CN102676679B - 一种鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系的方法。本发明提供了用于鉴定芽黄标记光敏不育系的引物组、PCR试剂组和试剂盒，还提供了鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系的方法。本发明的实验证明，本发明筛选出10个引物对，用其进行PCR扩增，这10个引物对特异性高，可以根据10个引物对的扩增产物大小来鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系，再结合待测样本的表型特征，从而实现芽黄标记光敏不育系的鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系的方法。
背景技术
快速准确地鉴定品种对于品种审定、假种鉴别和产权纠纷均有重要作用。然而，我国很多品种真伪的鉴定大多依靠田间表现鉴定，此法依赖于品种表现型差异，虽然鉴定方法直观简单，但是作物的表现型容易受到栽培措施和环境条件的影响。随着分子生物学技术的发展，从DNA水平上进行鉴定使得结果更客观、准确。目前，用SSR分子标记技术对品种进行鉴定的方法已经在各种作物中进行应用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于鉴定芽黄标记光敏不育系的引物组。
本发明提供的引物组，由如下10个引物对组成：
1）由序列表中序列1所示的DNA分子和序列表中序列2所示的DNA分子组成的引物对；
2）由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子组成的引物对；
3）由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子组成的引物对；
4）由序列表中序列7所示的DNA分子和序列表中序列8所示的DNA分子组成的引物对；
5）由序列表中序列9所示的DNA分子和序列表中序列10所示的DNA分子组成的引物对；
6）由序列表中序列11所示的DNA分子和序列表中序列12所示的DNA分子组成的引物对；
7）由序列表中序列13所示的DNA分子和序列表中序列14所示的DNA分子组成的引物对；
8）由序列表中序列15所示的DNA分子和序列表中序列16所示的DNA分子组成的引物对；
9）由序列表中序列17所示的DNA分子和序列表中序列18所示的DNA分子组成的引物对；
10）由序列表中序列19所示的DNA分子和序列表中序列20所示的DNA分子组成的引物对。
上述的引物组中，所述芽黄标记光敏不育系为陆地棉（Gossypium hirsutum）CGMCCNo.5262。
本发明的另一个目的是提供一种用于鉴定芽黄标记光敏不育系的PCR试剂组。
本发明提供的PCR试剂组，由如下10个PCR试剂组成：
1）由上述的引物组中的1）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶组成；
2）由上述的引物组中的2）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶组成；
3）由上述的引物组中的3）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶组成；
4）由上述的引物组中的4）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶组成；
5）由上述的引物组中的5）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶组成；
6）由上述的引物组中的6）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成；
7）由上述的引物组中的7）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶组成；
8）由上述的引物组中的8）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶组成；
9）由上述的引物组中的9）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶组成；
10）由上述的引物组中的10）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成。
上述各个PCR试剂中的每条引物在各自PCR试剂中的终浓度均为0.5μM；
上述芽黄标记光敏不育系为陆地棉（Gossypium hirsutum）CGMCC No.5262。
本发明的第三个目的是提供一种用于鉴定芽黄标记光敏不育系的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述的PCR试剂组。
上述的引物组或上述的PCR试剂组或上述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系中的应用也是本发明保护的范围。
在上述应用中，所述芽黄标记光敏不育系具体为陆地棉（Gossypium hirsutum）CGMCC No.5262。
本发明的第四个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系的方法。
本发明提供的方法，包括分子鉴定的步骤；
所述分子鉴定为用上述的引物组或上述的PCR试剂组或上述的试剂盒中的10个引物对分别对待测样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测PCR扩增产物；
若扩增产物为如下A-J全部所示，则所述待测样本为或候选为芽黄标记光敏不育系；若扩增产物不为如下A-J全部所示，则所述待测样本不为或候选不为芽黄标记光敏不育系；
A：1）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有150bp-160bp大小的片段；
B：2）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有175bp-185bp大小的片段；
C:3）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有155bp-165bp大小的片段；
D:4）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有195bp-205bp大小的片段；
E:5）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有255bp-265bp大小的片段；
F:6）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有165bp-175bp大小的片段；
G:7）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有165bp-175bp大小的片段；
H:8）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有175bp-185bp大小的片段；
I:9）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有150bp-160bp大小的片段；
J:10）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有165bp-175bp大小的片段和175bp-185bp大小的片段。
上述方法还包括光敏不育表型鉴定的步骤；
所述光敏不育表型鉴定包括先进行如下A和B处理，再进行检测：
A为将所述待测样本在每天光照11小时-12小时20分的条件下进行培育，
B为将所述待测样本在每天光照13小时-14小时40分的条件下进行培育，
若检测结果为所述待测样本在经A处理后得到雄性可育表型植株，且经B处理后得到雄性不育表型植株，则所述待测样本为或候选为芽黄标记光敏不育系；若所述待测样本在经A处理后未得到雄性可育表型植株，且经B处理后未得到雄性不育表型植株，则所述待测样本不为或候选不为芽黄标记光敏不育系。
上述检测为观察。
上述光敏不育表型鉴定中的A处理中，所述每天光照为11小时2分-12小时18分；
上述光敏不育表型鉴定中的B处理中，所述每天光照为13小时-14小时35分。
上述分子鉴定中的PCR扩增的模板均为待测样本的基因组DNA；
所述芽黄标记光敏不育系为陆地棉（Gossypium hirsutum）CGMCC No.5262。
上述方法还包括形态鉴定的步骤：
所述形态鉴定为培育所述待测样本，若所述待测样本为芽黄性状，则所述待测样本为或候选为芽黄标记光敏不育系；若所述待测样本不为芽黄性状，则所述待测样本不为或候选不为芽黄标记光敏不育系。
芽黄性状指的是种子萌发后顶叶较野生型表现淡黄色（叶绿素含量低），至倒五叶时恢复正常。
上述野生型为中040029。
陆地棉（Gossypium hirsutum）芽黄标记光敏雄性不育系已于2011年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCCNo.5262。陆地棉（Gossypium hirsutum）CGMCC No.5262简称芽黄标记光敏雄性不育系（又称中9106）。
本发明的实验证明，本发明筛选出10个引物对，用其进行PCR扩增，这10个引物对特异性高，可以根据10个引物对的扩增产物大小来鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系，再结合待测样本的表型特征，从而实现芽黄标记光敏不育系的鉴定。本发明具体采用了形态学鉴定和SSR分子标记鉴定相结合的方法对光敏核不育系中9106进行鉴定和保护，主要包括：光敏核不育系中9106的芽黄标记特点；光敏核不育系中9106育性随光照周期的变化特性；同时以8个棉花品系为对照，通过SSR分子标记技术，寻找到10引物组合，其中每对引物在光敏核不育系中9106中相对其他8个棉花品系均具有特异条带。
附图说明
图1为真叶期芽黄材料中9106与正常材料中040029叶绿素含量；
图2为芽黄材料中9106不育表型；
图3为芽黄材料中9106光敏可育表型；
图4为筛选的10对特异引物的PCR扩增结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
芽黄性状指的是种子萌发后顶叶较野生型表现淡黄色（叶绿素含量低），至倒五叶时恢复正常。
中040029：棉花航天诱变敏感材料的筛选及多态性分析，棉花学报，22（4）：312-318,2010；公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。
实施例1、鉴定芽黄标记光敏不育系
陆地棉（Gossypium hirsutum）芽黄标记光敏雄性不育系已于2011年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCCNo.5262。陆地棉（Gossypium hirsutum）CGMCC No.5262简称芽黄标记光敏雄性不育系（又称中9106）。
一、芽黄标记光敏不育系中9106的形态特征鉴定
1、芽黄表型
将陆地棉（Gossypium hirsutum）CGMCC No.5262（中9106）种子于2007年4月下旬种植于河南安阳。以中040029（野生型）为对照。
观察结果，与对照相比，中9106子叶期苗期开始表现芽黄，至真叶期顶叶表现芽黄，相对于对照呈淡黄色。随植株生长叶片的叶绿素含量逐渐增多，至倒五叶叶绿素含量与野生型植株相近。
用APAD-502 Plus叶绿素测定仪测得的芽黄材料中9106和中040029（野生型）的倒五叶、倒四叶、倒三叶、倒二叶、倒一叶、顶叶的叶绿素含量，结果如图1所示，可以看出，芽黄材料中9106的叶绿素含量均低于中040029（野生型），顶叶的叶绿素含量较野生型材料低10个点左右，且至倒五叶期恢复正常。
2、光敏雄性不育表型
1）、在河南安阳培育
河南处于东经110°21′～116°39′，北纬31°23′～36°22′之间。安阳处于东经113°37′至114°58′、北纬35°12′至36°22′之间。
将85粒芽黄标记光敏雄性不育系中9106（种子）于2010年4月种植于河南安阳，萌发得到85株幼苗，均具有芽黄性状，继续培养幼苗，直至8月份结束所有植株均没有花粉粒产生（见图2），表现为不育。从棉花的生长周期来看，对于4月种植的棉花而言，自7月份开始环境中的温度变化和光照周期与花粉发育相关，所以对7月份和8月份的温度和光照周期进行记录。自7月1日至8月31日河南安阳的光照时间变化区间为13小时至14小时35分。自7月1日至8月31日河南安阳的温度变化见表1。
表1 7月1日至8月31日河南安阳的温度变化
| 日期 | 平均温度（℃） | 日期 | 平均温度（℃） |
| 2010-7-1 | 27.3 | 2010-8-1 | 24.57 |
| 2010-7-2 | 29.95 | 2010-8-2 | 25.93 |
| 2010-7-3 | 29.57 | 2010-8-3 | 28.62 |
| 2010-7-4 | 29.81 | 2010-8-4 | 29.3 |
| 2010-7-5 | 30.66 | 2010-8-5 | 27.2 |
| 2010-7-6 | 31.35 | 2010-8-6 | 27.34 |
| 2010-7-7 | 29.31 | 2010-8-7 | 25.18 |
| 2010-7-8 | 26.52 | 2010-8-8 | 28.49 |
| 2010-7-9 | 27.25 | 2010-8-9 | 26.25 |
| 2010-7-10 | 22.98 | 2010-8-10 | 25.42 |
| 2010-7-11 | 26.17 | 2010-8-11 | 25.57 |
| 2010-7-12 | 27.45 | 2010-8-12 | 25 |
| 2010-7-13 | 27.98 | 2010-8-13 | 26.5 |
| 2010-7-14 | 27.96 | 2010-8-14 | 24.79 |
| 2010-7-15 | 26.86 | 2010-8-15 | 24.93 |
| 2010-7-16 | 27.17 | 2010-8-16 | 27.85 |
| 2010-7-17 | 25.18 | 2010-8-17 | 29.32 |
| 2010-7-18 | 26.36 | 2010-8-18 | 27.32 |
| 2010-7-19 | 22.18 | 2010-8-19 | 22.52 |
| 2010-7-20 | 25.34 | 2010-8-20 | 23 |
| 2010-7-21 | 26.78 | 2010-8-21 | 24.75 |
| 2010-7-22 | 28.27 | 2010-8-22 | 21.94 |
| 2010-7-23 | 27.38 | 2010-8-23 | 21.17 |
| 2010-7-24 | 27.62 | 2010-8-24 | 18.61 |
| 2010-7-25 | 28.28 | 2010-8-25 | 20.76 |
| 2010-7-26 | 28.62 | 2010-8-26 | 20.86 |
| 2010-7-27 | 29.06 | 2010-8-27 | 20.51 |
| 2010-7-28 | 29.58 | 2010-8-28 | 22.45 |
| 2010-7-29 | 30.67 | 2010-8-29 | 23.83 |
| 2010-7-30 | 31.84 | 2010-8-30 | 24.73 |
| 2010-7-31 | 31.85 | 2010-8-31 | 24.02 |
2）、在海南三亚培育
海南处于东经108°37′～111°05′，北纬3°30'～20°18'之间。三亚处于东经108°56′至109°48′，北纬18°09′至18°37′之间。
将85粒芽黄标记光敏雄性不育系（种子）中9106于2010年8月种植于海南三亚，萌发得到85株幼苗，均具有芽黄性状，植株均于2010年11月初开花，均表现为散粉可育（见图3），其育性持续到2011年3月底。自2010年11月1日至2011年3月31日海南三亚的光照时间变化区间为11小时2分至12小时18分。自2010年11月1日至2011年3月31日海南三亚的温度变化见表2。
表2 自2010年11月1日至2011年3月31日海南三亚的温度变化
| 日期 | 平均温度（℃） | 日期 | 平均温度（℃） |
| 2010-11-1 | 22.4 | 2011-2-1 | 19.5 |
| 2010-11-2 | 23.3 | 2011-2-2 | 19.8 |
| 2010-11-3 | 24.6 | 2011-2-3 | 20.5 |
| 2010-11-4 | 23.9 | 2011-2-4 | 21.6 |
| 2010-11-5 | 21.2 | 2011-2-5 | 20.5 |
| 2010-11-6 | 22.7 | 2011-2-6 | 20 |
| 2010-11-7 | 24.2 | 2011-2-7 | 19.3 |
| 2010-11-8 | 24.2 | 2011-2-8 | 21.2 |
| 2010-11-9 | 23.5 | 2011-2-9 | 22.1 |
| 2010-11-10 | 23.5 | 2011-2-10 | 23.3 |
| 2010-11-11 | 23.7 | 2011-2-11 | 22.4 |
| 2010-11-12 | 23.7 | 2011-2-12 | 23.1 |
| 2010-11-13 | 24.5 | 2011-2-13 | 23 |
| 2010-11-14 | 25.2 | 2011-2-14 | 20.9 |
| 2010-11-15 | 23.8 | 2011-2-15 | 19.9 |
| 2010-11-16 | 24.4 | 2011-2-16 | 22.3 |
| 2010-11-17 | 25 | 2011-2-17 | 23.5 |
| 2010-11-18 | 22.4 | 2011-2-18 | 23.9 |
| 2010-11-19 | 24.5 | 2011-2-19 | 22.7 |
| 2010-11-20 | 23.3 | 2011-2-20 | 21.7 |
| 2010-11-21 | 23.4 | 2011-2-21 | 21.4 |
| 2010-11-22 | 23.6 | 2011-2-22 | 23.7 |
| 2010-11-23 | 24.2 | 2011-2-23 | 23.6 |
| 2010-11-24 | 24.5 | 2011-2-24 | 23.2 |
| 2010-11-25 | 22.8 | 2011-2-25 | 23.7 |
| 2010-11-26 | 22.9 | 2011-2-26 | 23.3 |
| 2010-11-27 | 23.2 | 2011-2-27 | 23.6 |
| 2010-11-28 | 23.9 | 2011-2-28 | 23.4 |
| 2010-11-29 | 24.6 | ||
| 2010-11-30 | 23.8 | ||
| 2010-12-1 | 23 | 2011-3-1 | 23.4 |
| 2010-12-2 | 23.4 | 2011-3-2 | 23.9 |
| 2010-12-3 | 22.2 | 2011-3-3 | 24.2 |
| 2010-12-4 | 22.8 | 2011-3-4 | 24 |
| 2010-12-5 | 23.8 | 2011-3-5 | 24.1 |
| 2010-12-6 | 24.2 | 2011-3-6 | 24.6 |
| 2010-12-7 | 23.3 | 2011-3-7 | 24.5 |
| 2010-12-8 | 21.3 | 2011-3-8 | 24.2 |
| 2010-12-9 | 21 | 2011-3-9 | 24.5 |
| 2010-12-10 | 20.5 | 2011-3-10 | 24.4 |
| 2010-12-11 | 22.1 | 2011-3-11 | 24.8 |
| 2010-12-12 | 23.1 | 2011-3-12 | 23.2 |
| 2010-12-13 | 23.8 | 2011-3-13 | 24.2 |
| 2010-12-14 | 24.5 | 2011-3-14 | 24.1 |
| 2010-12-15 | 25.2 | 2011-3-15 | 24.8 |
| 2010-12-16 | 18.9 | 2011-3-16 | 22.1 |
| 2010-12-17 | 15.6 | 2011-3-17 | 19.7 |
| 2010-12-18 | 18.4 | 2011-3-18 | 17.9 |
| 2010-12-19 | 20.4 | 2011-3-19 | 20.2 |
| 2010-12-20 | 21.9 | 2011-3-20 | 24.2 |
| 2010-12-21 | 22.6 | 2011-3-21 | 26.6 |
| 2010-12-22 | 22.7 | 2011-3-22 | 25.8 |
| 2010-12-23 | 23.8 | 2011-3-23 | 23.8 |
| 2010-12-24 | 22.9 | 2011-3-24 | 23.5 |
| 2010-12-25 | 22.6 | 2011-3-25 | 22.6 |
| 2010-12-26 | 21.3 | 2011-3-26 | 22 |
| 2010-12-27 | 19.2 | 2011-3-27 | 21.3 |
| 2010-12-28 | 19.4 | 2011-3-28 | 19.1 |
| 2010-12-29 | 19.9 | 2011-3-29 | 20.9 |
| 2010-12-30 | 21.2 | 2011-3-30 | 19.2 |
| 2010-12-31 | 20.6 | 2011-3-31 | 18.6 |
| 2011-1-1 | 20.5 | 2011-3-1 | 23.4 |
| 2011-1-2 | 22.1 | 2011-3-2 | 23.9 |
| 2011-1-3 | 21.3 | 2011-3-3 | 24.2 |
| 2011-1-4 | 21.7 | 2011-3-4 | 24 |
| 2011-1-5 | 23.5 | 2011-3-5 | 24.1 |
| 2011-1-6 | 22.7 | 2011-3-6 | 24.6 |
| 2011-1-7 | 20.7 | 2011-3-7 | 24.5 |
| 2011-1-8 | 19.4 | 2011-3-8 | 24.2 |
| 2011-1-9 | 19.4 | 2011-3-9 | 24.5 |
| 20111-1-0 | 20.2 | 2011-3-10 | 24.4 |
| 2011-1-11 | 18.9 | 2011-3-11 | 24.8 |
| 2011-1-12 | 14.5 | 2011-3-12 | 23.2 |
| 2011-1-13 | 18.5 | 2011-3-13 | 24.2 |
| 2011-1-14 | 18.9 | 2011-3-14 | 24.1 |
| 2011-1-15 | 20.6 | 2011-3-15 | 24.8 |
| 2011-1-16 | 17.5 | 2011-3-16 | 22.1 |
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| 2011-1-19 | 20.9 | 2011-3-19 | 20.2 |
| 2011-1-20 | 21.1 | 2011-3-20 | 24.2 |
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| 2011-1-22 | 20 | 2011-3-22 | 25.8 |
| 2011-1-23 | 22.3 | 2011-3-23 | 23.8 |
| 2011-1-24 | 20.7 | 2011-3-24 | 23.5 |
| 2011-1-25 | 20.6 | 2011-3-25 | 22.6 |
| 2011-1-26 | 19.9 | 2011-3-26 | 22 |
| 2011-1-27 | 20.3 | 2011-3-27 | 21.3 |
| 2011-1-28 | 21.3 | 2011-3-28 | 19.1 |
| 2011-1-29 | 19.4 | 2011-3-29 | 20.9 |
| 2011-1-30 | 18.5 | 2011-3-30 | 19.2 |
| 2011-1-31 | 19.1 | 2011-3-31 | 18.6 |
结合2010年7月1日至2010年8月31日河南安阳的光温特点，以及2010年11月1日至2011年3月31日海南三亚的光温特点，分析影响育性的光温条件，得以下结论：芽黄标记光敏雄性不育系处在相同温度条件下即18.61°至26.6°的波动区间时，在不同的光照周期环境中（即安阳和三亚两个不同的光照环境）育性表现不一致，而在相同的光照周期（即分别在安阳和三亚的光照条件）条件下，在不同的温度的条件时育性表现一致，所以芽黄标记光敏雄性不育系的育性主要受光照周期的控制，即该植物材料为光敏不育材料，且其在光照时间为13小时至14小时35分的区间（即安阳7月1日至8月31日的光照时间）的环境下表现为不育性状（见图2），在光照时间为11小时2分至12小时18分的区间（即三亚11月1日至3月31日的光照时间）的环境下表现可育性状（见图3）。
从上述两种表型观察可以看出，中9106为芽黄标记光敏雄性不育系。
二、分子标记鉴定芽黄标记光敏不育系及引物的确定
1、扩增
选取8个对照材料：TM-1、中棉所58、中棉所41、山农SF01、奥试棉4406、邯郸559、G2005和中棉所36。
TM-1：陆地棉遗传标准系TM-1背景的海岛棉染色体片段置换系的培育，科学通报，53（9）：1065-1069,2008，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。
中棉所58：短季棉新品种——中棉所58，中国棉花，34（3）：16-19，2007，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。
中棉所41：中棉所41在巴州地区的种植表现，新疆农业科学，3：46,2010，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。
山农SF01:山农SF01的特性特征及栽培管理技术，中国种业，S1：121,2008，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。
奥试棉4406:2008年河南省审定品种——棉花品种，种业导刊，7：48-52,2008，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。
邯郸559：邯郸559品种特性及高产栽培技术，农业科技通讯，4：175-176,2011，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。
G2005：短季棉早熟性状QTL的分子标记及定位，中国农业科学院学位论文，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。
中棉所36：优质短季棉品种中棉所36，中国棉花，27（5）：25-26,2000，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。
2011年7月份于中国农业科学院棉花研究实验基地，摘取上述芽黄标记光敏雄性不育系中9106与上述8个对照材料的刚伸展开的幼嫩棉花叶片，采用改进的CTAB法(Paterson等，1993)提取基因组DNA，具体提取步骤如下所述：
（1）称取3克新鲜叶片于研钵中，加入液氮并迅速研磨成粉末。将粉末迅速转移至一个2mL的离心管中并加入800μL已预热的CTAB裂解缓冲液（65℃），混匀后置于65℃水浴30-40min，且每10min缓慢颠倒混匀一次。
（2）水浴后，取出离心管，加入500μL氯仿:异戊醇（24:1），反复颠倒约30-50次，颠倒混合至溶液不分层为止。
（3）4℃条件下，12000rpm离心15min。
（4）用带无尖的枪头的枪吸取上清液并转移至另一个2mL离心管中。
（5）加入与上清液等体积的氯仿:异戊醇（24:1），来回颠倒约30-50次，混匀。
（6）4℃条件下，12000rpm离心15min。（重复4，5，6的步骤2次）
（7）同样带无尖的枪头的枪吸取上清液并转移至另一个1.5mL离心管中。
（8）加入0.6倍体积的冰冷异丙醇，颠倒约20-30次，直至有絮状DNA生成，静止30min。
（9）用10μL小枪头挑出析出的DNA至1.5mL离心管中，加入70％乙醇洗1-2次，无水乙醇洗一次，静止过夜。
（10）倒去无水乙醇，放入真空冷冻干燥机中干燥，之后加入700μL1×TE（pH值8.0）溶解DNA，直至完全溶解。4℃保存待用。
选用CMD(Cotton Microsatellite Database)(http://www.cottonmarker.org/)和Cotton DB(http://cottondb.org/)的棉花SSR引物，由上海英骏生物技术有限公司和上海生工生物工程有限公司合成，具体序列如表3所示：
表3 SSR引物及其序列
分别以上述提取的基因组为模板，分别用上述10对引物进行SSR PCR扩增，PCR扩增反应的反应程序如下表4：
表4 SSR的PCR扩增程序
PCR扩增反应所用体系为10uL反应体系，扩增反应体系如下表5：
表5 SSR标记10μl体积的扩增反应体系
2、检测
将上述SSR扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，凝胶电泳中所用的电泳缓冲液为1×TBE，电泳电压设置为220V，电泳时间为70min，电泳结束后用银染方法进行结果检测；
银染溶液配方及银染过程具体如下：
1）固定：首先将凝胶从玻璃板上取下来，放置于固定液（340ml H2O+40ml 95%酒精+20ml 10%乙酸）中，并置于摇床上摇动，速度适中，固定时间至少为5min，然后将固定液回收，再用纯水缓慢的冲洗一遍。
2）渗透：在放置有凝胶的盒子中加入300ml渗透液（0.6g AgNO3+300ml H2O），并放置于摇床上进行渗透，速度适中，渗透时间为12分钟，然后用纯水快速冲洗两遍，约30s。
3）显色：加入显色液（6g NaOH+4ml CHOH+4ml 0.2%Na2S2O3+400ml H2O），将盛有凝胶和显色液的盒子放置于摇床上进行显色，至有清晰的条带现出，然后将显色液倒掉，用纯净水冲洗两遍。
4）终止：将显色好的凝胶中加入400ml终止液（3g Na2CO3+400ml H2O），暂时保存。在凝胶观测仪器上记录标记基因型数据，并将带型较好的胶片进行照相。
上述检测结果如图4所示，上图条带9个材料为一组：A，光敏不育系中9106；B，TM-1；C，中棉所58；D，中棉所41；E，山农SF01；F，奥试棉4406；G，邯郸559；H，G2005；I，中棉所36。所用的Marker为M1（100、200、300、400、500bp）和M2（100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500bp）；
可以看出，引物CGR5797的扩增组中，光敏不育系中9106有155bp的扩增产物（A），而其他8个对照均无此大小的片段；
引物CGR5802的扩增组中，光敏不育系中9106有180bp的扩增产物（A），而其他8个对照均无此大小的片段；
引物CGR6872的扩增组中，光敏不育系中9106有160bp的扩增产物（A），而其他8个对照均无此大小的片段；
引物BNL840的扩增组中，光敏不育系中9106有170bp的扩增产物（A），而其他8个对照均无此大小的片段；
引物BNL3435的扩增组中，光敏不育系中9106有170bp的扩增产物（A），而其他8个对照均无此大小的片段；
引物MUCS102的扩增组中，光敏不育系中9106有180bp的扩增产物（A），而其他8个对照均无此大小的片段；
引物CGR5527的扩增组中，光敏不育系中9106有155bp的扩增产物（A），而其他8个对照均无此大小的片段；
引物CGR5558的扩增组中，光敏不育系中9106有170bp和180bp的扩增产物（A），而其他8个对照均无此大小的片段；
引物DPL0190的扩增组中，光敏不育系中9106有200bp的扩增产物（A），而其他8个对照均无此大小的片段；
引物DPL0391的扩增组中，光敏不育系中9106有260bp的扩增产物（A），而其他8个对照均无此大小的片段；
由上图看以看出使用引物CGR5797、CGR5802、CGR6872、BNL840、BNL3435、MUCS102、CGR5527和CGR5558时，光敏不育系中9106相对其他八个材料在100bp-200bp区间均具有特异表带。在使用引物DPL0190和DPL0391时，光敏不育系中9106相对其他八个材料在200bp-300bp区间具有特异条带。
因此，上述10对引物可用来辅助鉴定未知样本是否为芽黄光敏不育系中9106，再结合牙黄和光敏不育的表型特征，从而鉴定未知样本是否为芽黄光敏不育系中9106。
Claims (9)
1.一种用于鉴定芽黄标记光敏不育系的引物组，由如下10个引物对组成：
1）由序列表中序列1所示的DNA分子和序列表中序列2所示的DNA分子组成的引物对；
2）由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子组成的引物对；
3）由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子组成的引物对；
4）由序列表中序列7所示的DNA分子和序列表中序列8所示的DNA分子组成的引物对；
5）由序列表中序列9所示的DNA分子和序列表中序列10所示的DNA分子组成的引物对；
6）由序列表中序列11所示的DNA分子和序列表中序列12所示的DNA分子组成的引物对；
7）由序列表中序列13所示的DNA分子和序列表中序列14所示的DNA分子组成的引物对；
8）由序列表中序列15所示的DNA分子和序列表中序列16所示的DNA分子组成的引物对；
9）由序列表中序列17所示的DNA分子和序列表中序列18所示的DNA分子组成的引物对；
10）由序列表中序列19所示的DNA分子和序列表中序列20所示的DNA分子组成的引物对；
所述芽黄标记光敏不育系为陆地棉（Gossypium hirsutum）CGMCC No.5262。
2.一种用于鉴定芽黄标记光敏不育系的PCR试剂组，由如下10个PCR试剂组成：
1）由权利要求1所述的引物组中的1）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成；
2）由权利要求1所述的引物组中的2）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成；
3）由权利要求1所述的引物组中的3）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成；
4）由权利要求1所述的引物组中的4）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成；
5）由权利要求1所述的引物组中的5）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成；
6）由权利要求1所述的引物组中的6）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成；
7）由权利要求1所述的引物组中的7）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成；
8）由权利要求1所述的引物组中的8）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成；
9）由权利要求1所述的引物组中的9）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成；
10）由权利要求1所述的引物组中的10）所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成；
所述芽黄标记光敏不育系为陆地棉（Gossypium hirsutum）CGMCC No.5262。
3.根据权利要求2所述的PCR试剂组，其特征在于：各个PCR试剂中的各条引物在各自PCR试剂中的终浓度均为0.5μM。
4.一种用于鉴定芽黄标记光敏不育系的试剂盒，包括权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的PCR试剂组。
5.权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的PCR试剂组或权利要求4所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系中的应用；所述芽黄标记光敏不育系为陆地棉（Gossypium hirsutum）CGMCC No.5262。
6.一种鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系的方法，包括分子鉴定的步骤；
所述分子鉴定为用权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的PCR试剂组或权利要求4所述的试剂盒中的10个引物对分别对待测样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测PCR扩增产物；
若扩增产物为如下A-J全部所示，则所述待测样本为或候选为芽黄标记光敏不育系；若扩增产物不为如下A-J全部所示，则所述待测样本不为或候选不为芽黄标记光敏不育系；
A：1）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有150bp-160bp大小的片段；
B：2）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有175bp-185bp大小的片段；
C:3）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有155bp-165bp大小的片段；
D:4）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有195bp-205bp大小的片段；
E:5）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有255bp-265bp大小的片段；
F:6）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有165bp-175bp大小的片段；
G:7）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有165bp-175bp大小的片段；
H:8）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有175bp-185bp大小的片段；
I:9）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有150bp-160bp大小的片段；
J:10）所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有165bp-175bp大小的片段和175bp-185bp大小的片段；
所述芽黄标记光敏不育系为陆地棉（Gossypium hirsutum）CGMCC No.5262。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法还包括光敏不育表型鉴定的步骤；
所述光敏不育表型鉴定包括先进行如下A和B处理，再进行检测：
A为将所述待测样本在每天光照11小时-12小时20分的条件下进行培育，
B为将所述待测样本在每天光照13小时-14小时40分的条件下进行培育，
若检测结果为所述待测样本在经A处理后得到雄性可育表型植株，且经B处理后得到雄性不育表型植株，则所述待测样本为或候选为芽黄标记光敏不育系；若所述待测样本在经A处理后未得到雄性可育表型植株，且经B处理后未得到雄性不育表型植株，则所述待测样本不为或候选不为芽黄标记光敏不育系。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述光敏不育表型鉴定中的A处理中，所述每天光照为11小时2分-12小时18分；
所述光敏不育表型鉴定中的B处理中，所述每天光照为13小时-14小时35分。
9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：
所述分子鉴定中的PCR扩增的模板均为待测样本的基因组DNA。
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