CN101249262A - 人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的靶向纳米粒及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，传统的肿瘤治疗方法如放射治疗、化学治疗、生物因子治疗等缺乏靶向性，免疫毒素治疗又存在着毒素蛋白的非特异性毒性和免疫原性的敏感性等问题。本发明的人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的靶向纳米粒，在纳米粒表面联接Trastuzumab，可与肿瘤细胞表面HER2抗原结合并发生细胞内吞；毒素蛋白包裹于纳米粒中，可降低毒素蛋白非特异性毒性和免疫原性的敏感性。本发明还提供了上述纳米粒的制备与应用。本发明经体外杀伤肿瘤细胞实验、体内抗肿瘤实验，结果证明生物靶向性良好，体外杀伤靶肿瘤细胞作用显著；同时对正常细胞毒性作用很小。体内试验进一步证明，本发明的纳米粒抗肿瘤效果明显。

Description

人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的靶向纳米粒及其制备与应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，涉及一种人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的靶向纳米粒，及其制备与应用。

背景技术

传统的肿瘤治疗方法包括：放射治疗、化学治疗、生物因子治疗等。但这些治疗方法都不是特异性地针对肿瘤细胞，即缺乏靶向性。药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常组织细胞也产生广泛毒性。致使药物利用度有限，副作用大，使用剂量受限。因此，需要一种有效的靶向给药系统使药物到达肿瘤区。这种系统不仅可以提高药物在肿瘤区的浓度，更有效地杀伤肿瘤细胞，而且可以减小对正常细胞、组织的损害。

细胞表面具有受体，理论上，可以与特异性配体结合。由于这种结合特异性很强，我们可以利用配体的向导作用，将药物定向引导至目的组织或细胞，发挥药效，实现靶向治疗。Trastuzumab是一种抗HER2抗原的人源化单克隆抗体，可以特异性地识别并结合于细胞表面的人表皮生长因子受体-(HER2)(参见专利JP3502885、US5677171、WO2004008099)。已有文献报道HER2在许多实体瘤中高表达，如结子宫内膜癌、肺癌、直肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌等(参见文献Hynes NE，Stern DF.The biology of erbB-2/neu/HER-2 and its role incancer.Biochem Biophys Acta 1198，1994，165-184.)。

目前，生物蛋白类药物治疗肿瘤的常用方法是免疫毒素治疗。免疫毒素是一种由毒素蛋白和靶向性配体(抗体或抗体片断)经基因工程技术组合形成的融合蛋白。其杀伤肿瘤细胞的机制是通过靶向性配体特异结合细胞上的受体，免疫毒素被细胞内吞后，毒素蛋白促使肿瘤细胞凋亡。然而，免疫毒素临床治疗肿瘤的效果并未达到令人满意的程度，多数免疫毒素停止于临床I、II试验。主要原因如下：首先，毒素蛋白的非特异性肝毒性及血管毒性，可以产生血管渗漏综合征(VLS)，由此导致治疗剂量受到限制。其次，由于免疫毒素有很强的免疫原性，给药后人体内会迅速出现抗毒素中和性抗体，从而限制了其临床的重复应用。因此，在制备免疫毒素时，如何降低毒素蛋白非特异性毒性、以及降低其免疫原性的敏感性也是亟待解决的问题。

蛋白类药物具有分子量大及空间结构复杂的特点，在药物投递过程中极易受到复杂的生理环境影响(特别是大量酶类物质的作用)，而使蛋白的结构受到破坏，导致其活性丧失。而通过制备纳米粒，将蛋白包裹起来可以有效解决这一问题。PLGA(poly lactic-co-glycolic acid)是一种可生物降解的聚乳酸聚乙醇酸嵌段共聚物，具有良好的亲水性和生物相溶性，已被美国FDA批准为注射用药用辅料。

发明内容

本发明目的是提供一种特异性靶向HER2高表达的肿瘤细胞的载药纳米粒，并使所载药物--毒素蛋白的非特异性毒性和免疫原性的敏感性降低。

本发明的另一目的是提供上述纳米粒的制备。

本发明的另一目的是提供上述纳米粒的应用。

靶向肿瘤细胞的载药纳米粒，其结构应包括(1)配体，可以识别并结合肿瘤细胞表面特异性受体，易被细胞内吞；(2)可生物降解高分子聚合物制备的纳米粒，包裹并运载抗肿瘤药物；(3)连接基团，连接所述配体与纳米粒。

本发明选择PLGA作为制备纳米粒的生物可降解高分子聚合物。

本发明在纳米粒表面联接人源化单克隆抗体Trastuzumab，该抗体可以与肿瘤细胞表面HER2抗原结合并发生细胞内吞。通过抗体的引导作用，靶向纳米粒原则上可以应用于所有HER2过度表达的肿瘤。

本发明将毒素蛋白包裹于纳米微粒中，毒素蛋白与正常组织接触的机会将大大降低，从而降低毒素蛋白非特异性毒性；同时包裹又可以减少毒素蛋白与机体产生的中和性抗体的接触，可进一步降低其免疫原性的敏感性。

本发明提供了一种人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的靶向纳米粒，包括以下结构：

——配体，为抗HER2人源化单克隆抗体Trastuzumab，该配体可以选择性地识别并结合于肿瘤细胞表面的人表皮生长因子受体-(HER2)；

——可生物降解高分子聚合物PLGA制备的纳米粒，纳米粒中包裹并运载抗肿瘤毒素蛋白药物；以及

——连接基团，为酰胺基团，连接所述配体与PLGA纳米粒。

另外，纳米粒的粒径大小也会影响药物的靶向性，如果粒径过大，则在血液循环中很容易被网状内皮系统(RES)吞噬，导致药物迅速清除，无法实现靶向肿瘤细胞。本发明的特异性靶向肿瘤细胞的载药纳米粒的粒径优选范围为80-200纳米，可以有效减少RES的吞噬，提高药物制剂的靶向性。

上述可生物降解高分子聚合物PLGA为羧基封端的PLGA，粘度为0.3-0.8dl/g。

上述的纳米粒中包裹并运载抗肿瘤毒素蛋白药物是水溶性的抗肿瘤毒素蛋白，具体是指：细菌毒素(如白喉毒素DT及假单孢菌外毒素PE)或植物毒素(如蓖麻毒素Ricin)以及它们的突变体。

本发明还提供了上述人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的靶向纳米粒的制备方法，具体包括以下步骤：

(A)载药纳米粒的制备：采用复乳-溶剂挥发法(参见文献S.H.Kim，J.H.Jeong，K.W.Chun，T.G.Park，Target-specific cellular uptake of PLGA nanoparticlescoated with poly(L-lysine)-poly(ethylene glycol)-folate conjugate，Langmuir 21(19)(2005)8852-8857.)制备纳米粒。即将药物溶液(W1)加入溶解PLGA材料的有机相(O)，通过超声分散制备W1/O初乳，再将初乳加入PVA溶液(W2)中进行均质乳化，获得W1/O/W2复乳。低速搅拌，挥干有机溶剂，离心收集纳米粒。

(B)抗体和纳米粒的连接：根据文献Otília Vieira，Isabelle Escargueil-blanc，Günther Jürgens，et al.Oxidized LDLs alter the activity of the ubiquitin-proteasomepathway：potential role in oxidized LDL-induced apoptosis，The FASEB Journal.14(2000)532-542.所公开的化学偶联方法，将抗体Trastuzumab与纳米粒的连接。在偶联试剂的催化作用下，载药纳米粒表面上的羧基与配体人源化单克隆抗体Trastuzumab中的某一氨基发生缩合反应，形成酰胺基团，进而将靶向配体与载药纳米粒连接，制得靶向纳米粒。

上述缩合反应，形成酰胺基团时，采用多肽缩合类试剂作为催化剂，如：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或N-羟基琥珀酰亚胺。

上述缩合反应的温度以15-25℃为宜。

本发明还提供了上述人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的靶向纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。特别是特异性靶向抗原HER2高表达的肿瘤细胞，如结子宫内膜癌、肺癌、直肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌细胞等。本发明的纳米粒经体外杀伤肿瘤细胞实验、体内抗肿瘤实验，结果证明生物靶向性良好，体外杀伤靶肿瘤细胞作用显著；同时对正常细胞毒性作用很小。体内试验进一步证明，本发明的纳米粒抗肿瘤效果明显。

附图说明

图1本发明的包裹毒素蛋白PE38KDEL的纳米粒粒径分布图

图2本发明的纳米粒连接抗体Trastuzumab过程示意图

图3本发明的包裹毒素蛋白PE38KDEL的纳米粒的体外释放实验结果

图4本发明的包裹毒素蛋白PE38KDEL的靶向纳米粒的体外杀伤肿瘤细胞实验结果

图5本发明的包裹毒素蛋白PE38KDEL的靶向纳米粒的体内抗肿瘤实验结果

图6本发明的包裹毒素蛋白RICIN A的纳米粒的体外释放实验结果

图7本发明的包裹毒素蛋白RICIN A的靶向纳米粒的体外杀伤肿瘤细胞实验结果

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述。

实施例1：抗肿瘤毒素蛋白PE38KDEL分离纯化

PE38是细菌毒素中假单孢菌外毒素(pseudomonas extoxin，PE)的一种，分子量为38KD，PE38KDEL是优选的PE38突变体，具有非特异性毒性小的优点。

参照文献Song S，Xue J，Fan K，et al.Preparation and characterization of fusionprotein truncated Pseudomonas Exotoxin A(PE38KDEL)in Escherichia coli.ProteinExpr Purif 2005；44：52-7.方法，首先构建PE38KDEL的pET表达载体，然后转入工程菌BL21(DE3)中，利用诱导剂IPTG诱导表达出PE38KDEL毒素蛋白。然后，通过镍柱亲和层析的方法来得到在细菌中可溶性表达的PE38KDEL。最后通过兔网织红细胞裂解物体外蛋白翻译系统，细胞杀伤实验来证实PE38KDEL的活性。

实施例2：包裹抗肿瘤毒素蛋白PE38KDEL纳米粒的制备

用BCA法精密测定分离纯化后毒素蛋白PE38KDEL的水溶液的浓度，浓度范围在2-10mg/ml为宜。将PLGA溶于1体积的乙酸乙酯中，PLGA浓度范围(10-40mg/ml)，加入1/12-1/5体积的蛋白毒素溶液，探头超声2分钟(100W)后加入到等体积的3％PVA溶液中，均质乳匀机乳化2分钟(转速22000rpm)形成复乳；将上述复乳溶液倒入10体积的0.3％PVA溶液中低速搅拌6-8小时，高速离心机离心30min(30000rpm)，蒸馏水重悬洗涤三次，加少量甘露醇冷冻干燥24小时，即得载药纳米粒。粒径分布范围为80-200nm，如图1所示。

实施例3：抗体和纳米粒表面的连接

取冷冻干燥后的载药纳米粒10毫克，分别加入1ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(200-500mM)和1ml的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(50-200mM)，温和搅拌15分钟，将得到的N-羟基琥珀酰亚胺活化纳米粒，立即加入抗体Trastuzumab(商品名Herceptin，购买于Genentech公司)(含量为占纳米粒总重量的2-5％)，温和搅拌15分钟，离心收集，即可得人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白PE38KDEL的PLGA纳米粒。详见图2。

实施例4：毒素蛋白PE38KDEL纳米粒的体外释放实验

精密称取载PE38KDEL纳米粒与空白纳米粒20mg分别置于7ml离心管中，加入一定体积10mM pH 7.2磷酸盐缓冲液。将离心管放在37℃恒温水浴摇床中，以100rpm速度振荡。分别在指定的时间点(0-480小时)取出离心管，30000rpm速度离心30min，吸取释放介质，待测。更换等量新的释放介质后，将离心管放回水浴摇床中，继续操作。以空白纳米粒释放的上清液作为空白对照，按MicroBCA试剂盒要求进行操作，测定释放液于562nm波长处的吸光度，通过标准曲线计算求得释放液中毒素蛋白PE38KDEL的含量。

结果见图3。药物在释放初期突释效应明显，1小时累积释药达24.5％，72小时后药物累积释放达80％。之后，药物在纳米粒中缓慢释放大约3周。

实施例5：毒素蛋白PE38KDEL靶向纳米粒的体外杀伤肿瘤细胞实验

我们采用96孔板细胞增值试验(Cell Titer 96 non-radioactive cell proliferationassay kit)来评价靶向纳米粒的体外抗肿瘤效果。将乳腺癌BT-474细胞(HER2抗原高表达细胞)和MCF-7细胞(表面无HER2抗原的阴性对照)(细胞购于中国科学院上海生科院细胞资源中心)分别按3×10⁴每孔接种于96孔细胞培养板中，取不同浓度的PE38KDEL靶向纳米粒(0.1～10,000pM)200μl分别加到样品孔中，后将培养板于二氧化碳孵箱中培养48小时。取出培养板，在每个细胞培养孔中加入20μl的MTS/PMS溶液。再经过2小时培养后，用酶标仪测定96孔培养板中样品孔在490nm处的吸光度。获得靶向纳米粒的杀伤曲线，计算求出其IC₅₀值。以同样方法，将无Trastuzumab靶向的载药纳米粒与未包裹的PE38KDEL原药(三组中PE38KDEL药量相等)，分别加入到BT-474、MCF-7细胞中作为对照组试验，比较靶向纳米粒的抗肿瘤效果。

结果见图4，靶向纳米粒对HER2高表达细胞杀伤效果明显(IC₅₀＝46pM)，而对无HER2抗原的细胞无明显作用(IC₅₀＞680pM)。说明靶向纳米粒的的靶向性良好，对其它细胞毒性作用很小。同时，对比对照组结果，靶向纳米粒的体外抗肿瘤效果明显，分别是无Trastuzumab靶向的载药纳米粒与未包裹的PE38KDEL原药组的10、11倍。

实施例6：毒素蛋白PE38KDEL靶向纳米粒的体内抗肿瘤实验

选取40支鼠龄为4周的BALB/c裸鼠，背部注射0.5ml浓度8×106个/ml的BT-474细胞，构建小鼠乳腺癌模型。将40只雌雄各半的BALB/c裸鼠乳腺癌模型随机分为4组即：靶向纳米微粒、载药纳米粒组、原药组、对照组。具体分组情况如下：

1、靶向纳米微粒组(10只)：将Trastuzumab修饰的包裹PE38KDEL的靶向纳米粒分散于生理盐水中，从裸鼠尾静脉注射(相当于0.5mg毒素蛋白/kg)。

2、载药纳米微粒组(10只)：将载PE38KDEL纳米粒分散于生理盐水中，从裸鼠尾静脉注射(相当于0.5mg毒素蛋白/kg)。

3、PE38KDEL原药组(10只)：将PE38KDEL分散于生理盐水中，从裸鼠尾静脉注射(0.5mg毒素蛋白/kg)。

4、对照组(10只)：尾静脉注射生理盐水。

连续2天同样剂量药物加强治疗。以肿瘤体积作为治疗指标进行观察，随后每5天测定一次，观察50天，计算公式为：肿瘤体积＝(长度×宽度2)/2。

结果如图5所示。对比对照组结果，靶向纳米粒组活体抑制肿瘤生长效果明显，肿瘤平均体积显著减小。

实施例7：包裹抗肿瘤毒素蛋白RICINA的靶向纳米粒的制备

Ricin A是植物毒素中蓖麻毒素的突变体，目前常用于免疫毒素的合成(Jinbiao Zhan，Yongdui Chen，Keyi Wang，Shu Zheng.Expression of ricin A chainand ricin A chain-KDEL in Escherichia coli.Protein Expression and Purification34；2004：197-201)。

采用与实施例2，实施例3相同的方法进行制备，亦可制得Trastuzumab修饰的包裹RICINA的靶向PLGA纳米粒。粒径分布范围为80-200nm。

实施例8：毒素蛋白Ricin A纳米粒的体外释放实验

参照实施4方法，将Ricin A纳米粒与空白纳米粒的磷酸盐溶液，放于37℃恒温水浴摇床中振荡。分别在指定的时间点(0-240小时)取出吸取释放介质，按照Micro BCA试剂盒方法，测定释放介质562nm处吸光度，计算求得释放液中毒素蛋白Ricin A的含量。

结果如图6所示。药物在释放初期突释效应明显，累积释药达35.5％，48小时后药物累积释放达80％。之后，药物在纳米粒中平稳释放大约10天。

实施例9：毒素蛋白Ricin A靶向纳米粒的体外杀伤肿瘤细胞实验

参照实施5方法评价靶向纳米粒的体外抗肿瘤效果。取不同浓度的RICIN A靶向纳米粒，加到接种BT-474细胞和MCF-7细胞的96孔细胞培养板中。培养48小时后，培养孔中加入MTS/PMS溶液。再经过2小时培养后，用酶标仪测定样品孔在490nm处的吸光度。获得靶向纳米粒的杀伤曲线，计算求出其IC₅₀值。以非靶向的载药纳米粒与未包裹的Ricin A原药同法对照试验，比较包裹Ricin A的靶向纳米粒的抗肿瘤效果。

结果如图7所示，与实施5相似，靶向纳米粒对BT-474细胞杀伤效果明显(IC₅₀＝88pM)，而对MCF-7细胞无明显作用(IC₅₀＞1200pM)。靶向纳米粒较对照组体外抗肿瘤效果明显，分别是非靶向载Ricin A纳米粒与未包裹的Ricin A原药组的9、10倍。

Claims (10)

1、一种人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的靶向纳米粒，包括以下结构，且粒径范围为80-200纳米：

配体，为抗HER2人源化单克隆抗体Trastuzumab；

包裹并运载抗肿瘤毒素蛋白的PLGA纳米粒；以及

连接基团，为酰胺基团，连接配体与PLGA纳米粒。

2、根据权利要求1所述的人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的靶向纳米粒，其特征在于其中的PLGA为羧基封端的PLGA，粘度为0.3-0.8dl/g。

3、根据权利要求1所述的人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的靶向纳米粒，其特征在于其中的抗肿瘤毒素蛋白是细菌毒素或植物毒素，以及它们的突变体。

4、根据权利要求3所述的人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的靶向纳米粒，其特征在于其中的细菌毒素是白喉毒素或假单孢菌外毒素。

5、根据权利要求3所述的人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的靶向纳米粒，其特征在于其中的植物毒素是蓖麻毒素。

6、一种如权利要求1所述的人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的靶向纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

(A)采用复乳—溶剂挥发法制备包裹并运载抗肿瘤毒素蛋白的PLGA纳米粒；

(B)采用化学偶联方法，将PLGA纳米粒表面上的羧基与配体人源化单克隆抗体Trastuzumab中的某一氨基发生缩合反应，形成酰胺基团，进而将配体与PLGA纳米粒连接。

7、根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：

(A)将药物溶液(W1)加入溶解PLGA材料的有机相(O)，通过超声分散制备W1/O初乳，再将初乳加入PVA溶液(W2)中进行均质乳化，获得W1/O/W2复乳，低速搅拌，挥干有机溶剂，离心收集纳米粒；

(B)在偶联试剂的催化作用下，将PLGA纳米粒表面上的羧基与配体人源化单克隆抗体Trastuzumab中的某一氨基发生缩合反应，形成酰胺基团，进而将配体与PLGA纳米粒连接，制得人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的靶向纳米粒；

上述偶联试剂是多肽缩合类试剂作为催化剂；

上述缩合反应的温度为15-25℃。

8、根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于其中的多肽缩合类试剂是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或N-羟基琥珀酰亚胺。

9、一种如权利要求1所述的人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的靶向纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。

10、根据权利要求9所述的人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的靶向纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用，其中的肿瘤是子宫内膜癌、肺癌、直肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌或膀胱癌。

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