CN102676425B - 解淀粉芽胞杆菌906及其所产生的细菌素和应用 - Google Patents

解淀粉芽胞杆菌906及其所产生的细菌素和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)906，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2012095。本发明还公开了解淀粉芽胞杆菌906所产生的细菌素和细菌素的应用。解淀粉芽胞杆菌906所产生的细菌素对多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌有抑制作用，尤其是对常见的致病菌如金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌和阪崎肠杆菌的具有较强的抑制作用，因此在生产食品和食品防腐剂中开发利用潜在价值很大。

Description

解淀粉芽胞杆菌906及其所产生的细菌素和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)906及其所产生的细菌素和细菌素的应用。
背景技术
单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌是肉类、蛋类、乳制品等很多食品中的常见致病菌，随着人们生活水平的日益提高，天然防腐剂的开发越来越受国内外研究者的重视。
解淀粉芽胞杆菌是广泛存在于自然界的一种非致病性细菌。目前，对其研究主要集中在：抑制植物病原真菌和病毒(申莉莉等，2010)；抑制黑曲霉、棉花枯萎病菌(Lisianne等，2010)；抑制大肠杆菌和产气荚膜梭菌(Diaz，2007)等。现有还没有关于利用解淀粉芽胞杆菌产生的细菌素抑制单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等致病菌的报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种解淀粉芽胞杆菌906。
本发明的第二个目的是提供一种由解淀粉芽胞杆菌906所产生的细菌素。
本发明的第三个目的是提供细菌素的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种解淀粉芽胞杆菌906，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2012095。
解淀粉芽胞杆菌906所产生的细菌素。
所述细菌素在生产食品中的应用。
所述细菌素在生产食品防腐剂中的应用。
本发明的有益效果是：解淀粉芽胞杆菌906所产生的细菌素对多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌有抑制作用，尤其是对常见的致病菌如金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌和阪崎肠杆菌的抑制效果显著，比相同浓度乳酸链球菌素(nisin)的抑制效果要强很多倍。
附图说明
图1是解淀粉芽胞杆菌906所产生的细菌素与nisin对金黄色葡萄球菌抑制效果比较的试验照片；
图2是解淀粉芽胞杆菌906所产生的细菌素与nisin对沙门氏菌抑制效果比较的试验照片；
图3是解淀粉芽胞杆菌906所产生的细菌素与nisin对单增李斯特菌抑制效果比较的试验照片；
图4是解淀粉芽胞杆菌906所产生的细菌素与nisin对阪崎肠杆菌抑制效果比较的试验照片。
图中：a、b、c、d、e、g分别表示nisin的浓度125IU/ml、250I U/ml、500IU/ml、1000IU/ml、2000IU/ml、4000IU/ml；f为细菌素的浓度：320AU/ml；h为生理盐水空白对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明。
实施例1细菌素的提取
在无菌环境下，将大米平铺于马铃薯培养基中，于28℃培养箱中培养3天，然后将对周围微生物有明显抑制作用的菌落挑出，在营养琼脂平板上划线分离纯化获得单个菌落，通过菌株的生理生化特征命名为解淀粉芽胞杆菌906并保存。采用BLAST分析法对解淀粉芽胞杆菌906菌株的16S rRNA基因序列与GenBank数据库比较分析发现，解淀粉芽胞杆菌906与解淀粉芽胞杆菌FZB42(登录号CP000560)的相似性高达99.9％，只有两个碱基不同，即解淀粉芽胞杆菌906第200和584个碱基分别为A和G，而解淀粉芽胞杆菌FZB42中分别为G和A，解淀粉芽胞杆菌906的16S rRNA基因序列为：
分离获得解淀粉芽胞杆菌906菌株在37℃的营养肉汤中振荡培养24h，离心后(10000rpm/min，20分钟)收集上清液，上清液经过滤除菌，然后通过质量浓度为60％的硫酸铵沉淀后透析，最后通过Sephadex G-100柱层析收集各组分，装柱前用pH为6.8，20mM的磷酸盐缓冲液平衡，并用相同的缓冲液冲洗，收集的有活性组分即为解淀粉芽胞杆菌906所产生的细菌素。
查阅有关资料，尚无解淀粉芽胞杆菌906产生的细菌素抑制金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、沙门氏菌等致病菌的报道。解淀粉芽胞杆菌906为新的菌株，已于2012年3月31日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCNO：M2012095。
实施例2细菌素的应用
解淀粉芽胞杆菌906(CCTCCNO：M2012095)产生的细菌素对单增李斯特菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌等有明显的抑制效果。分别在7ml纯牛奶中加入1ml菌浓度为108cfu/ml单增李斯特菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌和2ml细菌素后在常温下放置三天检测菌落总数，试验结果见表1。
表1细菌素对致病菌的抑制效果试验
Figure 2012101281535A00800042
在加入细菌素后三种致病菌的数量明显减少，这说明细菌素可以很好的抑制它们生长，其中对金黄色葡萄球菌抑制效果最好，达到了99.4％。这也表明解淀粉芽胞杆菌906(CCTCCNO：M2012095)产生的细菌素在一定浓度下可以将单增李斯特菌、阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌等控制在较低的范围。
将解淀粉芽胞杆菌906所产生的细菌素与nisin进行抑菌效果比较，结果如图1-4所示，从图中可以看出，细菌素对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌的抑菌效果明显强于nisin，通过图中抑菌圈的大小可以判断细菌素与nisin的倍数关系，如图1中细菌素的浓度：320AU/ml(f)产生的抑菌圈比浓度为2000IU/ml的nisin(e)产生的抑菌圈明显要大，故细菌素对金黄色葡萄球菌抑制效果倍数大于6(2000/320≈6)。具体数值见表2。
表2细菌素与nisin抑菌效果比较
  指示菌    细菌素与nisin抑制效果比较
  金黄色葡萄球菌      细菌素大于nisin的6倍
  沙门氏菌      细菌素约为nisin的2倍
  单增李斯特菌      细菌素约为nisin的10倍
  阪崎肠杆菌     Nisin没有抑制效果
解淀粉芽胞杆菌906产生的细菌素对速冻饺子馅中细菌和金黄色葡萄球菌抑制效果，分别对25g的速冻饺子馅做如下处理：A，直接测菌落总数；B，加入105cfu/ml金黄色葡萄球菌、C，加1ml细菌素、D，105cfu/ml金黄色葡萄球菌和1ml细菌素、E，空白对照，后四组在4℃下存放三天后检测菌落总数。不同处理后菌落总数分别为：1.3×106cfu/ml、1.1×107cfu/ml、4.5×105cfu/ml、6.0×105cfu/ml、9.7×106cfu/ml。通过C组和E组比较发现加细菌素后对细菌的抑制率达到95.36％，通过B组和D组比较发现加细菌素后对细菌的抑制率达到94.55％。这说明在加入该细菌素后对速冻饺子馅中细菌有明显的抑制作用。
Figure IDA00001802626400011
Figure IDA00001802626400021

Claims (3)

1.一种解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）906，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2012095。
2.解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）906所产生的细菌素，所述解淀粉芽胞杆菌906保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2012095，所述细菌素是通过下述方法制备的：将解淀粉芽胞杆菌906菌株在37℃的营养肉汤中振荡培养24h，以10000rpm的转速离心20分钟后收集上清液，上清液经过滤除菌，然后通过质量浓度为60%的硫酸铵沉淀后透析，最后通过Sephadex G-100柱层析收集各组分，装柱前用pH为6.8，20mM的磷酸盐缓冲液平衡，并用相同的缓冲液冲洗，收集的有活性组分即为解淀粉芽胞杆菌906所产生的细菌素,其中，所述活性是指抑制单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌生长的活性。
3.权利要求2所述的细菌素在抑制金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、沙门氏菌生长中的应用。
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