CN104800164A - 一种雷公藤免疫纳米粒及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种雷公藤免疫纳米粒，属于生物医药领域，本发明公开了一种内部包裹雷公藤外部偶联抗FcεRIα抗体的免疫纳米粒。本发明还提供该雷公藤免疫纳米粒的制备方法和用途。其优点表现在：本发明采用具有良好生物相容性和内核载药能力的纳米材料作为载体，包裹疏水性的中药雷公藤或其单体，外部偶联具有肥大细胞靶向性的基序抗FcεRIα抗体，得到了雷公藤免疫纳米粒。该纳米粒可特异地被肥大细胞摄取，诱导细胞凋亡，用于过敏和肥大细胞相关疾病的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种雷公藤免疫纳米粒及用途。
背景技术
肥大细胞和嗜碱性粒细胞是过敏反应的主要效应细胞，细胞表面表达特异性受体IgE高亲和力受体(FcεRI)，该受体可与IgE高亲和力结合，当多价抗原与细胞表面的IgE结合后，多个FcεRI受体分子发生交联，导致细胞的活化和生物活性物质的释放，发生I型超敏反应。近年来越来越多的研究证实，肥大细胞还参与其他多种疾病的发生和发展，如肥大细胞增多症、肿瘤、自身免疫性疾病和心血管疾病。肥大细胞和嗜碱性粒细胞凋亡可能是治疗过敏及肥大细胞相关疾病的有效手段。
雷公藤来源于植物雷公藤的根部，是临床上治疗自身免疫性疾病的有效药物。
雷公藤含有多种活性成分，如三萜类、二萜类和生物碱类。研究表明雷公藤具有抗炎、抗神经退行性变和抗肿瘤的作用。近年来研究发现，雷公藤及其单体成分具有肥大细胞凋亡作用，其主要作用机制是使促凋亡基因(bax、c-myc)表达增加，使抗凋亡基因(bcl-2)的表达减少。在体内，肥大细胞凋亡形成的凋亡小体可被巨噬细胞吞噬，而不引起颗粒内容物释放。因此，雷公藤及单体成分可能成为过敏性疾病或者肥大细胞相关疾病治疗的理想药物。
然而，雷公藤难溶于水，制成药物制剂有一定困难。此外，雷公藤对细胞的凋亡作用是非组织、器官和细胞特异的，这些特性导致了雷公藤体内应用时的毒副反应，特别是对生殖的抑制，使其临床应用范围受到极大限制。因此，如何克服雷公藤的水不溶性和毒性、增加生物利用度是目前亟待解决的问题。而制备靶向给药系统成了雷公藤临床应用的关键。
纳米材料在生物领域的应用为药物的研发提供了广阔的平台。纳米载体具有增溶、生物相容性好、缓释、循环时间长、靶向性等优点，在生物制药领域应用广泛，目前常用的纳米载体有脂质体、树枝状聚合物、纳米碳管和磁性纳米粒、聚合物纳米粒子。
FcεRI是IgE高亲和力受体，是由α、β和两个γ亚单位组成的四聚体，α 链是IgE的结合部位，主要表达于肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面，并且在疾病状态时肥大细胞膜表面的受体的表达量显著增加。FcεRI表达的局限性、疾病状态表达量增加的特性、FcεRIα为IgE结合部位的生物优越性使其成为肥大细胞有效的靶分子。
关于本发明的一种雷公藤免疫纳米粒及用途目前还未见报道，本发明以纳米材料为载体，包裹雷公藤，偶联抗FcεRIα抗体，构建雷公藤-纳米-抗人FcεRIα单抗三聚物，所形成的雷公藤免疫纳米粒既可以增加雷公藤的溶解度，提高药物的生物利用度；又能将雷公藤定向携带至表达FcεRI的肥大细胞或嗜碱性粒细胞使其凋亡，从而可以有效地缓解过敏性炎症和过敏症状，降低毒副作用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种雷公藤免疫纳米粒。
本发明的再一的目的是，提供一种雷公藤免疫纳米粒的制备方法。
本发明的另一的目的是，提供一种雷公藤免疫纳米粒的用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种雷公藤免疫纳米粒，所述的雷公藤免疫纳米粒为包封了细胞凋亡诱导剂的纳米粒，所述的细胞凋亡诱导剂为雷公藤或雷公藤单体成分，所述的纳米粒表面有抗体修饰。
所述的雷公藤单体成分为雷公藤红素、雷公藤酮、雷酚酮内酯、雷公藤对醌A、雷公藤三萜酸B、雷公藤内酯甲、雷公藤内酯乙、雷公藤内酯醇、雷公藤内酯二醇、雷公藤内酯酮、雷公藤碱戊、雷公藤内酯、雷公藤吉碱、雷公藤特碱、雷公藤次碱、雷公藤春碱、雷公藤晋碱、雷公藤灵碱、雷公藤增碱或雷公藤异春碱。
所述的雷公藤免疫纳米粒的载体材料为聚合物纳米粒子、脂质体、树枝状聚合物、磁性纳米粒或纳米碳管。
所述的抗体为识别并结合肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面IgE高亲和力受体α链的抗体或者抗体Fab片段或者人源化抗体或者单链抗体。
所述的抗体为抗人FcεRIα抗体、抗人FcεRIα抗体Fab片段、人源化抗人FcεRIα抗体、抗鼠FcεRIα抗体、抗鼠FcεRIα抗体Fab片段、单链抗人FcεRIα抗体或单链抗鼠FcεRIα抗体。
所述的雷公藤免疫纳米粒通过如下方法制得：由雷公藤和羧基修饰的纳米材料反应制得羧基修饰的雷公藤纳米粒，然后与抗FcεRIα单抗反应制得抗FcεRIα单抗-纳米粒-雷公藤三聚物，即雷公藤免疫纳米粒。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种雷公藤免疫纳米粒的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
a)将纳米材料包裹细胞凋亡诱导剂得到雷公藤纳米粒；
b)将抗体和雷公藤纳米粒连接得到内包裹雷公藤外连接抗体的雷公藤免疫纳米粒。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：所述的雷公藤免疫纳米粒在制备治疗肥大细胞或嗜碱性粒细胞相关的疾病的药物中的应用。
所述的肥大细胞相关疾病为过敏性疾病、肥大细胞增多症、器官纤维化、自身免疫病、心血管疾病或肿瘤。
本发明优点在于：
本发明中雷公藤免疫纳米粒的用途为特异地诱导表达FcεRIα阳性细胞凋亡，包括肥大细胞和嗜碱性粒细胞，治疗肥大细胞相关疾病包括过敏性疾病、肥大细胞增多症、肿瘤、自身免疫性疾病和心血管疾病。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1羧基修饰的雷公藤红素胶束的制备
称取雷公藤红素和羧基修饰的Pluronic P123嵌段共聚物，加入二氯甲烷搅拌至完全溶解，蒸发至有机溶剂完全蒸干，真空干燥过夜去除残留溶剂，获得干燥药膜。加入PBS重悬，去除未包封的雷公藤红素，获得羧基修饰的雷公藤红素胶束。
实施例2雷公藤红素免疫胶束的制备
取羧基修饰的雷公藤红素胶束，加入适量EDC，室温条件下活化15min；取已活化的雷公藤红素胶束，加入抗FcεRIα单抗Fab，室温反应2小时，获得抗FcεRIα单抗Fab-胶束-雷公藤红素三聚物，即雷公藤红素免疫胶束。
本发明的雷公藤红素免疫胶束的粒径为105nm-135nm。粒径的测量方法：取雷公藤红素免疫胶束在NICOMP 380ZLS Zeta Potential/Particle Sizer仪器上检测胶束粒径。
本发明的雷公藤红素免疫胶束的粒径为透射电子显微镜下见胶束为短棒状或椭圆状。形态的检测方法：载药胶束溶液滴加在覆盖碳膜的400目铜网上，置于干燥器中，待其自然干燥后置于透射电镜JEOL JEM-2010下观察。
雷公藤红素免疫胶束的载药量分别为25.8％。检测方法：用反相-高效液相 分析法(RP-HPLC)检测胶束中雷公藤红素的含量，通过公式：载药量＝胶束中雷公藤红素的量/(胶束中雷公藤红素的量+嵌段共聚物的量)×100％，计算羧基修饰的雷公藤红素胶束的载药量。
实施例3雷公藤红素免疫胶束对肥大细胞的靶向作用
以油溶性荧光染料香豆素6替代雷公藤红素，制备香豆素6免疫胶束，制备方法同实施例1、实施例2。分别与嗜碱性白血病细胞系KU812细胞(FcεRIα+)和未成熟肥大细胞系HMC-1细胞(FcεRIα-)孵育，分别采用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测细胞内荧光。结果显示，与香豆素6胶束相比，香豆素6免疫胶束作用后KU812细胞内荧光更强。与HMC-1细胞相比，香豆素6免疫胶束作用后，KU812细胞内荧光更强。
实施例4雷公藤红素免疫胶束对肥大细胞的凋亡作用
制备雷公藤红素免疫胶束及对照组样品空白免疫胶束、雷公藤红素胶束及空白胶束分别与KU812细胞孵育，采用AnnexinⅤ-PI试剂盒检测细胞凋亡情况。结果显示与空白胶束(1.2％)、空白免疫胶束(0.8％)、雷公藤红素胶束(21.8％)作用组相比，雷公藤红素免疫胶束(52.3％)作用后凋亡细胞的比例明显增加，说明雷公藤红素免疫胶束可特异性诱导肥大细胞凋亡。
实施例5雷公藤红素免疫胶束对小鼠被动皮肤过敏的抑制效果
构建小鼠被动皮肤过敏反应模型，小鼠耳廓皮内注射IgE-DNP，2小鼠后，尾静脉注射含伊文氏蓝的DNP-HSA，30分钟后，观察蓝斑面积，溶解蓝斑，检测A620nm。
给予小鼠抗人FcεRIα Fab-胶束-雷公藤红素治疗，同时以单纯的雷公藤红素、雷公藤红素胶束和PBS治疗作为对照。结果显示雷公藤红素治疗组、雷公藤红素胶束治疗组和抗人FcεRIα单抗-胶束-雷公藤红素治疗组小鼠的蓝斑面积依次减少。对蓝斑进行定量分析，结果显示与对照组、雷公藤红素治疗组和雷公藤红素胶束治疗组相比，抗人FcεRIα Fab-胶束-雷公藤红素治疗组扩散的Evans blue最少，说明雷公藤红素免疫胶束具有良好的抗过敏效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种雷公藤免疫纳米粒，其特征在于，所述的雷公藤免疫纳米粒为包封了细胞凋亡诱导剂的纳米粒，所述的细胞凋亡诱导剂为雷公藤或雷公藤单体成分，所述的纳米粒表面有抗体修饰。
2.根据权利要求1所述的雷公藤免疫纳米粒，其特征在于，所述的雷公藤单体成分为雷公藤红素、雷公藤酮、雷酚酮内酯、雷公藤对醌A、雷公藤三萜酸B、雷公藤内酯甲、雷公藤内酯乙、雷公藤内酯醇、雷公藤内酯二醇、雷公藤内酯酮、雷公藤碱戊、雷公藤内酯、雷公藤吉碱、雷公藤特碱、雷公藤次碱、雷公藤春碱、雷公藤晋碱、雷公藤灵碱、雷公藤增碱或雷公藤异春碱。
3.根据权利要求1所述的雷公藤免疫纳米粒，其特征在于，所述的雷公藤免疫纳米粒的载体材料为聚合物纳米粒子、脂质体、树枝状聚合物、磁性纳米粒或纳米碳管。
4.根据权利要求1所述的雷公藤免疫纳米粒，其特征在于，所述的抗体为识别并结合肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面IgE高亲和力受体α链的抗体或者抗体Fab片段或者人源化抗体或者单链抗体。
5.根据权利要求1所述的雷公藤免疫纳米粒，其特征在于，所述的抗体为抗人FcεRIα抗体、抗人FcεRIα抗体Fab片段、人源化抗人FcεRIα抗体、抗鼠FcεRIα抗体、抗鼠FcεRIα抗体Fab片段、单链抗人FcεRIα抗体或单链抗鼠FcεRIα抗体。
6.根据权利要求1所述的雷公藤免疫纳米粒，其特征在于，所述的雷公藤免疫纳米粒通过如下方法制得：由雷公藤和羧基修饰的纳米材料反应制得羧基修饰的雷公藤纳米粒，然后与抗FcεRIα单抗反应制得抗FcεRIα单抗-纳米粒-雷公藤三聚物，即雷公藤免疫纳米粒。
7.根据权利要求1所述的雷公藤免疫纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：
a)将纳米材料包裹细胞凋亡诱导剂得到雷公藤纳米粒；
b)将抗体和雷公藤纳米粒连接得到内包裹雷公藤外连接抗体的雷公藤免疫纳米粒。
8.根据权利要求1-6任一所述的雷公藤免疫纳米粒在制备治疗肥大细胞或嗜碱性粒细胞相关的疾病的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的肥大细胞相关疾病为过敏性疾病、肥大细胞增多症、器官纤维化、自身免疫病、心血管疾病或肿瘤。
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