CN102670510A - 穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体及在制备治疗前列腺癌、肺癌、乳腺癌药的应用 - Google Patents

Abstract

穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体及其制备方法和用途。穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体由雷公藤红素与脂质载体组成，各组分的重量份组成如下：雷公藤红素1，穿膜肽0.5~10，混合脂质5~100，乳化剂0.5~20，稳定剂5~100。本发明制得的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体可将纳米粒包封率提高至78-90%。本发明采用口服给药，促进雷公藤红素的体内吸收，提高其生物利用度，减少给药剂量，最终降低雷公藤红素的体内蓄积，结合纳米结构脂质载体的缓释作用，减小其毒性反应，最终提高雷公藤红素的临床治疗效果。

Description

穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体及在制备治疗前列腺癌、肺癌、乳腺癌药的应用

技术领域

本发明属于中药制剂领域，涉及一种穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体，是将中药雷公藤的三萜类单体成分雷公藤红素负载于穿膜肽修饰的纳米结构脂质载体中。本发明还涉及所述穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体在制备采用口服给药途径治疗前列腺癌、肺癌及乳腺癌药物中的应用。

背景技术

雷公藤红素（Tripterine）是从卫茅科雷公藤属植物雷公藤（Triperygium Wilfordii Hook f.）中分离提纯得到的五环三萜醌结构的化合物。分子式：C₂₉H₃₈O₄，分子量：450.61，CAS号： 34157-83-0，结构式：

雷公藤红素不溶于水，易溶于二甲基亚砜、氯仿、丙酮和乙醚。具有较强的抑制免疫反应、抗炎及抗癌作用，可以用于多种自体免疫、慢性炎症疾病及癌症治疗，包括前列腺癌、肺癌、乳腺癌、银屑病、特应性皮炎、全身性红斑狼疮及慢性类风湿性关节炎等。虽然雷公藤红素抑制免疫反应、抗炎症及抗癌的作用较好，但雷公藤红素不溶于水，口服胃肠道吸收较差，加之雷公藤红素毒性较大，有较强的生殖毒性、心脏毒性、肾毒性以及胃肠道不良反应，这些特点限制了雷公藤红素的应用。因此促进雷公藤红素的吸收，提高其口服生物利用度，增加其疗效，减少其毒副作用是雷公藤红素口服给药亟待解决的问题。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供一种穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体。本发明还将提供本所述穿膜肽修饰的纳米结构脂质载体在制备口服治疗前列腺癌、肺癌及乳腺癌药物中的应用。以上技术方案能促进雷公藤红素的吸收，提高其口服生物利用度，减少其毒副作用，以增加雷公藤红素口服给药的临床疗效。

完成上述发明任务的技术方案是：一种穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体，由雷公藤红素与穿膜肽修饰的纳米结构脂质载体组成，其特征在于，所述的各组分的重量份组成如下：

雷公藤红素           1

穿膜肽            0.5~10   

混合脂质          5~100

乳化剂            0.5~20

稳定剂            5~100。

以上方案中，所述的穿膜肽可以选用SA-R₆L₂、penetratin、octaarginine、TAT 、pVEC、MAP、(Arg) 7或MPG。

所述的SA-R₆L₂中，SA：硬脂酸；R：精氨酸；L：亮氨酸；

其中的稳定剂可以采用泊洛沙姆-188、聚乙烯醇或聚乙二醇；

其中的乳化剂可以选用磷脂、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯、 吐温-80或OP乳化剂；或者以上乳化剂中的两种。

本申请推荐采用磷脂，或使用维生素E聚乙二醇琥珀酸酯，或者同时采用磷脂与维生素E聚乙二醇琥珀酸酯。

本发明推荐的各组分重量份组成是：

雷公藤红素     1

穿膜肽        1-5

混合脂质     10-50

乳化剂        2-10

稳定剂        10-50。

本发明推荐各组分的最佳重量份组成是：

雷公藤红素     1

穿膜肽         2

混合脂质       16

乳化剂         4

稳定剂        16.7。

本申请推荐的最佳处方是：雷公藤红素60mg，穿膜肽SA-R₆L₂ 120mg， 双硬脂酸甘油酯720mg， 肉豆蔻酸异丙酯240mg，大豆卵磷脂120mg，维生素E聚乙二醇琥珀酸酯120mg，泊洛沙姆水溶液（1%,w/w）100mL。

优化方案中，所述的混合脂质由固体脂质和液体脂质组成；其中固体脂质可以为：双硬脂酸甘油酯、山嵛酸甘油酯、十六酸鲸蜡酯、棕榈酰硬脂酰甘油酯、三月桂酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂胺、硬脂酸、硬脂醇、棕榈酸及月桂酸或其中任意两种或两种以上的混合物；液体脂质可以为：肉豆蔻酸异丙酯、辛酸/癸酸甘油酯、月桂酸己酯、2-辛基月桂醇、棕榈酸异丙脂、油酸、亚油酸、维生素E、液体石蜡、大豆油、玉米油、葵花籽油、橄榄油、花生油或其中任意两种或两种以上的混合物。本发明推荐采用的固体脂质为双硬脂酸甘油酯，液体脂质为肉豆蔻酸异丙酯；所述的固体脂质和液体脂质的重量比为0.1:1 ~10:1；本发明推荐的重量比是3:1。

所述的乳化剂由磷脂和维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)按0.1:1~10:1重量比组成；本发明推荐的重量比是1:1。

所述的稳定剂最优为1%（w/w）的泊洛沙姆，按照最佳处方推算其质量为1000mg，当雷公藤红素的60mg为1重量份的时候，泊洛沙姆为重量份为16.7。

所述的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体，平均粒径在50~300nm之间。

更具体和更优化地说，上述穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体，是指按照以下制备方法得到的脂质载体：

⑴. 取一定量的混合脂质材料，先将固体脂质加热熔化；

⑵. 然后加入液体脂质、乳化剂（例如：磷脂、TPGS）、穿膜肽和雷公藤红素；

⑶. 充分溶解后在剧烈搅拌的条件下将熔融液分散到相同温度的含1%(w/w)稳定剂的水相中得到初乳；

⑷. 将此初乳通过高压乳匀机乳化；

⑸. 再在低温水相(0-2℃)中冷却固化即可得穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体。

所述固体脂质与液体脂质的质量比是，0.1:1~10:1；最佳比例是3:1。

完成本申请第2个发明任务的方案是，所述的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体在制备口服治疗前列腺癌、肺癌及乳腺癌药物中的应用。

所述的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体的应用，可以与药学可接受的辅料组合制成缓释制剂或普通制剂。

所述的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体的应用，所述的普通制剂是片剂、胶囊或颗粒剂。

所述的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体的应用，所述的缓释制剂为缓释片、胶囊或微丸。

纳米结构脂质载体(nanostructure lipid carriers, NLC)是将固体脂质和空间上不相容的液体脂质在一定温度下混合制备得到的纳米粒给药载体。通过形成一些含纳米隔室的脂质骨架，提高药物载药量，避免储存过程中药物被排挤，与传统载体系统(如脂质体、微球、固体脂质纳米粒等)相比，其具有更高的载药能力及降低储藏过程包封药物泄漏的优点。基于纳米结构脂质载体生物相容性好、制备成本低、载药量高、稳定性较好的特点，目前已成为解决中药难吸收有效成分口服生物利用度低问题最有前景的技术之一。

纳米粒子口服后主要经Peyer结上的M细胞或胞饮作用转运，在胃肠道中的吸收较为有限，纳米结构脂质载体也是如此。因此进一步增加纳米结构脂质载体经肠道细胞的转运效率，增加纳米结构脂质载体及其包封药物的口服吸收是非常必要和有意义的。细胞穿膜肽 (cell-penetrating peptides, CPPs)，是一类由 10～30 个氨基酸组成的短肽，是一种新的很有潜力的药物运输载体，他们能穿透细胞膜进入细胞内，而且多种运载物分子也可以与这些肽和蛋白质连接并易位进入细胞内。这些肽分子不会产生细胞膜永久性损伤，毒性低。

本发明采用的新型脂质穿膜肽SA-R₆L₂，其物理、化学稳定性较好，不具有吸湿性；结构简单，固相合成制备成本低，适于在中药口服释药系统中应用；通过初步研究，发现其穿膜效率及安全性均高于经典穿膜肽octaarginine；此外，因含有硬脂酸，具有亲脂性，在纳米结构脂质载体中的包封率为100%，适于修饰纳米结构脂质载体。

将雷公藤红素制备成纳米结构脂质载体，并用穿膜肽SA-R₆L₂对其进行修饰，可明显促进雷公藤红素吸收，提高其口服生物利用度，从而减少给药量与体内蓄积，降低雷公藤红素对正常组织的毒副作用及其胃肠道不良反应。其在治疗前列腺癌、肺癌及乳腺癌方面具有疗效好、毒性低的优势，将具有很好的应用开发前景。目前未见具有采用口服给药方式治疗前列腺癌、肺癌及乳腺癌作用的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体的研究报道。

本发明制得的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体，透射电镜观察载药纳米粒呈圆形，形态规整(详见附图1)，平均粒径在90~160nm之间，电位值为20mv~40mv (详见附图2、3)，说明所得纳米结构脂质载体的稳定性好。冷冻干燥后复溶，粒径、电位几乎无变化，冻干后可长期保存。本发明因采用新型辅料维生素E聚乙二醇琥珀酸酯可将纳米粒包封率提高至78-90%。经差示扫描量热仪(DSC)检查，雷公藤红素在175.7℃以及211.4℃有吸热峰，穿膜肽在164.4℃以及243.9℃有吸热峰，制成物理混合物后，雷公藤红素及穿膜肽的吸热峰均发生移动，而在穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体中，两者的吸热峰完全消失（详见附图4）。通过A、B、D、E四条曲线对比，可以看出，纳米结构脂质载体中辅料、穿膜肽及雷公藤红素的存在形式均发生变化，形成了无定形结构。这种结构的形成，可以提高脂质的载药量，避免脂质重结晶，并保持α构型，药物不易从纳米结构脂质载体中泄漏。

比格犬体内生物利用度的研究

实验方法

健康纯种比格犬6只，采取三周期交叉的实验设计，两周期间隔时间为一周。实验前禁食12h以上，正常饮水，口服给药，剂量1.5mg/kg。分别于给药后0，0.25，0.5，0.75，1，2，3，4，6，8，10，12，24h从前肢静脉取血2-3mL，置肝素试管中，3000 r·min^-1离心15min，分离血浆，-20℃保存。

将冷冻的血浆样品在室温下溶解。精密吸取500μL的血浆到10mL离心管中，加入20μL的内标物溶液，涡旋30s，加入2mL的乙酸乙酯，涡旋2 min，3500 r·min^-1离心10min，取上清液置10mL离心管中，提取3次，合并上清液氮气吹干，100μL流动相复溶，涡旋30s，13000 r·min^-1离心10min，取20μL上清液采用HPLC测定。

实验结果

雷公藤红素纳米结构脂质载体混悬液、穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体混悬液与雷公藤红素混悬液灌胃给药后的平均血药浓度-时间曲线见图2。经DAS 2.0软件对数据进行模型拟合，按照非房室依赖型进行计算，结果如表1所示。

 

表1 比格犬口服给药后药动学参数( ±s, n=6)

剂型

Cmax(μg/L)

Tmax(h)

t1/2(h)

AUC(0-t)( μg/L·h)

AUC(0-∞)( μg/L·h)

MRT(h)

雷公藤红素

223.73±31.55

0.96±0.10

1.60±0.13

482.45±57.52

625.75±66.39

1.65±0.13

雷公藤红素纳米结构脂质载体(NLCs)

305.02±35.40

2.33±0.58

3.85±0.94

1560.05±58.58

1791.97±57.10

4.37±0.33

穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体(CTNLCs)

483.02±15.38

1.67±0.58

3.10±0.54

2338.68±217.81

2568.02±343.41

4.09±0.37

相对生物利用度的计算

公式：相对生物利用度F (%)=(AUC_T×D_R)/( AUC_R×D_T) ×100%

T与R分别代表受试制剂与参比制剂，D表示给药剂量。根据受试制剂和参比制剂中雷公藤红素的AUC_0-t 计算相对生物利用度。

F_NLCs/ _Suspensions (%) =309.25%

F_CTNLCs/ _Suspensions (%) =484.75%

F_CTNLCs/ _NLCs (%) =149.91%

(即：雷公藤红素纳米结构脂质载体的生物利用度较单体提高了3.09倍，穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体的生物利用度较单体提高了4.84倍，)

结果表明纳米结构脂质载体载雷公藤红素后能够显著提高雷公藤红素的生物利用度，C_max和AUC均显著性提高1.36和3.23倍，而由于纳米结构脂质载体的缓慢释药的特性，T_max、t_1/2和MRT均显著延长。而穿膜肽修饰后的纳米结构脂质载体的生物利用度比与未修饰的纳米结构脂质载体相比，生物利用度提高1.57倍，可能因纳米粒子口服后主要经Peyer结上的M细胞或胞饮作用转运，在胃肠道中的吸收较为有限，而穿膜肽可以通过共价键或非共价键偶合等方式携带各种分子或纳米载体透过细胞膜，进一步增加NLC经肠道细胞的转运效率，增加NLC及其包封药物的口服吸收，提高雷公藤红素的口服生物利用度。

本发明具有以下有益效果：

1、纳米结构脂质载体与传统载体系统(如脂质体、微球、固体脂质纳米粒等)相比具有更高的载药能力及降低储藏过程包封药物泄漏的优势。基于纳米结构脂质载体生物相容性好、制备成本低、载药量高、稳定性较好的特点，目前已成为解决中药难吸收有效成分口服生物利用度低问题最有前景的技术之一。

2、细胞穿膜肽是一种新的很有潜力的药物运输载体，他们能穿透细胞膜进入细胞内，且多种运载物分子也可以与这些肽和蛋白质连接并易位进入细胞内。这些肽分子毒性低，不会产生细胞膜永久性损伤。本专利采用的新型脂质穿膜肽SA-R₆L₂，其物理、化学稳定性较好，不具有吸湿性；结构简单，固相合成制备成本低，适于在中药口服释药系统中应用；通过初步研究，发现其穿膜效率及安全性均高于经典穿膜肽octaarginine；此外，因含有硬脂酸，具有亲脂性，在纳米结构脂质载体中的包封率为100%，适于修饰纳米结构脂质载体。采用大鼠肠灌流模型对穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体的体内吸收进行的研究表明，与单体药物的体内吸收相比，穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体可将雷公藤红素的体内吸收提高2-3倍。申请人采用Caco-2细胞毒性试验，对穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体的肠道毒性进行了初步研究，结果表明，穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体可将雷公藤红素对Caco-2细胞的IC₅₀由单体药物的2.49μg/mL提高至3.56μg/mL，可以显著降低雷公藤红素的肠道毒性。这说明，将雷公藤红素制成纳米结构脂质载体，并采用穿膜肽SA-R₆L₂进行修饰，可以提高雷公藤红素的体内吸收，使其口服生物利用度得到提高，在临床使用时，可在低剂量的条件下，达到与单体同样的治疗效果，从而减少给药量与体内蓄积，结合纳米结构脂质载体的缓释作用，可降低雷公藤红素对正常组织的毒副作用及其胃肠道不良反应。因此将其应用于前列腺癌、肺癌及乳腺癌的治疗，将具有疗效好、毒性低的优势，具有重大的临床应用价值及很好的应用开发前景。本发明提出的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体，可弥补现有雷公藤红素制剂剂型不足的缺陷，且制备方法简单，生产成本低。

附图说明

图1为穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体透射电镜照片；

图2为穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体电位测定结果；

图3为穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体粒径测定结果； 

图4为DSC图谱。图中，A：雷公藤红素，B：穿膜肽，C：辅料物理混合物，D：穿膜肽、雷公藤红素与辅料的物理混合物，E：穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体；

图5为生物利用度的平均血药浓度-时间曲线。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步详细说明，但本发明的范围并不受这些实例的任何限制。

实施例1

穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体的制备。

处方：雷公藤红素60mg，穿膜肽SA-R₆L₂ 120mg， 双硬脂酸甘油酯720mg， 肉豆蔻酸异丙酯240mg，大豆卵磷脂120mg，维生素E聚乙二醇琥珀酸酯120mg，泊洛沙姆水溶液（1%,w/w）100mL。

制备工艺：将双硬脂酸甘油酯于60℃加热熔化，然后加入肉豆蔻酸异丙酯、磷脂、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯、穿膜肽和雷公藤红素，充分溶解后在剧烈搅拌的条件下（4000r/min）将熔融液分散到相同温度的100mL含泊洛沙姆（1%,w/w）的水相中得到初乳，将此初乳通过高压乳匀机乳化（500bar），循环3-6次；再在低温水相(0-2℃)中冷却固化，即可得穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体。所得纳米粒平均粒径为：102.3nm，电位：38.7mv，包封率87.4%。

实施例2

穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体冻干粉的制备

将5g的甘露醇加入实施例1制备所得的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体混悬液中进行冻干，所得冻干粉具有良好的再分散性，再分散后纳米粒的粒径、电位几乎不变。

实施例3

穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体片剂的制备（1000片）

将366 g穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体冻干粉过80目筛，与126g淀粉混匀，加40g10%淀粉浆制成软材，用14目筛制粒后，置55℃干燥后于12目筛整粒，加入40g干淀粉及4g硬脂酸镁，混匀后，压片，即得。每片含雷公藤红素量3 mg。

实施例4

穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体胶囊的制备（1000粒）

将366 g穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体冻干粉过80目筛，将适量10%淀粉浆制成白糊，与药物混合，制成软材后，过14目尼龙筛制粒，与55℃干燥至水分3%以下，将颗粒填入空胶囊中，即得。每粒含雷公藤红素量3 mg。  

实施例5

穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体胃漂浮缓释片的制备（1000片）

将366 g穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体，加入羟丙基甲基纤维素75g、聚维酮K30 35g、十八醇60g、硬脂酸镁4g，混合均匀，干法制粒，压片，制成胃漂浮缓释片。每片含雷公藤红素量3 mg。

实施例6

穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体缓释片的制备（1000片）

将366 g穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体，加入羧甲基纤维素95g、羟丙基甲基纤维素30g、甘露醇36g，用10%聚维酮K30乙醇液湿法制粒，加入硬脂酸镁8g，混合均匀，压片，制成缓释片。每片含雷公藤红素量3 mg。

实施例7

按照实施例1获得的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体混悬液，进行药效学实验，其中对比药物为用二甲基亚砜助溶的雷公藤红素单体溶液。

1、小鼠前列腺癌模型的建立

选择BALB/cA-nude裸小鼠作为实验动物。将体外培养的人前列腺癌PC-3细胞接种于裸鼠颈背部皮下，每鼠接种细胞悬液0.2mL，接种细胞密度为1.0×10¹⁰/L。

2、药效学实验

取成功建模裸小鼠40只，随机分为4组，每组10只。每天1次，用药14天。给药方式：灌胃给药。第1组为实施例1获得的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体混悬液，给药剂量为2mg雷公藤红素/kg；第2组为雷公藤红素单体溶液，给药剂量为2mg雷公藤红素/kg；第3组为穿膜肽修饰的空白纳米结构脂质载体组；第4组为模型对照组。停药次日以颈椎脱位法处死裸小鼠，于超净工作台上，以无菌操作完整剥取肿瘤，剥离干净后于电子天平称瘤体重量并按公式计算抑瘤率。抑瘤率（%）=（1 - 治疗组平均瘤重/模型对照组平均瘤重）×100%。

实验结果：穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体给药组抑瘤率为45.6%；雷公藤红素单体溶液给药组抑瘤率为30.9%；穿膜肽修饰的空白纳米结构脂质载体组对肿瘤几乎无抑制作用。穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体与红素单体溶液的抑瘤率有显著性差异(P<0.05)。

实施例8

按照实施例1获得的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体混悬液，进行药效学实验，其中对比药物为用二甲基亚砜助溶的雷公藤红素单体溶液。

1、家兔VX2原位肺癌模型的建立

1）荷瘤种兔的制作   常规复苏VX2肿瘤冰冻细胞悬液，制成10⁶/mL的活细胞悬液，取1mL接种于1只兔右后腿外侧肌肉内，3周后于接种部位可扪及一直径约30cm的肿块，即制成荷瘤种兔。

2）组织块悬液的制备   无菌条件下切取荷瘤种兔腿外侧肌肉内的肿瘤，取呈鱼肉样生长旺盛的肿瘤组织，剪成泥状。RPMI 1640培养液冲洗下过30目筛，去除单个细胞和过小的组织块，筛上部分在RPMI 1640培养液冲洗下过20 目筛，去除过大的组织块。取筛下部分，离心沉淀后，取沉淀物2mL，加RPMI 1640培养液配制成组织块悬液20mL。

3）肺内接种   所有家兔右胸壁脱毛，肌内注射速眠新合剂0.8mL/kg麻醉后固定，常规消毒，取无菌三通接头，分别接12号注射针头、吸有兔自身血凝块的1mL注射器及吸有VX2 肿瘤组织块悬液或细胞悬液1mL的注射器。在X线透视下，将12号针头刺入兔右肺下叶内，回吸无血后，注入0.4mL组织块悬液或细胞悬液, 然后注入0.2mL 兔自身血凝块，拔出针头，接种完毕。

4）移植瘤生长情况的观测   全部家兔自接种后第3天起，每日对胸部进行层宽、层厚均为5mm的CT扫描，观察肿瘤生长、胸腔内转移情况。

5）家兔VX2原位肺癌模型建立结果   家兔全部有肺内肿瘤生长，接种成功率100%。

2、药效学实验

取成功建模家兔40只，随机分为4组，每组10只。每天1次，用药14天。给药方式：灌胃给药。第1组为实施例1获得的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体混悬液，给药剂量为4mg雷公藤红素/kg；第2组为雷公藤红素单体溶液，给药剂量为4mg雷公藤红素/kg；第3组为穿膜肽修饰的空白纳米结构脂质载体组；第4组为模型对照组。停药次日以颈椎脱位法处死家兔，于超净工作台上，以无菌操作完整剥取肿瘤，剥离干净后于电子天平称瘤体重量并按公式计算抑瘤率。抑瘤率（%）=（1 - 治疗组平均瘤重/模型对照组平均瘤重）×100%。

实验结果：穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体给药组抑瘤率为63.1%；雷公藤红素单体溶液给药组抑瘤率为35.8%；穿膜肽修饰的空白纳米结构脂质载体组对肿瘤几乎无抑制作用。穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体与红素单体溶液的抑瘤率有显著性差异(P<0.05)。

实施例9

按照实施例1获得的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体混悬液，进行药效学实验，其中对比药物为用二甲基亚砜助溶的雷公藤红素单体溶液。

1、大鼠乳腺癌模型的建立

选择雌性SD大鼠作为实验动物。Walker-256肿瘤细胞株在含10%小牛血清1640培养液通过细胞培养技术传代培养扩增，细胞悬液约1.5mL(细胞数约1.0×10⁷)种鼠腹腔内注射，约1周后可形成腹水瘤。无菌抽取腹水约3mL，取少量腹水稀释并计数，之后800r/min离心5min，弃上清，沉淀细胞用PBS缓冲液稀释，调节悬液细胞浓度至4.0×10⁷/mL。将大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉，仰卧位，左侧腋窝皮肤消毒，皮下缓慢注射细胞悬液0.8mL(细胞数约3.0×10⁷)。注射针退出后穿刺点针口消毒。

2、药效学实验

取成功建模大鼠40只，随机分为4组，每组10只。每天1次，用药14天。给药方式：灌胃给药。第1组为实施例1获得的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体混悬液，给药剂量为4mg雷公藤红素/kg；第2组为雷公藤红素单体溶液，给药剂量为4mg雷公藤红素/kg；第3组为穿膜肽修饰的空白纳米结构脂质载体组；第4组为模型对照组。停药次日以颈椎脱位法处死大鼠，于超净工作台上，以无菌操作完整剥取肿瘤，剥离干净后于电子天平称瘤体重量并按公式计算抑瘤率。抑瘤率（%）=（1 - 治疗组平均瘤重/模型对照组平均瘤重）×100%。

实验结果：穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体给药组抑瘤率为57.8%；雷公藤红素单体溶液给药组抑瘤率为31.7%；穿膜肽修饰的空白纳米结构脂质载体组对肿瘤几乎无抑制作用。穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体与红素单体溶液的抑瘤率有显著性差异(P<0.05)。

实施例10，与上述各实施例基本相同，但所述的各组分的重量份组成如下：雷公藤红素：1，穿膜肽：0.5，混合脂质：5，乳化剂：0.5，稳定剂： 5。 

实施例11，与上述各实施例基本相同，但所述的各组分的重量份组成如下：雷公藤红素：1，穿膜肽：10，混合脂质：100，乳化剂：10，稳定剂：100。 

实施例12，与上述各实施例基本相同，但所述的各组分的重量份组成如下：雷公藤红素：1，穿膜肽：0.5，混合脂质：100，乳化剂：0.5，稳定剂：100。 

实施例13，与上述各实施例基本相同，但所述的各组分的重量份组成如下：雷公藤红素：1，穿膜肽：10 ，混合脂质：5，乳化剂：10，稳定剂：5。

实施例14，与上述各实施例基本相同，但所述的各组分的重量份组成如下：雷公藤红素：1，穿膜肽：5，混合脂质：50，乳化剂：6，稳定剂：50。

实施例15，与上述各实施例基本相同，但所述的各组分的重量份组成如下：雷公藤红素：1，穿膜肽：1，混合脂质：10，乳化剂：2，稳定剂：10。

实施例16，与上述各实施例基本相同，但所述的各组分的重量份组成如下：雷公藤红素：1，穿膜肽：1，混合脂质：50，乳化剂：2，稳定剂：50。

实施例17，与上述各实施例基本相同，但所述的各组分的重量份组成如下：雷公藤红素：1，穿膜肽：5，混合脂质：10，乳化剂：6，稳定剂：10。

实施例18，与上述各实施例基本相同，但所述的穿膜肽采用penetratin。所述的乳化剂采用磷脂、维生素E聚乙二醇琥珀酸脂、吐温-80或OP乳化剂中的一种或两种以上混合物。所述的混合脂质由固体脂质和液体脂质组成；其中固体脂质采用双硬脂酸甘油酯；所述的液体脂质采用肉豆蔻酸异丙酯；所述的固体脂质和液体脂质的重量比为3:1。

实施例19，与上述各实施例基本相同，但所述的穿膜肽采用octaarginine；所述的乳化剂采用吐温-80。所述的固体脂质采用山嵛酸甘油酯；所述的液体脂质采用辛酸/癸酸甘油酯；所述的固体脂质和液体脂质的重量比为0.1:1。

实施例20，与上述各实施例基本相同，但所述的穿膜肽采用TAT；所述的乳化剂采用OP乳化剂。所述的固体脂质采用十六酸鲸蜡酯；所述的液体脂质采用月桂酸己酯；所述的固体脂质和液体脂质的重量比为10:1。

实施例21，与上述各实施例基本相同，但所述的穿膜肽采用pVEC；稳定剂采用泊洛沙姆。所述的固体脂质采用棕榈酰硬脂酰甘油酯；所述的液体脂质采用2-辛基月桂醇。

实施例22，与上述各实施例基本相同，但所述的穿膜肽采用MAP；所述的稳定剂采用聚乙烯醇。所述的固体脂质采用三月桂酸甘油酯；所述的液体脂质采用棕榈酸异丙脂。

实施例23，与上述各实施例基本相同，但所述的穿膜肽采用 (Arg) 7；所述的稳定剂采用聚乙二醇。所述的固体脂质采用三肉豆蔻酸甘油酯；所述的液体脂质采用油酸。

实施例24，与上述各实施例基本相同，但所述的穿膜肽采用MPG。所述的固体脂质采用三棕榈酸甘油酯；所述的液体脂质采用亚油酸。

实施例25，与上述各实施例基本相同，但所述的固体脂质采用三硬脂酸甘油酯；所述的液体脂质采用亚油酸。

实施例26，与上述各实施例基本相同，但所述的固体脂质采用三硬脂酸甘油酯；所述的液体脂质采用维生素E。

实施例27，与上述各实施例基本相同，但所述的固体脂质采用单硬脂酸甘油酯；所述的液体脂质采用液体石蜡。

实施例28，与上述各实施例基本相同，但所述的固体脂质采用硬脂胺；所述的液体脂质采用大豆油。

实施例29，与上述各实施例基本相同，但所述的固体脂质采用硬脂酸；所述的液体脂质采用玉米油。

实施例30，与上述各实施例基本相同，但所述的固体脂质采用硬脂醇；所述的液体脂质采用葵花籽油。

实施例31，与上述各实施例基本相同，但所述的固体脂质采用棕榈酸；所述的液体脂质采用橄榄油。

实施例32，与上述各实施例基本相同，但所述的固体脂质采用月桂酸；所述的液体脂质采用花生油。

实施例33，与上述各实施例基本相同，但所述的固体脂质采用双硬脂酸甘油酯、山嵛酸甘油酯、十六酸鲸蜡酯、棕榈酰硬脂酰甘油酯、三月桂酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂胺、硬脂酸、硬脂醇、棕榈酸或月桂酸中任意两种或两种以上的混合物；所述的液体脂质采用：肉豆蔻酸异丙酯、辛酸/癸酸甘油酯、月桂酸己酯、2-辛基月桂醇、棕榈酸异丙脂、油酸、亚油酸、维生素E、液体石蜡、大豆油、玉米油、葵花籽油、橄榄油或花生油中任意两种或两种以上的混合物。

Claims (10)

1. 一种穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体，由雷公藤红素与穿膜肽修饰的纳米结构脂质载体组成，其特征在于，所述各组分的重量份组成如下：

雷公藤红素           1

穿膜肽            0.5~10   

混合脂质          5~100

乳化剂            0.5~20

稳定剂            5~100。

2. 根据权利要求1所述的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体，其特征在于，所述各组分重量份组成是：

雷公藤红素     1

穿膜肽        1-5

混合脂质     10-50

乳化剂        2-10

稳定剂        10-50。

3. 根据权利要求1所述的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体，其特征在于，所述的穿膜肽选自：SA-R₆L₂、penetratin、octaarginine、TAT 、pVEC、MAP、(Arg) 7或MPG；

所述的稳定剂选自：泊洛沙姆-188、聚乙烯醇或聚乙二醇；

所述的乳化剂选自：磷脂、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯、吐温-80或OP乳化剂；或者以上乳化剂中的两种。

4. 根据权利要求4所述的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体，其特征在于，所述的穿膜肽为SA-R₆L₂，其中，SA：硬脂酸；R：精氨酸；L：亮氨酸；所述的乳化剂同时采用磷脂与维生素E聚乙二醇琥珀酸酯；所述各组分的重量份组成是：雷公藤红素：1；穿膜肽：2；混合脂质：16；乳化剂：4；稳定剂：16.7。

5. 根据权利要求1所述的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体，其特征在于，所述的混合脂质由固体脂质和液体脂质组成；其中固体脂质选自：双硬脂酸甘油酯、山嵛酸甘油酯、十六酸鲸蜡酯、棕榈酰硬脂酰甘油酯、三月桂酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂胺、硬脂酸、硬脂醇、棕榈酸或月桂酸，或其中任意两种或两种以上的混合物；所述的液体脂质选自：肉豆蔻酸异丙酯、辛酸/癸酸甘油酯、月桂酸己酯、2-辛基月桂醇、棕榈酸异丙脂、油酸、亚油酸、维生素E、液体石蜡、大豆油、玉米油、葵花籽油、橄榄油或花生油，或其中任意两种或两种以上的混合物；所述的固体脂质和液体脂质的重量比为0.1:1 ~10:1。

6. 根据权利要求5所述的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体，其特征在于，所述的固体脂质为双硬脂酸甘油酯；所述的液体脂质为肉豆蔻酸异丙酯；所述的固体脂质和液体脂质的重量比为3:1。

7. 根据权利要求6所述的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体，其特征在于，所述的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体，是指按照以下制备方法得到的脂质载体：

⑴. 取一定量的混合脂质材料，先将固体脂质加热熔化；

⑵. 然后加入液体脂质、乳化剂、穿膜肽和雷公藤红素；

⑶. 充分溶解后在剧烈搅拌的条件下将熔融液分散到相同温度的含1%(w/w)稳定剂的水相中得到初乳；

⑷. 将此初乳通过高压乳匀机乳化；

⑸. 再在低温水相中冷却固化即可得穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体。

8. 根据权利要求7所述的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体，其特征在于，所述各组分的重量份组成是：雷公藤红素60mg，穿膜肽SA-R₆L₂ 120mg， 双硬脂酸甘油酯720mg， 肉豆蔻酸异丙酯240mg，大豆卵磷脂120mg，维生素E聚乙二醇琥珀酸酯120mg，1%,w/w泊洛沙姆水溶液100mL。

9. 权利要求1所述的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体在制备口服治疗前列腺癌、肺癌及乳腺癌药物中的应用。

10. 根据权利要求9所述的穿膜肽修饰的雷公藤红素纳米结构脂质载体在制备口服治疗前列腺癌、肺癌及乳腺癌药物中的应用，其特征在于，所述的脂质载体是与药学可接受的辅料组合制成缓释制剂或普通制剂。

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