CN102680603B

CN102680603B - 一种卷烟主流烟气中4种烟草特有氮亚硝胺TSNAs的测定方法

Info

Publication number: CN102680603B
Application number: CN 201210166674
Authority: CN
Inventors: 顾文博; 吴达; 陆怡峰; 周宛虹; 林华清; 余翀天
Original assignee: Shanghai Tobacco Group Co Ltd; Agilent Technologies China Co Ltd
Current assignee: Shanghai Tobacco Group Co Ltd; Agilent Technologies China Co Ltd
Priority date: 2012-05-24
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2032-05-24
Also published as: CN102680603A

Abstract

本发明涉及卷烟主流烟气中4种烟草特有氮亚硝胺TSNAs含量的方法。本发明采用三重串联四级杆气质联用色谱法测定卷烟主流烟气中4种烟草特有的氮亚硝胺的含量，以三重串联四级杆气质联用仪作为测定仪器，并用内标法定量测定卷烟主流烟气中4中烟草特有的氮亚硝胺NNN、NNK、NAT和NAB的含量。本发明提供了一种准确、操作简便的测定卷烟主流烟气中4种氮亚硝胺TSNAs的测定方法，克服了以往卷烟主流烟气中4种氮亚硝胺TSNAs相关标准检测方法的操作繁琐、费时等缺陷，且本发明测定方法的灵敏度与精密度高，重复性好，适用于烟草行业技术人员对卷烟主流烟气中4种氮亚硝胺TSNAs进行定性或定量测定。

Description

一种卷烟主流烟气中4种烟草特有氮亚硝胺TSNAs的测定方法

技术领域

本发明涉及卷烟主流烟气中4种TSNAs的测定方法，具体涉及一种采用三重串联气质联用色谱法测定卷烟主流烟气中4种烟草特有氮亚硝胺TSNAs含量的方法。

背景技术

烟草特有亚硝胺(TSNAs)是卷烟烟气中诱发癌症的主要活性成分之一，现已发现包括N-亚硝基降烟碱（NNN）、4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（NNK）、N-亚硝基新烟草碱（NAT）、N-亚硝基假木贼碱（NAB）等四种。其中NNK于1977年由Hecht等首次在卷烟烟气中发现。Hoffmann等在1981年对叙利亚金色仓鼠进行了皮下注射研究后认为NNK对哺乳动物有较强的致癌作用，且其致癌性在已发现的四种烟草特有N-亚硝胺中最强。国际癌症研究机构（IARC）根据一系列动物实验研究的结果，有充分的证据确定NNK是人体致癌物，并确定其致癌性等级（IARC Group1）。现NNK已被国内烟草行业列为七种主要有害成分之一重点监控。随着人们对吸烟与健康问题的关注，卷烟产品的安全、卫生越来越得到各方面的重视，因此准确测定卷烟烟气中NNK的含量具有重要的意义。由于卷烟烟气中的烟草特有亚硝胺含量极微，一般浓度均在ng/cig数量级，卷烟烟气又是非常复杂的混合物，因此卷烟烟气中的烟草特有N-亚硝胺的定量分析有相当的难度。目前，检测卷烟烟气中TSNAs的分析方法主要有气相色谱-热能分析仪法（GC-TEA）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）和液相色谱-多级质谱联用法（LC-MS/MS）等。TEA是专一性的检测器，只对亚硝胺和亚硝酸脂响应，因此GC-TEA成为了卷烟主流烟气中烟草特有N-亚硝胺含量测定的经典方法,并以此技术制订了相关国家标准。但是GC-TEA在检测卷烟主流烟气中TSNAs的方法局限于当时仪器水平，要求的前处理方法复杂，试剂消耗和工作量较大，其次该方法信噪比、灵敏度不够理想，定量下限一般在2.5ng/cig左右，并不能完全满足烤烟型卷烟的检测需要；GC-MS一般只适用于TSNAs含量很高的卷烟烟气样品；LCMS/MS灵敏度高，是现在国内外检测TSNAs的一种主要方法，但总体来看其检测数据与GC-TEA法相比仍有一定偏差。随着近些年来分析仪器的飞速发展，其它的一些检测方法也在烟草和烟气中N-亚硝胺的分析上得到了应用。特别是近期出现的三重四极杆气相质谱联用仪因其具有超高的灵敏度，可大大简化卷烟烟气样品的前处理过程，而且它比普通的四极杆气相质谱联用仪对于特征碎片离子具有更强的选择性，可极大的降低背景干扰，提高检测结果的准确性。此外通过商品化固相萃取柱碱性氧化铝采用同TEA类似的前处理方法，可以与GC-TEA法的检测结果取得较好的一致性。

发明内容

本发明的目的正是针对上述现有技术中存在的问题而提供的一种准确分析、操作简便的卷烟主流烟气中4种烟草特有氮亚硝胺TSNAs的测定方法，即采用三重串联四级杆气质联用色谱法，测定卷烟主流烟气中4种TSNAs的含量，以便卷烟生产企业的技术人员对TSNAs进行定性定量测定控制。

为了解决上述技术问题，本发明通过以下的技术方案来实现：

一种卷烟主流烟气中4种烟草特有的氮亚硝胺TSNAs的测定方法，为采用三重串联四级杆气质联用色谱法测定卷烟主流烟气中4种烟草特有的氮亚硝胺（TSNAs）的含量。

进一步的，采用三重串联四级杆气质联用色谱法进行测定时，采用三重串联四级杆气质联用仪作为测定仪器，并用内标法定量测定卷烟主流烟气中4中烟草特有的氮亚硝胺（TSNAs）的含量。

更进一步的，使用三重串联四级杆气质联用仪时，采用模式为氨气作反应气的正化学离子（PCI）模式。

本发明的4种烟草特有的氮亚硝胺TSNAs为N-亚硝基降烟碱（NNN）、4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（NNK）、N-亚硝基新烟草碱（NAT）以及N-亚硝基假木贼碱（NAB）。

本发明所采用的三重串联四级杆气质联用仪为美国Agilent公司的7000B型号的三重串联四级杆气质联用仪产品。

本发明的卷烟主流烟气中4种烟草特有的氮亚硝胺TSNAs的测定方法，主要包括以下步骤：

1）配置标准工作溶液和内标溶液并绘制标准工作曲线：

A、配置五级标准工作溶液，每级标准工作溶液均为含有NNN、NNK、NAT和NAB的二氯甲烷溶液；配置内标溶液，所述内标溶液为含有D4-NNN、D4-NNK、D4-NAT和D4-NAB的二氯甲烷溶液；

B、将每级标准工作溶液中加入相同体积的内标溶液，将加有内标物D4-NNN、D4-NNK、D4-NAT和D4-NAB的五级标准工作溶液分别采用三重串联四级杆气质联用仪进行测定，获得氮亚硝胺的标准色谱图，分别以标准化合物NNN、NNK、NAT或NAB的峰面积与相应内标物D4-NNN、D4-NNK、D4-NAT或D4-NAB的峰面积之比为Y轴、以标准化合物的浓度与相应内标化合物的浓度之比为X轴绘制标准工作曲线，分别获得NNN、NNK、NAT和NAB四条标准工作曲线。

较佳的，步骤1）的A中，所述每级标准工作溶液均为含有NNN、NNK、NAT和NAB的二氯甲烷溶液，其中，第一级工作溶液中NNN、NNK、NAT和NAB的浓度均为5ng/mL；第二级工作溶液中NNN、NNK、NAT和NAB的浓度均为25ng/mL；第三级工作溶液中NNN、NNK、NAT和NAB的浓度均为50ng/mL；第四级工作溶液中NNN、NNK、NAT和NAB的浓度均为75ng/mL；第五级工作溶液中NNN、NNK、NAT和NAB的浓度均为500ng/mL.

较佳的，步骤1）的A中，所述内标溶液为含有D4-NNN、D4-NNK、D4-NAT和D4-NAB的二氯甲烷溶液，其中，内标溶液中D4-NNN、D4-NNK、D4-NAT和D4-NAB的浓度均为400ng/mL。

较佳的，步骤1）的B中，加有内标物D4-NNN、D4-NNK、D4-NAT和D4-NAB的各级标准工作溶液中的内标化合物D4-NNN、D4-NNK、D4-NAT和D4-NAB的浓度均为20ng/mL。

2）采用滤片捕集方式捕集卷烟烟气，滤片采用二氯甲烷萃取，萃取时加入内标溶液并超声萃取，获得加有内标化合物的萃取液。

较佳的，所述滤片捕集方式根据GBT19609-2004标准方法捕集卷烟烟气；所述滤片，如可以为剑桥滤片。

较佳的，所述加有内标化合物的萃取液中的内标化合物D4NNN、D4-NNK、D4NAT和D4-NAB的质量均为400ng，即加入1ml含有D4-NNN、D4-NNK、D4-NAT和D4NAB的浓度均为400ng/mL的内标溶液。

3）将加有内标化合物的萃取液采用碱性氧化铝SPE小柱洗脱纯化，获得洗脱液。

较佳的，洗脱纯化时，先采用洗涤液对萃取液进行淋洗，再采用洗脱液对萃取液进行洗脱。

较佳的，所述洗涤液为二氯甲烷；所述洗脱液为甲醇和二氯甲烷的混合液，该混合液中甲醇的体积百分比为8%。

进一步的，洗脱纯化时，萃取液、洗涤液和洗脱液的体积比为1:1∶1。如取3ml萃取液上碱性氧化铝SPE小柱，先采用3ml的二氯甲烷进行淋洗，再采用3ml甲醇体积百分比为8%的甲醇和二氯甲烷的混合液进行洗脱。

4）将步骤3）获得的洗脱液采用三重串联四级杆气质联用仪进行测定，获得氮亚硝胺的标准色谱图，分别以卷烟主流烟气中的待测化合物NNN、NNK、NAT或NAB的峰面积与相应内标物D4-NNN、D4-NNK、D4-NAT或D4-NAB的峰面积之比获得相应的Y值，根据相应的Y值、相应内标化合物的质量和相应的标准工作曲线计算获得卷烟主流烟气中4种氮亚硝胺NNN、NNK、NAT和NAB的含量。

上述步骤1）和步骤4）中采用三重串联四级杆气质联用仪进行测定时的色谱条件为：

三重串联四级杆气质联用仪配CI源（也称为化学离子源）；其色谱柱为：30m×250um的DB-35UI色谱柱或相当于DB系列的色谱柱；其色谱柱内的膜厚为：0.25μm。

三重串联四级杆气质联用仪的仪器条件为：GC进样口温度为250℃，初始炉温为50℃；载气流速为1.2ml/min；进样量为2μl；传输线温度为290℃。

三重串联四级杆气质联用仪的程序升温梯度如表1所示的升温梯度：

表1

Rate/℃	Value/℃	Hold/min	Runtime/min
					50	1	1
30	170	0	5
				5	230	0	17
30	290	5	24
					290	0	24

三重串联四级杆气质联用仪的MRM参数如表2所示：

表2

Name	Precursor ion	Product ion	DW	CE
					D4NAB	196	166	25	5
NAB	192	162	25	5
					D4NAT	194	164	25	5
NAT	190	160	25	5

D4-NNN	182	152	25	5
					NNN	178	148	25	5
D4-NNK	212	126	75	5
					NNK	208	122	75	5

本发明用标准工作溶液制备标准工作曲线。由保留时间可定性检测4种氮亚硝胺TSNAs，根据标准工作溶液的浓度及4种氮亚硝胺TSNAs的响应峰面积，采用内标法进行定量测定。本发明的标准工作曲线的线性相关系数R²＞0.99。

采用本发明的测定方法每次试验应制作新的标准工作曲线，每20次样品测定后，应增加一个中等浓度的加有内标物的标准工作溶液进行测定，如果测得的标准化合物的值与中等浓度的加有内标物的标准工作溶液的值相差超过3%，则应重新进行标准工作曲线的制作，以确保测试的准确性。

本发明的测定方法中，若待测试样溶液的浓度超出标准工作曲线的浓度适用范围，则需改变萃取液的稀释倍数后重新测定。本发明的测定方法可确定卷烟主流烟气中4种氮亚硝胺TSNAs的检出限为0.1μg/支、定量下限为0.3μg/支。

获得的洗脱液采用三重串联四级杆气质联用仪进行测定，获得氮亚硝胺的标准色谱图，分别以卷烟主流烟气中的待测化合物NNN、NNK、NAT或NAB的峰面积与相应内标物D4-NNN、D4-NNK、D4-NAT或D4-NAB的峰面积之比获得相应的Y值，根据相应的Y值、相应内标化合物的质量和相应的标准工作曲线计算获得卷烟主流烟气中4种氮亚硝胺NNN、NNK、NAT和NAB的含量。

各氮亚硝胺的含量为各种氮亚硝胺的总质量除以卷烟的总支数即可获得每支卷烟主流烟气中4种氮亚硝胺NNN、NNK、NAT和NAB的相应含量，单位为纳克每支（ng/cig）。其计算公式为：A=M/m，单位为纳克每支（ng/cig）；其中，M代表由标准工作曲线得出的各种氮亚硝胺TSNAs的相应质量总量，单位为纳克（ng）；m为卷烟的总支数，单位为支（cig）。

本发明所取用的洗脱液进行三重串联四级杆气质联用色谱测定时，该洗脱液可以为萃取液的一部分；由于洗脱液样品中待测物与内标物的比值一定，所以待测物的质量含量一定。本发明所采用的二氯甲烷、甲醇等均为色谱纯试剂。

本发明优点是：提供了一种准确、操作简便的测定卷烟主流烟气中4种氮亚硝胺TSNAs的测定方法，克服了以往卷烟主流烟气中4种氮亚硝胺TSNAs相关标准检测方法的操作繁琐、费时等缺陷，且本发明测定方法的灵敏度与精密度高，重复性好，适用于烟草行业技术人员对卷烟主流烟气中4种氮亚硝胺TSNAs进行定性或定量测定。

附图说明

图1：TSNAs标准色谱图

图中，从左到右的四组色谱峰中，各组色谱峰的较高峰值分别代表的内标物D4-NAT、D4-NNN、D4-NAB、D4-NNK色谱峰；各组色谱峰的较底峰值分别代表标准物NAT、NNN、NAB、NNK的色谱峰。

图2：样品氮亚硝胺的色谱图

图中，从左到右的四组色谱峰中，各组色谱峰的较高峰值分别代表内标物D4-NAT、D4-NNN、D4-NAB、D4-NNK的色谱峰；各组色谱峰的较底峰值分别代表待测物NAT、NNN、NAB、NNK的色谱峰。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

实施例1

实施例中所采用的二氯甲烷、甲醇等试剂均为色谱纯试剂。

标准工作溶液和内标溶液的配置：

单一标准储备液：用二氯甲烷作溶剂，分别配制NNN、NNK、NAT、NAB标准储备液，各单一标准储备液中NNN、NNK、NAT或NAB的含量计算浓度为100μg/ml，贮存于0℃～4℃条件下，可储存6个月。

混合内标储备液（即内标溶液）：用二氯甲烷作溶剂，配置含有D4NNN、D4NNK、D4NAT、D4-NAB的内标储备液，各内标物的含量计算浓度均为400ng/ml，贮存于0℃～4℃条件下，可储存6个月。

加有内标物的标准工作溶液：采用上述单一标准储备液和混合内标储备液，按表3配制加有内标物的标准工作溶液系列，如表3所示，并采用二氯甲烷定容，即配即用。每一级加有内标物的标准工作溶液中均含有D4-NNN、D4-NNK、D4-NAT和D4-NAB各20ng/mL。

表3

序号	NNK ng/ml	NNN ng/ml	NAT ng/ml	NAB ng/ml
					Lv1	5	5	5	5
Lv2	25	25	25	25
					Lv3	50	50	50	50
Lv4	75	75	75	75
					Lv5	500	500	500	500

用加有内标物的标准工作溶液制定标准工作曲线时，其中，lv1级标准工作溶液含有NNK、NNN、NAT、NAB各5ng/mL,lv2级标准工作溶液含有NNK、NNN、NAT、NAB各25ng/mL,lv3级标准工作溶液含有NNK、NNN、NAT、NAB各50ng/mL,lv4级标准工作溶液含有NNK、NNN、NAT、NAB各75ng/mL,lv5级标准工作溶液含有NNK、NNN、NAT、NAB各500ng/mL,上述所有5级标准工作溶液分别含有内标物D4-NNK、D4-NNN、D4-NAT、D4-NAB各20ng/mL；，如表3所示。

以内标法做标准工作曲线：将加有内标物D4-NNN、D4-NNK、D4-NAT和D4-NAB的五级标准工作溶液分别采用三重串联四级杆气质联用仪进行测定，获得氮亚硝胺的标准色谱图（如图1所示），分别以标准化合物NNN、NNK、NAT或NAB的峰面积与相应内标物D4-NNN、D4-NNK、D4-NAT或D4-NAB的峰面积之比为Y轴、以标准化合物的质量与相应内标化合物的浓度之比为X轴绘制标准工作曲线，分别获得NNN、NNK、NAT和NAB四条标准工作曲线，如表4所示。

表4 TSNAs标准曲线及相关系数

化合物	线性公式	线性相关系数
			NAB	Y=0.1082x-0.2568	0.9996
NAT	Y=0.2041x-0.0474	0.9994
			NNN	Y=0.1146x-0.2119	0.9997
NNK	Y=0.2708x-0.9296	0.9999

选取卷烟20支，根据GBT19609-2004标准方法用bogwalt20孔道旋转式吸烟机抽吸，并用剑桥滤片收集卷烟烟气。滤片加入1mL上述内标溶液（即混合内标储备液），用20mL二氯甲烷萃取滤片，并超声萃取40min，获得加有内标化合物的萃取液，取3ml加有内标化合物的萃取液，上样并过碱性氧化铝SPE小柱洗脱纯化，洗脱纯化时先采用3ml的二氯甲烷进行淋洗，再3ml的甲醇和二氯甲烷的混合液（该混合液中甲醇的体积百分比为8%）进行洗脱，收集洗脱液，装入色谱瓶。将获得的洗脱液采用三重串联四级杆气质联用仪（三重串联四级杆气质联用仪配CI源）进行测定，获得样品氮亚硝胺的标准色谱图（如图2所示），分别以卷烟主流烟气中的待测化合物NNN、NNK、NAT或NAB的峰面积与相应内标物D4-NNN、D4-NNK、D4-NAT或D4-NAB的峰面积之比获得相应的Y值，根据相应的Y值、相应内标化合物的质量和相应的标准工作曲线计算获得卷烟主流烟气中4种氮亚硝胺NNN、NNK、NAT和NAB的含量，如表5所示。

待测样品目标化合物及相应内标峰面积比例由仪器测得，代入相应的标准工作曲线公式可计算出20支卷烟中各种氮亚硝胺的总量，进而计算出每支卷烟主流烟气中4种氮亚硝胺NNN、NNK、NAT和NAB的相应含量，如表5所示。上述各氮亚硝胺的总量除以卷烟的总支数即可获得每支卷烟主流烟气中4种氮亚硝胺NNN、NNK、NAT和NAB的相应含量，单位为纳克每支（ng/cig）。其计算公式为：A=M/m，单位为纳克每支（ng/cig）；其中，M代表由标准工作曲线得出的各种氮亚硝胺TSNAs的相应质量总量，单位为纳克（ng）；m为卷烟的总支数，单位为支（cig）。

表5 烟气中TSNAs的测定结果（单位ng/cig）

序号	NNK	NNN	NAT	NAB
					1	5.51	4.71	6.58	1.54
2	4.67	6.95	10.06	2.43
					3	12.79	66.12	30.86	7.42
4	19.34	106.16	43.02	10.29
					5	117.5	168.50	125.34	21.98

实施例1的测定试验结果显示：采用该测定方法对卷烟主流烟气中4中氮亚硝胺TSNAs进行定性和定量测定，测定方法可靠，操作简便；克服了以往卷烟主流烟气中4种氮亚硝胺TSNAs相关标准检测方法的操作繁琐、费时等缺陷，且该测定方法的灵敏度与精密度高，重复性好。

Claims

1.一种卷烟主流烟气中4种烟草特有的氮亚硝胺TSNAs的测定方法，为采用三重串联四级杆气质联用色谱法测定卷烟主流烟气中4种烟草特有的氮亚硝胺NNN、NNK、NAT和NAB的含量，采用三重串联四级杆气质联用仪作为测定仪器，并用内标法定量测定卷烟主流烟气中4种烟草特有的氮亚硝胺TSNAs的含量，采用模式为氨气作反应气的正化学离子PCI模式，采用三重串联四级杆气质联用仪进行测定时的色谱条件为：三重串联四级杆气质联用仪配CI源；其色谱柱为：30m×250μm的DB-35UI色谱柱或相当于DB系列的色谱柱。

2.如权利要求1所述的卷烟主流烟气中4种烟草特有的氮亚硝胺TSNAs的测定方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

1）配置标准工作溶液和内标溶液并绘制标准工作曲线：

B、将每级标准工作溶液中加入相同体积的内标溶液，将加有内标物D4-NNN、D4-NNK、D4-NAT和D4-NAB的五级标准工作溶液分别采用三重串联四级杆气质联用仪进行测定，获得氮亚硝胺的标准色谱图，分别以标准化合物NNN、NNK、NAT或NAB的峰面积与相应内标物D4-NNN、D4-NNK、D4-NAT或D4-NAB的峰面积之比为Y轴、以标准化合物的浓度与相应内标化合物的浓度之比为X轴绘制标准工作曲线，分别获得NNN、NNK、NAT和NAB四条标准工作曲线；

2）采用滤片捕集方式捕集卷烟烟气，滤片采用二氯甲烷萃取，萃取时加入内标溶液并超声萃取，获得加有内标化合物的萃取液；

3）将加有内标化合物的萃取液采用碱性氧化铝SPE小柱洗脱纯化，获得洗脱液；

3.如权利要求2所述的卷烟主流烟气中4种烟草特有的氮亚硝胺TSNAs的测定方法，其特征在于，步骤1）的A中，所述每级标准工作溶液均为含有NNN、NNK、NAT和NAB的二氯甲烷溶液，其中，第一级标准工作溶液中NNN、NNK、NAT和NAB的浓度均为5ng/mL；第二级标准工作溶液中NNN、NNK、NAT和NAB的浓度均为25ng/mL；第三级标准工作溶液中NNN、NNK、NAT和NAB的浓度均为50ng/mL；第四级标准工作溶液中NNN、NNK、NAT和NAB的浓度均为75ng/mL；第五级标准工作溶液中NNN、NNK、NAT和NAB的浓度均为500ng/mL。

4.如权利要求2所述的卷烟主流烟气中4种烟草特有的氮亚硝胺TSNAs的测定方法，其特征在于，步骤1）的B中，加有内标物D4-NNN、D4-NNK、D4-NAT和D4-NAB的各级标准工作溶液中的内标化合物D4-NNN、D4-NNK、D4-NAT和D4-NAB的浓度均为20ng/mL。

5.如权利要求2所述的卷烟主流烟气中4种烟草特有的氮亚硝胺TSNAs的测定方法，其特征在于，步骤3）中，所述加有内标化合物的萃取液中的内标化合物D4-NNN、D4-NNK、D4-NAT和D4-NAB的质量均为400ng。

6.如权利要求2所述的卷烟主流烟气中4种烟草特有的氮亚硝胺TSNAs的测定方法，其特征在于，步骤4）中，洗脱纯化时，先采用洗涤液对萃取液进行淋洗，再采用洗脱液对萃取液进行洗脱。

7.如权利要求2所述的卷烟主流烟气中4种烟草特有的氮亚硝胺TSNAs的测定方法，其特征在于，步骤4）中，所述洗涤液为二氯甲烷；所述洗脱液为甲醇和二氯甲烷的混合液，该混合液中甲醇的体积百分比为8%。

8.如权利要求1-7任一所述的卷烟主流烟气中4种烟草特有的氮亚硝胺TSNAs的测定方法在卷烟产品质量监测或TSNAs含量控制中的应用。