CN106913881A - 一种抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束及制备方法和应用,所述纳米胶束是由抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体与羧基化聚氧乙烯‑聚氧丙烯‑聚氧乙烯嵌段聚合物连接而成。本抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束为具有亲水端和疏水端的两亲性纳米胶束,具有较好的靶向性,副作用小,同时该免疫胶束封包性能稳定、封包率高、抗体活性良好,可以用作药物载体,使得被包裹的药物能够更加准确地识别靶位,在提高药物治疗效果的同时,也降低了药物的毒副作用,制作方法简单,成本低廉。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,尤其是一种抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束及制备方法和应用。
背景技术
乳腺癌是发生在乳腺导管上皮的女性常见恶性肿瘤。发病率为(11-80)/10万,病死率为(0.7-26.6)/10万,占全身各种恶性肿瘤的7%-10%。乳腺癌在全世界均有发病,在许多西方国家的妇科肿瘤中发病率最高。乳腺癌已严重危害中国妇女的身心健康,近2O年来其发病率呈明显上升的趋势,在中国大城市女性的肿瘤发病率中已占据前2位。
目前乳腺癌的治疗主要采用手术治疗,同时辅以放疗、内分泌治疗和化疗等治疗方法。对于有些乳腺癌症状手术治疗不能完全根除癌细胞,而放疗、内分泌治疗和化疗等辅助方法又不能区分癌细胞与正常细胞,结果往往导致手术效果不佳或产生严重的副作用,所以提高乳腺癌治疗的靶向择是提高疗效的关键。近年来随着研究进展,以抗体为导向的靶向治疗发展迅速,已成为国际生物技术领域当前开发的热点。
研究发现乳腺癌细胞表面的人表皮生长因子受体2(HER2)蛋白与乳腺癌关系密切,大约有20%~30%的乳腺癌患者为HER2阳性,HER2促进了癌细胞分裂生长,肿瘤分化差,容易发生淋巴结转移,治疗效果不佳,HER2过度表达的肿瘤患者较无过度表达的无病生存期短。赫赛汀(Herceptin,)是由Genentech公司研发的一种拮抗HER-2阳性的乳腺癌的单克隆人源化抗体,用以防止乳腺癌复发或扩散,是用于治疗乳腺癌转移的重要选择药物。
自赫赛汀问世以来,赫赛汀与紫杉醇类的联合方案已成为HER2阳性转移性乳腺癌患者标准的一线治疗方案。研究表明赫赛汀联合紫杉醇组患者乳腺癌复发风险较单纯化疗组下降52%(P<0.0001),死亡风险下降33%(P<0.05),研究者还对赫赛汀与紫杉醇的给药顺序进行了评估。结果显示,赫赛汀与紫杉醇联合应用比二者序贯应用使复发风险降低36%(P<0.05)。
纳米生物技术是国际生物技术领域的前沿和热点问题,在医药卫生领域有着广泛的应用和明确的产业化前景,特别是纳米药物载体。这种技术是以纳米颗粒作为药物载体,将药物等治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面,同时也在颗粒表面偶联特异性的靶向分子,如单克隆抗体等,通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合,在细胞摄取作用下进入细胞内,实现安全有效的靶向性药物和基因治疗。目前美国生物科学公司已研制出了一种紫杉醇白蛋白纳米悬浮液(ABI-007),已经在欧美上市并应用于临床。虽然临床研究结果显示,ABI-007所引起的毒副反应明显轻于同剂量的注射液,但ABI一007还是会引起骨髓抑制,粒细胞减少等副反应。因此,对紫杉醇纳米制剂做更进一步的改进,开发一种具有靶向治疗效果的紫杉醇纳米制剂将可提高靶细胞的药物浓集、增加药物疗效具有更重要意义和广泛的临床应用前景。
传统的治疗模式(手术、放疗、化疗)依然是肿瘤治疗的主要手段。然而,临床绝大多数抗癌制剂仍不能区分癌细胞与正常细胞,结果导致了系统性的毒性与严重副作用。所以提高药物的肿瘤选择性,减少其在非靶向部位的聚集是提高抗肿瘤药物疗效的关键。靶向抗肿瘤纳米药物的研究正日益受到人们的普遍关注和重视。纳米技术和纳米生物学研究的进一步深入已对医药业产生了巨大的影响,特别是纳米药物载体在药物传递系统(DDS)可发挥重要作用。目前研究的热点和已有较好基础及做出实质性成果的是药物纳米载体和纳米颗粒基因转移技术。这种技术是以纳米颗粒作为药物和基因转移载体,将药物、DNA和RNA等基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面,同时也在颗粒表面偶联特异性的靶向分子,如特异性配体、单克隆抗体等,通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合,在细胞摄取作用下进入细胞内,实现安全有效的靶向性药物和基因治疗。聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物是一类新型的纳米载体,它同时具有亲水性基团及疏水性基团,在水中溶解后自发形成高分子胶束,并完成对药物的增溶和包裹它具有亲水性外壳及疏水性内核,适合于携带不同性质的药物,且可使药物能逃避单核巨噬细胞吞噬。因此,推进靶向治疗的有效靶点的研究发现具有重要意义,结合纳米技术研究新一代治疗药物与治疗方法,具有重大的科学意义与社会意义。
通过检索,尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处,提供一种抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束及制备方法和应用,该结合免疫胶束具有较好的靶向性,可以与细胞表面特异性受体结合,在细胞摄取作用下进入细胞内,实现安全有效的靶向性药物和基因治疗,可以作为药物载体进行应用,效果好,制作方法简单,成本低廉。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的:
一种抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束,所述纳米胶束是由抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体与羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物连接而成。
而且,所述抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体与羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的摩尔比为1:500-1:10000。
如上所述的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束的制备方法,步骤如下:
⑴羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的合成与表征;
聚合物表面修饰的具体步骤为:
取聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物,将其溶解于2M氢氧化钠溶液中,105℃油浴回流反应7h,反应产物溶液以浓盐酸调pH值至2,使用与反应产物溶液等体积的二氯甲烷萃取加成反应产物溶液,加入无水硫酸钠放置过夜吸除萃取液中所含水份,过滤,滤液经40℃水浴旋转蒸发挥干溶剂,真空干燥过夜除尽溶剂,得粗产物;将等体积乙醚和粗产物涡旋混合,粗产物沉淀析出,8000rpm离心10min除去溶剂,将等体积35.60℃的石油醚和离心后粗产物涡旋混合,粗产物再次沉淀析出,8000rpm离心10min除去溶剂,沉淀经30℃真空干燥过夜后即得到纯化的羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物;
⑵羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物与抗HER2单克隆抗体的连接:
羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的羧基与单克隆抗体的氨基连接,羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物与单克隆抗体的连接具体步骤为:
将羧基活化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物溶于纯水溶液中,200-300r/min振荡反应15分钟,加入抗HER2单克隆抗体,其中,抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体与CT-P123的摩尔比为1:500-1:10000,继续搅拌1-1.2h,制得未标记的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束;
⑶125I标记抗体,测活度,计算抗体结合率,得125I标记抗体:
采用常规方法125I标记HER2单克隆抗体,即得抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束。
如上所述的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束在作为药物载体的应用。
一种包裹紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束,所述免疫胶束是由权利要求1或2所述的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束作为载体分子和包裹在该载体分子中的紫杉醇组成。
而且,所述抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体纳米胶束与紫杉醇的质量比为40-400:1。
如上所述的包裹紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束的制备方法,步骤如下:
⑴采用权利要求3所述的方法连接羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物和抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体,得到抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束;
⑵采用星点设计法将紫杉醇包裹进抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束中,所述星点设计法的具体步骤为:
步骤⑴的纳米胶束的固定载体量为20mg,选择对胶束形成有显著影响的两个因素:主药的投药量(X1)及水化时的水相量(X2)进行考察,实验采取两因素、五水平的星点设计,该设计为在二水平析因设计的基础上加上极值点和中心点构成,其代码分别为±1,±a和0,a=(F)1/4,F=2k(k为因素数);对于二因素的星点设计a=1.414.确定各因素水平的极大(+a)和极小值(-a)后,±1,0水平的安排遵循任意两个物理量之间的极差与对应代码之间差值成正比的原则安排实验,将各实验胶束用0.22um滤膜过滤后测定滤液中药物的浓度,除以未过滤胶束中药物的浓度,为该胶束的载药量;以载药量为因变量分别对各因素及其相互作用进行回归处理,分析各因素对各效应值的影响,选取载药量较多的工艺条件将紫杉醇包裹进抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束中,即得包裹紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束。
如上所述的包裹紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
本发明取得的优点和有益效果是:
1、本抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束为具有亲水端和疏水端的两亲性纳米胶束,具有较好的靶向性,副作用小,同时该免疫胶束封包性能稳定、封包率高、抗体活性良好,可以用作药物载体,使得被包裹的药物能够更加准确地识别靶位,在提高药物治疗效果的同时,也降低了药物的毒副作用,制作方法简单,成本低廉。
2、本发明中包裹紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束既能使药物送到一定的靶位,发挥紫杉醇与抗HER2抗体的抗肿瘤作用,使肿瘤细胞凋亡,并延长药物在肿瘤部位的作用时间,显示出更优越的抗肿瘤活性和更小的毒副作用;抗HER2抗体既能专一性地识别乳腺癌细胞表面HER2蛋白,又可发挥抑制肿瘤生长作用,将广谱抗癌药紫杉醇包裹于结合了抗HER2抗体的两亲纳米胶束中,既降低溶解紫杉醇带来的过敏反应并降低其毒性,又能使药物送到一定的靶位,同时发挥化疗药物与单抗药物的抗肿瘤作用,使肿瘤细胞凋亡,显示出优越的抗肿瘤活性和更小的毒副作用,制作方法简单,成本低廉。
附图说明
图1为本发明抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束的制备方法的工艺流程图;
图2为本发明羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(CT-P123)的合成工艺流程图;
图3为本发明的相关粒径检测图;其中,图3-1为的Pluronic P123胶束的粒径检测图,图3-2为载有紫杉醇的Pluronic P123胶束的粒径检测图,图3-3为抗人表皮生长因子受体2-PTX免疫胶束的粒径检测图。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明进一步说明;下述实施例是说明性的,不是限定性的,不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料,如无特殊说明,均为常规的市售产品;本发明中所使用的方法,如无特殊说明,均为本领域的常规方法。
本发明首先合成羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物CT-P123作为纳米载体,然后将CT-P123与抗HER2鼠源性抗体相连接,最后采用星点设计法将紫杉醇包裹于结合了该抗体的两亲纳米胶束中获得免疫胶束。
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明,而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:试验手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
本发明中所使用的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物可以购自厂家BASF。
一种抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束,所述纳米胶束是由抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体与羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物连接而成,较佳地,所述抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体与羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的摩尔比为1:500-1:10000,该抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束可以应用于作为药物载体中。
上述抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束的制备方法,步骤如下:
⑴羧基化嵌段聚合物P123(CT-P123)的合成与表征;
聚合物表面修饰的具体步骤为:
取聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物,将其溶解于20mL2M氢氧化钠溶液中,105℃油浴回流反应7h,反应产物溶液以浓盐酸调pH值至2,使用与反应产物溶液等体积的二氯甲烷萃取加成反应产物溶液,加入无水硫酸钠放置过夜吸除萃取液中所含水份,过滤,滤液经40℃水浴旋转蒸发挥干溶剂,真空干燥过夜除尽溶剂,得粗产物;将等体积乙醚和粗产物涡旋混合,粗产物沉淀析出,8000rpm离心10min除去溶剂,将等体积石油醚(35.60℃)和离心后粗产物涡旋混合,粗产物再次沉淀析出,8000rpm离心10min除去溶剂,沉淀经30℃真空干燥过夜后即得到纯化的CT-P123(羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物即为CT-P123)。羧基化羧基化嵌段聚合物P123(CT-P123)过程见图2。
⑵CT-P123与抗HER2单克隆抗体的连接:
CT-P123的羧基与单克隆抗体的氨基连接,CT-P123与单克隆抗体的连接具体步骤为:
将羧基活化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)与CT-P123溶于纯水溶液中,200-300r/min振荡反应15分钟,加入抗HER2单克隆抗体,其中,抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体与CT-P123的摩尔比为1:500-1:10000,继续搅拌1-1.2h,制得未标记的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束。
⑶125I标记抗体,测活度,计算抗体结合率(常规方法),得125I标记抗体:
采用常规方法125I标记HER2单克隆抗体,即得抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束。
一种包裹紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束,所述免疫胶束是由上述抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束作为载体分子和包裹在该载体分子中的紫杉醇组成,较佳地,所述抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体纳米胶束与紫杉醇的质量比为40-400:1,该抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束能够应用在制备治疗乳腺癌药物中。
上述包裹紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束的制备方法,步骤如下:
⑴采用如上所述的方法连接羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物和抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体,得到抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束;
⑵采用星点设计法将紫杉醇包裹进抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束中,所述星点设计法的具体步骤为:
步骤⑴的纳米胶束的固定载体量为20mg,选择对胶束形成有显著影响的两个因素:主药的投药量(X1)及水化时的水相量(X2)进行考察。实验采取两因素、五水平的星点设计,该设计为在二水平析因设计的基础上加上极值点和中心点构成,其代码分别为±1,±a和0,a=(F)1/4,F=2k(k为因素数);对于二因素的星点设计a=1.414.确定各因素水平的极大(+a)和极小值(-a)后,±1,0水平的安排遵循任意两个物理量之间的极差与对应代码之间差值成正比的原则安排实验,将各实验胶束用0.22um滤膜过滤后测定滤液中药物的浓度,除以未过滤胶束中药物的浓度,为该胶束的载药量;以载药量为因变量分别对各因素及其相互作用进行回归处理,分析各因素对各效应值的影响,选取载药量较多的工艺条件将紫杉醇包裹进抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束中,即得包裹紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束。
上述包裹紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束的相关检测:
⑴采用动态光散射法(DLS)等对制备的纳米药物进行表征:
使用Malvern公司Mastersizer 2000型纳米粒径分析仪,采用动态光散射法测定PBS(pH 7.4)溶液中抗HIF.1Q PTX免疫胶束的粒径与粒径分布,测定参数为:光源:He.Ne激光;测定角度:900;温度:25℃;粘度:0.8872cP;折光系数:1.33;波长:633nm;每个样品重复测定10次,每次10s。
为了达到在体内长循环即缓释的目的,胶束必须要有足够小的粒径以躲避RES系统的识别与吞噬。本申请人利用DLS技术检测了Pluronic P123胶束、载有紫杉醇的Pluronic P123胶束、抗人表皮生长因子受体2-PTX免疫胶束及粒径分布,其粒径大小分别为19.3±3.1nm,28.2±3.0nm,36.5±4.9nm,粒径分布见图3,由图3可以看出所有胶束的粒径分布范围均较窄,粒径均在50nm以下,虽然具备主动靶向性的载药胶束粒径有所增大(Mw of PTX:853.9g/mol),但仍小于大多数具主动靶向性的药物载体。
⑵HPLC法测定免疫胶束对药物的包封率及随时间变化(常规方法):使用常规方法进行检测;
⑶应用之细胞实验:观察紫杉醇免疫胶束躲避体内清除细胞的能力、进入乳腺癌细胞的效率与杀伤效应,并设立对照;
a)采用血浆蛋白结合实验、巨噬细胞吞噬实验探讨紫杉醇免疫胶束躲避体内清除的能力和机制(常规方法);
b)FITC标记抗体,设立对照,观察紫杉醇免疫胶束进入乳腺癌细胞的效率(常规方法)。
c)体外癌细胞杀伤实验,体外毒性(MTT)
人乳腺癌细胞培养使用含10%新生牛血清、100μg/μl青霉素、100μg/μl链霉素的RPMI1640培养液,置5%C02、37℃培养箱中培养,培养液隔天更换。收集细胞铺种于96孔板,铺种密度5000个/孔,继续培养一天,加药,各孔所加样液体积均为200μL,依次加入PTX浓度梯度从1到100ng/mL的抗人表皮生长因子抗体-PTX Pluronic P123免疫胶束(anti-EGF-PTx-Pluronic P123)、PTX PluronicP123胶束(NMs.PTX),对照孔为不含PTX的抗EGF与羧基功能化PluronicP123胶束的侨联物(McAbs.NMs)、单纯羧基功能化Pluronic P123胶束(NMs)。加样完毕后置入细胞培养箱中继续培养48h,每孔加2μL浓度为5mg/mL的MTT PBS(pH=7.4)溶液,置入细胞培养箱中继续培养4h,加入200μL二甲亚砜(DMSO)37℃震摇10min以溶解紫色结晶,酶标仪570nm读取吸光度。
d)流式细胞仪检测细胞凋亡周期计算凋亡率(常规方法)。
⑷药物动力学研究
a)建立紫杉醇免疫胶束在Wistar大鼠体内的检测方法;
b)设立对照,对紫杉醇免疫胶束在Wistar大鼠体内的药物动力学过程进行研究、靶向效率评价。
⑸组织分布学研究
a)建立紫杉醇免疫胶束在乳腺癌动物(BALB小鼠乳腺注射MCF-7)各组织中的检测方法,乳腺癌小鼠体内靶向示踪显像采用免疫胶束包载疏水性量子点标记,定量分析采用3H同位素标记,或罗丹明标记。
b)设立对照,对紫杉醇免疫胶束在乳腺癌动物体内的组织分布过程进行研究。
c)组织靶向性评价。
⑹药效实验
a)BALB小鼠乳腺注射MCF-7建立乳腺癌动物模型;
b)采用静脉注射给药,设计对照,观察紫杉醇免疫胶束的抑癌效果;
⑺安全性评价
a)对紫杉醇免疫胶束的溶血性、血浆蛋白结合率、LD50实验、刺激性实验;
b)紫杉醇免疫胶束对组织器官的影响实验,对关键脏器考虑切片分析。
经检测,本发明的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束和包裹紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束的各检测结果均较优,因此其可以应用在作为药物载体方面中,特别是应用在治疗乳腺癌药物中。
Claims (8)
1.一种抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束,其特征在于:所述纳米胶束是由抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体与羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物连接而成。
2.根据权利要求1所述的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束,其特征在于:所述抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体与羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的摩尔比为1:500-1:10000。
3.如权利要求1或2所述的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束的制备方法,其特征在于:步骤如下:
⑴羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的合成与表征;
聚合物表面修饰的具体步骤为:
取聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物,将其溶解于2M氢氧化钠溶液中,105℃油浴回流反应7h,反应产物溶液以浓盐酸调pH值至2,使用与反应产物溶液等体积的二氯甲烷萃取加成反应产物溶液,加入无水硫酸钠放置过夜吸除萃取液中所含水份,过滤,滤液经40℃水浴旋转蒸发挥干溶剂,真空干燥过夜除尽溶剂,得粗产物;将等体积乙醚和粗产物涡旋混合,粗产物沉淀析出,8000rpm离心10min除去溶剂,将等体积35.60℃的石油醚和离心后粗产物涡旋混合,粗产物再次沉淀析出,8000rpm离心10min除去溶剂,沉淀经30℃真空干燥过夜后即得到纯化的羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物;
⑵羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物与抗HER2单克隆抗体的连接:
羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的羧基与单克隆抗体的氨基连接,羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物与单克隆抗体的连接具体步骤为:
将羧基活化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物溶于纯水溶液中,200-300r/min振荡反应15分钟,加入抗HER2单克隆抗体,其中,抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体与CT-P123的摩尔比为1:500-1:10000,继续搅拌1-1.2h,制得未标记的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束;
⑶125I标记抗体,测活度,计算抗体结合率,得125I标记抗体:
采用常规方法125I标记HER2单克隆抗体,即得抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束。
4.如权利要求1或2所述的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束在作为药物载体的应用。
5.一种包裹紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束,其特征在于:所述免疫胶束是由权利要求1或2所述的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束作为载体分子和包裹在该载体分子中的紫杉醇组成。
6.根据权利要求5所述的包裹紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束,其特征在于:所述抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体纳米胶束与紫杉醇的质量比为40-400:1。
7.如权利要求5或6所述的包裹紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束的制备方法,其特征在于:步骤如下:
⑴采用权利要求3所述的方法连接羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物和抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体,得到抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束;
⑵采用星点设计法将紫杉醇包裹进抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束中,所述星点设计法的具体步骤为:
步骤⑴的纳米胶束的固定载体量为20mg,选择对胶束形成有显著影响的两个因素:主药的投药量(X1)及水化时的水相量(X2)进行考察,实验采取两因素、五水平的星点设计,该设计为在二水平析因设计的基础上加上极值点和中心点构成,其代码分别为±1,±a和0,a=(F)1/4,F=2k(k为因素数);对于二因素的星点设计a=1.414.确定各因素水平的极大(+a)和极小值(-a)后,±1,0水平的安排遵循任意两个物理量之间的极差与对应代码之间差值成正比的原则安排实验,将各实验胶束用0.22um滤膜过滤后测定滤液中药物的浓度,除以未过滤胶束中药物的浓度,为该胶束的载药量;以载药量为因变量分别对各因素及其相互作用进行回归处理,分析各因素对各效应值的影响,选取载药量较多的工艺条件将紫杉醇包裹进抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束中,即得包裹紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束。
8.如权利要求5或6所述的包裹紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
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