JP2013511266A - 細胞、核酸、酵素及びその使用並びにソホロリピッドの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の主題は、核酸、酵素及び細胞並びにソホロリピッドの製造のためのその使用とソホロリピッドの製造方法である。
界面活性剤は、今日では石油化学原料を実質的に基礎として製造される。再生原料を基礎とする界面活性剤の利用は、石油化学原料の予想可能な不足、及び、再生原料を基礎とするか或いは生分解可能である生成物の増加する需要のために、重要な代替物である。
意外なことに、以下に記載の細胞、核酸、ポリペプチド及び方法は、前述の課題を解決できることが見出された。
配列番号7、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61又は配列番号63、特に配列番号7のポリペプチド配列を有するか、又は、そのつどの参照配列 配列番号7、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61又は配列番号63、特に配列番号7に対しアミノ酸残基25%まで、好ましくは20%まで、特に好ましくは15%まで、とりわけ10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、そのつどの前記参照配列 配列番号7、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61又は配列番号63を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%、好ましくは65%、特に好ましくは80%、とりわけ90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E1、その際、酵素E1のための酵素活性とは、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号8又は配列番号11のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号8又は配列番号11に対しアミノ酸残基60%まで、好ましくは25%まで、特に好ましくは15%まで、とりわけ10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、そのつどの参照配列 配列番号8又は配列番号11を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%、好ましくは65%、特に好ましくは80%、とりわけ90%超を有するポリペプチド配列を有する少なくとも1の酵素E2、その際、酵素E2のための酵素活性とは、UDP−グルコース及び17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸を17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号11のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号11に対しアミノ酸残基60%まで、好ましくは25%まで、特に好ましくは15%まで、とりわけ10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、参照配列 配列番号11を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%、好ましくは65%、特に好ましくは80%、とりわけ90%超を有するポリペプチド配列を有する少なくとも1の酵素E3、その際、酵素E3のための酵素活性とは、17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸及びUDP−グルコースを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号9のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号9に対しアミノ酸残基50%まで、好ましくは25%まで、特に好ましくは15%まで、とりわけ10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、配列番号9を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%、好ましくは65%、特に好ましくは80%、とりわけ90%超を有するポリペプチド配列を有する少なくとも1の酵素E4、その際、酵素E4のための酵素活性とは、17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタートへと、又は、17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと、又は17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと変換する能力が理解される(その際、第1のものが好ましい)、
配列番号10のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号10に対しアミノ酸残基45%まで、好ましくは25%まで、特に好ましくは15%まで、とりわけ10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、配列番号10を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%、好ましくは65%、特に好ましくは80%、とりわけ90%超を有するポリペプチド配列を有する少なくとも1の酵素E5、その際、酵素E5のための酵素活性とは、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移す能力が理解される。
R1=H又はCO−CH3、
R2=H又はCO−CH3、
R3=非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって1〜3個の二重結合又は三重結合を含有する二価有機基であって、6〜32個の炭素原子を含むもの、
R4=H、CH3又は非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって1〜3個の二重結合又は三重結合を含有する一価有機基であって、2〜10個の炭素原子を含むもの、及び
n=1又は0]。
E1E2、E1E3、E1E4、E1E5、E2E3、E2E4、E2E5、E3E4、E3E5、E4E5、E1E2E3、E1E2E4、E1E2E5、E1E3E4、E1E3E5、E1E4E5、E2E3E4、E2E4E5、E3E4E5、E1E2E3E4、E2E3E4E5、E1E3E4E5、E1E2E4E5、E1E2E3E5、E1E2E3E4及びE1E2E3E4E5、
このうち次の組み合わせ
E1E2、E1E3、E1E4、E1E5、E2E3、E2E4、E2E5、E3E4、E3E5、E4E5、E1E2E3、E1E2E4、E1E2E5、E1E3E4、E1E3E5、E1E4E5、E2E3E4、E2E4E5、E3E4E5及びE1E2E3E4E5、
特に
E1E2、E1E3、E1E4、E1E5、E2E3、E2E4、E2E5、E3E4、E3E5、E4E5及びE1E2E3E4E5が好ましい。
E1E2、E1E4、E1E5、E2E4、E2E5、E4E5、E1E2E4、E1E2E5、E1E4E5及びE1E2E4E5、特に好ましくは
E1E2、E1E4、E1E5、E2E4、E2E5、E4E5及びE1E2E4E5。
E1E2、E1E3、E1E5、E2E3、E2E5、E3E5、E1E2E3、E1E2E5、E1E3E5及びE1E2E3E5、特に好ましくは
E1E2、E1E3、E1E5、E2E3、E3E5、及びE1E2E3E5。
E1E2、E1E5、E2E5、E1E2E5、
特に好ましくは
E1E2、E1E5及びE2E5。
及び
配列番号6及び参照配列 配列番号6に対して少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも90%、更に好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも99%同一である配列からなる群から選択される核酸配列を含む遺伝子
の改変により酵素活性の減少を達成する本発明の細胞であり、
その際、前記改変は次のものを含む、好ましくは次のものからなる群から選択されている:
遺伝子中への外来DNAの挿入、遺伝子の少なくとも一部の欠失、遺伝子配列中の点突然変異、RNA干渉(siRNa)、アンチセンスRNA又は前記遺伝子に隣接する制御配列の改変(挿入、欠失又は点突然変異)。
[式中、
R1=H又はCO−CH3、
R2=H又はCO−CH3、
R3=非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって1〜3個の二重結合又は三重結合を含有する二価有機基であって、6〜32個、好ましくは7〜19個の炭素原子を含むもの
R4=H、CH3又は非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって1〜3個の二重結合又は三重結合を含有する一価有機基であって、2〜10個の炭素原子を含むもの、及び
n=0又は1である]、
特に一般式(Ia)及び(Ib)の次の化合物:
[式中、
R1=H又はCO−CH3、
R2=H又はCO−CH3、
R3=非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって1〜3個の二重結合又は三重結合を含有する二価有機基であって、6〜32個、好ましくは7〜19個の炭素原子を含むもの
R4=H、CH3又はC9H19、
n=0又は1である]、
特にとりわけ好ましくは一般式(Ia)及び(Ib)の化合物:
[式中、
R1=H又はCO−CH3、
R2=H又はCO−CH3、
R3=非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって1〜3個の二重結合又は三重結合を含有する二価有機基であって、6〜32個、好ましくは7〜19個の炭素原子を含むもの、とりわけC8H15=C7H14
R4=H、CH3又はC9H19、特にH又はCH3、及び
n=1である]
の製造のための、本発明の細胞の使用である。
[式中、
R1=H又はCO−CH3、
R2=H又はCO−CH3、
R3=非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって1〜3個の二重結合又は三重結合を含有する二価有機基であって、6〜32個、好ましくは7〜19個の炭素原子を含むもの
R4=H、CH3又は非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって1〜3個の二重結合又は三重結合を含有する一価有機基であって2〜10個の炭素原子を含むもの、及び
n=0又は1である]、
特に一般式(Ia)及び(Ib)の次の化合物の製造方法:
[式中、
R1=H又はCO−CH3、
R2=H又はCO−CH3、
R3=非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって1〜3個の二重結合又は三重結合を含有する二価有機基であって、6〜32個、好ましくは7〜19個の炭素原子を含むもの
R4=H、CH3又はC9H19、及び
n=0又は1である]、
特にとりわけ好ましくは一般式(Ia)及び(Ib)の化合物の製造方法:
[式中、
R1=H又はCO−CH3、
R2=H又はCO−CH3、
R3=非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって1〜3個の二重結合又は三重結合を含有する二価有機基であって、6〜32個、好ましくは7〜19個の炭素原子を含むもの、とりわけC8H15=C7H14
R4=H、CH3又はC9H19、特にH又はCH3、及び
n=1である]
であって、次の方法工程
I)本発明の細胞を炭素源を含む培地と接触させる工程、
II)細胞に前記炭素源からソホロリピッドを形成することを可能にさせる条件下で、細胞を培養する工程、及び
III)場合によって、この形成されたソホロリピッドを単離する工程
を含むものである。
A1a) 配列番号2、配列番号52又は配列番号54、特に配列番号2に応じた配列、その際、この配列は、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質をコードする、
B1a) A1a)に応じた配列の1から誘導され、かつ、配列番号2、配列番号52又は配列番号54、特に配列番号2に応じた配列と同じタンパク質又はペプチドをコードするイントロン不含配列、
C1a) 配列番号7、配列番号53又は配列番号55、特に配列番号7に応じたアミノ酸配列を含み、かつ、好ましくは、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする配列、
D1a) 群A1a)〜C1a)の1に応じた配列、特に好ましくは群A1a)に応じた配列と、少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも90%、更に好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも99%同一である配列、その際、この配列は好ましくは、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、
E1a) 群A1a)〜D1a)の1に応じた配列、特に好ましくは群A1a)に応じた配列の対ストランドと、ハイブリダイゼーションするか又は遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイゼーションするだろう配列、その際、この配列は好ましくは、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、
F1a) 少なくとも1の塩基、好ましくは少なくとも2の塩基、更に好ましくは少なくとも5の塩基、最も好ましくは少なくとも10の塩基の、しかし、好ましくは100を超えない塩基、特に好ましくは50を超えない塩基、最も好ましくは25を超えない塩基の置換、付加、逆位及び/又は欠失により得られる、群A1a)〜E1a)の1に応じた、特に好ましくは群A1a)に応じた配列の誘導体、その際、この誘導体は好ましくは、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、及び
G1a) 群A1a)〜F1a)の1、特に好ましくは群A1a)に応じた配列に対する相補配列。
A1b) 配列番号56、配列番号58又は配列番号60に応じた配列、その際、この配列は、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質をコードする、
B1b) A1b)に応じた配列から誘導され、かつ、配列番号56、配列番号58又は配列番号60に応じた配列と同じタンパク質又はペプチドをコードするイントロン不含配列、
C1b) 配列番号57、配列番号59又は配列番号61に応じたアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする配列、
D1b) 群A1b)〜C1b)の1に応じた配列、特に好ましくは群A1b)に応じた配列と、少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも86%、更に好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも99%同一である配列、その際、この配列は好ましくは、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、
E1b) 群A1b)〜D1b)の1に応じた配列、特に好ましくは群A1b)に応じた配列の対ストランドと、ハイブリダイゼーションするか又は遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイゼーションするだろう配列、その際、この配列は好ましくは、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、
F1b) 少なくとも1の塩基、好ましくは少なくとも2の塩基、更に好ましくは少なくとも5の塩基、最も好ましくは少なくとも10の塩基の、しかし、好ましくは100を超えない塩基、特に好ましくは50を超えない塩基、最も好ましくは25を超えない塩基の置換、付加、逆位及び/又は欠失により得られる、群A1b)〜E1b)の1に応じた、特に好ましくは群A1b)に応じた配列の誘導体、その際、この誘導体は好ましくは、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、及び
G1b) 群A1b)〜F1b)の1、特に好ましくは群A1b)に応じた配列に対する相補配列。
A1c) 配列番号62に応じた配列、その際、この配列は、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質をコードする、
B1c) A1c)に応じた配列から誘導され、かつ、配列番号62に応じた配列と同じタンパク質又はペプチドをコードするイントロン不含配列、
C1c) 配列番号63に応じたアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする配列、
D1c) 群A1c)〜C1c)の1に応じた配列、特に好ましくは群A1c)に応じた配列と、少なくとも60%、好ましくは少なくとも85%、更に好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも99%同一である配列、その際、この配列は好ましくは、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、
E1c) 群A1c)〜D1c)の1に応じた配列、特に好ましくは群A1c)に応じた配列の対ストランドと、ハイブリダイゼーションするか又は遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイゼーションするだろう配列、その際、この配列は好ましくは、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、
F1c) 少なくとも1の塩基、好ましくは少なくとも2の塩基、更に好ましくは少なくとも5の塩基、最も好ましくは少なくとも10の塩基の、しかし、好ましくは100を超えない塩基、特に好ましくは50を超えない塩基、最も好ましくは25を超えない塩基の置換、付加、逆位及び/又は欠失により得られる、群A1c)〜E1c)の1に応じた、特に好ましくは群A1c)に応じた配列の誘導体、その際、この誘導体は好ましくは、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、及び
G1c) 群A1c)〜F1c)の1、特に好ましくは群A1c)に応じた配列に対する相補配列。
A2) 配列番号3に応じた配列、その際、この配列は、UDP−グルコース及び17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸を17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質をコードする、
B2) A2)に応じた配列から誘導され、かつ、配列番号3に応じた配列と同じタンパク質又はペプチドをコードするイントロン不含配列、
C2) 配列番号8に応じたアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、UDPグルコース及び17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸を17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする配列、
D2) 群A2)〜C2)の1に応じた配列、特に好ましくは群A2)に応じた配列と、少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも90%、更に好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも99%同一である配列、その際、この配列は好ましくは、UDPグルコース及び17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸を17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、
E2) 群A2)〜D2)の1に応じた配列、特に好ましくは群A2)に応じた配列の対ストランドと、ハイブリダイゼーションするか又は遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイゼーションするだろう配列、その際、この配列は好ましくは、UDPグルコース及び17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸を17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、
F2) 少なくとも1の塩基、好ましくは少なくとも2の塩基、更に好ましくは少なくとも5の塩基、最も好ましくは少なくとも10の塩基の、しかし、好ましくは100を超えない塩基、特に好ましくは50を超えない塩基、最も好ましくは25を超えない塩基の置換、付加、逆位及び/又は欠失により得られる、群A2)〜E2)の1に応じた、特に好ましくは群A2)に応じた配列の誘導体、その際、この誘導体は好ましくは、UDPグルコース及び17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸を17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、及び
G2) 群A2)〜F2)の1、特に好ましくは群A2)に応じた配列に対する相補配列。
A3) 配列番号4に応じた配列、その際、この配列は、
17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタートへと、
又は、17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと、
又は17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと変換できるタンパク質をコードし、その際、第1のものが好ましい、
B3) A3)に応じた配列の1から誘導され、かつ、配列番号4に応じた配列と同じタンパク質又はペプチドをコードするイントロン不含配列、
C3) 配列番号9に応じたアミノ酸配列を含み、好ましくは、
17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタートへと、
又は、17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと、
又は17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする配列、その際、第1のものが好ましい、
D3) 群A3)〜D3)の1に応じた、特に好ましくは群A3)に応じた配列と少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも90%、更に好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも99%同一である配列、その際、この配列は、好ましくは
17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタートへと、
又は17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと、
又は17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと変換できるタンパク質又はペプチドをコードし、その際、第1のものが好ましい、
E3) 群A3)〜D3)の1に応じた、特に好ましくは群A3)に応じた配列の対ストランドと、ハイブリダイゼーションするか又は遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイゼーションするだろう配列、その際、この配列は、好ましくは、
17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタートへと、
又は、17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと、
又は、17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと変換できるタンパク質又はペプチドをコードし、その際、第1のものが好ましい、
F3) 少なくとも1の塩基、好ましくは少なくとも2の塩基、更に好ましくは少なくとも5の塩基、最も好ましくは少なくとも10の塩基の、しかし、好ましくは100を超えない塩基、特に好ましくは50を超えない塩基、最も好ましくは25を超えない塩基の置換、付加、逆位及び/又は欠失により得られる、群A3)〜E3)の1に応じた、特に好ましくは群A3)に応じた配列の誘導体、その際、この誘導体は好ましくは、
17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタートへと、
又は、17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと、
又は、17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと変換できるタンパク質又はペプチドをコードし、その際、第1のものが好ましい、
及び
G3) 群A3)〜F3)の1、特に好ましくは群A3)に応じた配列に対する相補配列。
A4) 配列番号5に応じた配列、その際、この配列は、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移すことができるタンパク質をコードする、
B4) A4)に応じた配列から誘導され、かつ、配列番号5に応じた配列と同じタンパク質又はペプチドをコードするイントロン不含配列、
C4) 配列番号10に応じたアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移行できるタンパク質又はペプチドをコードする配列、
D4) 群A4)〜C4)の1に応じた配列、特に好ましくは群A4)に応じた配列と、少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも90%、更に好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも99%同一である配列、その際、この配列は好ましくは、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移行できるタンパク質又はペプチドをコードする、
E4) 群A4)〜D4)の1に応じた配列、特に好ましくは群A1a)に応じた配列の対ストランドと、ハイブリダイゼーションするか又は遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイゼーションするだろう配列、その際、この配列は好ましくは、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移行できるタンパク質又はペプチドをコードする、
F4) 少なくとも1の塩基、好ましくは少なくとも2の塩基、更に好ましくは少なくとも5の塩基、最も好ましくは少なくとも10の塩基の、しかし、好ましくは100を超えない塩基、特に好ましくは50を超えない塩基、最も好ましくは25を超えない塩基の置換、付加、逆位及び/又は欠失により得られる、群A4)〜E4)の1に応じた、特に好ましくは群A4)に応じた配列の誘導体、その際、この誘導体は好ましくは、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移行できるタンパク質又はペプチドをコードする、及び
G4) 群A4)〜F4)の1、特に好ましくは群A4)に応じた配列に対する相補配列。
A5) 配列番号6に応じた配列、その際、この配列は、
UDP−グルコース及び17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸を17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸へと、又は
17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸及びUDP−グルコースを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質をコードし、その際後者のものが好ましい、
B5) A5)に応じた配列から誘導され、かつ、配列番号6に応じた配列と同じタンパク質又はペプチドをコードするイントロン不含配列、
C5) 配列番号11に応じたアミノ酸配列を含み、かつ、好ましくは、
UDP−グルコース及び17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸を17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸へと、又は
17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸及びUDP−グルコースを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする配列、その際、後者のものが好ましい、
D5) 群A5)〜C5)の1に応じた配列、特に好ましくは群A5)に応じた配列と、少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも90%、更に好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも99%同一である配列、その際、この配列は好ましくは、UDPグルコース及び17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸を17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸へと、17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸及びUDPグルコースを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、その際後者のものが好ましい、
E5) 群A5)〜D5)の1に応じた配列、特に好ましくは群A5)に応じた配列の対ストランドと、ハイブリダイゼーションするか又は遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイゼーションするだろう配列、その際、この配列は好ましくは、UDPグルコース及び17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸を17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸へと、又は17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸及びUDPグルコースを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、その際後者のものが好ましい、
F5) 少なくとも1の塩基、好ましくは少なくとも2の塩基、更に好ましくは少なくとも5の塩基、最も好ましくは少なくとも10の塩基の、しかし、好ましくは100を超えない塩基、特に好ましくは50を超えない塩基、最も好ましくは25を超えない塩基の置換、付加、逆位及び/又は欠失により得られる、群A5)〜E5)の1に応じた、特に好ましくは群A5)に応じた配列の誘導体、その際、この誘導体は好ましくは、
UDPグルコース及び17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸を17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸へと、又は
17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸及びUDPグルコースを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、その際後者のものが好ましい、及び
G5) 群A5)〜F5)の1、特に好ましくは群A5)に応じた配列に対する相補配列。
Expect Threshold: 10
Word size: 28
Match Score: 1
Mismatch Score: -2
Gap costs: Linear。
前述のパラメーターは、ヌクレオチド配列比較におけるデフォルトパラメーターである。
このGAPプログラムは同様に、前述のパラメーターと一緒の使用に適している。
Expect Threshold: 10
Word size: 3
Matrix: BLOSUM62
Gap costs: Existence: 11; Extension: 1
Compositional adjustments: Conditional compositional score matrix adjustment。
前述のパラメーターはアミノ酸配列比較におけるデフォルトパラメーターである。
このGAPプログラムは同様に、前述のパラメーターと一緒の使用に適している。
配列番号7、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61又は配列番号63、特に配列番号7のポリペプチド配列を有するか、又は、そのつどの参照配列 配列番号7、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61又は配列番号63、特に配列番号7に対しアミノ酸残基25%までが、好ましくは20%までが、特に好ましくは15%までが、特に10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、そのつどの前記参照配列を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%、好ましくは65%、特に好ましくは80%、とりわけ90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E1、その際、酵素E1の酵素活性とは、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号8又は配列番号11のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号8又は配列番号11に対しアミノ酸残基60%まで、好ましくは25%まで、特に好ましくは15%まで、とりわけ10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、そのつどの参照配列 配列番号8又は配列番号11を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%、好ましくは65%、特に好ましくは80%、とりわけ90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E2、その際、酵素E2の酵素活性とは、UDP−グルコース及び17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸を17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号11のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号11に対しアミノ酸残基60%まで、好ましくは25%まで、特に好ましくは15%まで、とりわけ10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、そのつどの参照配列 配列番号11を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%、好ましくは65%、特に好ましくは80%、とりわけ90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E3、その際、酵素E3の酵素活性とは、17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸及びUDP−グルコースを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号9のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号9に対しアミノ酸残基50%まで、好ましくは25%まで、特に好ましくは15%まで、とりわけ10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、配列番号9を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%、好ましくは65%、特に好ましくは80%、とりわけ90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E4、その際、酵素E4の酵素活性とは、
17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタートへと、
又は、17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと、
又は17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと変換する能力が理解される、その際、第1のものが好ましい、
及び
配列番号10のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号10に対しアミノ酸残基45%まで、好ましくは25%まで、特に好ましくは15%まで、とりわけ10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、配列番号10を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%、好ましくは65%、特に好ましくは80%、とりわけ90%超を有するポリペプチド配列を有する酵素E5、その際、酵素E5の酵素活性とは、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移す能力が理解される。
実施例1:カンジダ・ボンビコラATCC 22214のウラシル栄養要求性突然変異体の作成
カンジダ・ボンビコラATCC 22214のウラシル栄養要求性突然変異体を以前に記載の通り作成した(van Bogaert et al. Yeast. 2007. 24 (3):201-8)。この株をC.ボンビコラATCC 22214 ura-と称呼した。
ソホロリピッド生合成に関与する酵素を同定できるようにするために、まずカンジダ・ボンビコラATCC 22214のゲノムをGLS Flexチタン技術を用いて配列決定した。カンジダ・ボンビコラATCC 22214の遺伝子情報の調査では、5つの遺伝子(配列番号01)のクラスターが同定され、そのコード領域(配列番号02、配列番号03、配列番号04、配列番号05、配列番号06)は遺伝子産物(配列番号07、配列番号08、配列番号09、配列番号10、配列番号11)をコードする。
表3:成功した欠失又は野生型シチュエーションの場合に染色体性SBG1−、SBG2−、SBG3−、SBG4−及びSBG5−遺伝子座の増幅の際に予期されるPCR断片サイズ
株C.ボンビコラATCC 22214、C.ボンビコラATCC 22214 sbg1、C.ボンビコラATCC 22214 sbg2、C.ボンビコラATCC 22214 sbg3、C.ボンビコラATCC 22214 sbg4及びC.ボンビコラATCC 22214 sbg5の繁殖(Propagierung)をYPD寒天プレート上で行う。ソホロリピッドの生産には、以下でSL生産培地と呼ばれる培地が使用される。これは、0.1% KH2PO4、0.5% MgSO4×7H2O、0.01% FeCl3、0.01% NaCl、0.01% ウラシル、0.4% 酵母エキス、0.1% 尿素、10.5% ナタネ油及び10% グルコースからなる。このpH値を4.5に調節し、この培地を続いてオートクレーブ(121℃、20分)を用いて滅菌する。培養の間のpH値の調節は必要でない。
ソホロリピッド生合成に関与する酵素を過剰発現するカンジダ・ボンビコラATCC 22214株の構築を可能にするには、まず、GeneArt AGによって組込/過剰発現カセットが合成される(配列番号75)。
表5:カンジダ・ボンビコラATCC 22214のために開発すべき組込/過剰発現カセット中に存在するモジュール及び重要な制限切断部位に関する概要
表6:染色体性C.ボンビコラLEU2遺伝子座中へのSBG1-、SBG2-、SBG3-、SBG4-及びSBG5発現カセット並びに制御カセットExCatの相同性組み換え後の染色体性LEU2遺伝子座の増幅の際に又は非相同性組込の際に予期すべきPCR断片サイズ
YPD寒天プレート上で株C.ボンビコラATCC 22214 ExCat、C.ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG1-TTSC3、C.ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG2-TTSC3、C.ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG3-TTSC3、C.ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG4-TTSC3及びC.ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG5-TTSC3の増殖を行う。ソホロリピッドの生産には、以下でSL生産培地と呼ばれる培地が使用される。これは、0.1% KH2PO4、0.5% MgSO4×7H2O、0.01% FeCl3、0.01% NaCl、0.01% ウラシル、0.4% 酵母エキス、0.1% 尿素、10.5% ナタネ油及び10% グルコースからなる。このpH値を4.5に調節し、この培地を続いてオートクレーブ(121℃、20分)を用いて滅菌する。培養の間のpH値の調節は必要でない。
大腸菌中のカンジダ・ボンビコラ ATCC22214遺伝子SBG2(配列番号03)の過剰発現のために、プラスミドpTZ_E02_His-GlcTrIを構築した。カンジダ・ボンビコラ ATCC22214からの染色体性DNAを、製造者の指示に応じたRoche Diagnostics (Mannheim)の"ExpandTM High Fidelity"-PCR-Kitを用いたPCRのための鋳型として使用した。SBG2遺伝子をオリゴヌクレオチド1373_GlcTrI_BsmBI_His_fp(配列番号76)及び1373_GlcTrI_AscI_rp(配列番号77)を用いて染色体性DNAから増幅し("PCR protocols. A guide to methods and applications" , 1990, Academic Press)、この過程で5′−末端に6倍のN末端ヒスチジンタグを取り付けた。更に、切断部位BsmBI及びAscIを導入した。このために以下オリゴヌクレオチドを使用した:
大腸菌中のカンジダ・ボンビコラ ATCC22214遺伝子SBG5(配列番号06)の過剰発現のために、プラスミドpTZ_E02_His-GlcTrIIを構築した。カンジダ・ボンビコラATCC22214からの染色体性DNAを、製造者の指示に応じてRoche Diagnostics (Mannheim)の"ExpandTM High Fidelity"-PCR-Kitを用いたPCRのための鋳型として使用した。SBG5遺伝子をオリゴヌクレオチド1373_GlcTrII_BsmBI_His_fp(配列番号79)及び1373_GlcTrII_AscI_rp(配列番号80)を用いて染色体性DNAから増幅し("PCR protocols. A guide to methods and applications" , 1990, Academic Press)、この過程で5′−末端に6倍のN末端ヒスチジンタグを取り付けた。更に、切断部位BsmBI及びAscIを導入した。このために以下オリゴヌクレオチドを使用した:
大腸菌中のカンジダ・ボンビコラ ATCC22214遺伝子SBG3(配列番号04)の過剰発現のために、プラスミドpTZ_E02_His-AcTrを構築した。カンジダ・ボンビコラ ATCC22214からの染色体性DNAを、製造者の記載に応じてRoche Diagnostics (Mannheim)の"ExpandTM High Fidelity"-PCR-Kitを用いたPCRのための鋳型として使用した。SBG3遺伝子をオリゴヌクレオチド1373_AcTr_BsmBI_His_fp(配列番号82)及び1373_AcTr_AscI_rp(配列番号83)を用いて染色体性DNAから増幅し("PCR protocols. A guide to methods and applications" , 1990, Academic Press)、この過程で5′−末端に6倍のN末端ヒスチジンタグを取り付けた。更に、切断部位BsmBI及びAscIを導入した。このために以下オリゴヌクレオチドを使用した:
項目1−3で構築した大腸菌株の個々のコロニーごとに、まず8時間5mlのLB培地(10g/l トリプトン、5g/l 酵母エキス、10g/l NaCl)中で50μg/mgのカナマイシンを用いて37℃及び175rpmで培養した。引き続き、100mlのLB培地を500mlの振盪フラスコ中で第1の予備培養物を用いて接種し、一晩37℃で175rpmで培養した。翌朝に、この第2の予備培養物を、0.1の開始OD600を有する1lのLB培地を接種するために利用した(5l 振盪フラスコ)。全ての培養物を37℃及び175rpmでインキュベーションした。培養物の成長をみかけ光学密度(OD600)をもとに追跡した。約0.3のOD600の達成時に培養温度37℃を20℃に低下させた。0D6000.6ではそのつどの目的遺伝子の発現を0.5mM IPTG(終濃度)の添加により誘導した。全培養工程の間に相応する抗生物質を添加した(カナマイシン50μg/ml)。
遺伝子発現の誘導24時間後に細胞を遠心分離(8000g、20分、4℃)を用いて回収した。1lの培養物は約5gの湿潤バイオマスを生じた。この細胞ペレットを100mlの緩衝液A(100mM Tris、pH7.8、50mM NaCl、20mM イミダゾール)中で再懸濁し、これは付加的にプロテアーゼ阻害剤(Roche, 注文Nr. 11 873 580 001)を含有する。この再懸濁した細胞を6回の継代を通過させてMicrofluidizerによって分解した。更なる遠心分離工程(10000g、20分、4℃)後に、溶解性タンパク質分画を得るために、この上清を濾過した(孔径:0.45μm)。この目的タンパク質をHisタグアフィニティクロマトグラフィカラム(GE, HisTrap FF 1 ml カラム、注文Nr. 17-5319-01)により精製した。この流速は1m/分であった。リニア溶出0〜100%を緩衝液B(100mM Tris、pH7.8,50mM NaCl、500mM イミダゾール)を用いて行った。この場合に、カラム容積20倍の緩衝液Bを使用し、2mlの分画を集めた。タンパク質を有する溶出分画をプールし、濾過ユニットを用いて濃縮した(Amicon Ultra-15, NMWL 10 kDa Centricons, Millipore、注文Nr. UFC901024)。引き続き、そのつどのタンパク質分画をSephadex25(PD-10カラム、GE、注文Nr. 17-0851-01)を用いたゲル濾過を用いて最終的な緩衝液(100mM Tris、pH7.8、50mM NaCl)へと緩衝液交換した(umpuffern)。タンパク質精製をSDS-PAGEを用いて検証した。1lの培養物から3.3mgのSbg2p(タンパク質濃度1.0μg/μl)、7.3mgのSbg5p(タンパク質濃度2.2μg/μl)及び6.9mgのSbg3p(タンパク質濃度2.1μg/μl)に精製した。
ソホロリピッド生合成に関与する酵素Sbg2p、Sbg3p及びSbg5pの機能を検出するために、3つの精製した酵素Sbg2p、Sbg3p及びSbg5pをそのつど個々に並びに全ての可能性のある組み合わせにおいて酵素アッセイを実施した。この実施を全容積350μlにおいて以下のスキームに応じて行った:
遺伝子SBG3を代わりの経路で個々に不活性化し、この相応する突然変異体のフェノタイプをソホロリピッド生合成に関して特性決定した。C.ボンビコラATCC 22214中の相応する突然変異体の構築のために、まずCbSBG3のための欠失カセットをGeneArt AG (Regensburg)により合成した(配列番号14;実施例2参照のこと)。引き続き、Trenzyme GmbH (Konstanz)でC.ボンビコラATCC 22214のオロチジン−5−ホスファート−デカルボキシラーゼをコードする遺伝子CbURA3 (van Bogaert et al. Yeast. 2007. 24(3):201-8)をヒグロマイシン耐性カセットにより交換した。このために、ベクターp-Col-5(配列番号85)のDNAのヒグロマイシンカセットを以下のオリゴヌクレオチドを用いて増幅した:
株C.ボンビコラATCC 22214及びC.ボンビコラATCC 22214 sbg3-hygの増殖をYPD寒天プレート上で行った。ソホロリピッドの生産には、以下でSL生産培地と呼ばれる培地が使用された。これは、0.1% KH2PO4、0.5% MgSO4×7H2O、0.01% FeCl3、0.01% NaCl、0.4% 酵母エキス、0.1% 尿素、10.5% ナタネ油及び10% グルコースからなる。このpH値を4.5に調節し、この培地を続いてオートクレーブ(121℃、20分)を用いて滅菌した。培養の間のpH値の調節は必要でない。
Claims (14)
- 以下からなる群から選択された酵素少なくとも1の、それぞれ以下に特定するような、その野生型に比較して変更した活性を有するように遺伝子工学により改変される、ソホロリピッドを形成する細胞:
配列番号7、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61又は配列番号63のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号7、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61又は配列番号63に対しアミノ酸残基25%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、そのつどの参照配列 配列番号7、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61又は配列番号63を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%を有するポリペプチド配列を有する少なくとも1の酵素E1、その際、酵素E1のための酵素活性とは、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号8又は配列番号11のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号8又は配列番号11に対しアミノ酸残基60%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、そのつどの参照配列 配列番号8又は配列番号11を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%を有するポリペプチド配列を有する少なくとも1の酵素E2、その際、酵素E2のための酵素活性とは、UDP−グルコース及び17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸を17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号11のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号11に対しアミノ酸残基60%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、参照配列 配列番号11を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%を有するポリペプチド配列を有する少なくとも1の酵素E3、その際、酵素E3のための酵素活性とは、17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸及びUDP−グルコースを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号9のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号9に対しアミノ酸残基50%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、配列番号9を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%を有するポリペプチド配列を有する少なくとも1の酵素E4、その際、酵素E4のための酵素活性とは、17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタートへと、又は、17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと、又は17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと変換する能力が理解される、
配列番号10のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号10に対しアミノ酸残基45%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、配列番号10を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%を有するポリペプチド配列を有する少なくとも1の酵素E5、その際、酵素E5のための酵素活性とは、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移す能力が理解される。 - 少なくとも部分的にそのβ−酸化においてブロックされていることを特徴とする請求項1記載の細胞。
- 変更した活性が増加した活性であることを特徴とする請求項1又は2記載の細胞。
- 以下の酵素組み合わせ:
E1E2、E1E3、E1E4、E1E5、E2E3、E2E4、E2E5、E3E4、E3E5、E4E5、E1E2E3、E1E2E4、E1E2E5、E1E3E4、E1E3E5、E1E4E5、E2E3E4、E2E4E5、E3E4E5、E1E2E3E4、E2E3E4E5、E1E3E4E5、E1E2E4E5、E1E2E3E5、E1E2E3E4及びE1E2E3E4E5
の増加した活性を有することを特徴とする請求項3記載の細胞。 - 酵素E3の減少した活性及び場合により以下の酵素組み合わせ:
E1E2、E1E4、E1E5、E2E4、E2E5、E4E5、E1E2E4、E1E2E5、E1E4E5及びE1E2E4E5
の増加した活性を有することを特徴とする請求項1又は2記載の細胞。 - 酵素E4の減少した活性及び場合により以下の酵素組み合わせ:
E1E2、E1E3、E1E5、E2E3、E2E5、E3E5、E1E2E3、E1E2E5、E1E3E5及びE1E2E3E5
の増加した活性を有することを特徴とする請求項1又は2記載の細胞。 - 酵素E3及びE4の減少した活性及び場合により以下の酵素組み合わせ:
E1E2、E1E5、E2E5、E1E2E5
の増加した活性を有することを特徴とする請求項1又は2記載の細胞。 - 請求項1から7のいずれか1項記載の細胞であって、請求項10又は11記載の核酸少なくとも1で形質転換されることを特徴とする細胞。
- 次の方法工程
I)請求項1から8の少なくともいずれか1項記載の細胞を炭素源を含む培地と接触させる工程、
II)細胞に前記炭素源からソホロリピッドを形成することを可能にさせる条件下で細胞を培養する工程、及び
III)場合によって、この形成されたソホロリピッドを単離する工程
を含むソホロリピッドを製造する方法。 - 化粧用、皮膚用又は医薬用調製物、植物保護調製物並びにケア剤及び清浄化剤並びに界面活性剤濃縮物の製造のための請求項9記載の方法で得られるソホロリピッドの使用。
- 以下の配列:
A)配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60又は配列番号62に応じた配列、
その際、配列番号2、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60又は配列番号62に応じた配列は、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質をコードする、
その際、配列番号3の配列は、UDP−グルコース及び17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸を17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質をコードする、
その際、配列番号4の配列は、17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタートへと、又は、17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと、
又は17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと変換できるタンパク質をコードする、
その際、配列番号5の配列は、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移すことができるタンパク質をコードする、
その際、配列番号6の配列は、UDP−グルコース及び17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸を17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸へと、又は17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸及びUDP−グルコースを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質をコードする、
B)A)に応じた配列の1から誘導され、かつ、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60又は配列番号62に応じた配列と同じタンパク質又はペプチドをコードする、イントロン不含配列、
C)配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61又は配列番号63に応じたアミノ酸配列を含むタンパク質又はペプチドをコードする配列、その際、配列番号7、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61又は配列番号63に応じたアミノ酸配列を含む前記タンパク質又はペプチドは、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換することができる、
D)群A)〜C)の1に応じた配列と少なくとも80%同一である配列、
E)群A)〜D)の1に応じた配列の対ストランドとハイブリダイゼーションするか、又は遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイゼーションするだろう配列、
F)1又は複数の塩基の置換、付加、逆位及び/又は欠失によって得られる、群A)〜E)の1に応じた配列の誘導体、及び
G)群A)〜F)の1に応じた配列に対する相補配列、
から選択されている単離DNA。 - 請求項11に定義される群A)〜G)の1に記載のDNA配列を含むベクター。
- 細胞の形質転換のための請求項12記載のベクターの使用。
- 配列番号7、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61又は配列番号63、特に配列番号7のポリペプチド配列を有するか、又は、そのつどの参照配列 配列番号7、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61又は配列番号63、特に配列番号7に対しアミノ酸残基25%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、そのつどの前記参照配列を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%を有するポリペプチド配列を有する酵素E1、その際、酵素E1のための酵素活性とは、Z−9−オクタデセン酸を17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号8又は配列番号11のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号8又は配列番号11に対しアミノ酸残基60%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、そのつどの参照配列 配列番号8又は配列番号11を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%を有するポリペプチド配列を有する酵素E2、その際、酵素E2のための酵素活性とは、UDP−グルコース及び17−ヒドロキシ−Z−9−オクタデセン酸を17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号11のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号11に対しアミノ酸残基60%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、参照配列 配列番号11を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%を有するポリペプチド配列を有する酵素E3、その際、酵素E3のための酵素活性とは、17−(β−D−グルコピラノシル−オキシ)−Z−9−オクタデセン酸及びUDP−グルコースを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号9のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号9に対しアミノ酸残基50%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、配列番号9を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%を有するポリペプチド配列を有する酵素E4、その際、酵素E4のための酵素活性とは、17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタートへと、又は、17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと、又は17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン及びアセチル−補酵素Aを17−L−[(2′−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−Z−9−オクタデセン酸−1′,4″−ラクトン−ジアセタートへと変換する能力が理解される、及び
配列番号10のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号10に対しアミノ酸残基45%までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、配列番号10を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも50%を有するポリペプチド配列を有する酵素E5、その際、酵素E5のための酵素活性とは、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移す能力が理解される、
からなる群から選択された単離ポリペプチド。
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