CN105560214A - 抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束及其制备和应用,该纳米胶束为抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体与羰基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物连接而成。本发明还公开了一种利用抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束作为药物载体,包裹紫杉醇制备的免疫胶束及其制备和应用。本发明的免疫胶束既能使药物送到一定的靶位,发挥紫杉醇与抗HER2抗体的抗肿瘤作用,使肿瘤细胞凋亡,并延长药物在肿瘤部位的作用时间;显示出更优越的抗肿瘤活性和更小的毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体涉及抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束及其制备与应用。
背景技术
乳腺癌是发生在乳腺导管上皮的女性常见恶性肿瘤。发病率为(11-80)/10万,病死率为(0.7-26.6)/10万,占全身各种恶性肿瘤的7%-10%。乳腺癌在全世界均有发病,在许多西方国家的妇科肿瘤中发病率最高。乳腺癌已严重危害中国妇女的身心健康,近2O年来其发病率呈明显上升的趋势,在中国大城市女性的肿瘤发病率中已占据前2位。
目前乳腺癌的治疗主要采用手术治疗,同时辅以放疗、内分泌治疗和化疗等治疗方法。对于有些乳腺癌症状手术治疗不能完全根除癌细胞,而放疗、内分泌治疗和化疗等辅助方法又不能区分癌细胞与正常细胞,结果往往导致手术效果不佳或产生严重的副作用。所以提高乳腺癌治疗的靶向择是提高疗效的关键。近年来随着研究进展,以抗体为导向的靶向治疗发展迅速,已成为国际生物技术领域当前开发的热点。
研究发现乳腺癌细胞表面的人表皮生长因子受体2(HER2)蛋白与乳腺癌关系密切,大约有20%~30%的乳腺癌患者为HER2阳性,HER2促进了癌细胞分裂生长,肿瘤分化差,容易发生淋巴结转移,治疗效果不佳,HER2过度表达的肿瘤患者较无过度表达的无病生存期短。赫赛汀(Herceptin,)是由Genentech公司研发的一种拮抗HER-2阳性的乳腺癌的单克隆人源化抗体,用以防止乳腺癌复发或扩散,是用于治疗乳腺癌转移的重要选择药物。
自赫赛汀问世以来,赫赛汀与紫杉醇类的联合方案已成为HER2阳性转移性乳腺癌患者标准的一线治疗方案。研究表明赫赛汀联合紫杉醇组患者乳腺癌复发风险较单纯化疗组下降52%(P<0.0001),死亡风险下降33%(P<0.05),研究者还对赫赛汀与紫杉醇的给药顺序进行了评估。结果显示,赫赛汀与紫杉醇联合应用比二者序贯应用使复发风险降低36%(P<0.05)。
纳米生物技术是国际生物技术领域的前沿和热点问题,在医药卫生领域有着广泛的应用和明确的产业化前景,特别是纳米药物载体。这种技术是以纳米颗粒作为药物载体,将药物等治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面,同时也在颗粒表面偶联特异性的靶向分子,如单克隆抗体等,通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合,在细胞摄取作用下进入细胞内,实现安全有效的靶向性药物和基因治疗。目前美国生物科学公司已研制出了一种紫杉醇白蛋白纳米悬浮液(ABI-007),已经在欧美上市并应用于临床。虽然临床研究结果显示,ABI-007所引起的毒副反应明显轻于同剂量的注射液,但ABI一007还是会引起骨髓抑制,粒细胞减少等副反应。因此,对紫杉醇纳米制剂做更进一步的改进,开发一种具有靶向治疗效果的紫杉醇纳米制剂将可提高靶细胞的药物浓集、增加药物疗效具有更重要意义和广泛的临床应用前景。
传统的治疗模式(手术、放疗、化疗)依然是肿瘤治疗的主要手段。然而,临床绝大多数抗癌制剂仍不能区分癌细胞与正常细胞,结果导致了系统性的毒性与严重副作用。所以提高药物的肿瘤选择性,减少其在非靶向部位的聚集是提高抗肿瘤药物疗效的关键。靶向抗肿瘤纳米药物的研究正日益受到人们的普遍关注和重视。纳米技术和纳米生物学研究的进一步深入已对医药业产生了巨大的影响,特别是纳米药物载体在药物传递系统(DDS)可发挥重要作用。目前研究的热点和已有较好基础及做出实质性成果的是药物纳米载体和纳米颗粒基因转移技术。这种技术是以纳米颗粒作为药物和基因转移载体,将药物、DNA和RNA等基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面,同时也在颗粒表面偶联特异性的靶向分子,如特异性配体、单克隆抗体等,通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合,在细胞摄取作用下进入细胞内,实现安全有效的靶向性药物和基因治疗。聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物是一类新型的纳米载体,它同时具有亲水性基团及疏水性基团,在水中溶解后自发形成高分子胶束,并完成对药物的增溶和包裹它具有亲水性外壳及疏水性内核,适合于携带不同性质的药物,且可使药物能逃避单核巨噬细胞吞噬。因此,推进靶向治疗的有效靶点的研究发现具有重要意义,结合纳米技术研究新一代治疗药物与治疗方法,具有重大的科学意义与社会意义。
发明内容
本发明的目的是提供抗人表皮生长因子受体2(HER2)单克隆抗体结合纳米胶束及其制备与应用。
本发明的另一目的是提供包裹紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束及其制备与应用。
本发明一方面提供了一种抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束,该纳米胶束是将抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体与羰基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物连接后形成。该纳米胶束为具有亲水端和疏水端的两亲性纳米胶束。
较佳的,上述纳米胶束中,抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体与羰基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的摩尔比为1:500-1:10000。
上述羰基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物即为CT-P123。
本发明第二方面,提供了抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束的制备方法,步骤如下:
1)羧基化嵌段聚合物P123(CT-P123)的合成与表征;
2)CT-P123与抗HER2单克隆抗体的连接。
本发明第三方面,提供了抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束用作药物载体。
本发明的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束可以用作药物分子载体,使得被包裹的药物分子能够更加准确地识别靶位,因此在提高药物分子治疗效果的同时,也降低了药物分子的毒副作用。
本发明第四方面,提供了一种包裹紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束,该免疫胶束是以上述抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体纳米胶束作为载体,在该载体分子中包裹有紫杉醇。
较佳的,上述免疫胶束中,抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体纳米胶束与紫杉醇的质量比为40:1-400:1。
本发明第五方面,提供了包裹紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束的制备方法,步骤如下:采用星点法将紫杉醇包裹进抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体纳米胶束中。
本发明第六方面,提供了包裹紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
本发明中包裹了紫杉醇的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束既能使药物送到一定的靶位,发挥紫杉醇与抗HER2抗体的抗肿瘤作用,使肿瘤细胞凋亡,并延长药物在肿瘤部位的作用时间;显示出更优越的抗肿瘤活性和更小的毒副作用。抗HER2抗体即能专一性的识别乳腺癌细胞表面HER2蛋白,又可发挥抑制肿瘤生长作用,将广谱抗癌药紫杉醇包裹于结合了抗HER2抗体的两亲纳米胶束中,既降低溶解紫杉醇带来的过敏反应并降低其毒性,又能使药物送到一定的靶位,同时发挥化疗药物与单抗药物的抗肿瘤作用,使肿瘤细胞凋亡,显示出优越的抗肿瘤活性和更小的毒副作用。
附图说明
图1抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束的制备方法流程图
具体实施方式
本发明首先合成羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物CT-P123作为纳米载体,然后将CT-P123与抗HER2鼠源性抗体相连接,最后采用星点设计法将紫杉醇包裹于结合了该抗体的两亲纳米胶束中获得免疫胶束。
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明,而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:试验手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实验中仪器原料来源及试剂配方:
原料及试剂厂家
聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物BASF
实施例1
1、聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的结构修饰
a)羧基化嵌段聚合物P123(CT-P123)的合成与表征;
聚合物表面修饰的具体步骤为:在氢氧化钠作用下使2-丁烯腈和聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物发生加成反应,然后通过搅拌反应对加成反应产物所含腈基进行水解,使用二甲苯从水解反应产物液中萃取得到羧基PEO-PPO-PEO嵌段共聚物产物。
b)CT-P123与抗HER2单克隆抗体的连接:
聚合物分子与单克隆抗体的连接具体步骤为:将羧基活化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)与聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物修饰物溶于水溶液中,搅拌
15分钟,加入抗HER2单克隆抗体,继续搅拌1h制得。
c)125I标记抗体,测活度,计算抗体结合率:
采用常规方法125I标记HER2单克隆抗体。
2、免疫胶束对紫杉醇的包载、冻干制剂的制备及表征:
a)紫杉醇免疫胶束制剂的制备,采用星点设计法对紫杉醇免疫胶束制剂的制备方法进行优化,
星点设计法的具体步骤为:固定载体量为20mg,选择对胶束形成有显著影响的两个因素:主药的投药量(X1)及水化时的水相量(X2)进行考察。实验采取两因素、五水平的星点设计,该设计为在二水平析因设计的基础上加上极值点和中心点构成,其代码分别为±1,±a和0,a=(F)1/4,F=2k(k为因素数)。对于二因素的星点设计a=1.414.确定各因素水平的极大(+a)和极小值(-a)后,±1,0水平的安排遵循任意两个物理量之间的极差与对应代码之间差值成正比的原则安排实验,将各实验胶束用0.22um滤膜过滤后测定滤液中药物的浓度,除以未过滤胶束中药物的浓度,为该胶束的载药量。以载药量为因变量分别对各因素及其相互作用进行回归处理,分析各因素对各效应值的影响,选取载药量较多的较优工艺。
b)采用动态光散射法(DLS)、核磁共振法(NMR)等对制备的纳米药物进行表征,
c)HPLC法测定免疫胶束对药物的包封率及随时间变化;
3、细胞实验:观察紫杉醇免疫胶束躲避体内清除细胞的能力、进入乳腺癌细胞的效率与杀伤效应,并设立对照
a)采用血浆蛋白结合实验、巨噬细胞吞噬实验探讨紫杉醇免疫胶束躲避体内清除的能力和机制;
b)FITC标记抗体,设立对照,观察紫杉醇免疫胶束进入乳腺癌细胞的效率。
c)体外癌细胞杀伤实验,体外毒性(MTT)
d)流式细胞仪检测细胞凋亡周期计算凋亡率。
4、药物动力学研究
a)建立紫杉醇免疫胶束在Wistar大鼠体内的检测方法
b)设立对照,对紫杉醇免疫胶束在Wistar大鼠体内的药物动力学过程进行研究、靶向效率评价。
5、组织分布学研究
a)建立紫杉醇免疫胶束在乳腺癌动物(BALB小鼠乳腺注射MCF-7)各组织中的检测方法,乳腺癌小鼠体内靶向示踪显像采用免疫胶束包载疏水性量子点标记,定量分析采用3H同位素标记,或罗丹明标记。
b)设立对照,对紫杉醇免疫胶束在乳腺癌动物体内的组织分布过程进行研究。
c)组织靶向性评价。
6、药效实验
a)BALB小鼠乳腺注射MCF-7建立乳腺癌动物模型;
b)采用静脉注射给药,设计对照,观察紫杉醇免疫胶束的抑癌效果
7、安全性评价
a)对紫杉醇免疫胶束的溶血性、血浆蛋白结合率、LD50实验、刺激性实验;
b)紫杉醇免疫胶束对组织器官的影响实验,对关键脏器考虑切片分析。
Claims (8)
1.一种抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束,其特征在于,所述纳米胶束是由抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体与羰基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物连接而成。
2.如权利要求1所述的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束,其特征在于,所述抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体与羰基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的摩尔比为1:500-1:10000。
3.如权利要求1或2所述的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
第一步、合成羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物;
第二步、连接羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物和抗血管抑素受体单克隆抗体,形成抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束。
4.如权利要求1或2所述的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束作为药物载体的应用。
5.一种抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束,其特征在于,所述免疫胶束是由权利要求1或2中所述抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束作为载体分子,在该载体分子中包裹有紫杉醇。
6.如权利要求5所述抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束,其特征在于,所述免疫胶束中,抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体纳米胶束与紫杉醇的质量比为40-400:1。
7.如权利要求5或6所述抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
第一步、连接羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物和抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体,形成抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束;
第二步、采用星点设计法将紫杉醇包裹进抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束中,所述星点设计法的具体步骤为:固定载体量的数值,考察主药的投药量及水化时的水相量;将各实验胶束用滤膜过滤后测定滤液中药物的浓度,除以未过滤胶束中药物的浓度,为该胶束的载药量;以载药量为因变量分别对各因素及其相互作用进行回归处理,选取载药量较多的方法作为优选工艺将紫杉醇包裹进抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合纳米胶束中。
8.如权利要求5或6所述的抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体结合免疫胶束在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
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