CN102676521A - microRNA444a或其编码基因在调控水稻分蘖中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种microRNA444a或其编码基因在调控水稻分蘖中的应用。本发明提供microRNA444a或其编码基因在调控植物分蘖中的应用；所述microRNA444a的核苷酸序列为序列表中的序列3或序列4或序列2。本发明的实验证明，本发明发现的microRNA444a，将其编码基因导入水稻中，得到OsmicroRNA444a的超表达株系，该植株与未转入该基因的水稻相比表现出明显的分蘖降低的表型，说明该microRNANA与水稻分蘖调控密切相关。

Description

microRNA444a或其编码基因在调控水稻分蘖中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种microRNA444a或其编码基因在调控水稻分蘖中的应用。

背景技术

microRNA广泛存在于真核生物的基因组中，在生物的生长和发育的过程中起着重要的调节作用，包括生长发育、代谢、信号传导和植物的胁迫响应。microRNAs长度一般在21-25nt之间，它在转录后水平负调控靶基因的表达,主要通过降解靶基因mRNA、抑制其翻译和染色体修饰进而调节基因的表达。研究发现microRNA在生物的转录调控网络中发挥着极其重要的作用，例如参与植物信号的转导、植物的形态建成、叶的发育和非生物胁迫反应等等。

在模式植物拟南芥根的发育方面，microRNA160通过负调控其靶基因ARF10、ARF16和ARF17的转录本水平控制根冠细胞的形成；microRNA390的表达受生长素调节，控制拟南芥侧生根发育；在拟南芥的器官发育中，microRNA164通过调节CUC进而影响拟南芥根和叶等组织器官的形态，而microRNA165/166通过调节PHB、PHV和REV表达来影响拟南芥叶片极性；microRNA172负调控AP2表达来影响拟南芥花器官的表达。2007年在《Nature Genetics》研究了microRNA172控制玉米的性决定和组织细胞的命运进而调控组织分支的发育，同一年《Nature Genetics》研究发现番茄的microRNA319可以控制复叶的发育；2010年研究发现水稻中的microRNA156负调控OsSPL14的表达进而参与调控水稻理想株型的发育，即减少分蘖数、增强抗倒伏和增加谷物产量的性状。2009年在《Cell》上建立了microRNA156和microRNA172调节拟南芥从营养生长到生殖生长时空的调控网络，2010年《Development》详细的研究了microRNA396b通过调节细胞的增殖最终影响了拟南芥叶片发育。在水稻中，越来越多的microRNAs被克隆和研究，2005年《the Plant Cell》报道了水稻中的一些microRNAs，发现了一个新的microRNA(microRNA444a)，它在单子叶植物中十分保守，比如在水稻、小麦、大麦和玉米中都发现了它的存在，拟南芥中却没有检测到它的表达。组织表达模式显示microRNA444a在水稻的叶片、茎、根、花序和幼苗中都有表达。详细深入研究microRNA444a在水稻中的生物学功能具有重要的意义。特别能调节水稻株型的发育，比如分蘖、分蘖数、分蘖角度、叶夹角和穗子的发育的调控。

在已经发现的水稻矮化突变体中，有些突变体还表现出分蘖减少或者增多的表型。水稻分蘖数的多少也是影响水稻产量的重要因素之一，人们往往希望控制水稻有效分蘖数量进而达到水稻增产的目的。水稻侧生分支的发育即分蘖的发育被广泛的研究。水稻中MOC1既影响水稻分蘖芽的起始又影响分蘖芽的伸长，是控制水稻分蘖发育的重要基因。moc1与野生型相比表现出分蘖极端减少和植株矮化的表型，而MOC1组成性超表达转基因植株则表现出分蘖数多于野生型的表型。MOC1基因编码GRAS转录因子家族的蛋白，该蛋白定位于细胞核，原位杂交证明MOC1主要在分蘖芽表达。根据同源性分析发现玉米的TEOSINTE BRANCHED1(TB1)高度同源性基因OsTB1/FC1，该基因编码TCP转录因子家族的蛋白，是分蘖发育的负调控因子。这个基因的突变体表现出分蘖数增多和半矮化的表型，该基因超表达转基因植株表现出分蘖减少的表型。2009年arice dwarf and low-tillering(dlt)mutant被发现和研究，这个突变体表现出矮化和分蘖减少的表型，相应的DLT转基因证实了该突变体的表型，结果表明dlt突变体表现出类似于水稻中油菜素内酯缺陷和信号突变体的表型。

发明内容

本发明的一个目的是提供microRNA444a或其编码基因或表达microRNA444a的重组载体的应用。

本发明提供的microRNA444a或其编码基因或表达microRNA444a的重组载体在调控植物分蘖中的应用；

所述microRNA444a的核苷酸序列为序列表中的序列3或序列4或序列2。

序列表中的序列2所示的RNA为序列3或序列4所示RNA的前体。

上述应用中，所述microRNA444a的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1或序列表中的序列1自5’末端第49-4406位核苷酸。

序列表中的序列1或序列表中的序列1自5’末端第49-4406位核苷酸编码序列2所示RNA。

所述表达microRNA444a的重组载体为将所述microRNA444a的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA444a的载体。

上述表达microRNA444a的重组载体具体为将所述microRNA444a的编码基因插入pUN1301载体的BglII和SacI之间得到的载体。

上述应用中，所述调控植物分蘖为抑制植物分蘖。

上述应用中，所述应用为将所述microRNA444a的编码基因导入目的植物中，得到分蘖数小于所述目的植物的转基因植物。

上述应用中，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为将所述microRNA444a的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物，得到分蘖数小于所述目的植物的转基因植物。

上述方法中，所述microRNA444a的编码基因通过重组载体导入目的植物中。

上述方法中，所述重组载体为将所述microRNA444a的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA444a的载体。

上述重组载体具体为将所述microRNA444a的编码基因插入pUN1301载体的BglII和SacI之间得到的载体。

本发明的第三个目的是提供一种重组载体。

本发明提供的重组载体，为将所述microRNA444a的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA444a的载体；

上述重组载体具体为将所述microRNA444a的编码基因插入pUN1301载体的BglII和SacI之间得到的载体。

本发明的实验证明，本发明发现的microRNA444a，将其编码基因导入水稻中，得到OsmicroRNA444a的超表达株系，该植株与未转入该基因的水稻相比表现降低分蘖的表型，说明该microRNANA与水稻分蘖调控密切相关。

附图说明

图1为扩增到OsmicroRNA444a包含前体序列在内的基因组DNA

图2为超表达载体pUN1301-OsmiR444a的物理图谱

图3为转基因水稻的Northern以及Real-time-PCR鉴定

图4为OsmicroRNA444a超表达转基因水稻表型观察

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、microRNA444a在调控水稻分蘖中的应用

一、microRNA444a的编码基因OsmicroRNA444a的获得

1、编码基因OsmicroRNA444a的克隆

根据数据库分析的结果设计引物，5′端引物：5′-GAAGATCTGCAATTGGGGGCAGCAAGC-3′(下划线序列为BglII位点)，3′端引物：5′-CGAGCTCTGGCAACAGGAGGCAGCAAG-3′(下划线序列为SacI位点)，提取粳稻中花十号三叶期幼苗总基因组，采用RT-PCR方法扩增到4392bp全长cDNA。

具体操作过程如下：

1）植物基因DNA的提取：选取0.5g三叶期中花十号水稻（Oryza sativa L.cvZhonghua 10）的幼苗（李梅芳，水稻花培品种—中花10号，农业科技通讯，1998年第1期第26页，公众可从中国科学院植物研究所获得，以下简称为野生型水稻。）为材料，在液氮中研磨，将液氮中研碎的冻干粉转入到含729μL基因组提取buffer(0.1M Tris-HCl(PH 8.0)、50mM EDTA(pH 8.0)、0.5M NaCl)，再加入18.4μL β-mercaptoethanol剧烈振荡使其全部悬浮；接着加入52.8μL 65C预热的20%SDS；65C水浴温育30min，每5min颠倒混匀一次；然后加入250μL冰上预冷的5M乙酸钾，立即颠倒混匀，冰上放置20min；4℃，12,000g离心10min，取上清；加入与上清等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），抽提一次，4℃，12,000g离心10min，用等体积的氯仿/异戊醇（24：1）再抽提一次；收集上清并加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，-20℃放置30min；4℃，12,000g离心10min，弃去上清；沉淀用1ml的70%乙醇洗2次；干燥后，溶于20μL ddH₂O中。

2）PCR扩增：提取的基因组稀释100倍，用作模板按以下体系进行PCR反应：0.2μl PrimerSTAR HS DNA Polymerase（5U/μl）、10μl 2×GC buffer，1.8μl dNTPs,0.5μl 5′端引物(10μM)，0.5μl 3′端引物(10μM)，加ddH₂O终体积20μl。引物序列5′端引物：5′-GAAGATCTGCAATTGGGGGCAGCAAGC-3′(下划线序列为BglII位点，序列3)，3′端引物：5′-CGAGCTCTGGCAACAGGAGGCAGCAAG-3′(下划线序列为SacI位点，序列4)，PCR程序为：94C预变性30s后进入PCR循环，循环参数为98C 10秒变性→52C 15秒复性→72C 4分钟20秒延伸,35个循环后在72C继续合成10分钟。

扩增的PCR产物经过0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图1所示，从图中可以看出，得到分子量大约4.39kb的条带，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收该片段得到20μl回收产物。进行测序分析，测序结果该PCR片段的核苷酸序列为序列表中的序列1自5’末端第49-4406位核苷酸，将该PCR产物的基因为OsmicroRNA444a，其编码的OsmicroRNA444a的核苷酸序列为序列表中的序列2，OsmicroRNA444a剪切成熟体为microRNA444a，其核苷酸序列为序列表中的序列3或序列4。

二、OsmicroRNA444a超表达载体pUN1301-OsmicroRNA444a的构建

1、含有OsmiR444a的载体pTE-OsmiR444a

取3.5μl上述PCR产物的回收产物，加入1μl（3U/μl）T4-DNA连接酶、5μl 2×连接酶缓冲液、0.5μl（50mg/ml）pGEM-T Easy载体（Promega）4℃连接过夜，得到连接产物，用连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经含羧苄青霉素的抗性平板筛选得到含有重组质粒的大肠杆菌菌株。采用碱裂解法从菌株中分离提取质粒，以pGEM-T Easy载体上的T7和SP6启动子序列为引物，进行测序分析，该质粒为将序列表中的序列1自5’末端第49-4406位核苷酸插入pGEM-T Easy载体中，将测序正确的质粒命名为pTE-OsmiR444a。

2、pUN1301载体的获得

1）剪取约0.2g玉米（品种名：中作-中单8,北京中农作科技发展有限公司）幼苗，置于液氮中研磨；然后加入800μL新配制的提取缓冲液(含0.1M Tris-HCl pH8.0，50mM EDTA，0.5M NaCl，1%SDS和1％β-巯基乙醇)，剧烈振荡使其全部悬浮；65℃水浴30分钟，每5分钟颠倒混匀一次；然后加入250μL预冷的5M乙酸钾水溶液，立即颠倒混匀，冰浴5分钟；加入等量酚/氯仿，抽提一次，12000rpm离心5分钟；收集上清液，加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，室温放置40分钟；4℃12000rpm离心15分钟,弃上清；沉淀用70%、100%乙醇各洗一次；干燥后，溶于20μL含100μg/mL RNase的ddH₂O中，得到玉米基因组DNA。

2）取上述玉米基因组DNA溶液2μL作为模板，在带有Hind III识别位点的5′引物（GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG）和带有BamHI识别位点的3′引物（CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG）为引物，进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃3分钟；再94℃45秒，62℃45秒，72℃2分钟，共35个循环，最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，表明得到长度约为2kb的扩增片段，与预期结果相符，回收该目的片段，得到的片段经测序验证，具有序列表中序列5所示的核苷酸，为玉米泛素启动子（UbiPro）。

（玉米泛素启动子（UbiPro）也可以人工合成获得。）

3）用限制性内切酶Sac I和EcoR I将Noster poly A终止序列（277bp）从质粒载体pBI 121（北京拜尔迪生物技术有限公司目录号：MP-091）上切下，连接到载体pUC19（北京百泰克生物技术有限公司目录号：DP7801）的Sac I和EcoR I位点间，得到重组载体，命名为pUC19-Noster。再用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切pUC19-Noster，琼脂糖凝胶电泳检测后，回收线性化的载体大片段，并将该回收片段与2）中经Hind III和BamH I双酶切获得的带有粘性末端的玉米泛素启动子（UbiPro）相连，得到重组载体，命名为pUN19。

4）用限制性内切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切（37C条件下，先加入EcoR I进行部分酶切，酶切时间为半小时，65C下20分钟使EcoR I酶失活,后加入HindIII完全酶切3小时即可)从3）购建的重组载体pUN19切下包含UbiPro和Noster的长度约为2.3kb的片段，将该片段克隆入质粒载体pCAMBIA1301(Biovector Co.,LTD公司目录号Biovec-11)的EcoR I和HindIII位点处，得到重组载体，命名为pUN1301。

3、pUN1301-OsmicroRNA444a的构建

用限制性内切酶BglII和SacI对2步骤获得的质粒pUN1301进行双酶切，酶切体系为：质粒10μl、10x酶切缓冲液5μl、BglII1μl（10U/μl）、SacI 0.8μl（10U/μl），加ddH₂O补充反应体系至50μl，37℃酶切4小时。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，回收线性化的pUN1301大片段，溶于20μl ddH₂O中。

用限制性内切酶BglII和SacI对1步骤获得的质粒pTE-OsmiR444a进行双酶切。酶切体系为：质粒10μl，酶切缓冲液5μl、BglII 1μl（10U/μl）、加ddH₂O补充反应体系至50μl，37℃酶切4个小时。再加入SacI 0.2μl（10U/μl），37℃酶切20分钟。用0.8%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，用AxyPrep公司的DNA凝胶回收试剂盒回收该片断，回收4392bp的OsmiR444a片段。

将10μl回收的4392bp的OsmiR444a溶液、6μl回收的载体pUN1301大片段溶液、2μl(3U/μl)T4DNA连接酶和2μl 10x连接酶缓冲液混和，16℃连接16小时，得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆。提取阳性克隆中的重组质粒，进行测序验证，结果该重组质粒为将序列表中的序列1自5’末端第49-4406位核苷酸插入pUN1301的BglII和SacI酶切位点间得到的载体，命名为pUN-OsmiR444a，且pUN-OsmiR444a中启动子、基因和终止子的结构正确（见图2）。在该表达载体中采用玉米泛素启动子（UbiPro）启动目的片段OsmiR444a在植物中超表达。

三、转基因水稻的获得

将上述pUN1301-OsmicroRNA444a质粒用电击法转化农杆菌EHA105（Hiei Y，Ohta S,Komari T,Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J 6:271-282，公众可从中国科学院植物研究所获得。），经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆的超表达工程菌，提取阳性克隆的超表达工程菌的质粒，为pUN1301-OsmicroRNA444a，将该阳性克隆的超表达工程菌命名为EHA105/pUN1301-OsmicroRNA444a。

将EHA105/pUN1301-OsmicroRNA444a侵染中花十号水稻（Oryza sativa L.cvZhonghua 10，以下简称为野生型水稻）的愈伤组织，再将导入EHA105/pUN-OsmiR444a的愈伤组织用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤5遍，无菌滤纸吸干后转至N₆D₂S₁培养基上，筛选一代；两周后，转移至N₆D₂S₂培养基上筛选二代（2周/代）；取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至分化培养基（1），上，在分化培养箱（12小时光周期，白天28℃，夜晚25℃）中培养7天；然后转移至分化培养基（2），上，在分化培养箱中培养至产生再生苗。再生的植株在生根壮苗培养基上生根壮苗；待小苗长至10厘米左右时，打开容器封口膜，炼苗2-3天，然后将小苗移入人工气候室栽培，获得10个株系共60棵T0代转OsmicroRNA444a水稻。

所用培养基如下表1：

表1所用培养基配方

四、转基因水稻的鉴定

1、GUS组织化学染色：

将上述三获得的60棵T0代转OsmicroRNA444a水稻的2-3mm长的根段分别放到GUS染色液中，抽气几分钟，然后置于37℃温育过夜，染色后的组织用70%乙醇脱色。根呈蓝色的植株即为阳性转基因材料。GUS染色液（pH 7.0）组分为：100mM Na₃PO₄(pH7.0)，0.1%Triton X-100，10mM EDTA，0.5mM亚铁氰化钾，0.5mM铁氰化钾，1mg/mlX-Gluc。

结果共鉴定出8个株系合计40棵阳性T0代转OsmicroRNA444a水稻。

将阳性T0代转OsmicroRNA444a水稻移至温室栽培，按照不同株系收种，得到T1代转基因种子，在此基础上经过繁种得到纯合T2代种子，在以后的实验中选取编号为5（miROE5）、8（miROE8）、12（miROE12）的T2代转OsmicroRNA444a水稻作为材料。

2、定量PCR鉴定

从编号为5（miROE5）、8（miROE8）、12（miROE12）的T2代转OsmicroRNA444a水稻的幼苗中提取总RNA，经过RNase free DNase I处理2μg总RNA用M-MLV反转录酶进行反转录成cDNA第一条链。将植物总RNA反转录成cDNA，利用Primer Express2.0程序(AppliedBiosystems)设计基因特异引物，并以ACTIN1引物为内标参照，引物长为20bp，Tm值为55-60C，GC含量在40-60%之间，扩出的目的片段长度为100-150bp。将反转录产物稀释50-100倍，取5μl做模板，利用SYBR GREEN PCR试剂盒(

Green Realtime PCR Master Mix,Toyobo,Japan)进行反应溶液的配置，在实时定量PCR仪MX3000P(Stratagene,USA)上运行PCR程序，95C 1min；95C15s，55C 10s，72C 15s；共45循环；95C 20s，55C 20s，95C 30s。根据CT值计算基因的相对表达量。

而miRNA实时荧光定量PCR检测，首先提取水稻的总RNA，接着利用PEG沉淀smallRNA，即在308μl的总RNA溶液中（总RNA的量不要超过21mg）加入70μl 30%(W/V)PEG8000溶液；在上述混合液中再加入42μl 5M NaCl溶液，混匀；

混合体系：

308μl total RNA

70μl  30%(W/V)PEG8000溶液

42μl 5M NaCl溶液

共420μl，按照步骤依次加入70μl 30%(W/V)PEG8000溶液和42μl 5M NaCl溶液。

在冰上放置30min沉淀后，4C 13000rpm离心10min，小心吸取上清转入另一个新RNase free管中；在上清中加入2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀；在-20C沉淀过夜或30min后，4C最大转速离心15-20min，小心去除上清；得到的沉淀物用70%的乙醇洗涤两次，在室温下干燥（注意不要太干）；溶于30μl ddH2O（可以在50C孵育5分钟）。准备好的small RNA可以利用Poly A加A方法做实时定量PCR，用5.8S rRNA做内参详细方法见。并分别转录获得cDNA（参照实施例1中的方法），以野生型水稻（水稻中花十号）为对照。利用荧光实时定量PCR法，以cDNA为模板，以1μl 5′端引物1(10μM)(5′-TTGCTGCCTCAAGCTTGCTG-3′)，1μl reverse primer引物1(10μM)(5'-GCTGTCAACGATACGCTACG-3')为引物，对T2代转OsmicroRNA444a中OsmiR444a的表达丰度进行检测。用于定量分析的试剂为SYBR Green Realtime PCRMaster Mix（TOYOBO）。所用仪器为美国Stratagene公司实时荧光定量PCR仪Mx3000P。吸取1μl第一链cDNA溶液，稀释50倍作为模板，按以下体系进行PCR反应：10 lSYBR Green Realtime PCR Master Mix,4μl模板,1μl 5′端引物1(10μM)，1μl 3′端引物1(10μM)，加ddH2O终体积20μl。

用5.8S RNA作为内参，5.8S RNA的5′端引物：5'-GAACGACTCTCGGCGGCTA-3'，3′端引物为：5’-GCTGTCAACGATACGCTACG-3'。PCR程序为：预变性2分钟,进入PCR循环，循环参数为94℃15秒→58℃10秒→72℃10秒，共40个循环。

结果如图3所示，在5.8sRNA作为内参的情况下，与野生型水稻（ZH10）相比，miROE5、miROE8和miROE12的T2幼苗中OsmiR444a的表达丰度有了不同程度的上调，说明目的基因（OsmiR444a）在转录水平已经成功表达。

采用同样的方法将空载体pUN1301转入野生型水稻中，得到T0代转空载体水稻，按照上述方法鉴定，OsmicroRNA444a基因没有过量表达，说明为阳性，将T0代转空载体水稻播种传代得到T2代转空载体水稻。

五、转基因水稻的表型观察

将编号为5（miROE5）、8（miROE8）、12（miROE12）的T2代转OsmicroRNA444a水稻、野生型水稻（ZH10）和T2代转空载体水稻的种子，在光照培养箱中（光强为10000μmol/m²/s,光照时间为16h/d,温度为30℃），接着把生长的幼苗种植于水稻田中。

每个株系15株，实验重复三次，结果取平均值。

对植株分蘖进行观察，结果如下：

拍照如图4A，其中从左到右依次为ZH10、miROE5、miROE8和miROE12，可以看出miROE5、miROE8、miROE12水稻分蘖数明显少于野生型水稻。

在播种后约第120天统计野生型水稻（ZH10）、编号为5（miROE5）、8（miROE8）、12（miROE12）的T2代转OsmicroRNA444a水稻分蘖数，结果如图4B所示，野生型水稻（ZH10）、编号为5（miROE5）、8（miROE8）、12（miROE12）的T2代转OsmicroRNA444a水稻分蘖数分别为14、8、10和3个。

T2代转空载体水稻和野生型水稻结果无显著差异。

Claims (9)

1.microRNA444a或其编码基因或表达microRNA444a的重组载体在调控植物分蘖中的应用；

所述microRNA444a的核苷酸序列为序列表中的序列3或序列4或序列2。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述microRNA444a的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1或序列表中的序列1自5’末端第49-4406位核苷酸；

所述表达microRNA444a的重组载体为将所述microRNA444a的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA444a的载体。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述调控植物分蘖为抑制植物分蘖。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述应用为将所述microRNA444a的编码基因导入目的植物中，得到分蘖数小于所述目的植物的转基因植物。

5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：

所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。

6.一种培育转基因植物的方法，为将权利要求1-5中任一所述的应用中的所述microRNA444a的编码基因导入目的植物中，得到分蘖数小于所述目的植物的转基因植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述microRNA444a的编码基因通过重组载体导入目的植物中。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述重组载体为将所述microRNA444a的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA444a的载体。

9.一种重组载体，为将权利要求1-5中任一所述的应用中的所述microRNA444a的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA444a的载体。

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