7）除了包括底物以外，还包含100µg Sbg2p。除了底物18-羟基-Z-9-十八碳烯酸以外，检测到18-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸（经验式C₂₄H₄₄O₈；分子量460.3031 g/mol）。这表明，Sbg2p能够将UDP-葡萄糖和18-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成18-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸。

混合物4（参见表7）除了底物以外，另外包含110µg Sbg5p。除了底物18-羟基-Z-9-十八碳烯酸以外，检测到18-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸和18-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸（经验式C₃₀H₅₄O₁₃；分子量622.3559 g/mol）。这表明，Sbg5p能够将UDP-葡萄糖和18-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成18-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸，并进一步转化成18-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸。

混合物5（参见表7）除了底物以外，另外包含100µg Sbg2p和105µg Sbg3p。除了底物18-羟基-Z-9-十八碳烯酸以外，检测到18-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸和18-(6-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸（经验式C₂₆H₄₆O₉；分子量502.3136 g/mol）。这证实，如同在混合物3中已经证实的，Sbg2p能够将UDP-葡萄糖和18-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成18-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸，并进一步证实，在乙酰辅酶A存在下，Sbg3p能够乙酰化18-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸，得到18-(6-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸。

混合物6（参见表7）除了底物以外，另外包含110µg Sbg5p和105µg Sbg3p。除了底物18-羟基-Z-9-十八碳烯酸以外，检测到18-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸、18-(6-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸、18-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸、18-L-[(6'-O-乙酰基-2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸（经验式C₃₂H₅₆O₁₄；分子量664.3665 g/mol）和18-L-[(6'-O-乙酰基-2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6''-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸（经验式C₃₄H₅₈O₁₅；分子量706.3770 g/mol）。这证实，如同在混合物4中已经证实的，Sbg5p能够将UDP-葡萄糖和18-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成18-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸，并进一步转化成18-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸，并且进一步证实，所形成的产物可以在乙酰辅酶A存在下被Sbg3p乙酰化，成为18-L-[(6'-O-乙酰基-2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸和/或18-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6''-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸以及18-L-[(6'-O-乙酰基-2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6''-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸。

混合物7（参见表7）除了底物以外，另外包含100µg Sbg2p和110µg Sbg5p。除了底物18-羟基-Z-9-十八碳烯酸以外，检测到18-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸和18-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸。这证实，Sbg2p和Sbg5p在混合物中能够将UDP-葡萄糖和18-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成18-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸，并进一步转化成18-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸。

混合物8（参见表7）除了底物以外，另外包含100µg Sbg2p、105µg Sbg3p和110µg Sbg5p。除了底物18-羟基-Z-9-十八碳烯酸以外，检测到18-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸、18-(6-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸、18-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸、18-L-[(6'-O-乙酰基-2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸和18-L-[(6'-O-乙酰基-2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6''-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸。这证实，如同在混合物7中已经证实的，Sbg2p和Sbg5p一起能够将UDP-葡萄糖和18-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成18-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸，并进一步转化成18-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸，并且进一步证实，如同在混合物5和6中已经证实的，所形成的产物能够在乙酰辅酶A存在下被Sbg3p乙酰化，成为18-L-[(6'-O-乙酰基-2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸和/或18-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6''-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸以及18-L-[(6'-O-乙酰基-2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6''-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸。

实施例 12 ：灭活假丝酵母菌 ATCC 22214 中的乙酰基转移酶（ SBG3 ）的替代途径

在一个替代途径中，单独地灭活基因SBG3，并表征对应的突变体在槐糖脂生物合成方面的表型。为了在C. bombicola ATCC 22214中构建对应的突变体，首先由GeneArt AG（Regensburg）合成CbSBG3的删除盒（Seq ID Nr. 14；参见实施例2）。此后，在Trenzyme GmbH（Konstanz）将基因CbURA3通过潮霉素抗性盒置换，该基因编码C. bombicola ATCC 22214的乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶（van Bogaert等人Yeast. 2007. 24(3):201-8）。为此，使用下述寡核苷酸，从载体p-Col-5的DNA（Seq ID Nr. 85）扩增潮霉素盒：

1390_hygR_fp_EcoRV: 5'- AAA GAT ATC TCT ATG CGC ACC CGT TCT C -3'

（Seq ID Nr. 86）

1390_hygR_rp_Hind/Bgl: 5'- TTT AGA TCT AAG CTT GAG ACA CCT CAG CAT GCA CCA TTC -3'

（Seq ID Nr. 87）。

将下述参数用于PCR：1 x：预变性，98℃，3 min；25 x：变性，98℃，0:10 min，退火，60℃，0:30 min；延伸，72℃，2:00 min；1 x：最后一次延伸，72℃，10 min。按照生产商的推荐，使用New England Biolabs（Frankfurt）的Phusion^TM Fidelity Master Mix进行扩增。按照生产商的说明书，使用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen, Hilden）纯化PCR产物。得到的PCR产物具有1831 bp的大小。PCR操作、借助于琼脂糖凝胶电泳验证成功的PCR扩增、DNA的溴化乙锭染色、测定PCR片段大小、纯化PCR产物和测定DNA浓度，都以技术人员已知的方式进行。将潮霉素盒克隆进载体pCR4_AcTr_URA（Seq ID Nr. 88）中，其中将所述载体用限制性内切核酸酶BglII和PmlI线性化。用限制性内切核酸酶EcoRV和BglII准备插入物用于随后的连接。以技术人员已知的方式进行连接，随后转化进大肠杆菌DH5α细胞中。通过DNA序列分析，验证插入物的可靠性。

产生的质粒被命名为pCR4_AcTr_HygR（Seq ID Nr. 89），且是8578 bp大的。

删除盒CbSbg3-hyg（Seq ID Nr. 90）由肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）潮霉素抗性基因（hph）组成，该基因编码潮霉素B磷酸酶（Gritz L和Davies J 1983 Plasmid-encoded hygromycin B resistance: the sequence of hygromycin B phosphotransferase gene and its expression in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Gene 25 (2-3): 179-188）。该抗性基因的启动子是组成型杂合启动子hp4d（Madzak等人2000, Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2, 207–216）。该抗性基因侧接XPR2基因的终止子，所述XPR2基因编码来自解脂假丝酵母（Y. lipolytica）的胞外蛋白酶（Nicaud等人1989a. Cloning, sequencing and amplification of the alkaline extracellular protease (XPR2) gene of the yeast Yarrowia lipolytica. J. Biotechnol. 12, 285–298）。该抗性基因在上游和下游侧接大约1000 bp的要灭活的基因的邻接区域。

在每种情况下，将loxP-基因座（其任选地通过暂时导入重组酶Cre编码基因及其功能性表达允许删除CbURA3基因）（关于综述，参见Kühn & Torres. Methods Mol Biol. 2002. 180:175-204）嵌入在侧接区和hph基因之间。构建对应于下表9中所示数据的删除盒：

表9：C. bombicola ATCC 22214的编码Sbg3p的结构基因的删除盒的结构。

Seq ID Nr.	基因	5’-侧接区	loxP基因座1	hph	loxP基因座2	3’-侧接区
							90	SBG3	1 - 1033	1034 - 1066	1067 - 3599	3600 - 3633	3634 - 4635

为了以足够的量提供删除盒用于随后的C. bombicola ATCC 22214的转化，通过PCR扩增所述删除盒。这里使用下述的寡核苷酸：

用于灭活CbSBG3的删除盒的扩增：

SBG3-fw: 5'- TGC AGA CAA GTT CCT GCA GCT G -3'

（Seq ID Nr. 21）

SBG3-rv: 5'- ATG CTT TAT TCA GGC ACG CTA CG -3'

（Seq ID Nr. 22）。

将下述参数用于PCR：1 x：预变性，98℃，3 min；25 x：变性，98℃，0:10 min，退火，60℃，0:30 min；延伸，72℃，2:00 min；1 x：最后一次延伸，72℃，10 min。按照生产商的推荐，使用New England Biolabs（Frankfurt）的Phusion^TM Fidelity Master Mix进行扩增。按照生产商的说明书，使用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen, Hilden）纯化PCR产物。PCR操作、借助于琼脂糖凝胶电泳验证成功的PCR扩增、DNA的溴化乙锭染色、测定PCR片段大小、纯化PCR产物和测定DNA浓度，都以技术人员已知的方式进行。

如前所述进行C. bombicola ATCC 22214的转化（van Bogaert等人Yeast. 2008. 25:273-278; van Bogaert等人FEMS Yeast Res. 2009. 9:610-617）。

为了验证在用CbSBG3（Seq ID Nr. 90）的删除盒转化以后基因SBG3在C. bombicola ATCC 22214转化体中的删除，借助于菌落PCR，分别扩增5个转化体和C. bombicola ATCC 22214的各基因座。这里使用下述寡核苷酸：

CbSBG3的基因组删除的验证：

SBG3-KO-fw: 5'- CAA ATT TAT CTG GGA GCA CAG TTA CAT TGC -3'（Seq ID Nr. 31）

SBG3-KO-rv: 5'- CAC ACA TTG CTT TAG TCC AGC AAG AAC C -3'（Seq ID Nr. 32）。

在扩增C. bombicola ATCC 22214的CbSBG3基因座时，仅测得在野生型情形存在时预期的片段大小，即2839 bp。

在转化删除盒CbSBG3-hyg以后扩增转化体的SBG3基因座时，仅得到在从染色体成功删除CbSBG3以后预期的片段大小，即4693 bp。

因此，可以鉴定出这样的克隆：其中染色体删除了基因CbSBG3。相应的菌株此后被称作C. bombicola ATCC 22214 sbg3-hyg。

实施例 13 ：经由 C. bombicola ATCC 22214 sbg3-hyg 的槐糖脂形成的表征。

在YPD琼脂平板上繁殖菌株C. bombicola ATCC 22214和C. bombicola ATCC 22214 sbg3-hyg。使用在下文中称作SL生产培养基的培养基用于生产槐糖脂。该培养基由0.1% KH₂PO₄、0.5% MgSO₄•7 H₂O、0.01% FeCl₃、0.01% NaCl、0.4% 酵母浸出物、0.1% 尿素、10.5%菜籽油和10% 葡萄糖组成。将pH调至4.5，然后借助于高压灭菌釜（121℃, 20 min）将培养基灭菌。在培养过程中，不需要调节pH。

使用蒸发光散射检测器（ELSD）进行槐糖脂和/或油酸的检测和定量测定。借助于Agilent Technologies 1200系列（Santa Clara, 加利福尼亚）和Zorbax SB-C8快速拆分柱（4.6 x 150 mm, 3.5µm, Agilent），进行实际测量。注射体积是5µl，该方法的运行时间是20 min。作为流动相使用H₂O和0.1% 的TFA（三氟醋酸, 溶液A）和甲醇（溶液B）。柱温是40℃。使用的检测器是ELSD（检测器温度60℃）和DAD（二极管阵列, 210 nm）。在该方法中使用的梯度如在下表10中所示。

表10：要用于基于HPLC的槐糖脂定量测定的流动相的梯度形式描述。

分析表明，C. bombicola ATCC 22214和C. bombicola ATCC 22214 sbg3-hyg都生产槐糖脂。

借助于LC-MS²证实，与由C. bombicola ATCC 22214形成的槐糖脂相反，由C. bombicola ATCC 22214 sbg3-hyg形成的槐糖脂仅对应通式（Ia）和（Ib）的化合物，其中R¹ = H，且R² = H（参见图1和2），并且这些化合物的浓度与C. bombicola ATCC 22214相比增加了因数10。这证实了Sbg3p在槐糖脂生物合成中作为乙酰基转移酶的功能。

序列表

<110> Evonik Degussa GmbH

<120> 细胞、核酸、酶和它们的用途以及用于生产槐糖脂的方法

<130> 200900338

<160> 90

<170> PatentIn 3.4版

<210> 1

<211> 18013

<212> DNA

<213> 假丝酵母菌

<400> 1

caaactcgac gctaaacaga ccttaaatga caccaatcaa tgtgaaaaaa tcaagttttt 60

ttgttcactc tatattgact gtttccgatg tgtgctatgc agccctcttt gaatcggtgg 120

aagcatgtag ttgaagaaag atggacgtag gagaaacatc aaactgaaca atagtaactt 180

aaacgtggtt tagaatgcaa gagcaggctc gctgctatgg cattcatagc caggaaagaa 240

acacggatga tctcacactt tgttggatcg acagtcggat ttttttgaaa atttatactt 300

ggcatacatc ttaatacagg ggtagaagga gaagtcgcga gagcgatttc tccgtcattt 360

attcgccgac aaatgtggat ccgtatttag cagattcgaa gtaaattgca ctcgacacca 420

cccacgtgat cgacactgtc gcgtcgatct ccatatatgt acgtgcctat ataaacaagc 480

aacacgcaga ttttgaaatc acatagggag ttgcccgtat gaatccggtt caaataataa 540

tactttgttt tcagatagga gaaacaaaac acccttggta ctcagaagac aaataacgat 600

ccattgtttt caactggaag aaataataca cattgatatt cagaagacaa ataactatcc 660

catttcttta gtatgtgcga aggtaaacag ttctatttca ccttaaaaac actactgaaa 720

gtgcgacata ctgtcgtacg taaaatataa aagcaatcac tatcatttcg ccattatcct 780

tgtcttgtaa taatccaaaa ctgagatcgg gaacggttcc cgttcttgac ataagcagga 840

gctgagaaca ggaacggttc ctggtcttga aatcagcagt aatagagaac gggattggtt 900

cccgttcttg acataagcag gaattggaaa caggaacggt tcccggtctt gacatcagca 960

gggatcgaaa acaggagcgg tttccggtct tgacatgata caaagaatga ttctttgtat 1020

cgggtctatg ggaggaaaaa cagctcattt tcacagaaaa tacagagaac aaaataattg 1080

aaagcgcgac ataatgtcgt acgtagaatt tagaagcaat tactcttatt tttccattat 1140

ccgcgctatt gtacacacac ccaaaccaga acgcgacttg agtgcaatgc ttactaacgc 1200

gcacattaat aagcaaatat agatacgcgg agagcacgcg aaatttgttt accagtacac 1260

tagtgcttag cacaatgaaa tagaccgtac tccggctgag gctcaaagtc cagaagttag 1320

agatttgcca gtttcgttac tagacggttc gttgtgccag gtatgtcgta cagcgcattt 1380

atcagggacg gaaatgggtc ttccatccct gttttggaat gcgctgtcga tccggacgca 1440

gcctcagccg cgtctatttc aaccccccat tagacaggcg gtacattagc tgtttggcct 1500

tcacgctaca gcataattct ccgtcatgtg tgtttccatg accaagaatt gttttggccc 1560

acgaaccaag atcatcgccg tcatataaac ccacattgga gtgttgactc tccatagctt 1620

gtcgttgaat gcaaacttga tgcccgcaaa agtgcttatt agcctacgca ctgattcgcc 1680

ccactctgcg agccacattt ccgctagctt aacatcaggc accgcaatcg gtgcctggac 1740

tgtctccggg ctcggccgag cccggttgag accatcttct tcaaattcat cttctgatag 1800

ctcatctaac atcctagagc tgttcctctt tttccttctt tttgttaatt ggtatttaaa 1860

ccaccaagtg tgtaaacttg tatttttgtc atccgagaga tatctaatag caagtttgcg 1920

attagttaca aatttgttgc gctcttgttc ggtactctta ttgaaacaag ggtgtcgact 1980

cgccaaattc catcggagaa aattgttcga tggatagctt tggagtctgt cccatcatga 2040

tacgaaaagc gtgaagctcc tctgacaatc aaaactttgt ttcaatgggg tgtaggatgg 2100

accccggatc caaacgaccg cgagtcaaaa aacctacggg tgcatttacc cgtagttgat 2160

ctggaaagtc gagatcaact ttttgtagtt tagttacatt catttcacgg tcgaaaaact 2220

cacacacaac gattgcagta tatttaccaa aatcgtctga agagaagcat ctgattgaga 2280

gttcaccatg acgaatccca taaacgacta ctccactgga cacaccgaca gacgccctgg 2340

ggatagtgaa actgaatttg tcggtataat ggcccgtctc acaggccggg cagaacactt 2400

tcatgtcctt tcgcaggtct cgacattgga caagtatgtt gtcgtgggtg acgacaaatt 2460

ggtcctcatc cttgaataag atgctccctt tgttctcagg aactggcacc attccattat 2520

gggcgaataa tttctgctca tcttcgggac tgatgccata ttcttctaac agaagacggc 2580

gctcacatgg gacctggtgc tctcgccggc ctctcaaatc gccggtgcat ctccacacgc 2640

aaattcacgg gtgtataccc ctgatcaaac gtatcttgcg cgttctgtta ttcattggag 2700

cgagggcccg atcctgtcct atcaaatgat ttcatgtggg aataatccat caattgttct 2760

ggattgaggt atacttcgag ctgtaaagat gtcgcttcta tgtcaagaat agtcggttaa 2820

acgcactcct tcaagattta catgatttac atgattcttc ataaagagca taaataaaga 2880

actgcagcca ttcttgagta aagtgctcag aataataaaa aggttgccac aggttgagtt 2940

aacatgggtt gattgaacca attaaggagg gaacgtttct tccatgggag gctaagaaac 3000

ttaagaaaac cgcacaacca caccgggagg agcgtgttga gctgtaagcg ttgttgagaa 3060

acgaggggac tctgggaagt cgggacccat ctcaatcttg gaatactcct gtaagagtct 3120

caccagagtt agcgaaagct ctgtcagggc gaattgttgg ccgagacaaa ttcggggacc 3180

gccattgaag ggcaagaatg cccacacatt atctagcttc aagttctccc atcgattggg 3240

attgaattcg tgggcgtcag gaccccaata cttgatgtcc ctgtggacca tgtaaattga 3300

atagtaaact gcggtgccct taggaacgaa gatcggatcc ttctgctcgg gaccaccacc 3360

tatgggtaga gttgtatctc tcacagcagt acggaagttc aatggcaata ccggcgcaag 3420

acgcaagact tcatttataa cttgcttcaa ataaggtgct tgcttcagaa gttcgaatga 3480

taaaggcctt tgctcctcct tggttccaaa atgatcgagg acctcctcac gtagtttgtt 3540

gaatacgtca ggatttctgg caaggaaatg aatagcgaag ctcaacgtag cagctgttgt 3600

atctctacca gcaatgagaa tgttgaaaat ttgatcacgt atcgtcactg ggtctcgggt 3660

aactttagcc atctcaagcg agaacacata gatgccacta gactctgcag cagcatcctt 3720

ctctgcaata gagttctcag cagcgaaaga tgtggcgtaa agagccttat caacgtagta 3780

gtcaatatag gactgagcac gtttcttgtg atctcggaat tccttagagt tgaacaacca 3840

gtagactttg cttgataggg tccgtttgaa agcgtaattc agtagaaagt tgtaggactc 3900

cacgaattgt tcggcagtaa tctccgaacc atcacgggct acaatacatg actgattctc 3960

agggttcaag ctctcgcagg actccccaaa taggaattca gtcgctgtat ccagcgtaag 4020

tttgtggaaa taatgttgaa catcaataaa ttggtccact ttcattgcac ggttcatctc 4080

ctttattaac tccgcagcat gactggaaat ctgatcaatt ctgcaaacct gatctttagt 4140

gaactgaggt ctcaacatcg atcgagactg tttccatcca tttccgctga gtgtaaatat 4200

cccttggcca aacacttttc ccactgtgtg gaaacgtgct ccaagaccaa aatcattgaa 4260

tttggttgcc aggattgtct taatgttttc tggctcgatt gtgaagattt ggtattgaag 4320

gggagcttgt cgaagatacg tccgtgcttt gaacttattg aagactctgt cgtattgaac 4380

ttccagtaag gtgtatgact tggccgtctt gatcatgtcc atggttcttt gtattcccag 4440

tgggaacgat ttctcaatga agcgaggcat actacacttg tgcctacgtg ctgcatagcg 4500

gtaccatagg agccagatag gctcgtgtag aactaagaaa gctacgaaga gcagtggcaa 4560

caagccagca acagcggata aactcattgg agttagaata atgtctttga ttaacatata 4620

tgtacttttc aatatgataa acggagaaat aacgcccggc tctatatgca agctgcatca 4680

accctaatat atattagcga gtttctcatg caggctgtag tttgagtcgc tgtaacctca 4740

gcctcaagac tcttacacca taggtagagt ttcgtcactg ggaaactcag ttactatcta 4800

aaccaaactg tgctaatgct caaacctatc actcagaatt tagattgaat caatctaagt 4860

ctgttgagaa acagatatgc atcaggggca cagactaaaa gctgctctca gcgagtaccc 4920

ttacctcttg agaaccctca aaatttaccc agcctgcagc atatcatgca ccatggttaa 4980

attcggaaat gaatttaccg gtggccttga accacgttcc tccaattatt taaggcaata 5040

acctgccact ctcttgattt gattaagaaa gactttcaat ttagcttctc cctacgaata 5100

ttcaatgagc ccttcatcac acaaacccct gattctcgct tgcggcttgc ctctttcagg 5160

ccatataatg cccgttttga gtctggtaca cggccttacg gacgacggat acgaagctac 5220

tgttgtgaca ggcagagcgt ttgaacaaaa agttcgagat gtgggtgcag actttgttcc 5280

tttagaaggg aacgcagatt ttgatgacca caccttagac gatctggtcc cgggccgtaa 5340

agacatggcc ccaagcttcg atcgtacagt tcaagatgtg gagcacatga tggtagctac 5400

tcttcctgag cagtttgccg ctattcagag ggctttcaaa aagctcagcg caagcggccg 5460

ccctgtcgtt cttgtcagtg aagtgctgtt tttcggtgca caccctatca gcctcggtgc 5520

tcctggtttc aaacccgctg gctggatttg tttaggggtt ttgcctcttt tgatccgcag 5580

tgatcatacc ttaggacttg acaacgacag gagccccgaa gcacatgcaa agaaactcgc 5640

tatgaaccac gctcttgagc accaaatttt cgttaaagcc actgctaagc acaaggaaat 5700

ctgccgagag ttaggttgca ctgaagatcc caaatttatc tgggagcaca gttacattgc 5760

tgcagacaag ttcctgcagc tgtgcccgcc ttctcttgag ttcagcagag accatctgcc 5820

tagcaacttc aaattcgccg gctcaacgcc caagcaccga actcaattca cccctccttc 5880

ctggtggggg gatgttctga gtgccaagcg agtcatcatg gtcactcaag gaacttttgc 5940

tgtcagttac aagcatctta ttgtgcctac tcttgaggcc ttgaaggacg agcctgacac 6000

tttaacagta gccatattgg gccgccgcgg tgccaagcta ccggatgatg ttgtggttcc 6060

tgagaatgct cgcgtgatcg actacttcaa ctacgatgct ctacttcctc acgttgatgc 6120

tcttgtctac aatggtggat atggcggact tcagcacagc ttaagccact ctgttccagt 6180

tgttattgct ggtgactctg aagacaagcc aatggtggca tcgagagctg aggccgctgg 6240

cgtggcaatt gatttgaaaa ctggcttgcc tacagtggag caaatcaaag aagctgttga 6300

ttcgataatt ggaaatccga aattccacga agcctcgaag aaggttcaaa tggagttgga 6360

aagccacaac tccttgaaaa ttcttgagga aagcatcgag gaaatcgcca gccatgactt 6420

tggtcttttg accaagagtg acgaggaaac tgaagatata cctgtcaaag ggccggcctt 6480

agcggtgagt tcttagaatc gtacgatcaa atcagatcag ggaagagagg tagggttttt 6540

tttatttatg tctttgtttt tattgattga aatttacaat acaacaacca tcaaattaat 6600

ttgaacaaac aacaacacac acacacactg caactttcaa aaaaataagt aaaaggaaga 6660

gaggagtttg ccaatatatt taccttcttc taattctgtt atttttttta attgttttgt 6720

ggaaagaaag aagaaaaggc tgtcatgaat ttagtttacc tagaccttct ggttagcggt 6780

attgacgttc atttcaactg gaagaaggaa ttccagttcc tctccttcag cctcgtcggg 6840

atcctcctct ggaatatgct tgaggattcg cgcagggact cctcccacca cagtacgagg 6900

aggaacatct tctcgaacga cagcaccagc cgcaattgtt gagccatctc caatcgtaac 6960

acccggcagg acagtcacat tcgcaccaat ccatacatta ttccccacct tgataggaag 7020

agcatacaca attctcctcg cacgtttctc ggggctaata ggatgagtcg cagtcacgaa 7080

cgttgtattg ggccctacaa tcacctcatc accaaagatt attggagccg agtccaagaa 7140

gcaaacgttg aagttggcgt aaaagtgctc gcctacgctg atgttgaatc caaaatcaac 7200

tgagaatgga gcggtcagcc agacaatatc ctttgtttga ccaaaagtgt ctttgagaat 7260

ctcgaccttc ttgatataag cagcgtgatt tgactcaaaa gtacgacttt cacttgcaat 7320

ggtattgaac tccctaactt tctcactagt agccagggct ctaaacataa gatctggatc 7380

gtatggattg taaggaactc ctgagaccat cttctcatag ttttcattgc caggggtgtt 7440

tttgaggttt tttttggccc aagagaccat ttcctggtca atttcttttc taggagtcat 7500

tcctttgttt tgagggtcct tcgaggagtt tacaaccatt gaattctaga atgtgaggtg 7560

gaatgaggca aggaaggagg aacgtattga gttgtacctt aagatatctc aaagtgctta 7620

tctccgacta ccggaatatg ctccgggtaa tgcaagtcag tgtgcatatg ggtaaggtga 7680

tgcaagctaa ccctcagggc atatctaatt cgcgtgaggg ttattattgg tctacattac 7740

ctcagtcata gcccgtcaaa gcaaaagccc aaaatcagca cgaaatccca gagatagatt 7800

gttgctgtct cttcaagtac tacgacagtt ccctatatct acagattatc gtcacgagtg 7860

aattatgcag gataggtgac tcaggggtca taatcagagg aatccaatgt gctatttcaa 7920

ttaacgagtc cctttaatca gacaatgtat ggtgactcag gggccataac tagagaaatt 7980

cgatatgcta tttcaattaa tgagtgcctt taatcaaata atgtatgcaa gcagtggcca 8040

aaaataaatg aacgtcaaat ctctccgaga ccttgcaagt tcaccaattc agcgtaccat 8100

ccattgagtt caaggaggct ctgatggtcg ccctgctcca cgatgcgccc tcctgagaac 8160

acatatatga catctgcttt ctgaattgtt gataatctat gcgcaacggc gattgtagta 8220

cggcccttcg ctgctgcgtc gagtgctgct tgaactactt tctcagattc ggaatccaga 8280

gctgaggtgg cctcatcgag gaggagtacc tttggatttc tgatcagggc ccttgcaatt 8340

gcaattcgct gcttttgccc cccagatagc aacgatcccc tagatccgct gagcgtttcg 8400

tagccatcag gcaacgacat gatgaattcg tgaatgttcg ctttgcgagc ggcatcctca 8460

atcatctcct gcgttacttc agactcaggg ccagaccatc ccattagaat attctcacgt 8520

agcgtgcctg aataaagcat tggttcttgc tggactaaag caatgtgtga tctcaatgca 8580

ttcaggttat attcgcgtaa atctttccca tcgaaaagta cttgacctgc taatggatca 8640

taaaatcttt ccaccagtcc aatagtagta gacttaccgc atccactggc tccaactaga 8700

gcgatgtatt ggcccttttt gactgttaag ttgagatctt gtaaaactgg tacttgaggt 8760

cgagtaggat atcggaaatt cacatgacgg aactcaatat ctcctctcac cgactcctcg 8820

ggagcaacgt aaccttcctc actccataca tctatagaag gagtggcagt caagattctg 8880

taaatgttac gcgctgcatc tttggctgag ttcatgtttg gagcatagct gaaaatttgg 8940

ccagcggctt gagaacctgt aataatagcc atgaagacag tcatatatcc tgcgaccgaa 9000

gcttcacctc gtctcattac agtgcttccc caccaaaaaa cgagggctac cacccagggt 9060

gtcattcctt ccgagagtgc gtagtacaat gctgagcggg caatggcaat tctggagctg 9120

aaaatctgag agtctactgt ctttgtgtat tttacgacca cgtctaactc acgagttaag 9180

gactggactg tgcggacagc acttgtatac tcagatgcca tggagccact tcgttcgtaa 9240

acttctctcg cacgatccga taattgggta agaacccaga ctctgacgaa gccacacacc 9300

aacatgacag gaacaacaga cgtagccacg agtccaattc tccaattgaa aggtatacca 9360

gtaactatgc cgccaatcaa ggtcaccaga ctctgttgaa tttgaccgag ggtggcccca 9420

ctcaaaccct cgatcatttt agcttccttc gccaaaattg aggttagcgc acccggcgtg 9480

ttgtttttgt ggtcgaagaa tgcaatatcc attcgcatca attggcggaa caaagctaat 9540

ctgatatttt tgaccaactt atcagatgca agtgataaag cagctatagt gataaaagcc 9600

gtcatgaatg aaatgcagcc tacgaaaaaa taccaccatc ccatgatatt caccacatgc 9660

cgcatttttc cgtattcact gggaggtaga accatgcttc cagtggtttg gccagttatt 9720

attgccattg caggatagca atagcccaaa ataatggagg ctaaactacc aatgagaatg 9780

taaccccatt ctttcctatt cagcccccaa accagtttgg tattggtcat caacgtgcta 9840

tgtggggggt tgcgcacacc agggatgtca ttttcttgat attcaggagg ttgagtggtc 9900

tgagtacctg cactgtgaac actcaatgtg ctcacatcct tgggattgaa cttttcgttc 9960

agtgagtcca gaggcgaaat gtctagagct tcaatatcga ggacctcaac gttagtgctc 10020

tttgctttag ttactctttg agcatcaacc aaagctttat aaggcccttc tcgctgtatg 10080

agctcattgt gagtaccctg ctctatgacg ttacctttag acatgacaac tatcttgttg 10140

gcatccttga tcgtagagag tctgtgtgca acgactatag tggtacgacc ttcggccgct 10200

ttgtcgagcg catcttgaac gataccttca gatttggtat ccagagcaga agtcgcttca 10260

tcgagcagca gaattttagg gtctgagacg attgctcttg ctattgcaat gcgttgtttc 10320

tgaccaccgc tgagaagaaa tcctcgatct ccaacattgg tttggatgcc ttctgagaga 10380

gtctgaatga aatcccaggc attggcatct ttacaagctt gaatgatttt agcttcctta 10440

acatgctcgt cagcgaactc aatgtcagtg ccaatcaaac catagctgat attctcatat 10500

attgactctg aaaagagtac tggttcctgc tgaacataac caatttgttg acggagccat 10560

cttgtgttca ggtcgctaat ctcctggcca tccagagtaa cgcttccttc gagaggtaaa 10620

tagaacctct caagaatacc tacaattgta gacttccctg atcccgaggc acctaccagt 10680

gccacagtag atccagcagg aacttcaagg ctaaaatcgg agaggaccaa aacgtctggg 10740

cgactaggat atcggaactt gacatttttg agctcaattc tgccaacggc cttagtttgg 10800

gggacaattc ctttatctat ggactggcca tcgatgactg ggacacgatc aatggcctca 10860

ttgagaatgc tcgcggcagt gagacccttg acaagaaacc tcacgtttgg cgcgatattc 10920

ccaagctgga agcttccaag taacatagct gtgattacaa ctattatctt tccaacgtca 10980

gcactcccac taacgatttc tctggaaccc tgccacagag ctaaggcata cacccaaaaa 11040

gtactagccc atatgcacgc taacatgacc cccaatgagt aactgctccg cttcgattcc 11100

ttcacaacac gatcaagtac cttttcatac ttgacggcga gatgaggttg agcgccaaat 11160

gctactgtag tcctgacagc actgagagcc tcctccgcaa cggtagctcc agactgcgaa 11220

tatatcgcgt cagatctgag ctgatatttg gccatgaagg tggcgccagt tcccattgtg 11280

attaccatga accctacagc actcaggagg atgcaagcca gtttccattg cgaagcaaaa 11340

cttataacgg tggccgcaat gaaggaagct attccctgta cgacgtttcc aagcttgtcg 11400

ctgatcgctt cctgaattga gttggtatcg ttaatgattc tggtgctgac ctcgccacca 11460

cctagtttgt cgtaaaacgc gatattctgg cgaataacag cactcagata atgctttcgg 11520

taacgtcctg ccaacacttc gcctctgtcc acaagcagga agctctcgag aaacgcactg 11580

ccgagcatac caatgccaat atagacaaaa tagagagaca ggtgattcac cttatgctgg 11640

aactcattgc ccttgaggtc atatgaagtg aagtctctga atgtgttgaa gatggcgccc 11700

actactaacg tgaacattgg aagcgcggct ccatgcaccg ctgcaaaaaa aagcgcaagt 11760

atctccaaga aaacgtcaag gggagtgcaa aatctgaaca acctgaaaaa gcttgtggcg 11820

actctctttg tttcaagctg acttcgcaat acattggcct catgtggatc taacgcagag 11880

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atatcatcca ccataagcca aaatcagaga gtgggacctg attcagaatc acacggaccc 12000

gtatatataa caatcacttt ccaacaatat agcgagtatt aatatatttc cgggtaaggg 12060

ttgttccgga cttatgcatt taatcacagg ttgcatcagc taaatatgtc agggccgacg 12120

gcgtaaattt agaaggttag gtcaagatcc atcggtcagg ccaatggagc tctactatga 12180

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gattctcact cagtggatgt ggcgacacac ggaaccaata atctcgccgg aaaggcggct 12300

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tacattcggg gcaagttaaa tccagcatta tataaacttg attgacacaa atgggcataa 12420

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<210> 2

<211> 1617

<212> DNA

<213> 假丝酵母菌

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<210> 3

<211> 1392

<212> DNA

<213> 假丝酵母菌

<400> 3

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 假丝酵母菌

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attggtatgc tcggcagtgc gtttctcgag agcttcctgc ttgtggacag aggcgaagtg 420

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gcagcgaagg gccgtactac aatcgccgtt gcgcatagat tatcaacaat tcagaaagca 3780

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cttgaactca atggatggta cgctgaattg gtgaacttgc aaggtctcgg agagatttga 3900

<210> 6

<211> 1299

<212> DNA

<213> 假丝酵母菌

<400> 6

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cagtacgatg cacttcaaac tgctctaaaa caggttgagg ctgaaaataa atcagctgtg 360

gtgattggcg agaccatgtt tctaggggtg catccgatat cactgggtgc cccaggtctc 420

aagccccaag gcgtaatcac gttaggaact attccgtgca tgctgaaagc agagaaggcg 480

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<210> 7

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<212> PRT

<213> 假丝酵母菌

<400> 7

Met Leu Ile Lys Asp Ile Ile Leu Thr Pro Met Ser Leu Ser Ala Val

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Ala Gly Leu Leu Pro Leu Leu Phe Val Ala Phe Leu Val Leu His Glu

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Pro Ile Trp Leu Leu Trp Tyr Arg Tyr Ala Ala Arg Arg His Lys Cys

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Ser Met Pro Arg Phe Ile Glu Lys Ser Phe Pro Leu Gly Ile Gln Arg

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Gln Tyr Asp Arg Val Phe Asn Lys Phe Lys Ala Arg Thr Tyr Leu Arg

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Gln Ala Pro Leu Gln Tyr Gln Ile Phe Thr Ile Glu Pro Glu Asn Ile

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Lys Thr Ile Leu Ala Thr Lys Phe Asn Asp Phe Gly Leu Gly Ala Arg

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Gly Asn Gly Trp Lys Gln Ser Arg Ser Met Leu Arg Pro Gln Phe Thr

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210 215 220

Ile Val Ala Arg Asp Gly Ser Glu Ile Thr Ala Glu Gln Phe Val Glu

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Ser Tyr Asn Phe Leu Leu Asn Tyr Ala Phe Lys Arg Thr Leu Ser Ser

245 250 255

Lys Val Tyr Trp Leu Phe Asn Ser Lys Glu Phe Arg Asp His Lys Lys

260 265 270

Arg Ala Gln Ser Tyr Ile Asp Tyr Tyr Val Asp Lys Ala Leu Tyr Ala

275 280 285

Thr Ser Phe Ala Ala Glu Asn Ser Ile Ala Glu Lys Asp Ala Ala Ala

290 295 300

Glu Ser Ser Gly Ile Tyr Val Phe Ser Leu Glu Met Ala Lys Val Thr

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Arg Asp Pro Val Thr Ile Arg Asp Gln Ile Phe Asn Ile Leu Ile Ala

325 330 335

Gly Arg Asp Thr Thr Ala Ala Thr Leu Ser Phe Ala Ile His Phe Leu

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Ala Arg Asn Pro Asp Val Phe Asn Lys Leu Arg Glu Glu Val Leu Asp

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His Phe Gly Thr Lys Glu Glu Gln Arg Pro Leu Ser Phe Glu Leu Leu

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Ala Pro Val Leu Pro Leu Asn Phe Arg Thr Ala Val Arg Asp Thr Thr

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Asn Leu Lys Leu Asp Asn Val Trp Ala Phe Leu Pro Phe Asn Gly Gly

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515 520 525

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530 535

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<212> PRT

<213> 假丝酵母菌

<400> 8

Met Ser Pro Ser Ser His Lys Pro Leu Ile Leu Ala Cys Gly Leu Pro

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Leu Ser Gly His Ile Met Pro Val Leu Ser Leu Val His Gly Leu Thr

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Asp Asp Gly Tyr Glu Ala Thr Val Val Thr Gly Arg Ala Phe Glu Gln

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Lys Val Arg Asp Val Gly Ala Asp Phe Val Pro Leu Glu Gly Asn Ala

50 55 60

Asp Phe Asp Asp His Thr Leu Asp Asp Leu Val Pro Gly Arg Lys Asp

65 70 75 80

Met Ala Pro Ser Phe Asp Arg Thr Val Gln Asp Val Glu His Met Met

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His Thr Leu Gly Leu Asp Asn Asp Arg Ser Pro Glu Ala His Ala Lys

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Thr Ala Lys His Lys Glu Ile Cys Arg Glu Leu Gly Cys Thr Glu Asp

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Asn Phe Lys Phe Ala Gly Ser Thr Pro Lys His Arg Thr Gln Phe Thr

245 250 255

Pro Pro Ser Trp Trp Gly Asp Val Leu Ser Ala Lys Arg Val Ile Met

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Val Thr Gln Gly Thr Phe Ala Val Ser Tyr Lys His Leu Ile Val Pro

275 280 285

Thr Leu Glu Ala Leu Lys Asp Glu Pro Asp Thr Leu Thr Val Ala Ile

290 295 300

Leu Gly Arg Arg Gly Ala Lys Leu Pro Asp Asp Val Val Val Pro Glu

305 310 315 320

Asn Ala Arg Val Ile Asp Tyr Phe Asn Tyr Asp Ala Leu Leu Pro His

325 330 335

Val Asp Ala Leu Val Tyr Asn Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gln His Ser

340 345 350

Leu Ser His Ser Val Pro Val Val Ile Ala Gly Asp Ser Glu Asp Lys

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Pro Met Val Ala Ser Arg Ala Glu Ala Ala Gly Val Ala Ile Asp Leu

370 375 380

Lys Thr Gly Leu Pro Thr Val Glu Gln Ile Lys Glu Ala Val Asp Ser

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Ile Ile Gly Asn Pro Lys Phe His Glu Ala Ser Lys Lys Val Gln Met

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Glu Leu Glu Ser His Asn Ser Leu Lys Ile Leu Glu Glu Ser Ile Glu

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Glu Ile Ala Ser His Asp Phe Gly Leu Leu Thr Lys Ser Asp Glu Glu

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450 455 460

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<212> PRT

<213> 假丝酵母菌

<400> 9

Met Val Val Asn Ser Ser Lys Asp Pro Gln Asn Lys Gly Met Thr Pro

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Arg Lys Glu Ile Asp Gln Glu Met Val Ser Trp Ala Lys Lys Asn Leu

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Pro Tyr Asn Pro Tyr Asp Pro Asp Leu Met Phe Arg Ala Leu Ala Thr

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Asp Thr Phe Gly Gln Thr Lys Asp Ile Val Trp Leu Thr Ala Pro Phe

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Ser Val Asp Phe Gly Phe Asn Ile Ser Val Gly Glu His Phe Tyr Ala

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Asn Phe Asn Val Cys Phe Leu Asp Ser Ala Pro Ile Ile Phe Gly Asp

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Ile Ser Pro Glu Lys Arg Ala Arg Arg Ile Val Tyr Ala Leu Pro Ile

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Gln Lys Val

<210> 10

<211> 1299

<212> PRT

<213> 假丝酵母菌

<400> 10

Met Val Asp Asp Ile Gln Val Glu Lys Arg Glu Lys Leu Ile Glu Thr

1 5 10 15

Lys Asp Lys Leu Leu Glu Glu Lys Leu Ser Ala Leu Asp Pro His Glu

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Ala Asn Val Leu Arg Ser Gln Leu Glu Thr Lys Arg Val Ala Thr Ser

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Ile Leu Ala Leu Phe Phe Ala Ala Val His Gly Ala Ala Leu Pro Met

65 70 75 80

Phe Thr Leu Val Val Gly Ala Ile Phe Asn Thr Phe Arg Asp Phe Thr

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Tyr Asp Lys Leu Gly Gly Gly Glu Val Ser Thr Arg Ile Ile Asn Asp

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180 185 190

Gln Gly Ile Ala Ser Phe Ile Ala Ala Thr Val Ile Ser Phe Ala Ser

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Ile Leu Ala Lys Glu Ala Lys Met Ile Glu Gly Leu Ser Gly Ala Thr

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Ile Ala Ile Ala Arg Ala Leu Ile Arg Asn Pro Lys Val Leu Leu

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Leu Asp Glu Ala Thr Ser Ala Leu Asp Ser Glu Ser Glu Lys Val

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Gln Gly Leu Gly Glu Ile

1295

<210> 11

<211> 432

<212> PRT

<213> 假丝酵母菌

<400> 11

Met Ala Ile Glu Lys Pro Val Ile Val Ala Cys Ala Cys Pro Leu Ala

1 5 10 15

Gly His Val Gly Pro Val Leu Ser Leu Val Arg Gly Leu Leu Asn Arg

20 25 30

Gly Tyr Glu Val Thr Phe Val Thr Gly Asn Ala Phe Lys Glu Lys Val

35 40 45

Ile Glu Ala Gly Cys Thr Phe Val Pro Leu Gln Gly Arg Ala Asp Tyr

50 55 60

His Glu Tyr Asn Leu Pro Glu Ile Ala Pro Gly Leu Leu Thr Ile Pro

65 70 75 80

Pro Gly Leu Glu Gln Thr Gly Tyr Ser Met Asn Glu Ile Phe Val Lys

85 90 95

Ala Ile Pro Glu Gln Tyr Asp Ala Leu Gln Thr Ala Leu Lys Gln Val

100 105 110

Glu Ala Glu Asn Lys Ser Ala Val Val Ile Gly Glu Thr Met Phe Leu

115 120 125

Gly Val His Pro Ile Ser Leu Gly Ala Pro Gly Leu Lys Pro Gln Gly

130 135 140

Val Ile Thr Leu Gly Thr Ile Pro Cys Met Leu Lys Ala Glu Lys Ala

145 150 155 160

Pro Gly Val Pro Ser Leu Glu Pro Met Ile Asp Thr Leu Val Arg Gln

165 170 175

Gln Val Phe Gln Pro Gly Thr Asp Ser Glu Lys Glu Ile Met Lys Thr

180 185 190

Leu Gly Ala Thr Lys Glu Pro Glu Phe Leu Leu Glu Asn Ile Tyr Ser

195 200 205

Ser Pro Asp Arg Phe Leu Gln Leu Cys Pro Pro Ser Leu Glu Phe His

210 215 220

Leu Thr Ser Pro Pro Pro Gly Phe Ser Phe Ala Gly Ser Ala Pro His

225 230 235 240

Val Lys Ser Ala Gly Leu Ala Thr Pro Pro His Leu Pro Ser Trp Trp

245 250 255

Pro Asp Val Leu Ser Ala Lys Arg Leu Ile Val Val Thr Gln Gly Thr

260 265 270

Ala Ala Ile Asn Tyr Glu Asp Leu Leu Ile Pro Ala Leu Gln Ala Phe

275 280 285

Ala Asp Glu Glu Asp Thr Leu Val Val Gly Ile Leu Gly Val Lys Gly

290 295 300

Ala Ser Leu Pro Asp Ser Val Lys Val Pro Ala Asn Ala Arg Ile Val

305 310 315 320

Asp Tyr Phe Pro Tyr Asp Glu Leu Leu Pro His Ala Ser Val Phe Ile

325 330 335

Tyr Asn Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gln His Ser Leu Ser His Gly Val

340 345 350

Pro Val Ile Ile Gly Gly Gly Met Leu Val Asp Lys Pro Ala Val Ala

355 360 365

Ser Arg Ala Val Trp Ala Gly Val Gly Tyr Asp Leu Gln Thr Leu Gln

370 375 380

Ala Thr Ser Glu Leu Val Ser Thr Ala Val Lys Glu Val Leu Ala Thr

385 390 395 400

Pro Ser Tyr His Glu Lys Ala Met Ala Val Lys Lys Glu Leu Glu Lys

405 410 415

Tyr Lys Ser Leu Asp Ile Leu Glu Ser Ala Ile Ser Glu Leu Ala Ser

420 425 430

<210> 12

<211> 4143

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 整合构建体

<400> 12

aattgttcga tggatagctt tggagtctgt cccatcatga tacgaaaagc gtgaagctcc 60

tctgacaatc aaaactttgt ttcaatgggg tgtaggatgg accccggatc caaacgaccg 120

cgagtcaaaa aacctacggg tgcatttacc cgtagttgat ctggaaagtc gagatcaact 180

ttttgtagtt tagttacatt catttcacgg tcgaaaaact cacacacaac gattgcagta 240

tatttaccaa aatcgtctga agagaagcat ctgattgaga gttcaccatg acgaatccca 300

taaacgacta ctccactgga cacaccgaca gacgccctgg ggatagtgaa actgaatttg 360

tcggtataat ggcccgtctc acaggccggg cagaacactt tcatgtcctt tcgcaggtct 420

cgacattgga caagtatgtt gtcgtgggtg acgacaaatt ggtcctcatc cttgaataag 480

atgctccctt tgttctcagg aactggcacc attccattat gggcgaataa tttctgctca 540

tcttcgggac tgatgccata ttcttctaac agaagacggc gctcacatgg gacctggtgc 600

tctcgccggc ctctcaaatc gccggtgcat ctccacacgc aaattcacgg gtgtataccc 660

ctgatcaaac gtatcttgcg cgttctgtta ttcattggag cgagggcccg atcctgtcct 720

atcaaatgat ttcatgtggg aataatccat caattgttct ggattgaggt atacttcgag 780

ctgtaaagat gtcgcttcta tgtcaagaat agtcggttaa acgcactcct tcaagattta 840

catgatttac atgattcttc ataaagagca taaataaaga actgcagcca ttcttgagta 900

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attaaggagg gaacgtttct tccatgggag gctaagaaac ttaataactt cgtataatgt 1020

atgctatacg aagttattaa ttaactgacg ggcggatagt acaggctttg ccaaaagcct 1080

ataaggctaa agaaagtaaa caagtgaggt tgaaccatga tggcagtgtt cgaattctga 1140

tcaatgaagt acactgcgaa gggaatcccc gaaacggcga acaaaaagaa catcagagga 1200

ggaacgccct cgcaatcccg aacataccag tttcgcagaa cctggggtat caactggatg 1260

caccagcata ctgttcccac tgttgccaat gctgtagacg ctccattgtt gtcagtcatt 1320

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<210> 13

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<212> DNA

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<220>

<223> 整合构建体

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tcaatcccta tcctctagaa ggcaaatatc tcgatgctga agacagggcg aagttggacg 2820

cgctgccaga gattgagcga gaagagatct tgtatgaccg agctcaggag atgcagcggt 2880

acgaggagag aaggtatctt gctcagcgaa ggaagcagat gacgcgggtt gctgacgagg 2940

acgaagcccc ctccgccaag cgtcaacggg gtacaacagg cgtctcttcg ggtacgaagt 3000

catctcttga ggcattaaag aaacgaaggg cccagcagtc tcggaagtcc tcacgccatg 3060

gagttgatga cgatgtgtat agtgacgatg atgttaatta ataacttcgt ataatgtatg 3120

ctatacgaag ttataagcca aaatcagaga gtgggacctg attcagaatc acacggaccc 3180

gtatatataa caatcacttt ccaacaatat agcgagtatt aatatatttc cgggtaaggg 3240

ttgttccgga cttatgcatt taatcacagg ttgcatcagc taaatatgtc agggccgacg 3300

gcgtaaattt agaaggttag gtcaagatcc atcggtcagg ccaatggagc tctactatga 3360

taggcagctg aagcgagaca agatatactt cagttgcgct ctctgaaaaa attattttgt 3420

gattctcact cagtggatgt ggcgacacac ggaaccaata atctcgccgg aaaggcggct 3480

gaacatcagt cttgcataag tgtgcaagtg gcctgagcac agcgtgcatt acccttacca 3540

tacattcggg gcaagttaaa tccagcatta tataaacttg attgacacaa atgggcataa 3600

aacaataaag tctcctatat ggccatcgag aaaccagtga tagttgcttg tgcctgccca 3660

ctagcggggc acgtgggccc agtgctcagc ctggtccgcg gtctactcaa tagaggatat 3720

gaggtgactt tcgtaacagg gaacgcattc aaggagaaag ttattgaggc aggatgcact 3780

ttcgtccctc tccaaggacg agctgactac catgaataca atctccctga aatcgctcca 3840

ggattgctca cgattcctcc aggccttgag cagaccggtt actcaatgaa tgagattttt 3900

gtgaaggcga ttcctgagca gtacgatgca cttcaaactg ctctaaaaca ggttgaggct 3960

gaaaataaat cagctgtggt gattggcgag accatgtttc taggggtgca tccgatatca 4020

ctgggtgccc caggtctcaa gccccaaggc gtaatcacgt taggaactat tccgtgcatg 4080

ctgaaagcag agaaggcgcc tggagttcct agtcttgagc caatgattga 4130

<210> 16

<211> 4141

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 整合构建体

<400> 16

attctggtgc tgacctcgcc accacctagt ttgtcgtaaa acgcgatatt ctggcgaata 60

acagcactca gataatgctt tcggtaacgt cctgccaaca cttcgcctct gtccacaagc 120

aggaagctct cgagaaacgc actgccgagc ataccaatgc caatatagac aaaatagaga 180

gacaggtgat tcaccttatg ctggaactca ttgcccttga ggtcatatga agtgaagtct 240

ctgaatgtgt tgaagatggc gcccactact aacgtgaaca ttggaagcgc ggctccatgc 300

accgctgcaa aaaaaagcgc aagtatctcc aagaaaacgt caaggggagt gcaaaatctg 360

aacaacctga aaaagcttgt ggcgactctc tttgtttcaa gctgacttcg caatacattg 420

gcctcatgtg gatctaacgc agagagcttc tcctcgagaa gcttgtcctt agtctcgatg 480

agtttctcac gcttctctac ctgtatatca tccaccataa gccaaaatca gagagtggga 540

cctgattcag aatcacacgg acccgtatat ataacaatca ctttccaaca atatagcgag 600

tattaatata tttccgggta agggttgttc cggacttatg catttaatca caggttgcat 660

cagctaaata tgtcagggcc gacggcgtaa atttagaagg ttaggtcaag atccatcggt 720

caggccaatg gagctctact atgataggca gctgaagcga gacaagatat acttcagttg 780

cgctctctga aaaaattatt ttgtgattct cactcagtgg atgtggcgac acacggaacc 840

aataatctcg ccggaaaggc ggctgaacat cagtcttgca taagtgtgca agtggcctga 900

gcacagcgtg cattaccctt accatacatt cggggcaagt taaatccagc attatataaa 960

cttgattgac acaaatgggc ataaaacaat aaagtctcct atataacttc gtataatgta 1020

tgctatacga agttattaat taactgacgg gcggatagta caggctttgc caaaagccta 1080

taaggctaaa gaaagtaaac aagtgaggtt gaaccatgat ggcagtgttc gaattctgat 1140

caatgaagta cactgcgaag ggaatccccg aaacggcgaa caaaaagaac atcagaggag 1200

gaacgccctc gcaatcccga acataccagt ttcgcagaac ctggggtatc aactggatgc 1260

accagcatac tgttcccact gttgccaatg ctgtagacgc tccattgttg tcagtcattt 1320

tagcatttta cagtaaccaa ctccaaaaaa cagcccgctc tgctgggaag acttcgcaat 1380

tatttatcca ctactgctgc ggttatatac ttctcgatct cagtctcggt tataattgcc 1440

gcttgacagc ctggagaaat tcggatactc cacgtgataa ttgccatagg gcataatttt 1500

cgaaacagct cgcaacgatc tcggctagtt ttcccctttt ttgacccata tcgacgctga 1560

gactcactca cttgatgcct accgttaggg taaatttttc aagcctgcag aatatcgcgg 1620

gacgcagtct cctgcacgcg cgtgacttca tcttacttac atcaaacagc ccgattaatt 1680

tgaaaagtcc tagctgatcg agggcacggg cactactgta gagaaataat atgaagctga 1740

gctatgagga gcgccgagag aggctgccgg ctgtagcagc ccggctattc gacatcattg 1800

tgagcaagca aacaaatctt tgcgcaagct tggatgtgcg aactacctct gagttactga 1860

gtatcctgga ccgcattgga ccttacattt gtatggttaa gacccacatt gacataattg 1920

acgacttcga atacgacaca actgtcagcg gtttgaaaca gctttcaacg aagcacaatt 1980

ttctcatttt tgaagaccga aagttcgcag acatcggttc cactgttaag gcccaatatg 2040

caggtggagt gtttaagatc gctcaatggg ctgatataac aaatgctcac ggtgttcctg 2100

ggccgggaat tgtgagcgga ctagaagagg ctgcgaagga aactacggat gaacctcgcg 2160

gccttgtcat gcttgcagaa ctgagttcga agggcacact ggctcacggc gaatactcgc 2220

aagcgacagt agacatcgct cgcagtaacc gcgcatttgt gtttggtttc atcgctcagc 2280

aaaaagtcgg aaagccagag gaagactggg tcattatgac tcctggggtg ggcctggacg 2340

acaaaggtga tggattgggg cagcagtatc gtactgtgga cgacgtcata gagaccggca 2400

cagacgttat tatcgtcgga cgcgggctct atagcaaggg acgagatcct gtgcacgaag 2460

ctcagcgtta ccaaaaggcg ggctggaatg catatctgag aaaagttcag tcaagatgat 2520

tttctcaaac agttccttca atgcaacttg cacatgaata cctataaaat ctgattaaat 2580

taccataaaa ggtacagatt aaaatatata tgccttcaat ggcatccttc gcgattctga 2640

ttcgtcagca cacttcaacc ttcctactat gagtgacagt gatgatgatc tgctggcatt 2700

ggccgacgtt ggctccgact ccgaagagga aatctcgctg ccgtcgccgc caagcaatga 2760

ggtcgtcaat ccctatcctc tagaaggcaa atatctcgat gctgaagaca gggcgaagtt 2820

ggacgcgctg ccagagattg agcgagaaga gatcttgtat gaccgagctc aggagatgca 2880

gcggtacgag gagagaaggt atcttgctca gcgaaggaag cagatgacgc gggttgctga 2940

cgaggacgaa gccccctccg ccaagcgtca acggggtaca acaggcgtct cttcgggtac 3000

gaagtcatct cttgaggcat taaagaaacg aagggcccag cagtctcgga agtcctcacg 3060

ccatggagtt gatgacgatg tgtatagtga cgatgatgtt aattaataac ttcgtataat 3120

gtatgctata cgaagttatt aacctggctc tttttctaga tatgtctgcg ccctgctcac 3180

tgcttactgg cctaagctgg tattacggac cttaatcaag tatcacccca aggcaatcga 3240

gagtcttatc gagtctctag gtagatagat acacgttttg atttttcggc ccactttgta 3300

gaaaaatctc agtgatttca tggaattcag ttacaaatac taatctgata aaccaagaac 3360

tacactcggt gttgagagca gaattaaagg gacttggcgt ctagcacaaa acgatacttg 3420

acgtcaccac tgtgaacgcg cttccaagct tcggcgatat agctgtactc aatcagctca 3480

acatcacagg tgatgttatt ttcaccacag aagtccagca tctcctgagt ctctggcaag 3540

ccaccaatgt ttgagtaagt gatagattta tttccagcca aatgagaggt cagaaccttg 3600

aggggtccaa tttgaccaac aacaacgaga cacccaccaa tatcaaggga cttgaggtat 3660

ggctcgaagt cgtgttcaaa gggaatggtg tcgatgatca ggtcaaatgt gccagcgacc 3720

gcctcgagct cattcggatc agaggaagca actacgcggc tagcaccttg tgctttcgct 3780

cctgcggctt tggcgtgact cctgctgaac agtgtgactt cagagcccat ggctgaggca 3840

aatttgatag ccatggaacc aaggcctccg agaccaacta caccgactct ttttccaggt 3900

ccggcgccgt gagccctcag aggagagtag gtagtgatac cagcacagag aaggggcgca 3960

gaagctgcca agtcgaggtt ggaggggatt ttgagcacaa actcctcgcg agcaagaatg 4020

tgttgcgaat accctccctt cgtgacttcc ccgttctttc cgctggaatt gtaagtttga 4080

gtgcgtgaaa cacaccaatt ttctttgcct aatttacagt tcttgcaagt acgacatgag 4140

t 4141

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 17

aattgttcga tggatagctt tggagtc 27

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 18

ttcggggctc ctgtcgttgt c 21

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 19

gaaatctgat caattctgca aacctg 26

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 20

atgactccta gaaaagaaat tgaccag 27

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 21

tgcagacaag ttcctgcagc tg 22

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 22

atgctttatt caggcacgct acg 23

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 23

ggatgagtcg cagtcacgaa c 21

<210> 24

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 24

tcaatcattg gctcaagact aggaac 26

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 25

attctggtgc tgacctcgcc ac 22

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 26

actcatgtcg tacttgcaag aactg 25

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 27

gtgtcgactc gccaaattcc atcggag 27

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 28

ggttcatagc gagtttcttt gcatgtgc 28

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 29

ctcctttatt aactccgcag catgactg 28

<210> 30

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 30

ctcctcgaag gaccctcaaa acaaagg 27

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 31

caaatttatc tgggagcaca gttacattgc 30

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 32

cacacattgc tttagtccag caagaacc 28

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 33

attctcctcg cacgtttctc ggggc 25

<210> 34

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 34

ggttgaaata cttgttgccg cactaaag 28

<210> 35

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 35

cgcttcctga attgagttgg tatcgttaat g 31

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 36

gacattgttg gaattggctg cttagtgg 28

<210> 37

<211> 3107

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 表达盒

<400> 37

acaaacgacc ccgccccacc cctcacacgg ccttaccagc ccaggaagca atggcccgaa 60

cctcgtgggc taccgcactc cgtttggaaa cccaatagga actgcagcag cagggaactc 120

agctgctact ccagctggaa accctctagg gaaggtaaga gcagactctt caacgagcct 180

tactactcag ggacagcgaa gggtccgcgt gcatgtccag ggcgacacat ttctcatttt 240

ggtgccaccg gacctgaagt ttgagcatct ttccaatcgt gttgagcgca agctccgact 300

atgtgggaaa atgccgcctt caggccaggc aggctcactc atttttgaat acatggatga 360

agacgaggac cgcgtgcgac tggagagcga cgaggaccta agtgtggcgt ttgaggctgt 420

gcccgaccac catgagctgt ccgtctacgt caaaaactga cgattatgat ctaatgatat 480

ttaaaagata tgtaaaacgg ttattttttg gacctgcgcc ctaaaatggg actttgtcaa 540

aaaaagaacg gcctcctgcg cgatggagag caatcaagaa ttcggagttc cgatgcgaat 600

ccatcaagaa aacggcccct aggcaatcta aaaccgtggc cgacatacta taagtcaatt 660

ccgctgtaca aataacaagc gatcaatcca taatctgagg ctcatttcat acggactttt 720

ctaagttcac ataattctat gatgcatact aacaaatacg atgcacaaat gggtacaagg 780

cctaaagagg gccacaatcg cgatttactc gatacggcaa atcagttcca caagtaattc 840

gctatcgtcg gtgttgttat acacctctcg gcttgagtca atatcgagca tgcaaggttg 900

acgcattctg gggaaatgta tccacgtgat cgccgatatc ggagcggata cgctgtgtag 960

tcttcagttg taagatttct tatacagcga cgcaaccatc atgtctgtgc aaacgaaaac 1020

aattgttctt cttcctggag accactgtgg cccagaagtc gttgccgaag cagtgaaagt 1080

actcaaagcc gtggaaactg ctttaccatc ggttaccttc gagtttcagc accatttgat 1140

tggcggtgct gccatagatg ctgctggtgt tcccattacg gaagagactc ttgctgcctc 1200

tagaaaggct gacgctgttt tgcttggtgc tgtaggaggg cccaagtggg gcactggctc 1260

agtgagaccc gaacagggtc tcctcaagat tcgcaaggag cttcaattgt acgcgaatct 1320

gcgtccctgt aacatcattg ctccaaagtt tgccaagctc agtcctctga aggaggagaa 1380

tgttttggga accgacatta tgattgtacg agaactcaca ggtggaatct acttcggaga 1440

tcgcgaagaa gccgatatga gcacggccga ccctcatgcc acagatactg agaagtacag 1500

cgttagtgaa attacgcgca tcgctcgtat ggcaggcttt ttggctctgc aggcccaacc 1560

tccgctacct gtttggagct tggacaaggc caatgtgctt gcttccagcc gtttgtggcg 1620

cgaaaccgtc accaaggtgt tcaaagagga attccctcag ctcaaattgg agcatcagct 1680

cattgattcg gcggccatga ttttggtgaa gaaccctcga cagctcaatg gtgtcgttat 1740

caccaccaac atgttcggag acattttcag cgacgaggcg agtgttattc ctggctctct 1800

gggtctgcta ccctcagctt cgctcagtgg actgcctgac acaaactctg cctttggtct 1860

gtacgagcct tgtcacggct ctgctcccga cctcgctgct aacaaggcaa atccagtcgc 1920

taccattctc agcgcagcaa tgatgcttcg tctttcacta ggtcttcctg aagctgctga 1980

tgctgttgag aaagctgttt ccaacgtttt gaactcagtc gcggccacgg cagacattgg 2040

tggaacagcc tccaccacag aggtaggcga tgcaattgcc gcagagacgt tgaagcttct 2100

caaatagtct gctataaatt gacggagttt cgtacagtgc gctcgtacag tgcgctgcca 2160

aatacaattt agtgtagcca gattggatgg ttgaattgct cttcacggtt gcacgctatt 2220

ggcaaaaaag agagagccgc tctgaactgg ttcatccgca gctgaccttc gaaactcttt 2280

aatatttaat aatattgcag caaaatctat agcttatgcc acatctatac ggaagaggta 2340

ttcaacatta gagcttgtgt cgcccattct ctacacgagc ccacgcatca gcagtgaggg 2400

gcttgtagct cgtgccctct aaccagtaga ttgtttgtcc tgctggggcg ggaatctgct 2460

ggtttcggaa ttctttcttc tgaactttgt tgttgccggt gatggtgacg gtgtcgacga 2520

acttaatgaa tatcggcacg gcatagcgtg gcagcctttc caaaagatgc ttgccgagtt 2580

tatccatatc cagctgtttt ctaggattgt tgagcttgat cacagcaaat ccggcacgac 2640

cctcatgctt gggaacctgc acacctacac agacacacag atcgactcca ccgaagtcca 2700

caactgcttc ctcgacttcg tttgtgctaa cgttctcgct cttccatcga aacgtatccc 2760

cgagtcgatc aacaaagtag acgctatgat ctttatcagc cctcagaagg tctccgctgc 2820

gcacccaggc atctcccttc ttgaaaacat caaacacaag cttctcatcc gtggctgatt 2880

ggttgccgac atagccctgg aaatcgagtt tgatattctt cgggtcgagt ttgaaaagga 2940

attcacccgg ctcgtccgag tgtgtctcac ggcacaggcc ggttttggga tcgcgccata 3000

aatcctgcgt gtcaacatca atcgcggcga tgttccacct ggtacgatgc agcacgcggg 3060

tggccacagt accataatgg ccacatgcac caacaccata tgcacct 3107

<210> 38

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 38

atatatatac atatgttaat caaagacatt attctaactc caatg 45

<210> 39

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 39

atatatggcc ggccaactta agaaaaccgc acaaccacac cg 42

<210> 40

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 40

atatatatac atatgagccc ttcatcacac aaacccctg 39

<210> 41

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 41

atatatggcc ggccattcta agaactcacc gctaaggcc 39

<210> 42

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 42

atatatatac atatggttgt aaactcctcg aaggaccc 38

<210> 43

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 43

atatatggcc ggcctaccta gaccttctgg ttagcggtat tg 42

<210> 44

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 44

atatatatac atatggtgga tgatatacag gtagagaagc 40

<210> 45

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 45

atatatggcc ggccacgtca aatctctccg agaccttgca ag 42

<210> 46

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 46

atatatatac atatggccat cgagaaacca gtgatagttg 40

<210> 47

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 47

atatatggcc ggccaggtta agaagctaat tcactaattg ccgac 45

<210> 48

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 48

ggacctgcgc cctaaaatgg gac 23

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 49

atcctagaaa acagctggat atggataaac 30

<210> 50

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 50

gtgcccgacc accatgagct gtc 23

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 51

cccaagcatg agggtcgtgc cgg 23

<210> 52

<211> 1572

<212> DNA

<213> 假丝酵母菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1572)

<400> 52

atg att ctt tat gct gtg ctg ggc gca ttc gcc gcc ttc ttg ctt tac 48

Met Ile Leu Tyr Ala Val Leu Gly Ala Phe Ala Ala Phe Leu Leu Tyr

1 5 10 15

atg gat gta ctt tac cct ttc gtg att tac cct ctg aga gcg cga tgg 96

Met Asp Val Leu Tyr Pro Phe Val Ile Tyr Pro Leu Arg Ala Arg Trp

20 25 30

cac aaa tgt ggt tac atc cct aga gat ttg agc tgg cca ttg ggg att 144

His Lys Cys Gly Tyr Ile Pro Arg Asp Leu Ser Trp Pro Leu Gly Ile

35 40 45

cca ctc acc ctg gta gtt ctc tcg aag ttg agg aaa gat atg ctg ctg 192

Pro Leu Thr Leu Val Val Leu Ser Lys Leu Arg Lys Asp Met Leu Leu

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Leu Thr Met Ile Lys Leu Val Leu Glu Phe Glu Arg Leu Glu Pro Ala

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Asp Asp Phe Glu Pro Asn Leu Leu Asp Arg Thr Ser Leu Thr Ala Met

500 505 510

Val Gly Gly Ser Gly Val Arg Val Lys Leu Ser

515 520

<210> 62

<211> 1206

<212> DNA

<213> 假丝酵母菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1206)

<400> 62

atg ttt gcg aaa gct tta tgg gag gat gat gtt ttg gag tac gcc tgc 48

Met Phe Ala Lys Ala Leu Trp Glu Asp Asp Val Leu Glu Tyr Ala Cys

1 5 10 15

cgc agg ttt gca ggc atg aag gtc aga act ggg ctt caa act gtc gct 96

Arg Arg Phe Ala Gly Met Lys Val Arg Thr Gly Leu Gln Thr Val Ala

20 25 30

ggc cag cta tgg ata gca act atc gag ccg gag aac atc aag acc gta 144

Gly Gln Leu Trp Ile Ala Thr Ile Glu Pro Glu Asn Ile Lys Thr Val

35 40 45

ctt gcc acc tcg ttc aat gac tac tcc ctt ggc ttc cgt tat aat gcc 192

Leu Ala Thr Ser Phe Asn Asp Tyr Ser Leu Gly Phe Arg Tyr Asn Ala

50 55 60

cta tac ggc ctt ctc gga aat ggt att ttc acc ctt agt ggt gat ggc 240

Leu Tyr Gly Leu Leu Gly Asn Gly Ile Phe Thr Leu Ser Gly Asp Gly

65 70 75 80

tgg aag cac agt cgt gct ttg ttg cgt ccg cag ttc agt cgt gag caa 288

Trp Lys His Ser Arg Ala Leu Leu Arg Pro Gln Phe Ser Arg Glu Gln

85 90 95

gtt tct cac ttg gac tcc atg cgt aca cac atc aac ttg atg atc aac 336

Val Ser His Leu Asp Ser Met Arg Thr His Ile Asn Leu Met Ile Asn

100 105 110

aac cat ttc aaa ggc ggc cac gtc gtt gac gca cag gct cga tac cac 384

Asn His Phe Lys Gly Gly His Val Val Asp Ala Gln Ala Arg Tyr His

115 120 125

aat ttg acc atc gat act gcg act gaa ttc ctt ttc ggt gag agc act 432

Asn Leu Thr Ile Asp Thr Ala Thr Glu Phe Leu Phe Gly Glu Ser Thr

130 135 140

aac aca ctc gac cct gtt ctt gca cag caa gga ctc cct ggt cct aag 480

Asn Thr Leu Asp Pro Val Leu Ala Gln Gln Gly Leu Pro Gly Pro Lys

145 150 155 160

ggc acc gtt acc gga gag cag ttt gct gaa gct ttc acc tcc gct ctt 528

Gly Thr Val Thr Gly Glu Gln Phe Ala Glu Ala Phe Thr Ser Ala Leu

165 170 175

caa gtg ctg agt gtc cga gtt atg gcc ggc tcc gca tgg ttc ctc att 576

Gln Val Leu Ser Val Arg Val Met Ala Gly Ser Ala Trp Phe Leu Ile

180 185 190

tgg act cct aaa ttc tgg cgc tcg tgc aag gtg tgc cac aac ttc att 624

Trp Thr Pro Lys Phe Trp Arg Ser Cys Lys Val Cys His Asn Phe Ile

195 200 205

gac tac ttc gta tac aag gcc ttg gcc act ccg atg gag aag ggc caa 672

Asp Tyr Phe Val Tyr Lys Ala Leu Ala Thr Pro Met Glu Lys Gly Gln

210 215 220

gag gct gat cgc tat gtt ttt att cga gag ctc aca aag gag act tct 720

Glu Ala Asp Arg Tyr Val Phe Ile Arg Glu Leu Thr Lys Glu Thr Ser

225 230 235 240

gac cca aga gtc atc cgt gac cag gct cta aat atc ctg ctg gct ggt 768

Asp Pro Arg Val Ile Arg Asp Gln Ala Leu Asn Ile Leu Leu Ala Gly

245 250 255

cgt gat acc act gcg gca ctc ctc atc att gcg gac ttt ggc tct gag 816

Arg Asp Thr Thr Ala Ala Leu Leu Ile Ile Ala Asp Phe Gly Ser Glu

260 265 270

gac gct gag ccc cct acc ttt gag cag ctc aag cag tgc aag gta ctg 864

Asp Ala Glu Pro Pro Thr Phe Glu Gln Leu Lys Gln Cys Lys Val Leu

275 280 285

cag aat gtc att cgc gag gtt tta cgt ttg cac cct aat gtg ccg ctc 912

Gln Asn Val Ile Arg Glu Val Leu Arg Leu His Pro Asn Val Pro Leu

290 295 300

aac ttc cgc cag gct ata act gat act aag ctc ccc act ggt ggt ggc 960

Asn Phe Arg Gln Ala Ile Thr Asp Thr Lys Leu Pro Thr Gly Gly Gly

305 310 315 320

ccg aac aga gac cag cct gtc ttt gtt cca aag gga cag aaa gtg ttc 1008

Pro Asn Arg Asp Gln Pro Val Phe Val Pro Lys Gly Gln Lys Val Phe

325 330 335

tac gcc acc tac gtc atg cag cga gat ccg gaa ata tgg ggc ccc gac 1056

Tyr Ala Thr Tyr Val Met Gln Arg Asp Pro Glu Ile Trp Gly Pro Asp

340 345 350

tct aca agc ttc cgc cct gat cga tgg aat gag ccg aga gag gct ctt 1104

Ser Thr Ser Phe Arg Pro Asp Arg Trp Asn Glu Pro Arg Glu Ala Leu

355 360 365

gca tca ggt tgg gat tat att cct ttc aat ggc ggc cct cgc att tgt 1152

Ala Ser Gly Trp Asp Tyr Ile Pro Phe Asn Gly Gly Pro Arg Ile Cys

370 375 380

atc ggt cag cag ttc gct ctc act gag gct agc tac aca ctt gtc cgt 1200

Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu Thr Glu Ala Ser Tyr Thr Leu Val Arg

385 390 395 400

atc tag 1206

Ile

<210> 63

<211> 401

<212> PRT

<213> 假丝酵母菌

<400> 63

Met Phe Ala Lys Ala Leu Trp Glu Asp Asp Val Leu Glu Tyr Ala Cys

1 5 10 15

Arg Arg Phe Ala Gly Met Lys Val Arg Thr Gly Leu Gln Thr Val Ala

20 25 30

Gly Gln Leu Trp Ile Ala Thr Ile Glu Pro Glu Asn Ile Lys Thr Val

35 40 45

Leu Ala Thr Ser Phe Asn Asp Tyr Ser Leu Gly Phe Arg Tyr Asn Ala

50 55 60

Leu Tyr Gly Leu Leu Gly Asn Gly Ile Phe Thr Leu Ser Gly Asp Gly

65 70 75 80

Trp Lys His Ser Arg Ala Leu Leu Arg Pro Gln Phe Ser Arg Glu Gln

85 90 95

Val Ser His Leu Asp Ser Met Arg Thr His Ile Asn Leu Met Ile Asn

100 105 110

Asn His Phe Lys Gly Gly His Val Val Asp Ala Gln Ala Arg Tyr His

115 120 125

Asn Leu Thr Ile Asp Thr Ala Thr Glu Phe Leu Phe Gly Glu Ser Thr

130 135 140

Asn Thr Leu Asp Pro Val Leu Ala Gln Gln Gly Leu Pro Gly Pro Lys

145 150 155 160

Gly Thr Val Thr Gly Glu Gln Phe Ala Glu Ala Phe Thr Ser Ala Leu

165 170 175

Gln Val Leu Ser Val Arg Val Met Ala Gly Ser Ala Trp Phe Leu Ile

180 185 190

Trp Thr Pro Lys Phe Trp Arg Ser Cys Lys Val Cys His Asn Phe Ile

195 200 205

Asp Tyr Phe Val Tyr Lys Ala Leu Ala Thr Pro Met Glu Lys Gly Gln

210 215 220

Glu Ala Asp Arg Tyr Val Phe Ile Arg Glu Leu Thr Lys Glu Thr Ser

225 230 235 240

Asp Pro Arg Val Ile Arg Asp Gln Ala Leu Asn Ile Leu Leu Ala Gly

245 250 255

Arg Asp Thr Thr Ala Ala Leu Leu Ile Ile Ala Asp Phe Gly Ser Glu

260 265 270

Asp Ala Glu Pro Pro Thr Phe Glu Gln Leu Lys Gln Cys Lys Val Leu

275 280 285

Gln Asn Val Ile Arg Glu Val Leu Arg Leu His Pro Asn Val Pro Leu

290 295 300

Asn Phe Arg Gln Ala Ile Thr Asp Thr Lys Leu Pro Thr Gly Gly Gly

305 310 315 320

Pro Asn Arg Asp Gln Pro Val Phe Val Pro Lys Gly Gln Lys Val Phe

325 330 335

Tyr Ala Thr Tyr Val Met Gln Arg Asp Pro Glu Ile Trp Gly Pro Asp

340 345 350

Ser Thr Ser Phe Arg Pro Asp Arg Trp Asn Glu Pro Arg Glu Ala Leu

355 360 365

Ala Ser Gly Trp Asp Tyr Ile Pro Phe Asn Gly Gly Pro Arg Ile Cys

370 375 380

Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu Thr Glu Ala Ser Tyr Thr Leu Val Arg

385 390 395 400

Ile

<210> 64

<211> 6084

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 载体

<400> 64

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120

gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180

gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240

gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300

acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattggcgg aaggccgtca 360

aggcctaggc gcgcctgcag gatcctagaa aacagctgga tatggataaa ctcggcaagc 420

atcttttgga aaggctgcca cgctatgccg tgccgatatt cattaagttc gtcgacaccg 480

tcaccatcac cggcaacaac aaagttcaga agaaagaatt ccgaaaccag cagattcccg 540

ccccagcagg acaaacaatc tactggttag agggcacgag ctacaagccc ctcactgctg 600

atgcgtgggc tcgtgtagag aatgggcgac acaagctcta atgttgaata cctcttccgt 660

atagatgtgg cataagctat agattttgct gcaatattat taaatattaa agagtttcga 720

aggtcagctg cggatgaacc agttcagagc ggctctctct tttttgccaa tagcgtgcaa 780

ccgtgaagag caattcaacc atccaatctg gctacactaa attgtatttg gcagcgcact 840

gtacgagcgc actgtacgaa actccgtcaa tttatagcag aacgcgtgcg atcgcgggcc 900

ccagcgatat gacgagaatc aggcaataat agcttaagct gaagtgtttt tagatttagt 960

tcggagtgcg cttctcaaaa gtgctgggat caacaagttt ttaacatggg ttttgattta 1020

tattgtttta tatgagcgcc tcagatatgc gctgacagcc tattaggaga aatggccggc 1080

ctacaagtcc atatgtgtag agttgttttt gttgttaagt ctttctttaa gagcttgacc 1140

gactataacc gttcaacggc gcattatata ctttgggtat cggccagtgc tgacaactca 1200

cacgttgcga ccccttaccc agaagcatac ccagcgcgat gtcgatcgtg ttatatcgta 1260

gacgcacacc ctgcaatgac gggtaggctc taaatcggga tgcgaaaaag aggttgcctt 1320

gctttttgcc ctggtagatg gcatgctgag cgtgcgcttg ccgcctaatt tttgtgtgtc 1380

gcctgctatt tattgctgaa gctagcccgc cgcatctttc cccaaggctt cgattgctcg 1440

tattggggca gggattggta ctcaaccttg cagatgagac tccagcaaca acgtcgtact 1500

gcttagcgat cgcacatgtt tcatcatcgt cactatacac atcgtcatca actccatggc 1560

gtgaggactt ccgagactgc tgggcccttc gtttctttaa tgcctcaaga gatgacttcg 1620

tacccgaaga gacgcctgtt gtaccccgtt gacgcttggc ggagggggct tcgtcctcgt 1680

cagcaacccg cgtcatctgc ttccttcgct gagcaagata ccttctctcc tcgtaccgct 1740

gcatctcctg agctcggtca tacaagatct cttctcgctc aatctctggc agcgcgtcca 1800

acttcgccct gtcttcagca tcgagatatt tgccttctag aggataggga ttgacgacct 1860

cattgcttgg cggcgacggc agcgagattt cctcttcgga gtcggagcca acgtcggcca 1920

atgccagcag atcatcatca ctgtcactca tagtaggaag gttgaagtgt gctgacgaat 1980

cagaatcgcg aaggatgcca ttgaaggcat atatatttta atctgtacct tttatggtaa 2040

tttaatcaga ttttataggt attcatgtgc aagttgcatt gaaggaactg tttgagaaaa 2100

tcatcttgac tgaacttttc tcagatatgc attccagccc gccttttggt aacgctgagc 2160

ttcgtgcaca ggatctcgtc ccttgctata gagcccgcgt ccgacgataa taacgtctgt 2220

gccggtctct atgacgtcgt ccacagtacg atactgctgc cccaatccat cacctttgtc 2280

gtccaggccc accccaggag tcataatgac ccagtcttcc tctggctttc cgactttttg 2340

ctgagcgatg aaaccaaaca caaatgcgcg gttactgcga gcgatgtcta ctgtcgcttg 2400

cgagtattcg ccgtgagcca gtgtgccctt cgaactcagt tctgcaagca tgacaaggcc 2460

gcgaggttca tccgtagttt ccttcgcagc ctcttctagt ccgctcacaa ttcccggccc 2520

aggaacaccg tgagcatttg ttatatcagc ccattgagcg atcttaaaca ctccacctgc 2580

atattgggcc ttaacagtgg aaccgatgtc tgcgaacttt cggtcttcaa aaatgagaaa 2640

attgtgcttc gttgaaagct gtttcaaacc gctgacagtt gtgtcgtatt cgaagtcgtc 2700

aattatgtca atgtgggtct taaccataca aatgtaaggt ccaatgcggt ccaggatact 2760

cagtaactca gaggtagttc gcacatccaa gcttgcgcaa agatttgttt gcttgctcac 2820

aatgatgtcg aatagccggg ctgctacagc cggcagcctc tctcggcgct cctcatagct 2880

cagcttcata ttatttctct acagtagtgc ccgtgccctc gatcagctag gacttttcaa 2940

attaatcggg ctgtttgatg taagtaagat gaagtcacgc gcgtgcagga gactgcgtcc 3000

cgcgatattc tgcaggcttg aaaaatttac cctaacggta ggcatcaagt gagtgagtct 3060

cagcgtcgat atgggtcaaa aaaggggaaa actagccgag atcgttgcga gctgtttcga 3120

aaattatgcc ctatggcaat tatcacgtgg agtatccgaa tttctccagg ctgtcaagcg 3180

gcaattataa ccgagactga gatcgagaag tatataaccg cagcagtagt ggataaataa 3240

ttgcgaagtc ttcccagcag agcgggctgt tttttggagt tggttactgt aaaatgctaa 3300

aatgactgac aacaatggag cgtctacagc attggcaaca gtgggaacag tatgctggtg 3360

catccagttg ataccccagg ttctgcgaaa ctggtatgtt cgggattgcg agggcgttcc 3420

tcctctgatg ttctttttgt tcgccgtttc ggggattccc ttcgcagtgt acttcattga 3480

tcagaattcg aacactgcca tcatggttca acctcacttg tttactttct ttagccttat 3540

aggcttttgg caaagcctgt actatccgcc cgtcagacca gcacgggccg tcacatgtat 3600

ggttgcgtcg ctgtataaga aatcttacaa ctgaagacta cacagcgtat ccgctccgat 3660

atcggcgatc acgtggatac atttccccag aatgcgtcaa ccttgcatgc tcgatattga 3720

ctcaagccga gaggtgtata acaacaccga cgatagcgaa ttacttgtgg aactgatttg 3780

ccgtatcgag taaatcgcga ttgtggccct ctttaggcct tgtacccatt tgtgcatcgt 3840

atttgttagt atgcatcata gaattatgtg aacttagaaa agtccgtatg aaatgagcct 3900

cagattatgg attgatcgct tgttatttgt acagcggaat tgacttatag tatgtcggcc 3960

acggttttag attgcctagg ggccgttttc ttgatggatt cgcatcggaa ctccgaattc 4020

ttgattgctc tccatcgcgc aggaggccgt tctttttttg acaaagtccc attttagggc 4080

gcaggtccaa aaaataagcg gccgcttaat taactggcct catgggcctt ccgctcactg 4140

cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aacatggtca tagctgtttc 4200

cttgcgtatt gggcgctctc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 4260

gtaaagcctg gggtgcctaa tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 4320

ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 4380

gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 4440

gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 4500

ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 4560

tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 4620

gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 4680

tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 4740

tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 4800

tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 4860

ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 4920

ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 4980

gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 5040

aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 5100

aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 5160

cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 5220

ctgcaatgat accgcgagaa ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 5280

cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 5340

ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 5400

ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 5460

ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 5520

gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 5580

ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 5640

ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 5700

gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 5760

ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 5820

cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 5880

ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 5940

aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 6000

gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 6060

gcacatttcc ccgaaaagtg ccac 6084

<210> 65

<211> 7693

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 载体

<400> 65

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120

gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180

gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240

gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300

acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattggcgg aaggccgtca 360

aggcctaggc gcgcctgcag gatcctagaa aacagctgga tatggataaa ctcggcaagc 420

atcttttgga aaggctgcca cgctatgccg tgccgatatt cattaagttc gtcgacaccg 480

tcaccatcac cggcaacaac aaagttcaga agaaagaatt ccgaaaccag cagattcccg 540

ccccagcagg acaaacaatc tactggttag agggcacgag ctacaagccc ctcactgctg 600

atgcgtgggc tcgtgtagag aatgggcgac acaagctcta atgttgaata cctcttccgt 660

atagatgtgg cataagctat agattttgct gcaatattat taaatattaa agagtttcga 720

aggtcagctg cggatgaacc agttcagagc ggctctctct tttttgccaa tagcgtgcaa 780

ccgtgaagag caattcaacc atccaatctg gctacactaa attgtatttg gcagcgcact 840

gtacgagcgc actgtacgaa actccgtcaa tttatagcag aacgcgtgcg atcgcgggcc 900

ccagcgatat gacgagaatc aggcaataat agcttaagct gaagtgtttt tagatttagt 960

tcggagtgcg cttctcaaaa gtgctgggat caacaagttt ttaacatggg ttttgattta 1020

tattgtttta tatgagcgcc tcagatatgc gctgacagcc tattaggaga aatggccggc 1080

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agtagtcaat ataggactga gcacgtttct tgtgatctcg gaattcctta gagttgaaca 1920

accagtagac tttgcttgat agggtccgtt tgaaagcgta attcagtaga aagttgtagg 1980

actccacgaa ttgttcggca gtaatctccg aaccatcacg ggctacaata catgactgat 2040

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taagtttgtg gaaataatgt tgaacatcaa taaattggtc cactttcatt gcacggttca 2160

tctcctttat taactccgca gcatgactgg aaatctgatc aattctgcaa acctgatctt 2220

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gaacttccag taaggtgtat gacttggccg tcttgatcat gtccatggtt ctttgtattc 2520

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gcaacaagcc agcaacagcg gataaactca ttggagttag aataatgtct ttgattaaca 2700

tatgtgtaga gttgtttttg ttgttaagtc tttctttaag agcttgaccg actataaccg 2760

ttcaacggcg cattatatac tttgggtatc ggccagtgct gacaactcac acgttgcgac 2820

cccttaccca gaagcatacc cagcgcgatg tcgatcgtgt tatatcgtag acgcacaccc 2880

tgcaatgacg ggtaggctct aaatcgggat gcgaaaaaga ggttgccttg ctttttgccc 2940

tggtagatgg catgctgagc gtgcgcttgc cgcctaattt ttgtgtgtcg cctgctattt 3000

attgctgaag ctagcccgcc gcatctttcc ccaaggcttc gattgctcgt attggggcag 3060

ggattggtac tcaaccttgc agatgagact ccagcaacaa cgtcgtactg cttagcgatc 3120

gcacatgttt catcatcgtc actatacaca tcgtcatcaa ctccatggcg tgaggacttc 3180

cgagactgct gggcccttcg tttctttaat gcctcaagag atgacttcgt acccgaagag 3240

acgcctgttg taccccgttg acgcttggcg gagggggctt cgtcctcgtc agcaacccgc 3300

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tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 7260

tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 7320

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gaccccttac ccagaagcat acccagcgcg atgtcgatcg tgttatatcg tagacgcaca 2040

ccctgcaatg acgggtaggc tctaaatcgg gatgcgaaaa agaggttgcc ttgctttttg 2100

ccctggtaga tggcatgctg agcgtgcgct tgccgcctaa tttttgtgtg tcgcctgcta 2160

tttattgctg aagctagccc gccgcatctt tccccaaggc ttcgattgct cgtattgggg 2220

cagggattgg tactcaacct tgcagatgag actccagcaa caacgtcgta ctgcttagcg 2280

atcgcacatg tttcatcatc gtcactatac acatcgtcat caactccatg gcgtgaggac 2340

ttccgagact gctgggccct tcgtttcttt aatgcctcaa gagatgactt cgtacccgaa 2400

gagacgcctg ttgtaccccg ttgacgcttg gcggaggggg cttcgtcctc gtcagcaacc 2460

cgcgtcatct gcttccttcg ctgagcaaga taccttctct cctcgtaccg ctgcatctcc 2520

tgagctcggt catacaagat ctcttctcgc tcaatctctg gcagcgcgtc caacttcgcc 2580

ctgtcttcag catcgagata tttgccttct agaggatagg gattgacgac ctcattgctt 2640

ggcggcgacg gcagcgagat ttcctcttcg gagtcggagc caacgtcggc caatgccagc 2700

agatcatcat cactgtcact catagtagga aggttgaagt gtgctgacga atcagaatcg 2760

cgaaggatgc cattgaaggc atatatattt taatctgtac cttttatggt aatttaatca 2820

gattttatag gtattcatgt gcaagttgca ttgaaggaac tgtttgagaa aatcatcttg 2880

actgaacttt tctcagatat gcattccagc ccgccttttg gtaacgctga gcttcgtgca 2940

caggatctcg tcccttgcta tagagcccgc gtccgacgat aataacgtct gtgccggtct 3000

ctatgacgtc gtccacagta cgatactgct gccccaatcc atcacctttg tcgtccaggc 3060

ccaccccagg agtcataatg acccagtctt cctctggctt tccgactttt tgctgagcga 3120

tgaaaccaaa cacaaatgcg cggttactgc gagcgatgtc tactgtcgct tgcgagtatt 3180

cgccgtgagc cagtgtgccc ttcgaactca gttctgcaag catgacaagg ccgcgaggtt 3240

catccgtagt ttccttcgca gcctcttcta gtccgctcac aattcccggc ccaggaacac 3300

cgtgagcatt tgttatatca gcccattgag cgatcttaaa cactccacct gcatattggg 3360

ccttaacagt ggaaccgatg tctgcgaact ttcggtcttc aaaaatgaga aaattgtgct 3420

tcgttgaaag ctgtttcaaa ccgctgacag ttgtgtcgta ttcgaagtcg tcaattatgt 3480

caatgtgggt cttaaccata caaatgtaag gtccaatgcg gtccaggata ctcagtaact 3540

cagaggtagt tcgcacatcc aagcttgcgc aaagatttgt ttgcttgctc acaatgatgt 3600

cgaatagccg ggctgctaca gccggcagcc tctctcggcg ctcctcatag ctcagcttca 3660

tattatttct ctacagtagt gcccgtgccc tcgatcagct aggacttttc aaattaatcg 3720

ggctgtttga tgtaagtaag atgaagtcac gcgcgtgcag gagactgcgt cccgcgatat 3780

tctgcaggct tgaaaaattt accctaacgg taggcatcaa gtgagtgagt ctcagcgtcg 3840

atatgggtca aaaaagggga aaactagccg agatcgttgc gagctgtttc gaaaattatg 3900

ccctatggca attatcacgt ggagtatccg aatttctcca ggctgtcaag cggcaattat 3960

aaccgagact gagatcgaga agtatataac cgcagcagta gtggataaat aattgcgaag 4020

tcttcccagc agagcgggct gttttttgga gttggttact gtaaaatgct aaaatgactg 4080

acaacaatgg agcgtctaca gcattggcaa cagtgggaac agtatgctgg tgcatccagt 4140

tgatacccca ggttctgcga aactggtatg ttcgggattg cgagggcgtt cctcctctga 4200

tgttcttttt gttcgccgtt tcggggattc ccttcgcagt gtacttcatt gatcagaatt 4260

cgaacactgc catcatggtt caacctcact tgtttacttt ctttagcctt ataggctttt 4320

ggcaaagcct gtactatccg cccgtcagac cagcacgggc cgtcacatgt atggttgcgt 4380

cgctgtataa gaaatcttac aactgaagac tacacagcgt atccgctccg atatcggcga 4440

tcacgtggat acatttcccc agaatgcgtc aaccttgcat gctcgatatt gactcaagcc 4500

gagaggtgta taacaacacc gacgatagcg aattacttgt ggaactgatt tgccgtatcg 4560

agtaaatcgc gattgtggcc ctctttaggc cttgtaccca tttgtgcatc gtatttgtta 4620

gtatgcatca tagaattatg tgaacttaga aaagtccgta tgaaatgagc ctcagattat 4680

ggattgatcg cttgttattt gtacagcgga attgacttat agtatgtcgg ccacggtttt 4740

agattgccta ggggccgttt tcttgatgga ttcgcatcgg aactccgaat tcttgattgc 4800

tctccatcgc gcaggaggcc gttctttttt tgacaaagtc ccattttagg gcgcaggtcc 4860

aaaaaataag cggccgctta attaactggc ctcatgggcc ttccgctcac tgcccgcttt 4920

ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaacatggt catagctgtt tccttgcgta 4980

ttgggcgctc tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc gggtaaagcc 5040

tggggtgcct aatgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 5100

ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 5160

cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 5220

ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 5280

tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 5340

gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 5400

tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 5460

gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 5520

tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 5580

ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 5640

agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 5700

gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 5760

attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 5820

agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta 5880

atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc 5940

cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg 6000

ataccgcgag aaccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga 6060

agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt 6120

tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt 6180

gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc 6240

caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc 6300

ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca 6360

gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag 6420

tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg 6480

tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa 6540

cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa 6600

cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga 6660

gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga 6720

atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg 6780

agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt 6840

ccccgaaaag tgccac 6856

<210> 68

<211> 9973

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 载体

<400> 68

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120

gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180

gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240

gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300

acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattggcgg aaggccgtca 360

aggcctaggc gcgcctgcag gatcctagaa aacagctgga tatggataaa ctcggcaagc 420

atcttttgga aaggctgcca cgctatgccg tgccgatatt cattaagttc gtcgacaccg 480

tcaccatcac cggcaacaac aaagttcaga agaaagaatt ccgaaaccag cagattcccg 540

ccccagcagg acaaacaatc tactggttag agggcacgag ctacaagccc ctcactgctg 600

atgcgtgggc tcgtgtagag aatgggcgac acaagctcta atgttgaata cctcttccgt 660

atagatgtgg cataagctat agattttgct gcaatattat taaatattaa agagtttcga 720

aggtcagctg cggatgaacc agttcagagc ggctctctct tttttgccaa tagcgtgcaa 780

ccgtgaagag caattcaacc atccaatctg gctacactaa attgtatttg gcagcgcact 840

gtacgagcgc actgtacgaa actccgtcaa tttatagcag aacgcgtgcg atcgcgggcc 900

ccagcgatat gacgagaatc aggcaataat agcttaagct gaagtgtttt tagatttagt 960

tcggagtgcg cttctcaaaa gtgctgggat caacaagttt ttaacatggg ttttgattta 1020

tattgtttta tatgagcgcc tcagatatgc gctgacagcc tattaggaga aatggccggc 1080

ctcaaatctc tccgagacct tgcaagttca ccaattcagc gtaccatcca ttgagttcaa 1140

ggaggctctg atggtcgccc tgctccacga tgcgccctcc tgagaacaca tatatgacat 1200

ctgctttctg aattgttgat aatctatgcg caacggcgat tgtagtacgg cccttcgctg 1260

ctgcgtcgag tgctgcttga actactttct cagattcgga atccagagct gaggtggcct 1320

catcgaggag gagtaccttt ggatttctga tcagggccct tgcaattgca attcgctgct 1380

tttgcccccc agatagcaac gatcccctag atccgctgag cgtttcgtag ccatcaggca 1440

acgacatgat gaattcgtga atgttcgctt tgcgagcggc atcctcaatc atctcctgcg 1500

ttacttcaga ctcagggcca gaccatccca ttagaatatt ctcacgtagc gtgcctgaat 1560

aaagcattgg ttcttgctgg actaaagcaa tgtgtgatct caatgcattc aggttatatt 1620

cgcgtaaatc tttcccatcg aaaagtactt gacctgctaa tggatcataa aatctttcca 1680

ccagtccaat agtagtagac ttaccgcatc cactggctcc aactagagcg atgtattggc 1740

cctttttgac tgttaagttg agatcttgta aaactggtac ttgaggtcga gtaggatatc 1800

ggaaattcac atgacggaac tcaatatctc ctctcaccga ctcctcggga gcaacgtaac 1860

cttcctcact ccatacatct atagaaggag tggcagtcaa gattctgtaa atgttacgcg 1920

ctgcatcttt ggctgagttc atgtttggag catagctgaa aatttggcca gcggcttgag 1980

aacctgtaat aatagccatg aagacagtca tatatcctgc gaccgaagct tcacctcgtc 2040

tcattacagt gcttccccac caaaaaacga gggctaccac ccagggtgtc attccttccg 2100

agagtgcgta gtacaatgct gagcgggcaa tggcaattct ggagctgaaa atctgagagt 2160

ctactgtctt tgtgtatttt acgaccacgt ctaactcacg agttaaggac tggactgtgc 2220

ggacagcact tgtatactca gatgccatgg agccacttcg ttcgtaaact tctctcgcac 2280

gatccgataa ttgggtaaga acccagactc tgacgaagcc acacaccaac atgacaggaa 2340

caacagacgt agccacgagt ccaattctcc aattgaaagg tataccagta actatgccgc 2400

caatcaaggt caccagactc tgttgaattt gaccgagggt ggccccactc aaaccctcga 2460

tcattttagc ttccttcgcc aaaattgagg ttagcgcacc cggcgtgttg tttttgtggt 2520

cgaagaatgc aatatccatt cgcatcaatt ggcggaacaa agctaatctg atatttttga 2580

ccaacttatc agatgcaagt gataaagcag ctatagtgat aaaagccgtc atgaatgaaa 2640

tgcagcctac gaaaaaatac caccatccca tgatattcac cacatgccgc atttttccgt 2700

attcactggg aggtagaacc atgcttccag tggtttggcc agttattatt gccattgcag 2760

gatagcaata gcccaaaata atggaggcta aactaccaat gagaatgtaa ccccattctt 2820

tcctattcag cccccaaacc agtttggtat tggtcatcaa cgtgctatgt ggggggttgc 2880

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tgtgaacact caatgtgctc acatccttgg gattgaactt ttcgttcagt gagtccagag 3000

gcgaaatgtc tagagcttca atatcgagga cctcaacgtt agtgctcttt gctttagtta 3060

ctctttgagc atcaaccaaa gctttataag gcccttctcg ctgtatgagc tcattgtgag 3120

taccctgctc tatgacgtta cctttagaca tgacaactat cttgttggca tccttgatcg 3180

tagagagtct gtgtgcaacg actatagtgg tacgaccttc ggccgctttg tcgagcgcat 3240

cttgaacgat accttcagat ttggtatcca gagcagaagt cgcttcatcg agcagcagaa 3300

ttttagggtc tgagacgatt gctcttgcta ttgcaatgcg ttgtttctga ccaccgctga 3360

gaagaaatcc tcgatctcca acattggttt ggatgccttc tgagagagtc tgaatgaaat 3420

cccaggcatt ggcatcttta caagcttgaa tgattttagc ttccttaaca tgctcgtcag 3480

cgaactcaat gtcagtgcca atcaaaccat agctgatatt ctcatatatt gactctgaaa 3540

agagtactgg ttcctgctga acataaccaa tttgttgacg gagccatctt gtgttcaggt 3600

cgctaatctc ctggccatcc agagtaacgc ttccttcgag aggtaaatag aacctctcaa 3660

gaatacctac aattgtagac ttccctgatc ccgaggcacc taccagtgcc acagtagatc 3720

cagcaggaac ttcaaggcta aaatcggaga ggaccaaaac gtctgggcga ctaggatatc 3780

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tatctatgga ctggccatcg atgactggga cacgatcaat ggcctcattg agaatgctcg 3900

cggcagtgag acccttgaca agaaacctca cgtttggcgc gatattccca agctggaagc 3960

ttccaagtaa catagctgtg attacaacta ttatctttcc aacgtcagca ctcccactaa 4020

cgatttctct ggaaccctgc cacagagcta aggcatacac ccaaaaagta ctagcccaaa 4080

tgcacgctaa catgaccccc aatgagtaac tgctccgctt cgattccttc acaacacgat 4140

caagtacctt ttcatacttg acggcgagat gaggttgagc gccaaatgct actgtagtcc 4200

tgacagcact gagagcctcc tccgcaacgg tagctccaga ctgcgaatat atcgcgtcag 4260

atctgagctg atatttggcc atgaaggtgg cgccagttcc cattgtgatt accatgaacc 4320

ctacagcact caggaggatg caagccagtt tccattgcga agcaaaactt ataacggtgg 4380

ccgcaatgaa ggaagctatt ccctgtacga cgtttccaag cttgtcgctg atcgcttcct 4440

gaattgagtt ggtatcgtta atgattctgg tgctgacctc gccaccacct agtttgtcgt 4500

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acacttcgcc tctgtccaca agcaggaagc tctcgagaaa cgcactgccg agcataccaa 4620

tgccaatata gacaaaatag agagacaggt gattcacctt atgctggaac tcattgccct 4680

tgaggtcata gctagtgaag tctctgaatg tgttgaagat ggcgcccact actaacgtga 4740

acattggaag cgcggctcca tgcaccgctg caaaaaaaag cgcaagtatc tccaagaaaa 4800

cgtcaagggg agtgcaaaat ctgaacaacc tgaaaaagct tgtggcgact ctctttgttt 4860

caagctgact tcgcaataca ttggcctcat gtggatctaa cgcagagagc ttctcctcga 4920

gaagcttgtc cttagtctcg atgagtttct cacgcttctc tacctgtata tcatccacca 4980

tatgtgtaga gttgtttttg ttgttaagtc tttctttaag agcttgaccg actataaccg 5040

ttcaacggcg cattatatac tttgggtatc ggccagtgct gacaactcac acgttgcgac 5100

cccttaccca gaagcatacc cagcgcgatg tcgatcgtgt tatatcgtag acgcacaccc 5160

tgcaatgacg ggtaggctct aaatcgggat gcgaaaaaga ggttgccttg ctttttgccc 5220

tggtagatgg catgctgagc gtgcgcttgc cgcctaattt ttgtgtgtcg cctgctattt 5280

attgctgaag ctagcccgcc gcatctttcc ccaaggcttc gattgctcgt attggggcag 5340

ggattggtac tcaaccttgc agatgagact ccagcaacaa cgtcgtactg cttagcgatc 5400

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cgagactgct gggcccttcg tttctttaat gcctcaagag atgacttcgt acccgaagag 5520

acgcctgttg taccccgttg acgcttggcg gagggggctt cgtcctcgtc agcaacccgc 5580

gtcatctgct tccttcgctg agcaagatac cttctctcct cgtaccgctg catctcctga 5640

gctcggtcat acaagatctc ttctcgctca atctctggca gcgcgtccaa cttcgccctg 5700

tcttcagcat cgagatattt gccttctaga ggatagggat tgacgacctc attgcttggc 5760

ggcgacggca gcgagatttc ctcttcggag tcggagccaa cgtcggccaa tgccagcaga 5820

tcatcatcac tgtcactcat agtaggaagg ttgaagtgtg ctgacgaatc agaatcgcga 5880

aggatgccat tgaaggcata tatattttaa tctgtacctt ttatggtaat ttaatcagat 5940

tttataggta ttcatgtgca agttgcattg aaggaactgt ttgagaaaat catcttgact 6000

gaacttttct cagatatgca ttccagcccg ccttttggta acgctgagct tcgtgcacag 6060

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tgacgtcgtc cacagtacga tactgctgcc ccaatccatc acctttgtcg tccaggccca 6180

ccccaggagt cataatgacc cagtcttcct ctggctttcc gactttttgc tgagcgatga 6240

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cgtgagccag tgtgcccttc gaactcagtt ctgcaagcat gacaaggccg cgaggttcat 6360

ccgtagtttc cttcgcagcc tcttctagtc cgctcacaat tcccggccca ggaacaccgt 6420

gagcatttgt tatatcagcc cattgagcga tcttaaacac tccacctgca tattgggcct 6480

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aggtagttcg cacatccaag cttgcgcaaa gatttgtttg cttgctcaca atgatgtcga 6720

atagccgggc tgctacagcc ggcagcctct ctcggcgctc ctcatagctc agcttcatat 6780

tatttctcta cagtagtgcc cgtgccctcg atcagctagg acttttcaaa ttaatcgggc 6840

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gcaggcttga aaaatttacc ctaacggtag gcatcaagtg agtgagtctc agcgtcgata 6960

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tatggcaatt atcacgtgga gtatccgaat ttctccaggc tgtcaagcgg caattataac 7080

cgagactgag atcgagaagt atataaccgc agcagtagtg gataaataat tgcgaagtct 7140

tcccagcaga gcgggctgtt ttttggagtt ggttactgta aaatgctaaa atgactgaca 7200

acaatggagc gtctacagca ttggcaacag tgggaacagt atgctggtgc atccagttga 7260

taccccaggt tctgcgaaac tggtatgttc gggattgcga gggcgttcct cctctgatgt 7320

tctttttgtt cgccgtttcg gggattccct tcgcagtgta cttcattgat cagaattcga 7380

acactgccat catggttcaa cctcacttgt ttactttctt tagccttata ggcttttggc 7440

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aggtgtataa caacaccgac gatagcgaat tacttgtgga actgatttgc cgtatcgagt 7680

aaatcgcgat tgtggccctc tttaggcctt gtacccattt gtgcatcgta tttgttagta 7740

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<213> 人工的

<220>

<223> 载体

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tgctgctcga tgaagcgact tctgctctgg ataccaaatc tgaaggtatc gttcaagatg 4740

cgctcgacaa agcggccgaa ggtcgtacca ctatagtcgt tgcacacaga ctctctacga 4800

tcaaggatgc caacaagata gttgtcatgt ctaaaggtaa cgtcatagag cagggtactc 4860

acaatgagct catacagcga gaagggcctt ataaagcttt ggttgatgct caaagagtaa 4920

ctaaagcaaa gagcactaac gttgaggtcc tcgatattga agctctagac atttcgcctc 4980

tggactcact gaacgaaaag ttcaatccca aggatgtgag cacattgagt gttcacagtg 5040

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<210> 74

<211> 4998

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 敲除盒

<400> 74

ggacctgcgc cctaaaatgg gactttgtca aaaaaagaac ggcctcctgc gcgatggaga 60

gcaatcaaga attcggagtt ccgatgcgaa tccatcaaga aaacggcccc taggcaatct 120

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cagtcatttt agcattttac agtaaccaac tccaaaaaac agcccgctct gctgggaaga 840

cttcgcaatt atttatccac tactgctgcg gttatatact tctcgatctc agtctcggtt 900

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tcaaaggggc gtcacttcct gatagcgtta aagttcctgc aaacgctcga attgttgatt 3960

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gaggtctgca gcacagtttg agccatggcg ttcccgtcat catcggagga ggaatgttgg 4080

tagacaagcc agctgttgct tcacgagctg tatgggctgg tgttggttat gatcttcaaa 4140

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tagtgtagcc agattggatg gttgaattgc tcttcacggt tgcacgctat tggcaaaaaa 4620

gagagagccg ctctgaactg gttcatccgc agctgacctt cgaaactctt taatatttaa 4680

taatattgca gcaaaatcta tagcttatgc cacatctata cggaagaggt attcaacatt 4740

agagcttgtg tcgcccattc tctacacgag cccacgcatc agcagtgagg ggcttgtagc 4800

tcgtgccctc taaccagtag attgtttgtc ctgctggggc gggaatctgc tggtttcgga 4860

attctttctt ctgaactttg ttgttgccgg tgatggtgac ggtgtcgacg aacttaatga 4920

atatcggcac ggcatagcgt ggcagccttt ccaaaagatg cttgccgagt ttatccatat 4980

ccagctgttt tctaggat 4998

<210> 75

<211> 3732

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 整合盒

<400> 75

gcggccgctt attttttgga cctgcgccct aaaatgggac tttgtcaaaa aaagaacggc 60

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cggcccctag gcaatctaaa accgtggccg acatactata agtcaattcc gctgtacaaa 180

taacaagcga tcaatccata atctgaggct catttcatac ggacttttct aagttcacat 240

aattctatga tgcatactaa caaatacgat gcacaaatgg gtacaaggcc taaagagggc 300

cacaatcgcg atttactcga tacggcaaat cagttccaca agtaattcgc tatcgtcggt 360

gttgttatac acctctcggc ttgagtcaat atcgagcatg caaggttgac gcattctggg 420

gaaatgtatc cacgtgatcg ccgatatcgg agcggatacg ctgtgtagtc ttcagttgta 480

agatttctta tacagcgacg caaccataca tgtgacggcc cgtgctggtc tgacgggcgg 540

atagtacagg ctttgccaaa agcctataag gctaaagaaa gtaaacaagt gaggttgaac 600

catgatggca gtgttcgaat tctgatcaat gaagtacact gcgaagggaa tccccgaaac 660

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gacagtgatg atgatctgct ggcattggcc gacgttggct ccgactccga agaggaaatc 2220

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gatgaaacat gtgcgatcgc taagcagtac gacgttgttg ctggagtctc atctgcaagg 2640

ttgagtacca atccctgccc caatacgagc aatcgaagcc ttggggaaag atgcggcggg 2700

ctagcttcag caataaatag caggcgacac acaaaaatta ggcggcaagc gcacgctcag 2760

catgccatct accagggcaa aaagcaaggc aacctctttt tcgcatcccg atttagagcc 2820

tacccgtcat tgcagggtgt gcgtctacga tataacacga tcgacatcgc gctgggtatg 2880

cttctgggta aggggtcgca acgtgtgagt tgtcagcact ggccgatacc caaagtatat 2940

aatgcgccgt tgaacggtta tagtcggtca agctcttaaa gaaagactta acaacaaaaa 3000

caactctaca catatggact tgtaggccgg ccatttctcc taataggctg tcagcgcata 3060

tctgaggcgc tcatataaaa caatataaat caaaacccat gttaaaaact tgttgatccc 3120

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tggatggttg aattgctctt cacggttgca cgctattggc aaaaaagaga gagccgctct 3360

gaactggttc atccgcagct gaccttcgaa actctttaat atttaataat attgcagcaa 3420

aatctatagc ttatgccaca tctatacgga agaggtattc aacattagag cttgtgtcgc 3480

ccattctcta cacgagccca cgcatcagca gtgaggggct tgtagctcgt gccctctaac 3540

cagtagattg tttgtcctgc tggggcggga atctgctggt ttcggaattc tttcttctga 3600

actttgttgt tgccggtgat ggtgacggtg tcgacgaact taatgaatat cggcacggca 3660

tagcgtggca gcctttccaa aagatgcttg ccgagtttat ccatatccag ctgttttcta 3720

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<210> 76

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工的

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<223> 引物

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aaacgtctca gatgcaccac caccaccacc acatggttgt aaactcctcg 50

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<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 77

aaaggcgcgc cctagacctt ctggttagcg 30

<210> 78

<211> 6700

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 载体

<400> 78

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ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

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accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

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ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

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ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

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gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

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gtgatcgact acttcaacta cgatgctcta cttcctcacg ttgatgctct tgtctacaat 6120

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ttgaaaactg gcttgcctac agtggagcaa atcaaagaag ctgttgattc gataattgga 6300

aatccgaaat tccacgaagc ctcgaagaag gttcaaatgg agttggaaag ccacaactcc 6360

ttgaaaattc ttgaggaaag catcgaggaa atcgccagcc atgactttgg tcttttgacc 6420

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ttggctgctg ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc 6660

ttgaggggtt ttttgctgaa aggaggaact atatccggat 6700

<210> 79

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 79

aaacgtctca gatgcaccac caccaccacc acatggccat cgagaaacca g 51

<210> 80

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 80

aaaggcgcgc cttaagaagc taattcacta attgcc 36

<210> 81

<211> 6607

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 载体

<400> 81

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

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ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

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cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

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ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

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gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

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caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

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gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

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cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

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gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

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tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

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catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

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ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

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aagccagctg ttgcttcacg agctgtatgg gctggtgttg gttatgatct tcaaaccttg 6240

caggcaactt ctgagctagt ctccacggcc gttaaggagg tgttggctac tccctcgtat 6300

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tccgtcgaca agcttgcggc cgcactcgag caccaccacc accaccactg agatccggct 6480

gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca ataactagca 6540

taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata 6600

tccggat 6607

<210> 82

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 82

aaacgtctca gatgcaccac caccaccacc acatggttgt aaactcctcg 50

<210> 83

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 83

aaaggcgcgc cctagacctt ctggttagcg 30

<210> 84

<211> 6088

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 载体

<400> 84

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

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ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

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ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

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<212> DNA

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<220>

<223> 载体

<220>

<221> misc_feature

<222> (3998)..(3998)

<223> n是a、c、g或t

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atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 9540

gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 9600

tcttgcccgg cgtcaacacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 9660

atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 9720

agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 9780

gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 9840

cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 9900

tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 9960

ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca 10020

ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc ttcaa 10065

<210> 86

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 86

aaagatatct ctatgcgcac ccgttctc 28

<210> 87

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 87

tttagatcta agcttgagac acctcagcat gcaccattc 39

<210> 88

<211> 8114

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 载体

<400> 88

agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60

acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120

tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctca 240

gaattaaccc tcactaaagg gactagtcct gcaggtttaa acgaattcgc cctttcatct 300

cgagatgctt tattcaggca cgctacgtga gaatattcta atgggatggt ctggccctga 360

gtctgaagta acgcaggaga tgattgagga tgccgctcgc aaagcgaaca ttcacgaatt 420

catcatgtcg ttgcctgatg gctacgaaac gctcagcgga tctaggggat cgttgctatc 480

tggggggcaa aagcagcgaa ttgcaattgc aagggccctg atcagaaatc caaaggtact 540

cctcctcgat gaggccacct cagctctgga ttccgaatct gagaaagtag ttcaagcagc 600

actcgacgca gcagcgaagg gccgtactac aatcgccgtt gcgcatagat tatcaacaat 660

tcagaaagca gatgtcatat atgtgttctc aggagggcgc atcgtggagc agggcgacca 720

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ctcattaatt gaaatagcat atcgaatttc tctagttatg gcccctgagt caccatacat 900

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ctgagtcacc tatcctgcat aattcactcg tgacgataat ctgtagatat agggaactgt 1020

cgtagtactt gaagagacag caacaatcta tctctgggat ttcgtgctga ttttgggctt 1080

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atatgccctg agggttagct tgcatcacct tacccatatg cacactgact tgcattaccc 1200

ggagcatatt ccggtagtcg gagataagca ctttgagata tcttaaggta caactcaata 1260

cgttcctcct tccttgcctc attccacctc acattctaga attcaataac ttcgtatagc 1320

atacattata cgaagttatt aattaacatc atcgtcacta tacacatcgt catcaactcc 1380

atggcgtgag gacttccgag actgctgggc ccttcgtttc tttaatgcct caagagatga 1440

cttcgtaccc gaagagacgc ctgttgtacc ccgttgacgc ttggcggagg gggcttcgtc 1500

ctcgtcagca acccgcgtca tctgcttcct tcgctgagca agataccttc tctcctcgta 1560

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gtccaacttc gccctgtctt cagcatcgag atatttgcct tctagaggat agggattgac 1680

gacctcattg cttggcggcg acggcagcga gatttcctct tcggagtcgg agccaacgtc 1740

ggccaatgcc agcagatcat catcactgtc actcatagta ggaaggttga agtgtgctga 1800

cgaatcagaa tcgcgaagga tgccattgaa ggcatatata ttttaatctg taccttttat 1860

ggtaatttaa tcagatttta taggtattca tgtgcaagtt gcattgaagg aactgtttga 1920

gaaaatcatc ttgactgaac ttttctcaga tatgcattcc agcccgcctt ttggtaacgc 1980

tgagcttcgt gcacaggatc tcgtcccttg ctatagagcc cgcgtccgac gataataacg 2040

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ttcgaaaatt atgccctatg gcaattatca cgtggagtat ccgaatttct ccaggctgtc 3000

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gctaaaatga ctgacaacaa tggagcgtct acagcattgg caacagtggg aacagtatgc 3180

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gctttccaac tccatttgaa ccttcttcga ggcttcgtgg aatttcggat ttccaattat 3900

cgaatcaaca gcttctttga tttgctccac tgtaggcaag ccagttttca aatcaattgc 3960

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gaactgttcg ccaggctcaa ggcgagcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat 5880

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tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt 6000

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acattcaaat atgtatccgc tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 6300

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ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 6600

gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 6660

cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 6720

cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 6780

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<220>

<223> 载体

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aggagtcgca taagggagag cgtcgactat tcctttgccc tcggacgagt gctggggcgt 1740

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acaatggagc gtctacagca ttggcaacag tgggaacagt atgctggtgc atccagttga 3660

taccccaggt tctgcgaaac tggtatgttc gggattgcga gggcgttcct cctctgatgt 3720

tctttttgtt cgccgtttcg gggattccct tcgcagtgta cttcattgat cagaattcga 3780

acactgccat catggttcaa cctcacttgt ttactttctt tagccttata ggcttttggc 3840

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tgagtgacca tgatgactcg cttggcactc agaacatccc cccaccagga aggaggggtg 4800

aattgagttc ggtgcttggg cgttgagccg gcgaatttga agttgctagg cagatggtct 4860

ctgctgaact caagagaagg cgggcacagc tgcaggaact tgtctgcagg tacctcaagg 4920

gcgaattcgc ggccgctaaa ttcaattcgc cctatagtga gtcgtattac aattcactgg 4980

ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg 5040

cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt 5100

cccaacagtt gcgcagccta tacgtacggc agtttaaggt ttacacctat aaaagagaga 5160

gccgttatcg tctgtttgtg gatgtacaga gtgatattat tgacacgccg gggcgacgga 5220

tggtgatccc cctggccagt gcacgtctgc tgtcagataa agtctcccgt gaactttacc 5280

cggtggtgca tatcggggat gaaagctggc gcatgatgac caccgatatg gccagtgtgc 5340

cggtctccgt tatcggggaa gaagtggctg atctcagcca ccgcgaaaat gacatcaaaa 5400

acgccattaa cctgatgttc tggggaatat aaatgtcagg catgagatta tcaaaaagga 5460

tcttcaccta gatccttttc acgtagaaag ccagtccgca gaaacggtgc tgaccccgga 5520

tgaatgtcag ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc aagcgcaaag agaaagcagg 5580

tagcttgcag tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc ggttttatgg acagcaagcg 5640

aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact 5700

ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagctct gatcaagaga 5760

caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg 5820

cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg 5880

ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt 5940

ccggtgccct gaatgaactg caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg 6000

gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat 6060

tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat 6120

ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg 6180

accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg 6240

atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc 6300

tcaaggcgag catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc 6360

cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg 6420

tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg 6480

gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca 6540

tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgaattat taacgcttac aatttcctga 6600

tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatcagg tggcactttt 6660

cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 6720

ccgctcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 6780

tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 6840

agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 6900

gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 6960

ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 7020

gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 7080

cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 7140

acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 7200

cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 7260

cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 7320

ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 7380

tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 7440

atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 7500

tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 7560

actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 7620

aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 7680

ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgacc 7740

aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 7800

ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 7860

ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 7920

actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc 7980

caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 8040

gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 8100

ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 8160

cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt 8220

cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc 8280

acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 8340

ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 8400

gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc 8460

tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat 8520

accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaag 8578

<210> 90

<211> 4657

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 载体

<400> 90

ggtttaaacg aattcgccct ttcatctcga gatgctttat tcaggcacgc tacgtgagaa 60

tattctaatg ggatggtctg gccctgagtc tgaagtaacg caggagatga ttgaggatgc 120

cgctcgcaaa gcgaacattc acgaattcat catgtcgttg cctgatggct acgaaacgct 180

cagcggatct aggggatcgt tgctatctgg ggggcaaaag cagcgaattg caattgcaag 240

ggccctgatc agaaatccaa aggtactcct cctcgatgag gccacctcag ctctggattc 300

cgaatctgag aaagtagttc aagcagcact cgacgcagca gcgaagggcc gtactacaat 360

cgccgttgcg catagattat caacaattca gaaagcagat gtcatatatg tgttctcagg 420

agggcgcatc gtggagcagg gcgaccatca gagcctcctt gaactcaatg gatggtacgc 480

tgaattggtg aacttgcaag gtctcggaga gatttgacgt tcatttattt ttggccactg 540

cttgcataca ttatttgatt aaaggcactc attaattgaa atagcatatc gaatttctct 600

agttatggcc cctgagtcac catacattgt ctgattaaag ggactcgtta attgaaatag 660

cacattggat tcctctgatt atgacccctg agtcacctat cctgcataat tcactcgtga 720

cgataatctg tagatatagg gaactgtcgt agtacttgaa gagacagcaa caatctatct 780

ctgggatttc gtgctgattt tgggcttttg ctttgacggg ctatgactga ggtaatgtag 840

accaataata accctcacgc gaattagata tgccctgagg gttagcttgc atcaccttac 900

ccatatgcac actgacttgc attacccgga gcatattccg gtagtcggag ataagcactt 960

tgagatatct taaggtacaa ctcaatacgt tcctccttcc ttgcctcatt ccacctcaca 1020

ttctagaatt caataacttc gtatagcata cattatacga agttattaat taacatcatc 1080

gtcactatac acatcgtcat caactccatg gcgtgaggac ttccgagact gctgggccct 1140

tcgtttcttt aatgcctcaa gagatgactt cgtacccgaa gagacgcctg ttgtaccccg 1200

ttgacgcttg gcggaggggg cttcgtcctc gtcagcaacc cgcgtcatct gcttccttcg 1260

ctgagcaaga taccttctct cctcgtaccg ctgcatctcc tgagctcggt catacaagat 1320

ctaagcttga gacacctcag catgcaccat tccttgcggc ggcggtgctc aacggcctca 1380

acctactact gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa gggagagcgt cgactattcc 1440

tttgccctcg gacgagtgct ggggcgtcgg tttccactat cggcgagtac ttctacacag 1500

ccatcggtcc agacggccgc gcttctgcgg gcgatttgtg tacgcccgac agtcccggct 1560

ccggatcgga cgattgcgtc gcatcgaccc tgcgcccaag ctgcatcatc gaaattgccg 1620

tcaaccaagc tctgatagag ttggtcaaga ccaatgcgga gcatatacgc ccggagccgc 1680

ggcgatcctg caagctccgg atgcctccgc tcgaagtagc gcgtctgctg ctccatacaa 1740

gccaaccacg gcctccagaa gaagatgttg gcgacctcgt attgggaatc cccgaacatc 1800

gcctcgctcc agtcaatgac cgctgttatg cggccattgt ccgtcaggac attgttggag 1860

ccgaaatccg cgtgcacgag gtgccggact tcggggcagt cctcggccca aagcatcagc 1920

tcatcgagag cctgcgcgac ggacgcactg acggtgtcgt ccatcacagt ttgccagtga 1980

tacacatggg gatcagcaat cgcgcatatg aaatcacgcc atgtagtgta ttgaccgatt 2040

ccttgcggtc cgaatgggcc gaacccgctc gtctggctaa gatcggccgc agcgatcgca 2100

tccatggcct ccgcgaccgg ctgcagaaca gcgggcagtt cggtttcagg caggtcttgc 2160

aacgtgacac cctgtgcacg gcgggagatg caataggtca ggctctcgct aaattcccca 2220

atgtcaagca cttccggaat cgggagcgcg gccgatgcaa agtgccgata aacataacga 2280

tctttgtaga aaccatcggc gcagctattt acccgcagga catatccacg ccctcctaca 2340

tcgaagctga aagcacgaga ttcttcgccc tccgagagct gcatcaggtc ggagacgctg 2400

tcgaactttt cgatcagaaa cttctcgaca gacgtggcgg tgagttcagg ctttttcatt 2460

gtggatgtgt gtggttgtat gtgtgatgtg gtgtgtggag tgaaaatctg tggctggcaa 2520

acgctcttgt atatatacgc acttttgccc gtgatcagtg catgccggat cgaggtgggc 2580

gggaacaacg gtctcgataa tgtacgtaca ctacacacaa agagaagcaa gtgggggcgg 2640

gactgcacgg cacttgtgag acacctcagc atgccggatc gaggtgggcg ggaacaacgg 2700

tctcgataat gtacgtacac tacacacaaa gagaagcaag tgggggcggg actgcacggc 2760

acttgtgaga cacctcagca tgccggatcg aggtgggcgg gaacaacggt ctcgataatg 2820

tacgtacact acacacaaag agaagcaagt gggggcggga ctgcacggca cttgtgagac 2880

acctcagcat gccggatcga ggtgggcggg aacaacggtc tcgataatgt acgtacacta 2940

cacacaaaga gaagcaagtg ggggcgggac tgcacggcac ttgtgagaca cctcagcatg 3000

caccattcct tgcggcggcg gtgctcaacg gcctggatcc acaggacggg tgtggtcgcc 3060

atgatcgcgt agtcgatagt ggctccaagt agcgaagcga gcaggactgg gcggcggcca 3120

aagcggtcgg acagtgctcc gagaacgggt gcgcatagag atgtggagta tccgaatttc 3180

tccaggctgt caagcggcaa ttataaccga gactgagatc gagaagtata taaccgcagc 3240

agtagtggat aaataattgc gaagtcttcc cagcagagcg ggctgttttt tggagttggt 3300

tactgtaaaa tgctaaaatg actgacaaca atggagcgtc tacagcattg gcaacagtgg 3360

gaacagtatg ctggtgcatc cagttgatac cccaggttct gcgaaactgg tatgttcggg 3420

attgcgaggg cgttcctcct ctgatgttct ttttgttcgc cgtttcgggg attcccttcg 3480

cagtgtactt cattgatcag aattcgaaca ctgccatcat ggttcaacct cacttgttta 3540

ctttctttag ccttataggc ttttggcaaa gcctgtacta tccgcccgtc agttaattaa 3600

taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tattaggtaa actaaattca tgacagcctt 3660

ttcttctttc tttccacaaa acaattaaaa aaaataacag aattagaaga aggtaaatat 3720

attggcaaac tcctctcttc cttttactta tttttttgaa agttgcagtg tgtgtgtgtg 3780

ttgttgtttg ttcaaattaa tttgatggtt gttgtattgt aaatttcaat caataaaaac 3840

aaagacataa ataaaaaaaa ccctacctct cttccctgat ctgatttgat cgtacgattc 3900

taagaactca ccgctaaggc cggccctttg acaggtatat cttcagtttc ctcgtcactc 3960

ttggtcaaaa gaccaaagtc atggctggcg atttcctcga tgctttcctc aagaattttc 4020

aaggagttgt ggctttccaa ctccatttga accttcttcg aggcttcgtg gaatttcgga 4080

tttccaatta tcgaatcaac agcttctttg atttgctcca ctgtaggcaa gccagttttc 4140

aaatcaattg ccacgccagc ggcctcagct ctcgatgcca ccattggctt gtcttcagag 4200

tcaccagcaa taacaactgg aacagagtgg cttaagctgt gctgaagtcc gccatatcca 4260

ccattgtaga caagagcatc aacgtgagga agtagagcat cgtagttgaa gtagtcgatc 4320

acgcgagcat tctcaggaac cacaacatca tccggtagct tggcaccgcg gcggcccaat 4380

atggctactg ttaaagtgtc aggctcgtcc ttcaaggcct caagagtagg cacaataaga 4440

tgcttgtaac tgacagcaaa agttccttga gtgaccatga tgactcgctt ggcactcaga 4500

acatcccccc accaggaagg aggggtgaat tgagttcggt gcttgggcgt tgagccggcg 4560

aatttgaagt tgctaggcag atggtctctg ctgaactcaa gagaaggcgg gcacagctgc 4620

aggaacttgt ctgcaggtac ctcaagggcg aattcgc 4657

Claims

1.形成槐糖脂的细胞，其已如此进行了遗传工程改变，使得所述细胞相较于它的野生型而言具有一种经改变的如分别在以下列举的选自下列所述组的至少一种酶的活性：

至少一种酶E₁，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 7、Seq ID Nr. 53、Seq ID Nr. 55、Seq ID Nr. 57、Seq ID Nr. 59、Seq ID Nr. 61或Seq ID Nr. 63，或具有这样的多肽序列：其中相对于Seq ID Nr. 7、Seq ID Nr. 53、Seq ID Nr. 55、Seq ID Nr. 57、Seq ID Nr. 59、Seq ID Nr. 61或Seq ID Nr. 63，最多25%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有带有各参照序列Seq ID Nr. 7、Seq ID Nr. 53、Seq ID Nr. 55、Seq ID Nr. 57、Seq ID Nr. 59、Seq ID Nr. 61或Seq ID Nr. 63的酶的至少50%的酶的活性，其中将酶E₁的酶的活性理解为将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸的能力，

至少一种酶E₂，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 8或Seq ID Nr. 11，或具有这样的多肽序列：其中相对于Seq ID Nr. 8或Seq ID Nr. 11，最多60%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有带有各参照序列Seq ID Nr. 8或Seq ID Nr. 11的酶的至少50%的酶的活性，其中将酶E₂的酶的活性理解为将UDP-葡萄糖和17-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸的能力，

至少一种酶E₃，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 11，或具有这样的多肽序列：其中相对于Seq ID Nr. 11，最多60%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有带有参照序列Seq ID Nr. 11的酶的至少50%的酶的活性，其中将酶E₃的酶的活性理解为将17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸和UDP-葡萄糖转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸的能力，

至少一种酶E₄，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 9，或具有这样的多肽序列：其中相对于Seq ID Nr. 9，最多50%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有带有Seq ID Nr. 9的酶的至少50%的酶的活性，其中将酶E₄的酶的活性理解为将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸1',4''-内酯单乙酸酯，或将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯单乙酸酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯二乙酸酯，或将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸1',4''-内酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯二乙酸酯的能力，

至少一种酶E₅，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 10，或具有这样的多肽序列：其中相对于Seq ID Nr. 10，最多45%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有带有Seq ID Nr. 10的酶的至少50%的酶的活性，其中将酶E₅的酶活性理解为将槐糖脂从细胞转移到周围的培养基中的能力。

2.根据权利要求1的细胞，其特征在于，在其β-氧化中所述细胞被至少部分地阻断。

3.根据权利要求1或2的细胞，其特征在于，所述改变的活性是增加的活性。

4.根据权利要求3的细胞，其特征在于，所述细胞具有增加的下述酶的组合的活性：

E₁E₂、E₁E₃、E₁E₄、E₁E₅、E₂E₃、E₂E₄、E₂E₅、E₃E₄、E₃E₅、E₄E₅、E₁E₂E₃、E₁E₂E₄、E₁E₂E₅、E₁E₃E₄、E₁E₃E₅、E₁E₄E₅、E₂E₃E₄、E₂E₄E₅、E₃E₄E₅、E₁E₂E₃E₄、E₂E₃E₄E₅、E₁E₃E₄E₅、E₁E₂E₄E₅、E₁E₂E₃E₅、E₁E₂E₃E₄和E₁E₂E₃E₄E₅。

5.根据权利要求1或2的细胞，其特征在于，所述细胞具有减少的酶E₃的活性和任选增加的下述酶的组合的活性：

E₁E₂、E₁E₄、E₁E₅、E₂E₄、E₂E₅、E₄E₅、E₁E₂E₄、E₁E₂E₅、E₁E₄E₅和E₁E₂E₄E₅。

6.根据权利要求1或2的细胞，其特征在于，所述细胞具有减少的酶E₄的活性和任选增加的下述酶的组合的活性：

E₁E₂、E₁E₃、E₁E₅、E₂E₃、E₂E₅、E₃E₅、E₁E₂E₃、E₁E₂E₅、E₁E₃E₅和E₁E₂E₃E₅。

7.根据权利要求1或2的细胞，其特征在于，所述细胞具有减少的酶E₃和E₄的活性和任选增加的下述酶的组合的活性：

E₁E₂、E₁E₅、E₂E₅、E₁E₂E₅。

8.根据权利要求1-7的至少一项的细胞，其特征在于，将所述细胞用根据权利要求10或11的至少一种核酸转化。

9.用于生产槐糖脂的方法，所述方法包括下述工艺步骤：

I）使根据权利要求1-8的至少一项的细胞与包含碳源的培养基接触，

III）任选分离形成的槐糖脂。

10.用根据权利要求9的方法得到的槐糖脂制备化妆品制剂、皮肤病学制剂或药物制剂、作物保护制剂和护理剂及清洁剂和表面活性剂浓缩物的用途。

11.分离的DNA，所述DNA选自下述序列：

A）根据Seq ID Nr. 2、Seq ID Nr. 3、Seq ID Nr. 4、Seq ID Nr. 5、Seq ID Nr. 6、Seq ID Nr. 52、Seq ID Nr. 54、Seq ID Nr. 56、Seq ID Nr. 58、Seq ID Nr. 60或Seq ID Nr. 62的序列，

其中根据Seq ID Nr. 2、Seq ID Nr. 52、Seq ID Nr. 54、Seq ID Nr. 56、Seq ID Nr. 58、Seq ID Nr. 60或Seq ID Nr. 62的序列编码能够将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质，

其中所述序列Seq ID Nr. 3编码能够将UDP-葡萄糖和17-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质，

其中所述序列Seq ID Nr. 4编码能够将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸1',4''-内酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸1',4''-内酯单乙酸酯，或将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸1',4''-内酯单乙酸酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸1',4''-内酯二乙酸酯，或将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸1',4''-内酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸1',4''-内酯二乙酸酯的蛋白质，

其中所述序列Seq ID Nr. 5编码能够将槐糖脂从细胞转移到周围的培养基中的蛋白质，

其中所述序列Seq ID Nr. 6编码能够将UDP-葡萄糖和17-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸，或将17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸和UDP-葡萄糖转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸的蛋白质，

B）一种不含内含子的序列，其源自根据A）的序列，且其与根据Seq ID Nr. 2、Seq ID Nr. 3、Seq ID Nr. 4、Seq ID Nr. 5、Seq ID Nr. 6、Seq ID Nr. 52、Seq ID Nr. 54、Seq ID Nr. 56、Seq ID Nr. 58、Seq ID Nr. 60或Seq ID Nr. 62的序列编码相同的蛋白质或肽，

C）一种序列，其编码蛋白质或肽，所述蛋白质或肽包含根据Seq ID Nr. 7、Seq ID Nr. 8、Seq ID Nr. 9、Seq ID Nr. 10、Seq ID Nr. 11、Seq ID Nr. 53、Seq ID Nr. 55、Seq ID Nr. 57、Seq ID Nr. 59、Seq ID Nr. 61或Seq ID Nr. 63的氨基酸序列, 其中所述包含根据Seq ID Nr. 7、Seq ID Nr. 53、Seq ID Nr. 55、Seq ID Nr. 57、Seq ID Nr. 59、Seq ID Nr. 61或Seq ID Nr. 63的氨基酸序列的蛋白质或肽能够将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸，

D）一种序列，其与根据组A）至C）中的任一组的序列至少80%相同，

E）一种序列，其与根据组A）至D）中的任一组的序列的反链杂交，或在考虑遗传密码的简并性的情况下与所述反链杂交，

F）根据组A）至E）中的任一组的序列的衍生物，其通过置换、添加、反转和/或删除一个或多个碱基而得到，和

G）与根据组A）至F）中的任一组的序列互补的序列。

12.载体，其包含如在权利要求11中定义的、根据组A）至G）中的任一组的DNA序列。

13.根据权利要求12的载体用于转化细胞的用途。

14.分离的多肽，其选自：

酶E₁，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 7、Seq ID Nr. 53、Seq ID Nr. 55、Seq ID Nr. 57、Seq ID Nr. 59、Seq ID Nr. 61或Seq ID Nr. 63、特别是Seq ID Nr. 7，或具有这样的多肽序列：其中相对于各个参照序列Seq ID Nr. 7、Seq ID Nr. 53、Seq ID Nr. 55、Seq ID Nr. 57、Seq ID Nr. 59、Seq ID Nr. 61或Seq ID Nr. 63、特别是Seq ID Nr. 7，最多25%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有带有各个参照序列的酶的至少50%的酶的活性，其中将酶E₁的酶的活性理解为将Z-9-十八碳烯酸转化成17-羟基-Z-9-十八碳烯酸的能力，

酶E₂，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 8或Seq ID Nr. 11，或具有这样的多肽序列：其中相对于Seq ID Nr. 8或Seq ID Nr. 11，最多60%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有带有各个参照序列Seq ID Nr. 8或Seq ID Nr. 11的酶的至少50%的酶的活性，其中将酶E₂的酶的活性理解为将UDP-葡萄糖和17-羟基-Z-9-十八碳烯酸转化成17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸的能力，

酶E₃，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 11，或具有这样的多肽序列：其中相对于Seq ID Nr. 11，最多60%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有带有参照序列Seq ID Nr. 11的酶的至少50%的酶的活性，其中将酶E₃的酶的活性理解为将17-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-Z-9-十八碳烯酸和UDP-葡萄糖转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸的能力，

酶E₄，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 9，或具有这样的多肽序列：其中相对于Seq ID Nr. 9，最多50%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有带有Seq ID Nr. 9的酶的至少50%的酶的活性，其中将酶E₄的酶的活性理解为将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸1',4''-内酯单乙酸酯，或将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯单乙酸酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯二乙酸酯，或将17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸1',4''-内酯和乙酰基-辅酶A转化成17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-Z-9-十八碳烯酸-1',4''-内酯二乙酸酯的能力，和

酶E₅，该酶具有多肽序列Seq ID Nr. 10，或具有这样的多肽序列：其中相对于Seq ID Nr. 10，最多45%的氨基酸残基通过删除、插入、置换或这些的组合被改变，且该酶还具有带有Seq ID Nr. 10的酶的至少50%的酶的活性，其中将酶E₅的酶的活性理解为将槐糖脂从细胞转移到周围的培养基中的能力。