CN102676491A

CN102676491A - 复合胰蛋白酶组合物及其应用

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Publication number: CN102676491A
Application number: CN201210151662XA
Authority: CN
Inventors: 李旭; 陈功; 周虹
Original assignee: SUZHOU XIANKUO BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Niu Anlin
Priority date: 2012-05-16
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2032-05-16
Also published as: CN102676491B

Abstract

一种复合胰蛋白酶组合物，包含低聚木糖及胰蛋白酶，其中，所述低聚木糖质量（g）与胰蛋白酶活性（u）的比例小于等于100:1000。本发明提供的复合胰蛋白酶组合物在传统胰蛋白酶中加入了低聚木糖，提高了胰蛋白酶的活性。本发明还提供该复合胰蛋白酶组合物在医药工业、皮革制造、食品加工中的应用，以较低的成本获得较佳的效果。

Description

复合胰蛋白酶组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物酶技术领域，特别涉及一种复合胰蛋白酶组合物，以及其应用。

背景技术

蛋白水解酶具有广泛的商业应用，并成功的在工业中实现，诸如，清洁剂、皮革、医药、农业、食品及乳制品中。

胰蛋白酶作为蛋白酶的一种，已经在商业应用中得到了推广。胰蛋白酶是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。胰蛋白酶也是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，是不可缺少的工具。

胰蛋白酶临床用于抗炎消肿，能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用；临床上还用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等，通过喷雾吸入，用于呼吸道疾病，也可用于治疗毒蛇咬伤，另外，还可应用于皮革制造、生丝处理、食品加工。

胰蛋白酶最早是从新鲜动物的胰脏制备获得的，具体为通过绞碎、配料、磨浆、消化、过滤、干燥、球磨等工艺制备成胰蛋白酶原粉，然后加填充剂稀释成不同酶活性的胰蛋白酶成品。虽然制备过程相对简单，但由此制备的胰蛋白酶活性相对较低，且难以控制，从而限制了胰蛋白酶的使用。

低聚木糖（xylooligosaccharide，XOS），又称为木寡糖，是由2-7个木糖分子以β-1,4糖苷键结合而成的功能性聚合糖，其天然存在于竹根、水果、蔬菜、牛乳和蜂蜜中，来源广泛，获得成本低。低聚木糖因其稳定性，以及多重生理功能性，已在食品、医药、保健、饲料等各种领域得到广泛应用。随着研究的深入，人们也逐渐发现低聚木糖还具有更多其他功能，作为最具市场潜力的一种低聚糖，低聚木糖在更多应用领域的潜能也有待进一步开发。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够提高胰蛋白酶活性的复合胰蛋白酶组合物。

一种复合胰蛋白酶组合物，包含低聚木糖及胰蛋白酶，其中，所述低聚木糖质量（g）与胰蛋白酶活性（u）之比大于等于0.001:1000。

进一步地，所述低聚木糖质量（g）与胰蛋白酶活性（u）之比在0:001:1000 ~ 100:1000的范围。

进一步地，所述低聚木糖质量（g）与胰蛋白酶活性（u）之比在0.005:1000~100:1000的范围。

进一步地，所述低聚木糖质量（g）与胰蛋白酶活性（u）之比在0.01:1000~100:1000的范围。

进一步地，所述低聚木糖质量（g）与胰蛋白酶活性（u）之比在0.02:1000~100:1000的范围。

进一步地，所述低聚木糖质量（g）与胰蛋白酶活性（u）之比在1:1000~100:1000的范围。

进一步地，所述低聚木糖质量（g）与胰蛋白酶活性（u）之比为0:001:1000或0.005:1000或0.01:1000或0.02:1000或1:1000或100:1000。

本发明另一方面还涉及上述复合胰蛋白酶组合物在医药工业、皮革制造、食品加工中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供的复合胰蛋白酶组合物在传统胰蛋白酶中加入了低聚木糖，提高了胰蛋白酶的活性，这样相对于具有相同活性的胰蛋白酶的制备成本降低，使得胰蛋白酶的使用范围更加广泛。

另外，由于在胰蛋白酶添加了低聚木糖，有效利用低聚木糖的生理功能，使得胰蛋白酶的功能得到了扩展。

本发明提供的复合胰蛋白酶组合物应用于医药工业、皮革工业、食品工业中，以较小的复合胰蛋白酶组合物添加量，实现了胰蛋白酶活性显著的提升，降低了生产成本。

附图说明

图1为本发明提供的测试复合胰蛋白酶组合物酶活性的工艺流程图。

图2为本发明提供各实施例的不同组份的低聚木糖的胰蛋白酶组合物对应的酶活性提高率折线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对复合胰蛋白酶组合物进一步说明。

实施方式中的一种复合胰蛋白酶组合物，包含低聚木糖及胰蛋白酶，其中，所述低聚木糖质量（g）与胰蛋白酶活性（u）之比大于等于0.001:1000。

上述复合胰蛋白酶组合物在医药工业、皮革制造、食品加工中的应用。

本发明提供的复合胰蛋白酶组合物在传统胰蛋白酶中加入了低聚木糖，提高了胰蛋白酶的活性，这样相对于具有相同活性的胰蛋白酶的制备成本降低，使得胰蛋白酶的使用范围更加广泛。

以下为具体实施例部分：

采用《QBT1803-1993工业酶制剂通用试验方法》中测定蛋白酶活性的方法进行实验。

试剂

福林试剂：在2000 mL磨口回流装置中加入100g钨酸钠(Na₂WO₄-2H₂O)、25g钼酸钠 (Na₂MoO₄- 2 H₂O)、700 mL水、50mL 85%磷酸、100mL浓盐酸，置于小火中沸腾回流10h，取下回流装置，在通风橱中加入50 g硫酸锂(Li₂SO₄)、50 mL水和数滴浓溴水(99%)，再微沸15min，以除去多余的溴，冷却，加水定容至1000mL.混匀、过滤，贮存于棕色瓶内；使用时将一份福林试剂与二份水混合，摇匀；

0.4mol/L碳酸钠溶液(Na₂CO₃)；

0.4mol/L三氯乙酸；

0.5mol/L氢氧化钠溶液 (NaOH)；

l mol/L盐酸溶液(HCl)及0. lmol/L盐酸溶液(HCl)；

缓冲溶液：制备pH=7.5磷酸缓冲液，称取6.02 g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)和0.5g磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)，加水溶解并定容至1000mL，用pH剂校正至7.5；

胰蛋白酶：购自上海源叶生物科技有限公司（10000U/g），使用时稀释5000倍。

酪素：购自上海源叶生物科技有限公司，使用时配成10g/L。

实验方法

对照实验：

(1).在试剂瓶中加入1 mL的胰蛋白酶及1 mL的各种浓度的低聚木糖溶液（包括浓度为零，即不含低聚木糖）于40℃±0.2℃环境中静置2min；加入2.00 mL的三氯乙酸，摇匀，于40℃±0.2℃环境中静置10min；加入1.00 mL酪素,混合均匀；

(2).将上述试剂瓶取出静置10min后过滤；

(3).用量杯取1.00 mL滤液，再在量杯中加入5.00 mL碳酸钠溶液；加入1.00mL福林试剂使用溶液，混合均匀；

(4).将步骤（3）中最终的溶液置于40℃±0.2℃，显色20 min，并于680nm波长，用10mm比色皿，选取低聚木糖浓度为零的样品管设背景管，并调零。

样品测试：请参阅图1为本发明提供的测试复合胰蛋白酶组合物酶活性的工艺流程图，具体工艺如下：

(1).在试剂瓶中加入1 mL的胰蛋白酶及1 mL的各种浓度的低聚木糖溶液（包括浓度为零，即不含低聚木糖）于40℃±0.2℃环境中静置2min；

(2).再在上述试剂瓶中加入1.00 mL酪素,混合均匀，于40℃±0.2℃环境中静置10min；

(3).再在上述试剂瓶中加入2.00 mL的三氯乙酸，摇匀；

(4).将上述试剂瓶取出静置10 min后过滤；

(5).用量杯取1.00 mL滤液，再在量杯中加入5.00 mL碳酸钠溶液；

(6).在上述量杯中加入1.00 mL福林试剂使用溶液，混合均匀；

(7).将步骤（6）中最终的溶液置于40℃±0.2℃，显色20 min，并于680nm波长，用10mm比色皿测试其吸光度。

标准曲线：

绘制相应的含有不同含量低聚木糖的酪氨酸标准曲线，计算吸光常数K是否在规定范围内。计算得出K=98.2895±0.0013。即K值基本相同。实验所述浓度的低聚木糖在680nm波长处无明显吸光度。

X = 5/ 10 × A × K × n

X-----样品的酶活力，u/g(u/mL)

A----- 样品吸光度;

K------吸光常数;

5------反应试剂的总体积,mL

10----反应时间10min，以l min计;

n-----稀释倍数。

由此可以看出，由于K值基本相同，酶活的变化可以由A的变化来计算，本发明提供的实施例基于这一原理，通过计算样品吸光度A变化率来表征样品的酶活性变化率。

提高率按照下式计算：

低聚木糖对胰蛋白酶活性提高率=（加入XOS后含胰蛋白酶样品吸光度-不加XOS时含胰蛋白酶样品吸光度）/不加XOS时含胰蛋白酶样品吸光度×100%。

对比例：

加入不加低聚木糖时，按照上述试验所述的实验方法，即胰蛋白酶活性不受低聚木糖影响时，测试吸光度为0.0322。

实施例1：

加入低聚木糖质量（g）：胰蛋白酶活性（u）为0.001:1000，按照上述正式试验所述的实验方法，测试吸光度为0.0334。采用上述提高率计算公式得出，本实施例提供的胰蛋白酶活性（u）相对于对比例胰蛋白酶活性（u）提高3.73%。

实施例2：

加入低聚木糖质量（g）：胰蛋白酶活性（u）为0.005:1000，按照上述正式试验所述的实验方法，测试吸光度为0.0342。采用上述提高率计算公式得出，本实施例提供的胰蛋白酶活性（u）相对于对比例胰蛋白酶活性（u）提高6.21%。

实施例3：

加入低聚木糖质量（g）：胰蛋白酶活性（u）为0.01:1000，按照上述正式试验所述的实验方法，测试吸光度为0.0361。采用上述提高率计算公式得出，本实施例提供的胰蛋白酶活性（u）相对于对比例胰蛋白酶活性（u）提高12.11%。

实施例4;

加入低聚木糖质量（g）：胰蛋白酶活性（u）为0.02:1000，按照上述正式试验所述的实验方法，测试吸光度为0.0379。采用上述提高率计算公式得出，本实施例提供的胰蛋白酶活性（u）相对于对比例胰蛋白酶活性（u）提高17.70%。

实施例5：

加入低聚木糖质量（g）：胰蛋白酶活性（u）为1:1000，按照上述正式试验所述的实验方法，测试吸光度为0.0391。采用上述提高率计算公式得出，本实施例提供的胰蛋白酶活性（u）相对于对比例胰蛋白酶活性（u）提高21.43%。

实施例6：

加入低聚木糖质量（g）：胰蛋白酶活性（u）为100:1000，按照上述正式试验所述的实验方法，测试吸光度为0.0397。采用上述提高率计算公式得出，本实施例提供的胰蛋白酶活性（u）相对于对比例胰蛋白酶活性（u）提高23.29%。

表1为本发明上述各实施例提供的胰蛋白酶添加不同质量的低聚木糖的吸光度及酶活性提高率。

表1-各种胰蛋白酶组合物活性

请参阅附图2，为本发明提供各实施例的不同组份的低聚木糖的胰蛋白酶组合物对应的酶活性提高率折线图。其横坐标表示为胰蛋白酶组合物低聚木糖（g）：胰蛋白酶（u）值，纵坐标为胰蛋白酶组合物酶活性提高率。从图2中看出，低聚木糖对胰蛋白酶的酶活性有增强的作用，且随着添加的低聚木糖质量的增大胰蛋白酶的酶活性提高的百分比也相应增加。

本发明提供的复合胰蛋白酶组合物在传统胰蛋白酶中加入了低聚木糖，提高了胰蛋白酶的活性，这样相对于具有相同活性的胰蛋白酶的制备成本降低，使得胰蛋白酶的使用范围更加广泛；另外，由于在胰蛋白酶添加了低聚木糖，有效利用低聚木糖的生理功能，使得胰蛋白酶的功能得到了扩展。

实施例7：

复合胰蛋白酶组合物在药物上的应用

如：一种含有复合胰蛋白酶组合物的喷雾剂。

按照常规方法制备适量的复合胰蛋白酶组合物制剂冻干品，其中含1.25万或者2.5万或者5万或者10万单位的胰蛋白酶以及相应比例的低聚木糖。临使用时，加入氯化钠注射液适量使之溶解。加入到医用喷雾器材，喷入病人咽喉部，用于治疗咽喉疾病。由于低聚木糖提高了胰蛋白酶活性，因此疗效比喷入单独的胰蛋白酶效果更加，加快了患者痊愈。同时，低聚木糖或者可以减少胰蛋白酶的用量，降低了药物成本和治疗费用。或者可将这种复合胰蛋白酶组合物制成常规喷雾剂随身携带使用，减轻咽喉疾病患者的症状。

实施例8：

复合胰蛋白酶组合物在皮革制造上的应用

传统的皮革制造过程中，酶的使用在浸泡，脱毛和软化的步骤中。在这些步骤中，蛋白酶用于降解部分蛋白质，皮毛因此柔软，易曲，便于随后的鞣革。胰蛋白酶是一种非常好的用于软化的蛋白酶，特异性的作用于赖氨酰和精氨酰键。由于低聚木糖可以提高胰蛋白酶活性，因此采用复合胰蛋白酶组合物代替传统的胰蛋白酶，其效力更佳，制造出的皮毛经多人评定，比原来质量更高。优势之二，可以减少胰蛋白酶的用量，降低制造成本。

实施例9：

复合胰蛋白酶组合物在食品加工中的应用

胰蛋白酶可用于蛋白食品加工。胰蛋白酶组合物还可以利用加工肉类等动物蛋白原料，成为各种天然肉类食品添加剂，性能好，香味浓郁。同时可以水解原料制成各类饮料或者调味料。以制造蛋白质饮料和氨基酸口服液为例。干蚕蛹为原料，蛋白酶水解后，再经过脱色等步骤得到蛋白水解液，进而制成蛋白质饮料和氨基酸口服液。优势之一，复合胰蛋白酶组合物由于活性更高，因此比使用单独的胰蛋白酶，水解效果更佳。优势之二，低聚木糖具有极佳的保健价值，如增殖益生菌，降低血糖，降低胆固醇等多项功能。因此，复合胰蛋白酶组合物的使用，给食品增加了许多的高附加值，提高了产品的风味和价值。经感官评定实验证明，采用复合胰蛋白酶的蛋白质饮料和氨基酸口服液，其评分要明显高于使用传统的胰蛋白酶制成的蛋白质饮料和氨基酸口服液。

此外，复合胰蛋白酶组合物也可用于肉类嫩化中。肉类嫩化的方法有物理，化学和生物方法。外加蛋白酶是利用蛋白酶破坏肉类结缔组织中的胶原蛋白和弹性蛋白，使得肌肉柔软嫩化，无粗糙条纹，具有投入设备少，操作简单，效果明显等优点。优势之一，由于复合胰蛋白酶组合物的酶活性大于单纯使用胰蛋白酶，因此极大的提高了效率，效果比传统的胰蛋白酶更佳，且可以降低成本。优势之二，低聚木糖具有极佳的保健价值，如增殖益生菌，降低血糖，降低胆固醇等多项功能。因此，复合胰蛋白酶组合物的使用，给食品增加了许多的高附加值，提高了产品的风味和价值。经感官评定实验证明，使用复合胰蛋白酶组合物嫩化的肉类，比传统只使用胰蛋白酶的肉类，无论是风味口感，还是外观，都有明显的提高。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种复合胰蛋白酶组合物，其特征在于，包含低聚木糖及胰蛋白酶，其中，所述低聚木糖质量（g）与胰蛋白酶活性（u）之比大于等于0.001:1000。

2.根据权利要求1所述的复合胰蛋白酶组合物，其特征在于，所述低聚木糖质量（g）与胰蛋白酶活性（u）之比在0:001:1000 ~ 100:1000的范围。

3.根据权利要求2所述的复合胰蛋白酶组合物，其特征在于，所述低聚木糖质量（g）与胰蛋白酶活性（u）之比在0.005:1000~100:1000的范围。

4.根据权利要求3所述的复合胰蛋白酶组合物，其特征在于，所述低聚木糖质量（g）与胰蛋白酶活性（u）之比在0.01:1000~100:1000的范围。

5.根据权利要求4所述的复合胰蛋白酶组合物，其特征在于，所述低聚木糖质量（g）与胰蛋白酶活性（u）之比在0.02:1000~100:1000的范围。

6.根据权利要求5所述的复合胰蛋白酶组合物，其特征在于，所述低聚木糖质量（g）与胰蛋白酶活性（u）之比在1:1000~100:1000的范围。

7.根据权利要求6所述的复合胰蛋白酶组合物，其特征在于，所述低聚木糖质量（g）与胰蛋白酶活性（u）之比为0:001:1000或0.005:1000或0.01:1000或0.02:1000或1:1000或100:1000。

8.权利要求1至7之任一项在医药工业、皮革制造、食品加工中的应用。