CN102649803A - 一种提取分离高纯度杯苋甾酮的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提取分离高纯度杯苋甾酮的制备工艺，其特征在于：将川牛膝药材粉碎，加入适量溶剂提取，滤过，浓缩，浓缩液先后采用大孔吸附树脂柱层析及高速逆流色谱技术进行分离制备高纯度的杯苋甾酮。本发明分离效果好、样品损失少、无污染、高效快速，工艺稳定，可大制备量分离杯苋甾酮，获得的杯苋甾酮纯度可达98％以上。
Description
技术领域：
本发明涉及一种采用大孔树脂和高速逆流色谱法分离制备高纯度杯苋甾酮的工艺。
背景技术：
川牛膝(Cyathula officinalis Kuan.)为苋科杯苋属多年生草本植物，别名甜膝，主要分布于四川、云南和贵州，野生或栽培，生长于海拔1500米以上的地区，为著名的川产地道中药材，是极常用且是重要的出口品种。川牛膝的主要成分为生物碱、川牛膝主要和含甾类化合物、皂苷、多糖和少量异黄酮类以及多种微量元素等化学成分，其中甾类化合物包括杯苋甾酮、异杯苋甾酮、5-表杯苋甾酮、羟基杯苋甾酮、蜕皮甾酮、苋菜甾酮A及B、头花杯苋甾酮、前杯苋甾酮、后甾酮等。黎万寿等的药理研究表明，杯苋甾酮对去势小鼠的体重和子宫系数有增加趋势，子宫湿重有显著增长，提示其为川牛膝的雌激素样活性的有效成分；杯苋甾酮能增加去势大鼠提肛肌重量，提示其有蛋白质同化作用；实验结果表明，杯苋甾酮的药理活性与川牛膝强筋健骨“其滋补之功如牛之多力也”相符，与中医临床用药功能主治基本吻合，可以作川牛膝的对照品。
现常采用醇提、氧化铝柱层析分离等对杯苋甾酮进行提取分离，由于生产周期长、制备量小、纯度低，难以满足需要，本发明克服了现有技术的不足，提供了一种提取分离高纯度杯苋甾酮的制备工艺。
高速逆流色谱(High Speed Countercurrent Chromatography，简称HSCCC)是国际上于上世纪80年代以来在液-液分配色谱基础上发展起来的新型分离技术，其分离原理是利用螺旋柱在高速行星运动时产生的巨大离心力，使螺旋柱中互不相容的两相不断混合，达到稳定的流体动力学平衡态，此时在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂都反复进行着混合和静置的分配过程，这一过程频率极高，当柱心以800rpm旋转时，频率超过每秒13次。流动相不断地穿过固定相，同时保留其中的一相(固定相)，利用横流泵连续输入另一相(流动相)，流动相载着溶质(样品)进入螺旋柱并不断反复穿过固定相，使样品再两相之间也不断反复地进行分批额，由于样品中各组分再两相中分配系数不同，导致在螺旋柱中的移动速度不同，因而能使样品各组分按分配系数的次序，依次得到分离。
高速逆流色谱作为一种新型的分配技术，有许多优点是传统液-固色谱无法比拟的，因而有很广阔的应用前景。首先，它的流动相、固定相均为液体，不需要固体载体，避免了液-固色谱常会造成的固体载体对样品的不可逆吸附，可以保证样品再不损失任何一种组分的情况下得到分离，理论上样品回收率相当高；其次，它的分离效率高，可以达到几千个理论塔板数，尤其在天然产物组分分离提取中有较高的分离度，有的样品经过一次分离就可以得到一个甚至多个单体，并且分离时间也短，一般是几个小时即可完成一次分离；此外，它使用常规试剂，有广泛的液-液分配体系可供选择，体系更换方便、快捷；它的进样量大，可以从毫克到克量级，进样体积可达20ml以上，这对于样品的纯化制备显示出惊人的优势。
发明内容：
本发明的目的是提供一种提取分离高纯度杯苋甾酮的制备工艺，所得产品杯苋甾酮含量达98％以上。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种提取分离高纯度杯苋甾酮的制备工艺，其特征在于：将牛膝药材粉碎过20-50目筛，加入5-10倍量提取溶剂，加热至60-80℃，提取2-3次，每次1-3小时，合并提取液，减压回收乙醇，所得提取物用大孔树脂吸附，先用水洗至色淡，再用60-80％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得到总甾酮浸膏；将总甾酮浸膏采用高速逆流色谱分离制备高纯度杯苋甾酮，所得产品杯苋甾酮含量为98％以上。
所述提取溶剂为50-95％的乙醇水溶液。
所述大孔树脂柱分离采用湿法装柱，洗脱液减压回收至相对密度1.15-1.20(60℃测)。
所述高速逆流色谱分配系统为庚烷-甲醇-二氯甲烷或正己烷-乙腈-丙酮，三种组分的体积比为(5-12)∶(9-12)∶(1-5)。
所述高速逆流色谱恒温循环器温度为25-28℃。
所述高速逆流色谱流动相的流速为2-5ml/min。
所述高速逆流色谱达到动态平衡后，将样品溶液泵入色谱系统中，同时在出液端接紫外检测器，在246nm波长处对流出液连续检测，与杯苋甾酮的标准图谱对应，收集液蒸除溶剂，干燥即得产品。
本发明采用大孔树脂吸附，处理量大；通过采用合理的溶剂体系、控制主机转速和流动相流速，可得到高纯度的杯苋甾酮，整个工艺条件温和、损失少。
具体实施方式：
实施例1：
将川牛膝药材粉碎过50目筛，取1kg加入8L的70％乙醇加热提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度1.19(60℃测)，将浓缩液置于D101型大孔吸附树脂柱中，采用湿法装柱，用65％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇得川牛膝总甾酮浸膏；然后采用高速逆流色谱分离川牛膝总甾酮浸膏，将庚烷-甲醇-二氯甲烷(5∶11∶4)系统置于分液漏斗中振摇，放置，分别取上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满固定相，让仪器以900r/min转动，同时将流动相以2.2ml/min的流速泵入，待流动相从出液端流出且两相在色谱中达到平衡后，将样品溶液注入色谱系统中。在246nm波长处对流出液进行连续检测，与杯苋甾酮的标准图谱对应，收集杯苋甾酮流出液，用旋转蒸发仪除去溶剂，干燥，得到0.55g杯苋甾酮，经HPLC法测定其含量为98.6％。
实施例2：
将川牛膝药材粉碎过50目筛，取1kg加入5L的80％乙醇加热提取3次，每次3小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度117(60℃测)，将浓缩液置于AB-8型大孔吸附树脂柱中，采用湿法装柱，用65％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇得川牛膝总甾酮浸膏；然后采用高速逆流色谱分离川牛膝总甾酮浸膏，将正己烷-乙腈-丙酮(7∶10∶5)系统置于分液漏斗中振摇，放置，分别取上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满固定相，让仪器以800r/min转动，同时将流动相以3.0ml/min的流速泵入，待流动相从出液端流出且两相在色谱中达到平衡后，将样品溶液注入色谱系统中。在246nm波长处对流出液进行连续检测，与杯苋甾酮的标准图谱对应，收集杯苋甾酮流出液，用旋转蒸发仪除去溶剂，干燥，得到0.58g杯苋甾酮，经HPLC法测定其含量为98.5％。
实施例3：
将川牛膝药材粉碎过50目筛，取1kg加入7L的50％乙醇加热提取2次，每次1小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度1.18(60℃测)，将浓缩液置于D101型大孔吸附树脂柱中，采用湿法装柱，用75％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇得川牛膝总甾酮浸膏；然后采用高速逆流色谱分离川牛膝总甾酮浸膏，将庚烷-甲醇-二氯甲烷(8∶12∶3)系统置于分液漏斗中振摇，放置，分别取上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满固定相，让仪器以850r/min转动，同时将流动相以5.0ml/min的流速泵入，待流动相从出液端流出且两相在色谱中达到平衡后，将样品溶液注入色谱系统中。在246nm波长处对流出液进行连续检测，与杯苋甾酮的标准图谱对应，收集杯苋甾酮流出液，用旋转蒸发仪除去溶剂，干燥，得到0.63g杯苋甾酮，经HPLC法测定其含量为98.7％。
实施例4：
将川牛膝药材粉碎过50目筛，取1kg加入10L的65％乙醇加热提取3次，每次1小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度1.15(60℃测)，将浓缩液置于D101型大孔吸附树脂柱中，采用湿法装柱，用60％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇得川牛膝总甾酮浸膏；然后采用高速逆流色谱分离川牛膝总甾酮浸膏，将正己烷-乙腈-丙酮(12∶8∶1)系统置于分液漏斗中振摇，放置，分别取上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满固定相，让仪器以900r/min转动，同时将流动相以3.5ml/min的流速泵入，待流动相从出液端流出且两相在色谱中达到平衡后，将样品溶液注入色谱系统中。在246nm波长处对流出液进行连续检测，与杯苋甾酮的标准图谱对应，收集杯苋甾酮流出液，用旋转蒸发仪除去溶剂，干燥，得到0.62g杯苋甾酮，经HPLC法测定其含量为98.4％。
实施例5：
将川牛膝药材粉碎过50目筛，取1kg加入6L的75％乙醇加热提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度1.20(60℃测)，将浓缩液置于AB-8型大孔吸附树脂柱中，采用湿法装柱，用72％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇得川牛膝总甾酮浸膏；然后采用高速逆流色谱分离川牛膝总甾酮浸膏，将庚烷-甲醇-二氯甲烷(10∶9∶2)系统置于分液漏斗中振摇，放置，分别取上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满固定相，让仪器以880r/min转动，同时将流动相以2.5ml/min的流速泵入，待流动相从出液端流出且两相在色谱中达到平衡后，将样品溶液注入色谱系统中。在246nm波长处对流出液进行连续检测，与杯苋甾酮的标准图谱对应，收集杯苋甾酮流出液，用旋转蒸发仪除去溶剂，干燥，得到0.54g杯苋甾酮，经HPLC法测定其含量为98.9％。
实施例6：
将川牛膝药材粉碎过50目筛，取1kg加入8L的95％乙醇加热提取2次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度1.18(60℃测)，将浓缩液置于AB-8型大孔吸附树脂柱中，采用湿法装柱，用80％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇得川牛膝总甾酮浸膏；然后采用高速逆流色谱分离川牛膝总甾酮浸膏，将正己烷-乙腈-丙酮(9∶10∶3)系统置于分液漏斗中振摇，放置，分别取上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满固定相，让仪器以1000r/min转动，同时将流动相以4.4ml/min的流速泵入，待流动相从出液端流出且两相在色谱中达到平衡后，将样品溶液注入色谱系统中。在246nm波长处对流出液进行连续检测，与杯苋甾酮的标准图谱对应，收集杯苋甾酮流出液，用旋转蒸发仪除去溶剂，干燥，得到0.60g杯苋甾酮，经HPLC法测定其含量为98.2％。
Claims (7)
1.一种提取分离高纯度杯苋甾酮的制备工艺，其特征在于：将牛膝药材粉碎过20-50目筛，加入5-10倍量提取溶剂，加热至60-80℃，提取2-3次，每次1-3小时，合并提取液，减压回收乙醇，所得提取物用大孔树脂吸附，先用水洗至色淡，再用60-80％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得到总甾酮浸膏；将总甾酮浸膏采用高速逆流色谱分离制备高纯度杯苋甾酮，所得产品杯苋甾酮含量为98％以上。
2.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于：所述提取溶剂为50-95％的乙醇水溶液。
3.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于：所述大孔树脂柱分离采用湿法装柱，洗脱液减压回收至相对密度1.15-1.20(60℃测)。
4.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于：所述高速逆流色谱分配系统为庚烷-甲醇-二氯甲烷或正己烷-乙腈-丙酮，三种组分的体积比为(5-12)∶(9-12)∶(1-5)。
5.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于：所述高速逆流色谱恒温循环器温度为25-28℃。
6.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于：所述高速逆流色谱流动相的流速为2-5ml/min。
7.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于：所述高速逆流色谱达到动态平衡后，将样品溶液泵入色谱系统中，同时在出液端接紫外检测器，在246nm波长处对流出液连续检测，与杯苋甾酮的标准图谱对应，收集液蒸除溶剂，干燥即得产品。
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