CN102617661A

CN102617661A - 一种分离纯化二苯乙烯苷单体的方法

Info

Publication number: CN102617661A
Application number: CN2011100316918A
Authority: CN
Inventors: 王尉; 王覃; 张经华; 周晓晶; 赵新颖; 刘清珺; 武会娟
Original assignee: Beijing Physichemistry Analysis & Measurment Centre
Current assignee: Beijing Physichemistry Analysis & Measurment Centre
Priority date: 2011-01-28
Filing date: 2011-01-28
Publication date: 2012-08-01

Abstract

本发明提供一种分离纯化二苯乙烯苷单体的方法，其采用高速逆流色谱法，以乙酸乙酯、乙醇和水组成的三元溶剂体系作为分离溶剂系统，从二苯乙烯苷粗品中分离提取二苯乙烯苷单体。本发明的分离纯化方法采用半制备型高速逆流色谱仪对二苯乙烯苷粗品进行分离纯化，并通过三元溶剂体系，利用高速逆流色谱的回收率高和无不可逆吸附的特点，能够大规模的制备二苯乙烯苷单体，制备量能够达到克量级；且制得的二苯乙烯苷单体纯度高，达99％以上，以该高纯度的二苯乙烯苷单体为原料，能够制得二苯乙烯苷单体标准样品。本发明方法能够适合于不同的二苯乙烯苷粗品，具有技术工艺先进、分离效率高、回收率好、产品纯度高、制备量较大等优点。

Description

一种分离纯化二苯乙烯苷单体的方法

技术领域

本发明涉及一种分离纯化二苯乙烯苷单体的方法，具体地说，涉及一种用高速逆流色谱法分离纯化二苯乙烯苷单体的方法。

背景技术

现代医学表明，何首乌具有增强免疫功能、抗氧化作用，能延缓大脑衰老、提高DNA修复功能、延长寿命、降低胆固醇、改善脂肪代谢等多项功能。何首乌的主要成分有羟基蒽醌类化合物(主要为大黄素、大黄酚、大黄酸等葡萄糖苷，均为二苯代乙烯化合物)、醌类化合物、二苯乙烯苷类化合物、酰胺类化合物、色原酮类化合物、卵磷脂、以及微量元素钙、铁、锌、锰、铜等。其中，二苯乙烯苷是何首乌中特有的生物活性成分，它具有良好的水溶性，且具有多项生理功能，如：抗氧化清除自由基、抗肿瘤、降低胆固醇、抑制动脉粥样硬化、保护肝脏、具有血管舒张作用、防治老年痴呆、提高记忆等功效。

为了深入研究何首乌中二苯乙烯苷的药理活性，二苯乙烯苷单体成分制备的研究也得到了相应的重视。如专利CN101195646A采用乙醇提取，乙酸乙酯反复萃取，得到了含量大于55％的二苯乙烯苷；《积雪草苷、二苯乙烯苷提取纯化工艺及何首乌化学成分的研究》(天津大学2006硕士论文)，先后使用D101大孔吸附树脂和硅胶柱纯化，最终得到纯度为92.2％的二苯乙烯苷样品；《制备色谱纯化何首鸟活性成分二苯乙烯苷》(中国生物药物创新研究论坛会议论文)，采用AB-8大孔吸附树脂进行初步分离，最后采用制备型高效液相色谱获得了纯度大于97％的二苯乙烯苷样品，该产物再次循环制备即可以得到纯度大于99％的二苯乙烯苷单体。二苯乙烯苷的化学结构如下所示：

现有的二苯乙烯苷单体成分的制备分离方法，大多采用简单的溶剂萃取和柱层析的分离纯化手段，其应用十分广泛，具有样品处理量大等优点，但上述方法的缺点是操作步骤繁琐、样品回收率低、所得样品纯度不高等。此外，还有采用高效液相色谱分离方法得到纯度较高的二苯乙烯苷单体成分，但是该方法仪器成本昂贵、溶剂消耗量大，制约了该技术的发展。

高速逆流色谱(HSCCC)作为二十世纪七八十年代间发展起来的一种连续高效的液-液分配色谱分离技术，结合了液液萃取和分配色谱的优点，是一种无需任何固态载体或支撑的液-液分配色谱技术。HSCCC通过行星式运转过程中产生的离心力，使两种互不相溶的溶剂在高速旋转的螺旋管中单向分布，其中一相作固定相，由恒流泵输送载有样品的流动相穿过固定相，利用样品在两相中分配系数的不同实现分离。HSCCC作为一种常用的分离纯化技术，具有无不可逆吸附、回收率高、操作简单快捷、进样量大、分离效率高等诸多优点，十分适合于天然植物提取物的分离和纯化，以及高纯度标准样品的制备。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离纯化二苯乙烯苷单体的方法，该方法能够得到纯度达99％以上的二苯乙烯苷单体纯品，二苯乙烯苷单体的生产可达克量级。

为了实现上述目的，本发明的分离纯化二苯乙烯苷的方法，采用高速逆流色谱法，以乙酸乙酯、乙醇和水组成的三元溶剂体系作为分离溶剂系统，从二苯乙烯苷粗品中分离提取二苯乙烯苷单体。

其中，所述三元溶剂体系中乙酸乙酯、乙醇和水的体积比为10～50∶1∶10～50。

具体地说，本发明的分离纯化二苯乙烯苷的方法，包括以下步骤：

1)将乙酸乙酯、乙醇和水混合置于分液漏斗中，充分摇匀后静置分层，取上层溶液为固定相、下层溶液为流动相，备用；将二苯乙烯苷粗品溶于下层溶液中，备用；

2)在高速逆流色谱仪的色谱柱中充满所述固定相，然后使主机转动，再将所述流动相泵入色谱柱；待体系平衡完毕后，由进样阀进入二苯乙烯苷粗品，然后根据检测器图谱接收目标组分，经浓缩、冷冻干燥后，制得二苯乙烯苷单体纯品；

本发明中的二苯乙烯苷粗品既可以通过市售得到，如购自西安三江生物工程有限公司的何首乌提取物；也可以根据现有方法制备得到，如根据CN101195646A中的以何首乌为原料提取二苯乙烯苷的方法。所述二苯乙烯苷粗品中二苯乙烯苷的纯度为50％。

步骤2)中所述二苯乙烯苷粗品的上样量为200～400mg。

所述高速逆流色谱仪的流速为2～4mL/min、转速为700～1000r/min、分离温度为20～30℃。所述高速逆流色谱仪优选为半制备型。

将上述制得的二苯乙烯苷单体用高效液相色谱进行分析检测，所述高效液相色谱的色谱条件为：WondaSil C18色谱柱5μm，250mm×4.6mm i.d.；以体积比乙腈∶水＝22∶78的混合溶剂作为流动相；流速1mL/min；柱温30℃；检测波长320nm；分析时间：20min。结果表明，本发明的分离纯化方法能够制得高纯度的二苯乙烯苷单体，纯度可达99％以上。

此外，可以将本发明方法制得的二苯乙烯苷单体纯品作为原料，制备二苯乙烯苷单体标准样品。即，将上述二苯乙烯苷单体纯品用棕色瓶进行分装，编号后置于2～8℃温度下密封保存。

本发明的优点和有益效果在于，本发明的分离纯化方法采用半制备型高速逆流色谱仪对二苯乙烯苷粗品进行分离纯化，并通过三元溶剂体系，利用高速逆流色谱的回收率高和无不可逆吸附的特点，能够大规模的制备二苯乙烯苷单体，制备量能够达到克量级；且制得的二苯乙烯苷单体纯度高，达99％以上，以该高纯度的二苯乙烯苷单体为原料，能够制得二苯乙烯苷单体标准样品。本发明方法能够适合于不同的二苯乙烯苷粗品，具有技术工艺先进、分离效率高、回收率好、产品纯度高、制备量较大等优点。

附图说明

图1为经本发明方法分离纯化前，二苯乙烯苷粗品的高效液相色谱图。

图2为经本发明方法分离纯化后，二苯乙烯苷单体的高效液相色谱图。

图3为本发明实施例1的高速逆流色谱的色谱图。

图4为本发明实施例2的高速逆流色谱的色谱图。

图5为本发明实施例3的高速逆流色谱的色谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中的二苯乙烯苷粗品均为购自西安三江生物工程有限公司的何首乌提取物，经HPLC检测，上述二苯乙烯苷粗品中二苯乙烯苷的纯度为50％。

实施例1

(1)将乙酸乙酯、乙醇和水按体积比15∶1∶15混合，置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上层溶液为固定相、下层溶液为流动相，备用；将300mg二苯乙烯苷粗品溶于20mL下层溶液中，备用；

(2)使用半制备型高速逆流色谱仪，以上述乙酸乙酯、乙醇和水组成的三元溶剂体系作为分离溶剂系统；在高速逆流色谱仪的色谱柱中充满固定相，然后调节转速800r/min使主机转动，恒温水浴的温度设定为20℃，紫外检测器检测波长设定为280nm，再将流动相以2.5mL/min泵入色谱柱；待体系平衡完毕后，由进样阀进入二苯乙烯苷粗品(180min时第二次进样)，根据检测器图谱接收目标组分(参见图3)，然后经浓缩、冷冻干燥后，制得二苯乙烯苷单体纯品，纯度为99.31％。

对分离纯化前的二苯乙烯苷粗品和制得的二苯乙烯苷单体纯品用高效液相色谱分析，所述高效液相色谱的色谱条件如下：WondaSilC18色谱柱(5μm，250×4.6mm i.d.)，乙腈∶水＝22∶78作为流动相，流速1mL/min，柱温：30℃，检测波长：320nm，分析时间：20min，结果分别如图1和图2所示。

此外，将上述纯品用Bruker 500MHz超导核磁共振谱仪进行¹H-NMR及¹³C-NMR分析，其氘代溶剂为二甲基亚砜，结果如表1所示。

表1二苯乙烯苷的NMR检测数据

实施例2

(1)将乙酸乙酯、乙醇和水按体积比35∶1∶35混合，置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上层溶液为固定相、下层溶液为流动相，备用；将200mg二苯乙烯苷粗品溶于10mL下层溶液中，备用；

(2)使用半制备型高速逆流色谱仪，以上述乙酸乙酯、乙醇和水组成的三元溶剂体系作为分离溶剂系统；在高速逆流色谱仪的色谱柱中充满固定相，然后调节转速900r/min使主机转动，恒温水浴的温度设定为25℃，紫外检测器检测波长设定为280nm，再将流动相以2mL/min泵入色谱柱；待体系平衡完毕后，由进样阀进入二苯乙烯苷粗品(270min时第二次进样)，根据检测器图谱接收目标组分(参见图4)，然后经浓缩、冷冻干燥后，制得二苯乙烯苷单体纯品，纯度为99.26％。

实施例3

(1)将乙酸乙酯、乙醇和水按体积比50∶1∶50混合，置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上层溶液为固定相、下层溶液为流动相，备用；将400mg二苯乙烯苷粗品溶于20mL下层溶液中，制得粗样品，备用；

(2)使用半制备型高速逆流色谱仪，以上述乙酸乙酯、乙醇和水组成的三元溶剂体系作为分离溶剂系统；在高速逆流色谱仪的色谱柱中充满固定相，然后调节转速950r/min使主机转动，恒温水浴的温度设定为25℃，紫外检测器检测波长设定为280nm，再将流动相以3mL/min泵入色谱柱；待体系平衡完毕后，由进样阀进入二苯乙烯苷粗品，根据检测器图谱接收目标组分(参见图5)，然后经浓缩、冷冻干燥后，制得二苯乙烯苷单体纯品，纯度为99.20％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种分离纯化二苯乙烯苷单体的方法，其特征在于，采用高速逆流色谱法，以乙酸乙酯、乙醇和水组成的三元溶剂体系作为分离溶剂系统，从二苯乙烯苷粗品中分离提取二苯乙烯苷单体。

2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述三元溶剂体系中乙酸乙酯、乙醇和水的体积比为10～50∶1∶10～50。

3.根据权利要求1或2所述的分离纯化方法，其特征在于，其包括以下步骤：

2)在高速逆流色谱仪的色谱柱中充满所述固定相，然后使主机转动，再将所述流动相泵入色谱柱；待体系平衡完毕后，由进样阀进入二苯乙烯苷粗品，然后根据检测器图谱接收目标组分，经浓缩、冷冻干燥后，制得二苯乙烯苷单体。

4.根据权利要求3所述的分离提取方法，其特征在于，所述二苯乙烯苷粗品中二苯乙烯苷的纯度为50％。

5.根据权利要求3所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)中所述二苯乙烯苷粗品的上样量为200～400mg。

6.根据权利要求3所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)中所述高速逆流色谱仪的流速为2～4mL/min、转速为700～1000r/min、分离温度为20～30℃。

7.根据权利要求3所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)中所述高速逆流色谱仪是半制备型。