JP2015119698A - アセチル化スフィンゴイドの製造方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】改変スターメレラ属微生物、特にスターメレラボンビコーラを用いたアセチル化スフィンゴイドを生産する手段の提供。
【解決手段】スフィンゴイドをアセチル化する活性を有するポリペプチドをコードする異種生物由来の遺伝子が導入されたスターメレラ属微生物、並びに該微生物を培養する、アセチル化スフィンゴイドの製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、アセチル化スフィンゴイドを生産する改変スターメレラ属微生物、及び当該微生物を用いたアセチル化スフィンゴイドの製造方法に関する。
スフィンゴ脂質はＬ-セリンとパルミトイル-ＣｏＡなどのアシルＣｏＡとの縮合反応から始まる生合成により合成される。その基本構造となるスフィンゴイド塩基は、主として炭素鎖長１８の分子として合成され、スフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン（スフィンガニン）、６−ヒドロキシスフィンゴシンなどが知られている。これらスフィンゴイド塩基と脂肪酸がアミド結合することでセラミドが合成される。
スフィンゴ脂質は多くの生理機能を有している。特にセラミドおよびスフィンゴイド塩基は皮膚の保湿機能、バリア機能に関与し、皮膚からの水分蒸散を防止し、外界からの様々な刺激から人体を守る役割を担っている。また、フィトスフィンゴシンは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ミクロコッカス菌 (Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ)、アクネ菌(Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ)、カンジダ症原因菌(Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ)、汗疱状白癬菌(Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ)に対する増殖阻害効果が報告されており（非特許文献１、２）、とくにフィトスフィンゴシンのアクネ菌に対する抗菌効果はマクロライド系抗生物質の一つであるエリスロマイシンの効果よりも高いことが知られている（非特許文献３）。
セラミドやスフィンゴイド塩基は、化粧によって補うことで皮膚性状を改善させる効果があることが知られ、また、フィトスフィンゴシンやそのアセチル化物であるテトラアセチルフィトスフィンゴシンは、皮膚に塗ると皮膚に浸透し、セラミドに転換されることが確認されている（特許文献１）。よって、セラミドやスフィンゴイド塩基又はアセチル化フィトスフィンゴシンは外用による皮膚性状改善効果、感染原因菌の増殖抑制効果が期待されている。
また、近年皮膚のセラミド組成を詳細に解析する技術が構築され、脂肪酸とスフィンゴイドの組み合わせにより１２型３４０種以上の分子種が存在することが分かっている（非特許文献４）。例えば飽和型脂肪酸とフィトスフィンゴシンが組み合わされたＮＰ型セラミドとしては、炭素鎖長２３〜３０脂肪酸および炭素鎖長１６〜２６のフィトスフィンゴシンの組み合わせで検出され、脂肪酸とフィトスフィンゴシンの炭素鎖長の合計が４０〜５２の分子が存在すること、飽和型脂肪酸とスフィンゴシンが組み合わされたＮＳ型セラミドとしては炭素鎖長１６〜３０の脂肪酸および炭素鎖長１６〜２６のスフィンゴシンの組み合わせで検出され、脂肪酸とスフィンゴシンの炭素鎖長の合計が４０〜５４の分子が存在することなどが知られている（非特許文献４）。健常な皮膚では鎖長の長いセラミドが多く存在するが、荒れた皮膚ではセラミド量が減少する他、より鎖長の短いセラミド量が増加することが知られている（非特許文献５）。このことから鎖長の長いセラミド又はスフィンゴイド塩基の有用性が期待されている。
しかしながら現在市販されているセラミドやスフィンゴイド塩基又はアセチル化フィトスフィンゴシンは、１ｋｇあたり数万円〜数十万円と非常に高価であり、またその炭素鎖長はＮＰ型セラミドおよびＮＳ型セラミドでは３４、３６又は４０、フィトスフィンゴシンおよびスフィンゴシンでは１８など、限られた鎖長の分子しか提供されていない。
セラミドおよびスフィンゴイド塩基の生産法として、動物および植物由来スフィンゴ脂質は分離精製が困難なため、近年、酵母による発酵を用いたスフィンゴ脂質の生産法の開発が進められている。候補酵母株として、ピチア シフェリイ(Ｐｉｃｈｉａ ｃｉｆｅｒｒｉｉ；現在はウィッカーハモミセス シフェリイ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ ｃｉｆｅｒｒｉｉ））、カンジダ ユチリス(Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ)およびサッカロミセス セレビシエ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)などが挙げられているが、テトラアセチルフィトスフィンゴシンを菌体外に分泌するウィッカーハモミセス シフェリイを利用してテトラアセチルフィトスフィンゴシンを得る方法の開発が積極的に進められている（特許文献６）。本方法で生産されるアセチル化フィトスフィンゴシンの炭素鎖長は主に１８であり、脱アセチル化してフィトスフィンゴイシンとして、または化学合成で脂肪酸とアミド結合させてセラミドとして利用されている。
斯かるウィッカーハモミセス シフェリイにおけるテトラアセチルフィトスフィンゴシン合成の律速段階は、生合成経路のｉｎ ｖｉｔｒｏ解析より、セリンとパルミトイル−ＣｏＡの縮合反応及びフィトスフィンゴシンのアセチル化反応であることが明らかにされ（非特許文献７）、アセチル化酵素としてＳＬＩ１とＡＴＦ２の二つが見出されている。このうち、ＳＬＩ１は、サッカロマイセス セルビシエにおいて、これを発現させた場合にトリアセチルフィトスフィンゴシンを産生することから（非特許文献６）、フィトスフィンゴシンの３つの水酸基及び１つのアミノ基のうちの何れか３箇所のアセチル化に関与すると考えられている。
一方、スターメレラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ）属微生物、例えばスターメレラ ボンビコーラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）、旧学名カンジダ ボンビコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）は著量の糖脂質であるバイオサーファクタントを細胞外に生産でき、高い脂質利用性を有する微生物として知られている（非特許文献８）。しかし、該微生物はセラミド又はスフィンゴ脂質の生産についてはほとんど知られていない。
米国特許第５５７８６４１号明細書 特表平９−５０４４３４号明細書
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本発明は、改変スターメレラ属微生物、特に改変スターメレラ ボンビコーラを用いたアセチル化スフィンゴイドを生産する手段を提供することに関する。
本発明者らは、高い脂質利用性を有する微生物として知られているスターメレラ属微生物について検討したところ、該微生物はセラミド又はスフィンゴ脂質を利用可能な量で生産できないことが判明した。そして、更に検討した結果、当該スターメレラ属微生物にスフィンゴイドをアセチル化する活性を有するポリペプチドをコードする異種生物由来の遺伝子を導入し、当該改変微生物を培養した場合に、意外にもアセチル化スフィンゴイドを利用可能な量で生産でき、またその生産物の炭素鎖長が主として１９又は２０であり、ウィッカーハモミセス シフェリイを用いた場合の１８とは異なることを見出した。
すなわち、本発明は、（１）又は（２）に係るものである。
（１）スフィンゴイドをアセチル化する活性を有するポリペプチドをコードする異種生物由来の遺伝子が導入されたスターメレラ属微生物を培養する、アセチル化スフィンゴイドの製造方法。
（２）スフィンゴイドをアセチル化する活性を有するポリペプチドをコードする異種生物由来の遺伝子が導入されたスターメレラ属微生物。
本発明によれば、本来、セラミド又はスフィンゴ脂質を利用可能な量で生産できないスターメレラ属微生物を利用することにより、セラミド合成の中間体或いはセラミド前駆物質として有用なアセチル化スフィンゴイド、好ましくは炭素鎖長１９又は２０のアセチル化フィトスフィンゴシンを利用可能な量で製造することが可能となる。
アセチル化フィトスフィンゴシン発現量を示すグラフ。（Ａ）トリアセチルフィトスフィンゴシン（ＴｒｉＡＰＳ）の生産、（Ｂ）テトラアセチルフィトスフィンゴシン（ＴＡＰＳ）の生産
本明細書において、アミノ酸配列間の同一性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。具体的には、リップマン−パーソン法（Lipman-Pearson法；Science, 227, 1435, (1985))によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ｖｅｒ.５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行なうことにより算出できる。
また、遺伝子とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨であり、またその長さに何ら制限されるものではない。また、ポリヌクレオチドとしては、ＲＮＡ、ＤＮＡを例示でき、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡを包含する。
また、本明細書では、スフィンゴイドをアセチル化する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子をアセチルトランスフェラーゼ遺伝子ともいい、ＳＬＩ１をコードする遺伝子をＳＬＩ１遺伝子ともいう。
さらに、本明細書において異種生物由来とは、スターメレラ属以外に分類される微生物若しくは生物由来であることを意味する。
本発明において、「スフィンゴイド」としては、下記の基：
を有する炭素鎖長が１８〜２０の長鎖アミノアルコールが挙げられ、例えば、炭素鎖長が１８のスフィンゴイドとしては（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−アミノオクタデカン−１，３，４−トリオール（フィトスフィンゴシン）、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アミノ−４−オクタデセン−１，３−ジオール（スフィンゴシン）、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノオクタデカン−１，３−ジオール（スフィンガニン）、炭素鎖長が１９のスフィンゴイドとしては（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−アミノノナデカン−１，３，４−トリオール（Ｃ１９フィトスフィンゴシン）、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アミノ−４−ノナデセン−１，３−ジオール（Ｃ１９スフィンゴシン）、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノノナデカン−１，３−ジオール（Ｃ１９スフィンガニン）、炭素鎖長が２０のスフィンゴイドとしては（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−アミノイコサン−１，３，４−トリオール（Ｃ２０フィトスフィンゴシン）、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アミノ−４−イコセン−１，３−ジオール（Ｃ２０スフィンゴシン）、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノイコサン−１，３−ジオール（Ｃ２０スフィンガニン）などが挙げられ、このうち炭素鎖長１９〜２０のフィトスフィンゴシンが好ましく、さらに、炭素鎖長２０のフィトスフィンゴシンがより好ましい。
本発明において、スターメレラ属微生物に導入される遺伝子は、スターメレラ属以外に分類される微生物若しくは生物が有する、スフィンゴイドのアセチル化活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であれば良い。好ましくは、ウィッカーハモミセス シフェリイ、サッカロマイセス セレビシエ、またはピチア パストリスから見出され、ＳＬＩ１と命名されたアセチルトランスフェラーゼ、並びに当該ポリペプチドから演繹されるポリペプチド、具体的には、以下の（ａ）〜（ｉ）から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｆ）配列番号４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｇ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｈ）配列番号６で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉ）配列番号６に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
ここで、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ウィッカーハモミセス シフェリイ由来のＳＬＩ１であり、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、サッカロマイセス セレビシエ由来のＳＬＩ１であり、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドはピチア パストリス由来のＳＬＩ１であり、いずれもアセチルトランスフェラーゼ活性、好適にはスフィンゴイドに対するアセチル化活性を有する。
また、（ｂ）、（ｅ）、（ｈ）のポリペプチドにおいて、１〜数個とは１〜８０個、好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個である。
さらに、（ｃ）の配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列としては、配列番号２に示すアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を意味する。（ｆ）の配列番号４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列としては、配列番号４に示すアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を意味する。（ｉ）の配列番号６に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列としては、配列番号６に示すアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、配列番号６のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を意味する。
また（ａ）〜（ｉ）のポリペプチドをコードする遺伝子は、アミノ酸配列が（ａ）〜（ｉ）に該当する限り、いかなるコドンを選択してもよい。例えば、スターメレラ属微生物に適したコドンを選択することが好ましい。
アセチルトランスフェラーゼ活性としては、具体的にはスフィンゴイドに対するアセチル化反応を触媒する活性が挙げられ、好ましくはフィトスフィンゴシンまたはスフィンゴシンの水酸基及びアミノ基に対するアセチル化反応を触媒する活性が挙げられる。
本発明の遺伝子は、配列番号１、３または５に示す塩基配列を参考にプライマーを作製し、それぞれの遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡをテンプレートとする常法のＰＣＲ法で容易に得ることができる。
すなわち、例えば、配列番号１に示すＳＬＩ１遺伝子のＮ末端開始コドンを含む配列からなるオリゴヌクレオチドＡ、及び該遺伝子の終始コドンを含む配列と相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドＢを化学合成し、これらのオリゴヌクレオチドＡとＢを１セットにし、ウィッカーハモミセス シフェリイのＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ反応を行なうことにより得ることができる。また、こうして得られる遺伝子断片を効率よくプラスミドベクター等にクローニングを行なうために、オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に制限酵素切断のための配列を付加して用いることもできる。ここで、プライマーとしては、ＳＬＩ１遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたヌクレオチド等が一般的に使用できるが、既に取得されたＳＬＩ１遺伝子やその断片も良好に利用できる。当該ヌクレオチドとしては、配列番号１に対応する部分ヌクレオチド配列であって、１０〜５０個の連続した塩基、好ましくは１５〜３５個の連続した塩基等が挙げられる。
また、ＰＣＲの条件は、例えば９８℃２分、（９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃１分）×３０サイクルが挙げられる。
また、その当該塩基配列又はアミノ酸配列に従い、ＤＮＡ合成機により人工的に合成して得ることもできる。ＤＮＡ合成に際しては、同一のアミノ酸残基であっても、異なるコドンを選択（コドン変換）することができる。前記コドン変換したＤＮＡの一態様として、ウィッカーハモミセス シフェリイのＳＬＩ１をコードするＤＮＡ中に存在するスターメレラ属微生物におけるレアコドン（当該微生物におけるコドンの使用頻度が少ないもの）を、コードするアミノ酸を同一のまま、スターメレラ属微生物の翻訳機構において利用頻度が高いコドンに変換したＤＮＡが挙げられ、具体的には、配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。同様に、サッカロマイセス セレビシエのＳＬＩ１をコードするＤＮＡ配列をアミノ酸同一のままスターメレラ属微生物において使用頻度の高いコドンに変換したＤＮＡとして配列番号８で示される塩基配列からなるＤＮＡが挙げられ、ピチア パストリスのＳＬＩ１をコードするＤＮＡ配列をアミノ酸同一のままスターメレラ属微生物において使用頻度の高いコドンに変換したＤＮＡとして配列番号９で示される塩基配列から成るＤＮＡが挙げられる。
本発明において、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のスターメレラ属微生物への導入は、スターメレラ属微生物に対して、上述したアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現可能に導入する方法が挙げられる。
当該遺伝子を発現可能に導入する方法としては、特に限定されず、上記のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む核酸断片であって、その上流側で、転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むＤＮＡ断片と適正な形で結合している核酸断片を導入すればよい。
このような断片は、（１）そのまま核酸断片として、あるいはプラスミドベクター等に導入された核酸断片として導入すること、（２）その両端に宿主が有する染色体の一部配列からなる核酸断片が付加された核酸断片として導入すること、により宿主微生物に遺伝的に安定に保持させることができる。導入する遺伝子のコピー数は何ら限定されず、シングルコピーで当該遺伝子を導入しても良いし、マルチコピーで当該遺伝子を導入しても良い。
（１）の核酸断片の宿主微生物内への導入方法としては、エレクトロポレーション法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
また、（２）の断片を導入すれば、核酸断片に付加された宿主染色体が有する配列に相当する部位において相同組換えが起こり、導入した核酸断片が微生物内の染色体に組み込まれる。
尚、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の上流に結合する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位としては、宿主微生物において機能を有するものであればよく、例えば、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の本来の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位、又はその他の公知の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が挙げられる。例えば、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子やシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモータなどを使用することができる。
ここで、遺伝子導入の対象となるスターメレラ属微生物は、スフィンゴイド、少なくともスフィンゴシン又はフィトスフィンゴシンを生産する代謝系を有するものであればよく、例えば、スターメレラ ボンビコーラ、キャンディダ アピコラ、キャンディダ フロリコーラ等が挙げられ、このうちスターメレラ ボンビコーラが好ましく、具体的には、スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株（特開昭６１-３１０８４）又はＮＢＲＣ１０２４３株等が挙げられる。スターメレラ ボンビコーラは、ソホロリピッド（ＳＬ）を生産することが知られているが（非特許文献６）、アセチル化スフィンゴイドの生産能は有さない。
本発明において、アセチル化スフィンゴイドとしては、スフィンゴイドが有するアセチル化可能な基（水酸基、アミノ基等）の水素原子の何れか１以上がアセチル基で置換された化合物を意味する。例えば、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−アミノオクタデカン−１，３，４−トリオール（フィトスフィンゴシン）、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アミノ−４−オクタデセン−１，３−ジオール（スフィンゴシンン）、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノオクタデカン−１，３−ジオール（スフィンガニン）、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−アミノノナデカン−１，３，４−トリオール（Ｃ１９フィトスフィンゴシン）、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アミノ−４−ノナデセン−１，３−ジオール（Ｃ１９スフィンゴシン）、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノノナデカン−１，３−ジオール（Ｃ１９スフィンガニン）、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−アミノイコサン−１，３，４−トリオール（Ｃ２０フィトスフィンゴシン）、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アミノ−４−イコセン−１，３−ジオール（Ｃ２０スフィンゴシン）、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノイコサン−１，３−ジオール（Ｃ２０スフィンガニン）のアセチル化物などが挙げられる。このうち、炭素鎖長１９又は２０のスフィンゴイドの水酸基及びアミノ基の何れか１以上がアセチル基で置換されたアセチル化スフィンゴイドが好ましく、このうち、炭素鎖長が１９又は２０のフィトスフィンゴシンで水酸基およびアミノ基の何れか１以上がアセチル化されたアセチル化フィトスフィンゴシンがより好ましい。また、炭素鎖長が２０のフィトスフィンゴシンで水酸基およびアミノ基の何れか１以上がアセチル化されたアセチル化フィトスフィンゴシンがさらに好ましい。
斯くして作製された微生物は、アセチル化スフィンゴイド、好ましくは炭素鎖長１９又は２０のアセチル化フィトスフィンゴシンを生産する能力を有し、当該微生物を培養したときに培養液中に当該アセチル化スフィンゴイドを蓄積する。
上述した本発明に係る微生物を培地にて培養し、培養液中にアセチル化スフィンゴイドを蓄積させ、培養液に含まれるアセチル化スフィンゴイドを回収することにより、アセチル化スフィンゴイドを製造することができる。
後記実施例に示すように、本発明の微生物を用いることにより、スフィンゴイドの炭素鎖長が１９又は２０のアセチル化スフィンゴイド（例えば、アセチル化Ｃ１９フィトスフィンゴシンやアセチル化Ｃ２０フィトスフィンゴシン）が製造できる。更に、培地に、ペンタデカン酸アルキルエステル又はヘプタデカン酸アルキルエステル又はノナデカン酸アルキルを添加して当該微生物を培養することにより、スフィンゴイドの炭素鎖長が１９のアセチル化スフィンゴイドの生産量又は生産比率を増加させることができる。また、培地にオクタデカン酸アルキルエステルを添加して当該微生物を培養することにより、スフィンゴイドの炭素鎖長が２０のアセチル化スフィンゴイドの生産比率を増加させることができる。
ここで、アルキルエステルとしては、炭素数１〜４のアルキルエステルが挙げられ、好ましくはメチルエステル又はエチルエステルである。
また、当該脂肪酸アルキルエステルの添加量は、好ましくは１質量％以上で、好ましくは３０質量％以下、より好ましくは１０％以下、更に好ましくは３％以下である。また、好ましくは１〜３０質量％、より好ましくは１〜１０質量％、更に好ましくは１〜３質量％である。
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地又は天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩又は硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。
培養は、好ましくは、培養温度２０〜３５℃に制御することが好ましい。このような条件下で、好ましくは２４時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中にアセチル化フィトスフィンゴイドを蓄積することができる。
培養終了後の培養液からアセチル化スフィンゴイドを回収する方法は、特に限定されないが、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはカラムクロマトグラフィー等によってアセチル化スフィンゴイドを回収することができる。
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞スフィンゴイドをアセチル化する活性を有するポリペプチドをコードする異種生物由来の遺伝子が導入されたスターメレラ属微生物を培養する、アセチル化スフィンゴイドの製造方法。
＜２＞スフィンゴイドをアセチル化する活性を有するポリペプチドが以下の（ａ）〜（ｉ）から選ばれるアミノ酸配列からなる、＜１＞記載のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｆ）配列番号４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｇ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｈ）配列番号６で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉ）配列番号６に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
＜３＞前記（ｂ）、（ｅ）、（ｈ）の１〜数個が、１〜８０個、好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個である、＜２＞記載のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。
＜４＞前記（ｃ）のポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、（ｆ）のポリペプチドが、配列番号４に示すアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、（ｉ）のポリペプチドが、配列番号６に示すアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である＜２＞記載のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。
＜５＞スターメレラ属微生物が、スターメレラ ボンビコーラである＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。
＜６＞スターメレラ ボンビコーラがスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株又はスターメレラ ボンビコーラ ＮＢＲＣ１０２４３株である＜４＞記載のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。
＜７＞アセチル化スフィンゴイドがアセチル化フィトスフィンゴシンである＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の製造方法。
＜８＞アセチル化スフィンゴイドが、炭素鎖長が１９又は２０のアセチル化スフィンゴイドである、＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。
＜９＞炭素鎖長が１９又は２０のアセチル化スフィンゴイドが、炭素鎖長が１９又は２０のアセチル化フィトスフィンゴシンである、＜８＞記載のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。
＜１０＞培地にペンタデカン酸アルキルエステル、ヘプタデカン酸アルキルエステル、オクタデカン酸アルキルエステル及びノナデカン酸アルキルエステルから選ばれる１以上の脂肪酸アルキルエステルを添加する、＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。
＜１１＞脂肪酸アルキルエステルが炭素数１〜４のアルキルと脂肪酸のエステルである＜１０＞記載のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。
＜１２＞脂肪酸アルキルエステルの培地への添加量が、好ましくは１〜３０質量％、より好ましくは１〜１０質量％、更に好ましくは１〜３質量％である＜１０＞又は＜１１＞記載のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。
＜１３＞スフィンゴイドをアセチル化する活性を有するポリペプチドをコードする異種生物由来の遺伝子が導入されたスターメレラ属微生物。
＜１４＞スフィンゴイドをアセチル化する活性を有するポリペプチドが以下の（ａ）〜（ｉ）から選ばれるアミノ酸配列からなる、＜１３＞記載のスターメレラ属微生物。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｆ）配列番号４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｇ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｈ）配列番号６で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉ）配列番号６に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
＜１５＞前記（ｂ）、（ｅ）、（ｈ）の１〜数個が、１〜８０個、好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個である、＜１４＞記載のスターメレラ属微生物。
＜１６＞前記（ｃ）のポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、（ｆ）のポリペプチドが、配列番号４に示すアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、（ｉ）のポリペプチドが、配列番号６に示すアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である＜１４＞記載のスターメレラ属微生物。
＜１７＞スターメレラ属微生物が、スターメレラ ボンビコーラである＜１３＞〜＜１６＞のいずれかに記載のスターメレラ属微生物。
＜１８＞スターメレラ ボンビコーラがスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株又はスターメレラ ボンビコーラ ＮＢＲＣ１０２４３株である＜１７＞記載のスターメレラ属微生物。
以下、実施例によって本発明の内容をさらに詳細に説明する。
実施例１：ウィッカーハモミセス シフェリイ由来ＷｃＳＬＩ１遺伝子導入株の作製
（１）導入遺伝子断片の構築
スターメレラ ボンビコーラのコドン使用頻度に合わせて人工合成したウィッカーハモミセス シフェリイ由来アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＷｃＳＬＩ１）（配列番号７）をテンプレートとして配列番号１０、１２または１１，１２のプライマーを用いてＰＣＲすることにより、ＷｃＳＬＩ１遺伝子断片を得た。ＰＣＲの条件は、例えば９８℃２分、（９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃１分）×３０サイクルが挙げられる。ＷｃＳＬＩ１の発現には、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（５’−ＧＡＰＤＨ）とＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（５’−ＵＧＴ）遺伝子のプロモータを使用した。それぞれの配列は配列番号１３と１４、１５と１６のプライマーを用いてスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲすることにより得た。さらに、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ（３’−ＣＹＣ）のターミネータを使用した。３’−ＣＹＣ配列は配列番号１７と１８のプライマーを用いてスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲすることにより得た。これらをＳＯＥ−ＰＣＲを用いて連結し、［５’−ＧＡＰＤＨ ｏｒ ５’−ＵＧＴ］［ＷｃＳＬＩ１］［３’−ＣＹＣ］の遺伝子断片を得た。この遺伝子断片とプラスミドｐＨｓｐ７０Ａ／ＲｂｃＳ２−Ｃｈｌａｍｙ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）を制限酵素ＳａｃＩとＮｃｏＩで処理したものをｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結させ、プラスミド１を得た。形質転換の選抜にはハイグロマイシン耐性遺伝子（配列番号１９）を使用した。ハイグロマイシン耐性遺伝子は配列番号２０と２１のプライマーでハイグロマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｌｏｘＰ−ＰＧＫ−ｇｂ２−ｈｙｇｒｏ−ｌｏｘＰ（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ）をテンプレートとしてＰＣＲし、ＵＲＡ３遺伝子のプロモータ、ターミネータを配列番号２２と２３または２４と２５でスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてそれぞれＰＣＲした増幅物とＳＯＥ−ＰＣＲにて連結し［５’−ＵＲＡ３］［ハイグロマイシン耐性遺伝子］［３’−ＵＲＡ３］の遺伝子断片を得た。さらに、プラスミドｐＵＣ−Ａｒｇ７−ｌｏｘ−Ｂ ＡＲＧ７を配列番号２６と２７のプライマーを用いたＰＣＲでＡＲＧ７以外の領域を増幅し、ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＳＯＥ−ＰＣＲの増幅物と連結し、プラスミド２を得た。プラスミド１とプラスミド２のｌｏｘＰ配列を利用してｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ反応によって連結させ、［５’−ＧＡＰＤＨ ｏｒ ５’−ＵＧＴ］［ＷｃＳＬＩ１］［３’−ＣＹＣ］−［５’−ＵＲＡ３］［ハイグロマイシン耐性遺伝子］［３’−ＵＲＡ３］のように連結したプラスミド３を得た。プラスミド３を配列番号１３と２５または１５と２５のプライマーでＰＣＲすることにより、ＷｃＳＬＩ１導入遺伝子断片を得た。
また、ｃｙｐ５２Ｍ１を欠損させるための遺伝子導入断片としてｃｙｐ５２Ｍ１遺伝子の上流領域を配列番号２８と２９のプライマー、下流領域を配列番号３０と３１のプライマー、またＵＲＡ３遺伝子を配列番号３２と３３のプライマーを用いて、それぞれスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、得られた３断片をＳＯＥ−ＰＣＲにて連結した。この断片をｃｙｐ５２Ｍ１欠損遺伝子断片として使用した。
実施例１において使用したプライマーを表１にまとめる。
（２）ウラシル要求性株の取得
スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９）を０．６８％
Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、２％ グルコース、０．０３％ウラシルおよび１．５％Ａｇａｒを含むＳＤ−Ｕ寒天培地に接種したのち、３０℃で１ヶ月間培養し、得られた菌体を１ｍＬの０．８％食塩水に一白金耳懸濁し、０．６８％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、２％グルコース、０．０３％ウラシル、および５−フルオロオロチン酸、１．５％Ａｇａｒを含むＳＤ-ＵＦ寒天培地に１００μＬ塗抹し３０℃で２週間培養した。生育したコロニーを再度ＳＤ−ＵＦ寒天培地で培養した後、それぞれについてウラシル要求性、５−フルオロオロチン酸耐性を確認し、ウラシル要求性株を取得した。
スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株および得られたウラシル要求性株を５０ｇ／ＬのＹＰＤ Ｂｒｏｔｈ（日本ＢＤ製）５ｍＬを含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間培養した。培養液１ｍＬを５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して集めた菌体からＧｅｎとるくんTM（ＴＡＫＡＲＡバイオ）を用い、添付の方法に従ってゲノムＤＮＡを抽出した。表１記載のプライマー（配列番号３２、３３）およびＫＯＤ−ｐｌｕｓ．ｖｅｒ２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてウラシル生合成に関わるオロチジンデカルボキシラーゼをコードするＵＲＡ３遺伝子を増幅し、ＰＣＲ産物を鋳型としてＵＲＡ３遺伝子の配列をシーケンス解析し、スターメレラ ボンビコーラ ＮＢＲＣ１０２４３株の配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＤＱ９１６８２８）と比較した。その結果、スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株はスターメレラ ボンビコーラ ＮＢＲＣ１０２４３株のＵＲＡ３遺伝子と同じ配列を有すること、ウラシル要求性株は皆５４位のシステインがチロシンに変異していることが確認された。取得した、ウラシル要求性株をスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６−ｕｒａ３株として使用した。
（３）ウラシル要求性株の取得方法
（２）において、ウラシル要求性株の変異位置が確定されたので、例えば下記の遺伝子組換え手段を用いて容易にウラシル要求性株の調製が可能である。
スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＵＲＡ３遺伝子を配列番号３２、３３のプライマーを用いて増幅する。増幅した遺伝子断片を適当なベクターに導入し、５４位のシステインをチロシンに変更する点変異を導入する。点変異を導入したベクターを配列番号３２，３３のプライマーを用いて増幅し、ＵＲＡ３３遺伝子に変異の導入された形質転換断片を得る。スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６を、５ｍＬのＹＰＤ Ｂｒｏｔｈを含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間培養する。得られた培養液を、ＹＰＤ Ｂｒｏｔｈ５０ｍＬを含む坂口フラスコに１％植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍでＯＤ６００＝１〜２になるまで培養する。増殖した菌体を３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して集菌した後、氷上で冷やした滅菌水２０ｍＬで２回洗浄する。菌体を氷冷した１ｍＬの１Ｍソルビトール溶液に懸濁し、５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てたのち、４００μＬの１Ｍソルビトール溶液を加えて氷上におき、ピペッティングで懸濁する。この酵母懸濁液を５０μＬずつ分注し、形質転換用のＤＮＡを１μｇ加える。酵母懸濁液を氷冷した０．２ｃｍギャップのチャンバーに移したのち、ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて２５ｕＦ，３５０Ω、２．５ｋＶのパルスをかける。氷冷した１Ｍソルビトール入りＹＰＤ Ｂｒｏｔｈを加えて１．５ｍＬ容チューブに移し、３０℃で２時間振とうした後、５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して菌体を回収し、２００μＬの１Ｍソルビトール溶液に再懸濁して１００μＬずつ選択培地に塗抹し、３０℃で約１週間培養する。選択培地には、０．６８％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、２％グルコース、０．０３％ウラシル、および５−フルオロオロチン酸、１．５％Ａｇａｒを含むＳＤ-ＵＦ寒天培地を使用する。生育したコロニーを再度ＳＤ−ＵＦ寒天培地で培養した後、それぞれについてウラシル要求性、５−フルオロオロチン酸耐性を確認し、ウラシル要求性株を取得することができる。
（４）ｃｙｐ５２Ｍ１遺伝子欠損株の取得
上記スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６−ｕｒａ３株を、５ｍＬのＹＰＤ Ｂｒｏｔｈを含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間培養した。得られた培養液を、ＹＰＤ Ｂｒｏｔｈ５０ｍＬを含む坂口フラスコに１％植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍでＯＤ６００＝１〜２になるまで培養した。増殖した菌体を３０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心して集菌した後、氷上で冷やした滅菌水２０ｍＬで２回洗浄した。菌体を氷冷した１ｍＬの１Ｍソルビトール溶液に懸濁し、５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てたのち、４００μＬの１Ｍソルビトール溶液を加えて氷上におき、ピペッティングで懸濁した。この酵母懸濁液を５０μＬずつ分注し、形質転換用のＤＮＡ（ｃｙｐ５２Ｍ１欠損遺伝子断片）を１μｇ加えた。酵母懸濁液を氷冷した０．２ｃｍギャップのチャンバーに移したのち、ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて２５ｕＦ，３５０Ω、２．５ｋＶのパルスをかけた。氷冷した１Ｍソルビトール入りＹＰＤ Ｂｒｏｔｈを加えて１．５ｍＬ容チューブに移し、３０℃で２時間振とうした後、５０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心して菌体を回収し、２００μＬの１Ｍソルビトール溶液に再懸濁して１００μＬずつ選択培地に塗抹し、３０℃で約１週間培養した。選択培地には、０．６８％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，２％ グルコース、０．０７７％ ＣＳＭ−ｕｒａ（フナコシ）及び１．５％ Ａｇａｒを含むＳＤ−ｕｒａ寒天培地を使用した。生育したコロニーを配列番号２８、３１のプライマーを用いてＫＯＤ−ＦＸ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）によりコロニーＰＣＲし、増幅される配列長が変化していることを確認したのち、ｃｙｐ５２Ｍ１遺伝子欠損株を得た。
（５）スターメレラ ボンビコーラへのＷｃＳＬＩ１遺伝子の導入
上記スターメレラ ボンビコーラ ｃｙｐ５２Ｍ１遺伝子欠損株およびスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株を、５ｍＬのＹＰＤ Ｂｒｏｔｈを含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間培養した。得られた培養液を、ＹＰＤ Ｂｒｏｔｈ５０ｍＬを含む坂口フラスコに１％植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍでＯＤ６００ｎｍ＝１〜２になるまで培養した。増殖した菌体を３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して集菌した後、氷上で冷やした滅菌水２０ｍＬで２回洗浄した。菌体を氷冷した１ｍＬの１Ｍソルビトール溶液に懸濁し、５０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心し、上清を捨てたのち、４００μＬの１Ｍソルビトール溶液を加えて氷上におき、ピペッティングで懸濁した。この酵母懸濁液を５０μＬずつ分注し、形質転換用のＤＮＡ（ＷｃＳＬＩ１導入遺伝子断片）を１μｇ加えた。酵母懸濁液を氷冷した０．２ｃｍギャップのチャンバーに移したのち、ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて２５ｕＦ，３５０Ω、２．５ｋＶのパルスをかけた。氷冷した１Ｍソルビトール入りＹＰＤ Ｂｒｏｔｈを加えて１．５ｍＬ容チューブに移し、３０℃で２時間振とうした後、５０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心して菌体を回収し、２００μＬの１Ｍソルビトール溶液に再懸濁して１００μＬずつ選択培地に塗抹し、３０℃で約１週間培養した。選択培地には、０．６８％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，２％ グルコース、０．０７７％ ＣＳＭ−ｕｒａ（フナコシ），２００μｇ／ｍＬ ハイグロマイシン及び１．５％ Ａｇａｒを含むＳＤ−ｕｒａ＋ハイグロマイシン寒天培地を使用した。生育したコロニーを配列番号１３と１８又は１５と１８のプライマーを用いてＫＯＤ−ＦＸ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）によりコロニーＰＣＲし、遺伝子がゲノムに挿入されていることを確認したのち、スターメレラ ボンビコーラ ｃｙｐ５２Ｍ１欠損株に遺伝子導入したΔｃｙｐ５２Ｍ１／ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株（ＧＡＰＤＨプロモータを使用）、Δｃｙｐ５２Ｍ１／ｐＵＧＴ−ＷｃＳＬＩ１株（ＵＧＴプロモータを使用）、およびスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株に遺伝子導入したｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株、ｐＵＧＴ−ＷｃＳＬＩ１株を得た。またコントロールとしてハイグロマイシン耐性遺伝子のみを導入した株を得た。
実施例２：ＷｃＳＬＩ１遺伝子導入株におけるアセチル化フィトスフィンゴシン生産性の解析（１）
（１）遺伝子導入株の脂質組成の解析
コントロール株（ハイグロマイシン耐性遺伝子を）、Δｃｙｐ５２Ｍ１／ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株、Δｃｙｐ５２Ｍ１／ｐＵＧＴ−ＷｃＳＬＩ１株をＹＰＤ寒天培地に塗抹し、生育したコロニーを５ ｍＬのＳＤ−Ｕｒａ培地を含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間培養した。得られた培養液 ５００ μＬを５ ｍＬのＳＤ−Ｕｒａ培地を含む１００ｍＬ容試験管に植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで２４〜７２時間培養し、脂質の組成を解析した。
（２）アセチル化フィトスフィンゴシンの定量
培養液を１ｍＬ回収後、クロロホルム：メタノール（２：１）混合溶液を４ｍＬ添加し、ボルテックスした後、１５ｍｉｎ静置した。３０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ遠心し、下層（クロロホルム層）を回収した。回収した液を窒素にて乾固させた後、１ｍＬのメタノールに懸濁、適宜希釈し、フィルターろ過後のサンプルをＬＣＭＳにて測定した。ＬＣＭＳの条件は以下の通りである。
ＬＣ条件：Ｃａｐｃｅｌｌ ｃｏｒｅ Ｃ１８ ２．７ ｕｍφ２．１×５０ｍｍ（資生堂）、Ｏｖｅｎ Ｔｅｍｐ． ４０℃、Ｓｏｌ．Ａ： ０．１％ ＨＣＯ２Ｈ ｉｎ ｗａｔｅｒ、Ｓｏｌ．Ｂ： ＭＥＣＮ、（Ａ６０％、Ｂ４０％） ０．５ｍｉｎ→［（Ａ６０％、Ｂ４０％）→（Ａ０％、Ｂ１００％）５．５ｍｉｎ］→Ｂ１００％ ２ｍｉｎ、［（Ａ０％、Ｂ１００％）→（Ａ６０％、Ｂ４０％）０．０１ｍｉｎ］→（Ａ６０％、Ｂ４０％）２ｍｉｎ、Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ０．６ｍｌ／ｍｉｎ．、Ｉｎｊｅｃｔ ５μｌ、ＭＳ／ＭＳ装置：ＡＰＩ３２００ＱＴｒａｐ（ＡＢ ＳＣＩＥＸ）
図１に、培養２４、４８時間後の脂質組成を示した。コントロールの株ではトリアセチルフィトスフィンゴシン（ＴｒｉＡＰＳ）（炭素鎖長１８）とテトラアセチルフィトスフィンゴシン（ＴＡＰＳ）（炭素鎖長１８）の生産が確認されないのに対して、ＷｃＳＬＩ１を遺伝子導入したスターメレラ ボンビコーラではＴｒｉＡＰＳとＴＡＰＳの生産が確認された。
表３および表４に、培養７２時間目のアセチル化フィトスフィンゴシンの生産量および生産物の割合を示す。
実施例３：ＷｃＳＬＩ１遺伝子導入株におけるアセチル化フィトスフィンゴシン生産性の解析（２）
Δｃｙｐ５２Ｍ１／ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株をＹＰＤ寒天培地に塗抹し、生育したコロニーを５ ｍＬのＳＤ−Ｕｒａ培地を含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間培養した。得られた培養液 １００μＬを５ｍＬのＳＤ−Ｕｒａ培地および炭素鎖長Ｃ１５〜Ｃ１９の脂肪酸エチルエステルを５０ｍＭ含む１００ｍＬ容試験管に植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで７２時間培養し、実施例２と同様の方法で脂質の組成を解析した。
表５および表６として培養７２時間目におけるＣ１８〜Ｃ２０アセチル化フィトスフィンゴシン生産量および生産物の割合を示す。
参考例：ＷｃＳＬＩ１遺伝子導入株におけるアセチル化フィトスフィンゴシン生産性の解析（３）
Δｃｙｐ５２Ｍ１／ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株、ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株、Δｃｙｐ５２Ｍ１／ｐＵＧＴ−ＷｃＳＬＩ１株およびｐＵＧＴ−ＷｃＳＬＩ１株をＹＰＤ寒天培地に塗抹し、生育したコロニーを５ ｍＬのＹＰＤ培地を含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間培養した。得られた培養液 １００μＬを５ｍＬの改良ＹＰＤ培地（１０％ グルコース、１０％ヘキサデカン酸エチル、２％ Ｐｅｐｔｏｎｅ、１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２５ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５０ｍＭ Ｌ−セリン）を含む１００ｍＬ容試験管に植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで７日間培養し、実施例２と同様の方法で脂質の組成を解析した。脂質解析の結果を表７に示す。また、本培養液１ｍＬを２ｍＬのヘキサンで抽出し、ヘキサン層を回収したのち、残った水層に２ｍＬの酢酸エチルを加えて抽出し、酢酸エチル層を回収した。乾燥させた酢酸エチル層の解析からΔｃｙｐ５２Ｍ１／ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株およびΔｃｙｐ５２Ｍ１／ｐＵＧＴ−ＷｃＳＬＩ１株ではソホロリピッドは生産されず、ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株およびｐＵＧＴ−ＷｃＳＬＩ１株ではソホロリピッドが生産されたことを確認した。
実施例４ 他の生物種由来ＳＬＩ１導入株の作製
（１）導入用断片の作製
配列番号３４、３５のプライマーを用いてスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株のゲノムＤＮＡをテンプレートにＰＣＲにてＣＹＰ５２Ｍ１遺伝子の上流部分を増幅させ、配列番号３６、３７のプライマーで増幅させたプラスミド１とｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結することにより、ＧＡＰＤＨプロモーターの前方にＣＹＰ５２Ｍ１遺伝子の上流部分を挿入し、プラスミド１−Ａとした。次に配列番号２２、２５のプライマーを用いてスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株のゲノムＤＮＡをテンプレートにＰＣＲにてＵＲＡ３遺伝子のプロモーターおよびターミネータを含む領域を増幅させ、さらに配列番号２６、２７を用いてプラスミドｐＵＣ−Ａｒｇ７−ｌｏｘ−Ｂ ＡＲＧ７のＡＲＧ７以外の領域を増幅し、ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＵＲＡ３の増幅物と連結した。得られたプラスミドをプラスミド２−Ａとした。さらに、配列番号３８、３９のプライマーを用いてスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株のゲノムＤＮＡをテンプレートにＰＣＲにてＣＹＰ５２Ｍ１遺伝子の下流部分を増幅させ、配列番号４０、４１のプライマーを用いて増幅させたプラスミド２−Ａをｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結することにより、ＵＲＡ３ターミネータの後方にＣＹＰ５２Ｍ１遺伝子の下流部分を挿入し、プラスミド２−Ｂとした。プラスミド１−Ａおよび２−ＢをＣｒｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ反応によって連結させ、プラスミド４とした。配列番号２８、３１のプライマーを用いてプラスミド４をテンプレートにＰＣＲにてｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１断片を得た。
（２）他の生物由来ＳＬＩ１導入用断片の作製
サッカロマイセス セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピチア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｒｉｓ）由来ＳＬＩ１をスターメレラボンビコーラのコドン使用頻度に合わせて人工合成し、それぞれ配列番号８、９の配列を得た。これらをテンプレートに配列番号４２、４３および４４、４５のプライマーを用いてＰＣＲし、ＳｃＳＬＩ１、およびＰｐＳＬＩ１断片を得た。次にプライマー４６、４７を用いてプラスミド４をテンプレートにＰＣＲにてＷｃＳＬＩ１以外の領域を増幅した。ＳｃＳＬＩ１断片またはＰｐＳＬＩ１断片をプラスミドとｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で連結させ、それぞれプラスミド５、６とした。配列番号２８、３１のプライマーを用いてプラスミド５または６をテンプレートにＰＣＲにてｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＳｃＳＬＩ１断片、ｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＰｐＳＬＩ１断片を得た。
（３）各種ＳＬＩ１導入株の作製
上記スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６−ｕｒａ３株を、５ｍＬのＹＰＤ Ｂｒｏｔｈを含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間培養した。えられた培養液を、ＹＰＤ Ｂｒｏｔｈ５０ｍＬを含む坂口フラスコに１％植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍでＯＤ６００＝１〜２になるまで培養した。増殖した菌体を３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して集菌した後、氷上で冷やした滅菌水２０ｍＬで２回洗浄した。菌体を氷冷した１ｍＬの１Ｍソルビトール溶液に懸濁し、５０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心し、上清を捨てたのち、４００μＬの１Ｍソルビトール溶液を加えて氷上におき、ピペッティングで懸濁した。この酵母懸濁液を５０μＬずつ分注し、形質転換用のＤＮＡを１μｇ加えた。酵母懸濁液を氷冷した０．２ｃｍギャップのチャンバーに移したのち、ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて２５ｕＦ，３５０Ω、２．５ｋＶのパルスをかけた。氷冷した１Ｍソルビトール入りＹＰＤ Ｂｒｏｔｈを加えて１．５ｍＬ容チューブに移し、３０℃で２時間振とうした後、５０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心して菌体を回収し、２００μＬの１Ｍソルビトール溶液に再懸濁して１００μＬずつ選択培地に塗抹し、３０℃で約１週間培養した。選択培地には、０．６８％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，２％ グルコース、０．０７７％ ＣＳＭ−ｕｒａ（フナコシ）及び１．５％ Ａｇａｒを含むＳＤ−ｕｒａ寒天培地を使用した。生育したコロニーを配列番号２８，３１のプライマーを用いてＫＯＤ−ＦＸ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）によりコロニーＰＣＲし、増幅される配列長が変化していることを確認したのち、ｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株、ｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＳｃＳＬＩ１株、ｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＰｐＳＬＩ１株を得た。実施例４において使用したプライマーを表８にまとめる。
実施例５ 各種ＳＬＩ１発現株のアセチルフィトスフィンゴシン生産性の評価
実施例４で得られた３株およびｃｙｐ５２Ｍ１欠損株をＹＰＤ寒天培地に塗抹し、生育したコロニーを５ ｍＬのＳＤ−Ｕｒａ培地を含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間培養した。得られた培養液 １００μＬを５ｍＬのＳＤ−Ｕｒａ培地を含む１００ｍＬ容試験管に植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで１２０時間培養し、実施例２と同様の方法で脂質の組成を解析した。表９および表１０として培養１２０時間目におけるＣ１８〜Ｃ２０アセチル化フィトスフィンゴシン生産量および生産物の割合を示す。

Claims (10)

  1. スフィンゴイドをアセチル化する活性を有するポリペプチドをコードする異種生物由来の遺伝子が導入されたスターメレラ属微生物を培養する、アセチル化スフィンゴイドの製造方法。
  2. スフィンゴイドをアセチル化する活性を有するポリペプチドが以下の（ａ）〜（ｉ）から選ばれるアミノ酸配列からなる、請求項１記載のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。
    （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    （ｄ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｆ）配列番号４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    （ｇ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｈ）配列番号６で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｉ）配列番号６に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  3. スターメレラ属微生物が、スターメレラ ボンビコーラである請求項１又は２記載の製造方法。
  4. スフィンゴイドの炭素鎖長が１９又は２０である請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方法。
  5. アセチル化スフィンゴイドがアセチル化フィトスフィンゴシンである請求項１〜４のいずれか１項記載の製造方法。
  6. 培地に、ペンタデカン酸アルキルエステル又はヘプタデカン酸アルキルエステル又はノナデカン酸アルキルエステルを添加し、スフィンゴイドの炭素鎖長が１９であるアセチル化スフィンゴイドを製造する請求項１〜５のいずれか１項記載の製造方法。
  7. 培地に、オクタデカン酸アルキルエステルを添加し、スフィンゴイドの炭素鎖長が２０であるアセチル化スフィンゴイドを製造する請求項１〜５のいずれか１項記載の製造方法。
  8. スフィンゴイドをアセチル化する活性を有するポリペプチドをコードする異種生物由来の遺伝子が導入されたスターメレラ属微生物。
  9. スフィンゴイドをアセチル化する活性を有するポリペプチドが以下の（ａ）〜（ｉ）から選ばれるアミノ酸配列からなる、請求項８記載のスターメレラ属微生物。
    （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    （ｄ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｆ）配列番号４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    （ｇ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｈ）配列番号６で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｉ）配列番号６に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  10. スターメレラ ボンビコーラである請求項８又は９記載のスターメレラ属微生物。
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