CN102697733B - 一种内包裹免疫毒素外连接抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,更具体地,本发明公开了一种内包裹毒素外连接抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米颗粒、其制备方法及用途。本发明公开的内包裹PE38KDEL I型突变体外连接人源化SM5-1抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物具有抗肿瘤活性高、非特异毒性和免疫原性小、对抗PE中和性抗体的敏感度低的优点,可用于制备抗肿瘤药物。
Description
技术领域:
本发明属于生物医药领域,更具体地,本发明公开了一种内包裹毒素外连接抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米颗粒、其制备方法及用途。
背景技术:
免疫毒素是由抗体或抗体片段和蛋白毒素(如绿脓杆菌外毒素PE)进行化学交联或基因融合而形成的复合物。目前,PE构建的免疫毒素是把除去细胞结合部分的PE和抗体片段进行基因融合而形成的。尽管PE构建的免疫毒素在肿瘤的临床治疗中取得了令人瞩目的成就,然而,其临床应用仍然受限于免疫毒素的严重的非特异毒性,这些非特异毒性主要表现为肝毒性-由于免疫毒素和正常组织非特异性结合造成的一种非特异毒性,PE构建的免疫毒素中的毒素部分在非特异毒性中起着重要的作用。最近人们发现,一些方法(如降低免疫毒素的等电点)可以用作来降低免疫毒素的非特异毒性。此外,针对PE构建的免疫毒素中的毒素部分的免疫反应是治疗固体肿瘤的主要障碍,克服免疫毒素的免疫原性的方法一般为联合使用免疫抑制剂(CTLA4Ig或Rituximab)。如果能减小免疫毒素的免疫原性和非特异毒性,我们便可以加大免疫毒素的临床使用剂量,从而得到更好的临床效果。但是,除了聚乙二醇修饰免疫毒素以外,目前很少有同时可以解决这两个问题的方法。
发明内容:
本发明的发明人经过大量实验,将通常应用于包裹小分子药物、减少这些药物毒副作用的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)来包裹PE毒素,这里优选PE38KDEL的I型突变体:PE38KDEL I,为了增加其靶向性,本发明的发明人在包裹了PE38KDEL I的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)表面通过碳化二亚胺技术连接人源化SM5-1单克隆抗体的Fab’片段,得到了一种内包裹PE38KDEL I型突变体,外连接人源化SM5-1抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒。
本发明的发明人利用本发明得到的内包裹PE38KDEL I型突变体外连接人源化SM5-1抗体Fab’片段的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒(以下简称PE-NP-S)进行了一系列的实验,实验结果表明PE-NP-S显示出更好的抗肿瘤活性,而且具有更小的非特异毒性和免疫原性,对抗PE中和性抗体的敏感度更低,达到了本发明的目的。
本发明的发明人还公开了制备上述纳米颗粒的方法,包括首先制备包裹免疫毒素的纳米颗粒,然后在纳米颗粒表面连接抗体两个步骤。
类似地,利用本发明公开的方法,还可以连接其它完整抗体或其它人源化抗体片段(例如Fab’片段或F(ab’)2)得到外部连接上述抗体或片段的包裹了PE38KDEL I型突变体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒,这些完整抗体或人源化抗体片段可为被肿瘤细胞内吞的抗体或其片段,如重组人源化抗HER2单克隆抗体(rhuMAbHER2)和重组人源化抗CD22单克隆抗体。
相应地,利用本发明公开的方法,还可以利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物包裹其他类型的毒素然后再在其外部连接上述的抗体或抗体片段得到各种纳米颗粒,这些毒素可以为篦麻毒素和白喉毒素之一。
本发明公开的纳米颗粒可以和其它药学上可接受的辅料一起组成药物制剂。这些药物制剂可以用于治疗肿瘤。肿瘤可以是SM5-1结合蛋白抗原表达阳性的肿瘤,或者是HER2、CD22表达阳性的肿瘤。
所述的治疗SM5-1结合蛋白抗原表达阳性的肿瘤药物,包括但不限于缓解或/和减轻SM5-1结合蛋白抗原表达阳性的肿瘤的各种症状的药物。这里所述的SM5-1结合蛋白抗原表达阳性的肿瘤包括肝癌、乳腺癌及黑色素瘤等,优选肝癌。
更具体地,本发明公开了:
1.一种内包裹免疫毒素外连接抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒。
2.如1所述的纳米颗粒,其中免疫毒素为篦麻毒素、白喉毒素、PE38KDELI型突变体之一,抗体为人源化抗体或人源化抗体的Fab’片段。
3.如2所述的纳米颗粒为内包裹PE38KDEL I型突变体外连接人源化SM5-1抗体Fab’片段的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒。
4.如3所述的纳米颗粒,其粒径为70~140nm,包裹效率为35~45%,抗体连接效率为15~25μg/mg纳米颗粒。
5.一种制备如1至4任一所述的纳米颗粒的方法,包括首先制备包裹免疫毒素的纳米颗粒,然后在纳米颗粒表面连接抗体两个步骤。
6.如5所述的方法,其中制备包裹免疫毒素的纳米颗粒步骤包括:
a)将免疫毒素溶解到水性溶液中然后和聚乳酸-羟基乙酸共聚物一起加入到油性溶剂,超声得到油包水的初乳;
b)利用a)得到的初乳制备复乳;
c)复乳再加入到聚乙烯醇溶液中后,搅拌使有机溶剂挥发,溶液经过离心、水洗,低温冻干即制得成品纳米颗粒。
7.如6所述的方法,其中步骤a)中的水性溶液为PBS,油性溶剂为乙酸乙酯。
8.如6所述的方法,其中步骤a)还包括在溶解了免疫毒素的水性溶液中加入海藻糖。
9.如5的方法,其中在纳米颗粒表面连接抗体步骤包括将包裹免疫毒素的纳米颗粒和EDC、NHS在避光的条件下共同孵育,然后将溶于HEPES(pH 7.4)的抗体或抗体片段加入到沉淀的纳米球中避光反应而得。
10.如1-4任一所述的纳米颗粒在制备治疗肿瘤药物中的用途。
11.如10所述的用途,其中肿瘤为SM5-1结合蛋白抗原或Her2表达阳性的肿瘤。
12.如11所述的用途,其中SM5-1结合蛋白抗原表达阳性的肿瘤为乳腺癌、黑色素瘤和肝癌。
13.如12所述的用途,其中SM5-1结合蛋白抗原表达阳性的肿瘤为肝癌。
在本发明中,如没有特别说明,PE-NP-S指的是本发明公开的内包裹PE38KDEL I型突变体外连接人源化SM5-1 Fab’片段的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒,Mut-I为SM5-1单链抗体和PE38KDEL I突变体进行基因融合后的免疫毒素(以下如果没有特别说明,PE38KDEL I均指PE38KDEL I突变体,各附图中也均同),PE-NP为包裹PE38KDEL I的PLGA纳米颗粒,FITC-PE-NP-S为FITC标记的PE-NP-S,PE-NP-CD25为连接anti-CD25的Fab’片段的PE-NP。NP-S为不含免疫毒素的PLGA纳米颗粒(NP)连接上SM5-1的Fab’片段。
附图说明:
图1:PE-NP-S纳米颗粒的形态学和粒径分布图,其中图1-1:PE-NP-S投射电镜(TEM)的形态学照片,分辨率为0.2微米,图1-2:PE-NP-S通过粒径仪测定的粒径分布图。
图2:竞争结合实验结果,其中1×105Ch-hep-3细胞和亚饱和浓度的FITC标记的鼠源SM5-1(mSM5-1)、逐渐增高浓度的Mut-I、CD25-PE38KDEL或纳米颗粒在4℃孵育1小时,细胞洗涤后用流式进行分析。最大荧光强度定义为:在没有竞争抗体时,FITC标记的鼠源SM5-1对Ch-hep-3细胞进行染色得到的平均荧光强度。所有数据为三次独立实验的平均值。
图3:FITC-PE-NP-S结合并被Ch-hep-3细胞内吞的过程分析,Ch-hep-3细胞在下列时间被染色:0,1和30分钟。图3-1:Ch-hep-3细胞,孵育时间为1分钟,图3-2:Ch-hep-3细胞,孵育时间为30分钟,图3-3:QGY7701细胞,孵育时间为30min,其中图3-1-1为相差,图3-1-2为FITC的绿荧光,图3-1-3为4′,6二脒基-2-苯吲哚盐酸(对细胞核进行染色)的蓝荧光,图3-1-4为重叠图象,图3-2-1,3-2-2,3-2-3,3-2-4及3-3-1,3-3-2,3-3-3,3-3-4均同,分辨率为10μm。
图4:抗PE抗体测定结果,图4-1:鼠对PE38KDEL I的IgG反应,5组小鼠在箭头所指的时间分别免疫了1mg/kg的PE-NP-S,PE-NP,PE-NP-CD25,Mut-I,和PE38KDEL I,血清中抗PE IgG水平在第21天被检测;对照组免疫PBS;*,P<0.05;图4-2:抗PE中和性测定结果。
图5:Mut-I和PE-NP-S对BALB/c裸鼠的抗肿瘤效应,5×106 Ch-hep-3细胞在第0天皮下注射到小鼠中,一旦肿瘤长到了50mm3,在第5,7和9天(箭头所指),小鼠接受每天两次的静脉治疗,每组6只小鼠。数据显示为平均肿瘤体积±标准差(n=6)。图5有八个治疗组,分别为PBS、PE38KDEL I(5mg/kg)、PE-NP(5mg/kg,按包裹的PE38KDEL I计算)+SM5-1 Fab’(按实际抗体连接效率与毒素包裹效率折算,抗体量与5mg/kg剂量的PE-NP-CD25上连接的抗体等量)、PE-NP-CD25(5mg/kg,包裹的PE38KDEL I的并连接anti-CD25单抗Fab’片段的PLGA纳米颗粒,按包裹的PE38KDEL I计算)、PE-NP-S(0.5mg/kg,包裹PE38KDEL I并连接SM5-1Fab’片段的PLGA纳米颗粒,按包裹的PE38KDELI计算)、PE-NP-S(2.5mg/kg,按包裹的PE38KDEL I计算)、Mut-I(0.5mg/kg)、Mut-I(5mg/kg)。
具体实施方式:
以下实施例、实验例仅仅对本发明进行进一步的说明,不应理解为对本发明的限制。
PE38KDEL I的制备、纯化和分析方法见(Wang H,Song S,Kou G,et al.Treatment of hepatocellular carcinoma in a mouse xenograft model withan immunotoxin which is engineered to eliminate vascular leak syndrome.Cancer Immunol Immunother 2007;56(11):1775-1783.Song S,Xue J,Fan K,et al.Preparation and characterization of fusion protein truncatedPseudomonas Exotoxin A(PE38KDEL-I)in Escherichia coli.Protein ExprPurif 2005;44:52-7.);人源化SM5-1单克隆抗体通过Li B,Wang H,Zhang D,et al.Construction and characterization of a high-affinity humanizedSM5-1 monoclonal antibody.Biochem Biophys Res Commun 2007;357(4):951-6中提供的方法,用Protein A柱对表达人源化SM5-1单克隆抗体的CHO细胞(中国仓鼠卵巢癌细胞)的细胞上清进行亲和层析后得到;另外,除非特别提及,本文中的SM5-1指人源化SM5-1,人源化SM5-1单克隆抗体和人源化anti-CD25单克隆抗体的Fab’片段的方法制备得参见:Martin FJ,Hubbell WL,Papahadjopoulos D.Immunospecific targeting of liposomes to cells:anovel and efficient method for covalent attachment of Fab’fragmentsvia disulfide bonds.Biochemistry 1981;20:4229-38.;三株肝癌细胞株Ch-hep-1,Ch-hep-3和QGY7701公开资料参见Preparation andCharacterization of Paclitaxel-loaded PlGA Nanoparticles Coated withCationic SM5-1 Single-chain Antibody,Journal of Biochemistry andMolecular Biology,Vo.40,No.5,September 2007,page 731-739;PLGA(乳酸和乙醇胺的摩尔比为50∶50,RG503,分子量为40~75kDa)购买自德国Boehringer Ingelheim公司;Mut-I的制备方法参见:Wang H,Song S,Kou G,et al.Treatment of hepatocellular carcinoma in a mouse xenograft modelwith an immunotoxin which is engineered to eliminate vascular leaksyndrome.Cancer Immunol Immunother 2007;56(11):1775-1783;其余化学试剂均购自sigma,为分析级纯度。
实施例1:包裹PE38KDEL I的纳米颗粒PE-NP的制备
PE38KDEL I按2mg/ml的浓度溶于PBS(pH 7.4),称取15毫克的海藻糖加入150μl上述蛋白溶液,颠倒混匀至完全溶解后,再和40毫克的PLGA共同加入到1.5毫升的乙酸乙酯中,在冰浴中超声15秒(功率为14瓦)(BransonSonicator450)得到初乳。然后,2毫升的聚乙烯醇(分子量:25-35kDa),水溶液(质量体积比为1%)加入到制备得到的初乳(油包水)中,再超声15秒(功率为14瓦)得到复乳【水(油包水)】。得到的复乳再加入到50毫升的聚乙烯醇(分子量:25-35kDa)水溶液中(质量体积比为0.3%)。最终的溶液再搅拌8小时使有机溶剂挥发,最后制得的纳米颗粒经过离心(30000g×30min),水洗三次后,再低温冻干(冻干过程:样品分装至冻干瓶中,2~5ml/瓶,在-20℃条件下预冻4小时,置冻干机内,层板温度设定为-40℃,待样品温度至-30℃以后,开启真空泵,冻干24小时,无菌条件下释放真空,并取出样品)即制得成品纳米颗粒PE-NP。空纳米颗粒NP的制备也是按照上述方法制备(不含2mg/kg的PE38KDEL I)。
实施例2:FITC(异硫氰酸荧光素)标记的PLGA纳米颗粒的制备
100mg的PLGA溶于5毫升的无水二氯甲烷中,然后用1,3-二环己基碳二亚胺(0.7毫克)和N-羟基琥珀酰亚胺(0.4毫克)进行活化。反应4小时以后,副产品dicyclohexyliosurea用透析的方法除去(透析方法参见Ataman-Onal,Y.,Munier,S.,Ganee,A.,Terrat,C.,Durand,P.Y.,Battail,N.,Martinon,F.,Le,G.R.,Charles,M.H.,Delair,T.and Verrier,B.(2006)Surfactant-free anionic PLA nanoparticles coated with HIV-1 p24protein induced enhanced cellular and humeral immune responses in variousanimal models.J.Control.Release 112,175-185.)。透析后,在上述反应液中加入0.7毫克氨茶碱,反应4小时使PLGA的succinimidyl酯基团转变为伯胺基团,反应完毕,加入到500毫升的的-20℃预冷乙醚用沉淀法进行纯化,然后进行真空干燥(真空度20Pa、干燥温度为25℃、干燥时间12小时)。将溶于二甲亚砜(DMSO)的FITC(1.2mg)和50毫克的具有伯胺基团的PLGA(真空干燥后的产品)反应。产物对去离子水透析(透析方法上面所述方法相同)后,冻干。将FITC标记的PLGA聚合物和PLGA按照1∶9的比例混合后,按照实施例1的复乳法来制得FITC标记的PLGA纳米颗粒FITC-PE-NP。
实施例3:靶向纳米颗粒的制备
1毫升的PLGA纳米颗粒(实施例1产品PE-NP)溶液(5μg/μl,PE-NP溶于pH 6.3的10mM NaH2PO4水溶液)和10μl的50mg/ml EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)水溶液、10μl的50mg/ml NHS(N-hydroxysuccinimide)水溶液共同避光孵育20分钟后,30000g离心10分钟后除去上清,然后将溶于50mM HEPES缓冲液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸,4-(2-hydroxyerhyl)piperazine-1-erhanesulfonic acid)(pH 7.4)的SM5-1或anti-CD25Fab’(1μg/μl)加入到沉淀的纳米颗粒中避光反应2小时后,离心,水洗后制得连接抗体片段的纳米颗粒PE-NP-S或PE-NP-CD25。
NP-S的制备可以利用实施例1得到的NP经过实施例3的步骤得到。
FITC-PE-NP-S的制备可以利用实施例2得到的FITC-PE-NP通过实施例3的步骤得到。
实验例
除非特别说明,以下实验例均利用上述实施例得到的产品进行实验
实验例1:包裹效率、平均粒径和粒径分布测定
被PLGA纳米颗粒包裹进去的PE38KDELI的百分比为包裹效率,每毫克纳米颗粒中PE38KDEL I的含药量为PE38KDEL I的载药量,抗体片段连接效率为每毫克的PLGA纳米球连接的抗体片段的质量,包裹效率、PE38KDEL I的载药量和抗体片段连接效率都是通过MicroBCA protein assay kit(Pierce,Rockford,IL)按说明书方法进行测定(Ofra Benny,Maayan Duvshani-Eshet,TheresaCargioli,Lorenzo Bello,Andreas Bikfalvi,Rona S.Carroll,and MarcelleMachluf,Continuous Delivery of Endogenous Inhibitors from Poly(Lactic-Co-Glycolic Acid)Polymeric Microspheres Inhibits Glioma TumorGrowth,Clinical Cancer Research 2005;768(11):768-76)。纳米颗粒的平均粒径和粒径分布是由粒径仪Zeta Sizer 3000HS(Malvern,UK)测定的。纳米颗粒的表面形态和粒径是通过投射电镜JEOL 2010 Transmission ElectronicMicroscopy测定的。
结果:PE-NP-S的包裹效率为41.8±2.3%,PE38KDEL I的载药量是8.5±0.2μg/mg,抗体连接效率是19.4±2.4μg SM5-1的Fab’/mg纳米颗粒(mean±SD;n=4)。通过Zeta Sizer 3000HS粒径仪测量,PE-NP-S的平均直径为107.7±30.9nm(mean±SD;n=10)。通过透射电镜TEM的观察,我们发现PE-NP-S的形状为圆形,而且粒径分布比较狭窄为107.67±27.6nm,见图1。
对于PE-NP-CD25进行上述实验也得到了相同的结果。
实验例2:竞争性结合的结合和内吞活性实验
竞争性结合实验:1×105Ch-hep-3细胞和亚饱和浓度的FITC标记的鼠源SM5-1(制备方法参见:U.Trefzer,N.Rietz,Y.Chen,H.Audring,G.Herberth,P.Siegel,S.Reinke,P.Koniger,S.Wu,J.Ma,Y.Liu,H.Wang,W.Sterry,Y.Guo,SM5-1:a new monoclonal antibody which is highly sensitive andspecific for melanocytic lesions,Arch.Dermatol.Res.292(2000)583-589.)和逐渐增高浓度的鼠源SM5-1、Mut-I或PE-NP-S在4℃孵育1小时,同时以CD25-PE38KDEL、PE-NP-CD25作为阴性对照。细胞通过离心洗涤以后用流式细胞仪进行分析。流式细胞仪结果用FACScan flow cytometer(BectonDickinson,San Jose,CA)来分析。竞争者的IC50(半数抑制浓度)用四参数算法来计算,结果见图2,结果表明PE-NP-S和Mut-I都可以竞争性阻断鼠源SM5-1结合Ch-hep-3细胞,意味着它们都保留了特异性结合SM5-1结合蛋白抗原的能力。PE-NP-S的亲和力(平均IC50±SD,n=3)为0.40±0.02μg/ml,大大高于Mut-I的亲和力(16.47±2.69μg/ml),而和鼠源SM5-1的亲和力(0.32±0.03μg/ml)相似,意味着把SM5-1的Fab’抗体片段连接到纳米颗粒上没有改变它的结合活性,最大荧光强度定义为:在没有竞争抗体时,FITC标记的鼠源SM5-1对Ch-hep-3细胞进行染色得到的平均荧光强度。
结合和内吞实验通过共聚焦显微镜来测定:Ch-hep-3细胞和PE-NP-S在37℃孵育0,1或30分钟,然后用PBS洗涤两次,用10毫升的4%PFA(多聚甲醛)固定30分钟。最后,细胞用Leica TCS SP2 Confocal Spectral Microscope(UV-VIS)进行拍照,照片用Leica共聚焦软件分析,结果见图3,结果显示通过1分钟的孵育,FITC的荧光仅仅在Ch-hep-3细胞表面被检测到(图3-1),在孵育30分钟以后,FITC荧光可以在Ch-hep-3细胞胞质内可以清楚的被检测到(图3-2)。然而,在SM5-1结合蛋白抗原表达阴性的细胞株QGY7701,则没有检测到任何FITC荧光(图3-3)。
另外,本发明的发明人利用PE-NP和PE-NP-CD25进行了同样的实验,实验结果表明PE-NP和PE-NP-CD25与PE-NP-S结果相反,表明其均不能结合到细胞表面抗原从而不能被Ch-hep-3细胞内吞。
本发明的发明人利用另外一株SM5-1结合蛋白抗原表达阳性的细胞株Ch-hep-1也得到了与上述实验相似的结果。
实验例3:体外细胞毒性实验
三株肝癌细胞在96孔板中以1×104/孔的密度在37℃,7.5%CO2中培养24小时后,和PE-NP-S、Mut-I或PE38KDEL I、PE-NP+SM5-1Fab’、PE-NP-CD25在37℃共孵育两天,药物中PE38KDEL I的浓度为1到10,000pM。细胞生存率用细胞效价非放射性细胞增殖试剂盒(Cell Titer 96 non-radioactive cellproliferation assay kit,Promega,Madison,WI,USA)来进行测定。简要地说,20μl of MTS/PMS溶液加到每个孔中,在37℃孵育两个小时以后,用全自动定量绘图酶标仪在490nm波长进行读数,结果见表1。
表1 药物对肝癌细胞株的IC50(pM)
a数据显示为平均值±标准差(n=3).
表1显示,高表达SM5-1结合蛋白抗原的Ch-hep-3细胞对PE-NP-S最敏感(IC50=32.39pM)。中度表达SM5-1结合蛋白抗原的Ch-hep-1细胞对PE-NP-S也比较敏感(IC50=82.26pM)。然而,表达SM5-1结合蛋白抗原阴性的QGY7701细胞对PE-NP-S相当不敏感(IC50>2000pM)。对Mut-I来说,我们得到了相似的结果,这意味着PE-NP-S和Mut-I对表达SM5-1结合蛋白抗原的乳腺癌细胞株的特异性结合活性对细胞毒性起着关键性作用。和Mut-I比起来,PE-NP-S对Ch-hep-3细胞的细胞毒性更大(PE-NP-S的IC50为32.39±5.36pM,而Mut-I的IC50为82.26±9.58pM(mean±SD);两者具有显著统计学意义,P<0.05)(表1)。在Ch-hep-1细胞中也得到了相似的结果。然而,PE-NP和SM5-1的Fab’的混合物(SM5-1的Fab’量和结合到PE-NP-S上的SM5-1的Fab’的量一样)、PE-NP-CD25对这三株细胞株有非常高的IC50值,意味着PE-NP-S的细胞毒性是依赖结合在纳米颗粒上的SM5-1的Fab’,而不是游离的SM5-1的Fab’。
本发明的发明人同时也利用未包裹PE38KDEL I的NP和NP-HER进行了上述的细胞毒性实验,结果表明未包裹PE38KDEL I,这些纳米颗粒几乎无细胞毒性。
实验例4:非特异毒性和肝脏酶实验
8只雌性BALB/c小鼠静脉注射200μl剂量逐渐提高的药物,在两个星期内观察动物的死亡率。LD50定义为杀死50%的动物需要的PE38KDEL I的剂量,是通过trimmed Spearman-Karbar统计方法来得出。肝脏损害则通过对血浆中ALT的酶活性来进行定量分析(上海生物制品研究所提供的ALT检测试剂盒检测)。不同剂量的药物通过静脉注射的方式注射入BALB/c小鼠,几乎所有的死亡均发生在注射3天之内,Mut-I和PE38KDEL I的LD50值为11.56mg/kg,相反的是,PLGA包裹的PE38KDEL I则能够很好的被小鼠耐受:PE-NP-S,PE-NP和PE-NP-CD25的LD50值为52.79mg/kg。为了评估PLGA包裹PE38KDEL I的肝脏毒性,小鼠在接受各种药物的静脉注射以后(剂量为5mg/kg PE38KDEL I),在3小时和24小时我们收集了血样品,PLGA包裹的PE38KDEL I的剂量指的是PE-NP在37℃中24小时释放PE38KDEL I的累积量,在注射Mut-I和PE38KDEL I以后,血浆中的ALT水平显著增加,然而,在注射等量的PE-NP-S,PE-NP和PE-NP-CD25以后,ALT的血浆水平没有显著改变。
实验例5:抗PE抗体测定实验
小鼠对PE38KDEL I的IgG反应实验:24只雌性BALB/c小鼠(~20g)分为6组,每组在第1、14天时腹腔免疫1mg/kg的PE38KDEL I,血样在第1天免疫后在第21天收集。ELISA(酶联免疫吸附测定)平板用PE38KDEL I进行包被后,通过ELISA来测定血清中对PE38KDEL I的特异性IgG抗体。测定抗体是连接HRP(辣根过氧化物酶)羊抗鼠IgG抗体(Zymed Lab,San Francisco,CA),DAB(3,3’-二氨基联苯胺)用作反应底物。第1天免疫以后的第21天收集血清样品,用ELISA来测定血清中的鼠抗PE38KDEL I IgG抗体水平,PE-NP-S、Mut-I及相关对照品的测定也同,结果见图4-1,结果显示,PE-NP-S和Mut-I相比其吸光度有统计学差异,PE38KDEL I和Mut-I的产生了高滴度的抗PE38KDEL I IgG。相反的是,PE-NP-S的免疫原性则很低。
抗PE中和性实验是用SM5-1结合蛋白抗原表达阳性的乳腺癌细胞株来进行:在96孔板中每孔接种1×105 Ch-hep-3细胞,在37℃孵育24小时。第二天,小鼠免疫1mg/kg PE38KDEL I(在第1,14和28天分别免疫一次)后收集的第42天的血浆样品在56℃热灭活30分钟后,用培养液十倍比稀释。200pM PE-NP-S或者Mut-I(PE38KDEL I剂量)加到每个稀释血浆样品后孵育30分钟后,将混合物和各种对照都加入到Ch-hep-3细胞中,在37℃继续孵育48小时,细胞生存率用细胞效价非放射性细胞增殖试剂盒(Promega,Madison,WI,USA)来进行测定,结果见图4-2,结果表明Mut-I对Ch-hep-3的细胞毒性能被抗PE中和性血清剂量依赖性抑制。特别的,和200pM Mut-I、未稀释的中和性血清共孵育的Ch-hep-3的细胞生存率为98%,这意味着Mut-I的细胞活性完全被消除了。然而,PE-NP-S对Ch-hep-3的细胞毒性则没有被抗PE中和性血清显著影响(数据显示为平均值±标准差(n=4).***,P<0.001;PE-NP-S和Mut-I组的细胞生存率的比较显示出统计学差异(two-sample individual t test))。
在Ch-hep-1细胞中我们也得到了相似的结果。
同时,我们也用ELISA来证实了抗PE中和性血清不能中和SM5-1或SM5-1的Fab’。
实验例6:抗肿瘤活性实验
5×106 Ch-hep-3细胞在第0天皮下注射到BALB/c裸鼠(~20g)中,在第5天肿瘤体积达到了50mm3。从第5天开始,小鼠开始接受静脉注射药物,在第5,7,和9天进行,每天两次。共有八个治疗组,分别为PBS、PE38KDEL I(5mg/kg)、PE-NP(5mg/kg)联合SM5-1Fab’(5.25mg/kg)、PE-NP-CD25(5mg/kg)、PE-NP-S(0.5mg/kg)、PE-NP-S(2.5mg/kg)、Mut-I(0.5mg/kg)、Mut-I(5mg/kg),每组都有6只老鼠,肿瘤每5天用游标卡尺测量一次,共观察40天。肿瘤体积=(宽2×长)/2。所有的老鼠都来自上海中科院,老鼠放在无病原微生物的环境中饲养,饲养一星期以后再用作实验小鼠。
实验结果见图5,实验结果表明Mut-I和PE-NP-S对肿瘤的抑制显示出剂量依赖性。对于完全的肿瘤消退,定义为完全的肿瘤消失达50天。我们发现,0.5mg/kg×6的Mut-I可以使1只小鼠完全肿瘤消退。在5mg/kg×6的Mut-I治疗组,在6只小鼠中我们观察到了完全的肿瘤消退。然而,PE-NP-S的抗肿瘤活性得到了极大的提高;在0.5mg/kg×6的PE-NP-S治疗组,有2只小鼠完全肿瘤消退;而在2.5mg/kg×6的PE-NP-S治疗组,所有的小鼠达到了完全的肿瘤消退;这些数据清楚的显示了提高免疫毒素治疗剂量的有效性。相反,高达5mg/kg PE38KDEL I的对照药物治疗没有任何抗肿瘤活性。这些数据显示了给更高免疫毒素治疗剂量的有效性。
综合上述实验例,可以看出,PE-NP-S和Mut-I对小鼠的毒性:PE-NP-S的LD50为52.79mg/kg,而Mut-I的LD50为11.56mg/kg,注射5mg/kg的PE-NP-S没有引起肝脏明显的损害,相反,5mg/kg的Mut-I对肝脏有严重的损害,这些结果提示PE38KDEL I通过PLGA包裹后,其毒性大大减小。另外,PE-NP-S比Mut-I有更小的免疫原性,而且在体外对抗PE中和性抗体更加不敏感,抗PE抗体测定证实了和抗PE中和性血清共孵育后,PE-NP-S的对SM5-1结合蛋白抗原阳性的肝癌细胞株的细胞毒性没有被明显影响,相反,Mut-I则完全丧失了它的细胞毒性。此外,在预免疫PE38KDEL I、长有高表达SM5-1结合蛋白抗原肝癌小鼠中的PE-NP-S和Mut-I的抗肿瘤活性中,尽管在血循环中存在抗PE中和性抗体,PE-NP-S仍然显示出强大的抗肿瘤活性,而Mut-I则没有。PE-NP-S减少的敏感性可能是由于PLGA的包裹和它的快速内吞。PE-NP-S对SM5-1结合蛋白抗原有特异性的结合,而且几乎完全被SM5-1结合蛋白抗原阳性肿瘤细胞内吞。由于选择性的内吞,PE-NP-S可以有效的引起SM5-1结合蛋白抗原阳性细胞死亡,而对SM5-1结合蛋白抗原阴性细胞毒性较小。PE-NP-S选择性杀伤SM5-1结合蛋白抗原阳性细胞的原因是纳米颗粒表面的SM5-1抗体片段介导了内吞,然后纳米颗粒中的药物释放出来杀伤细胞。对SM5-1结合蛋白抗原阳性肝癌细胞株的细胞毒性比Mut-I更大是因为靶向纳米颗粒比免疫毒素具有更高的转运、结合能力。体内抗肿瘤实验证实了PE-NP-S的抗肿瘤活性是Mut-I的两倍,另外,PE-NP-S的体内毒性是Mut-I的1/5,所以,PE-NP-S的治疗效率提高了10倍。PE-NP-S有效的抗肿瘤效应的机制可能是由于靶向纳米颗粒的双相转运:在第一相转运中,纳米颗粒的在肿瘤组织中缓慢聚集,而且由于增强的渗透和滞留效应,纳米颗粒在肿瘤组织的浓度会得到进一步提高;在第二相,通过配体-受体互相作用,靶向纳米颗粒结合并被肿瘤细胞内吞。关于PE-NP-S的组织分布的进一步研究则在进行中。另外,纳米颗粒的粒径对其在体内的分布起着重要的作用。100~200nm的纳米颗粒可以逃避网状内皮系统的吞噬,在体内的循环时间达到最长。通过复乳溶剂蒸发法,得到了平均粒径为107.67±27.6nm的PE-NP-S,具有长循环的特征。更为重要的是,本发明的发明人选择了rhuMAbSM5-1结合蛋白抗原的Fab’片段,而不是完整的抗体来作为PE-NP-S的靶向分子,这也可以减少肿瘤相关巨噬细胞对纳米颗粒的吞噬,而且纳米颗粒对实体瘤的渗透也更加广泛。
本发明的发明人还对本发明中公开的PE-NP-S进行了体外释放实验(体外释放实验参照Gaspar MM,Blanco D,Cruz ME,Alonso MJ.Formulation ofL-asparaginase-loaded poly(lactide-co-glycolide)nanoparticles:influence of polymer properties on enzyme loading,activity and in vitrorelease.J Control Release 1998;52:53-62.进行),实验结果显示:1小时以后,仅仅2.9%的PE38KDEL I从PE-NP中释放出来,使得中和性抗体不太可能完全中和PE,因为接种PE构建的免疫毒素后,动物会引起抗PE免疫反应,PE-NP-S对中和性抗体减小的敏感性可以增加重复应用药物的有效性,这些研究为克服针对PE38KDEL I的中和性抗体提供了有益的尝试。PE-NP-S有更小的免疫原性,原因可能为纳米颗粒的粒径较小,100~200nm的纳米颗粒更少被巨噬细胞吞噬,而巨噬细胞吞噬在激活免疫反应方面起着重要的作用。
总之,PE-NP-S显示出更好的抗肿瘤活性,而且具有更小的非特异毒性和免疫原性,对抗PE中和性抗体的敏感度更低。
对照例:包裹蛋白的生物学活性实验
利用与实施例1相同的方法(只是没有加入10%海藻糖或加入其它添加剂(如1%甘油,1%PEG400)替代海藻糖)得到的PE-NP与利用实施例1的制备方法得到的PE-NP进行了包裹蛋白的生物学活性实验(实验方法参见:用FlexiRabbit Reticulocyte Lysate System体外蛋白翻译试剂盒测定蛋白的生物学活性(Promega公司)),未包裹的PE38KDEL的IC50值(半数抑制浓度)为4.76±2.25pmol(mean±SD,n=3),而包裹后的PE38KDEL的IC50值为4.99±2.96pmol(mean±SD,n=3),P>0.05,两者比较没有显著性差异,表明利用实施例1的制备方法得到的PE-NP提取出来的PE38KDEL I保持了和未包裹的PE38KDEL I相似的活性。而对于没有加入10%海藻糖或加入其它添加剂(如1%甘油,1%PEG400)替代海藻糖利用实施例1相同的方法得到的PE-NP,提取得到的PE38KDEL I的活性和未包裹的PE38KDEL I相比,其活性均大大降低。
本发明的发明人按照实施例中公开的方法得到了内包裹蓖麻毒素外连接人源化SM5-1抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒,取得了和上述试验例一致的抗肿瘤效果。
另外,本发明的发明人还利用包裹PE38KDEL I型突变体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物连接抗Her2的人源化单克隆抗体的Fab’片段用于治疗Her2表达阳性的肿瘤,也获得了与本发明目的一致的良好的治疗效果。
Claims (10)
1.一种内包裹免疫毒素外连接抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒,特征在于,所述的纳米颗粒为内包裹PE38KDELI型突变体外连接人源化抗Her2单克隆抗体Fab’片段的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒。
2.权利要求1所述的纳米颗粒,其粒径为70~140nm,包裹效率为35~45%,抗体连接效率为15~25μg/mg纳米颗粒。
3.一种制备权利要求1或2所述的纳米颗粒的方法,包括首先制备包裹免疫毒素的纳米颗粒,然后在纳米颗粒表面连接抗体两个步骤。
4.权利要求3所述的方法,其中制备包裹免疫毒素的纳米颗粒步骤包括:
a)将免疫毒素溶解到水性溶液中然后和聚乳酸-羟基乙酸共聚物一起加入到油性溶剂,超声得到油包水的初乳;
b)利用a)得到的初乳制备复乳;
c)复乳再加入到聚乙烯醇溶液中后,搅拌使有机溶剂挥发,溶液经过离心、水洗,低温冻干即制得成品纳米颗粒。
5.权利要求4所述的方法,其中步骤a)中的水性溶液为PBS,油性溶剂为乙酸乙酯。
6.权利要求4所述的方法,其中步骤a)还包括在溶解了免疫毒素的水性溶液中加入海藻糖。
7.权利要求1或2所述的纳米颗粒在制备治疗肿瘤药物中的用途。
8.权利要求7所述的用途,其中肿瘤为Her2表达阳性的肿瘤。
9.权利要求8所述的用途,其中Her2结合蛋白抗原表达阳性的肿瘤为乳腺癌、黑色素瘤和肝癌。
10.权利要求9所述的用途,其中Her2结合蛋白抗原表达阳性的肿瘤为乳腺癌。
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