CN102631664A

CN102631664A - 3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸的应用

Info

Publication number: CN102631664A
Application number: CN2011100765550A
Authority: CN
Inventors: 饶敏; 罗敏玉; 阮丽军; 朱丽; 阮林高; 夏兴; 戈梅; 李秋爽; 杨天
Original assignee: Shanghai Laiyi Biomedical Research And Development Center LLC
Current assignee: Shanghai Laiyi Biomedical Research And Development Center LLC
Priority date: 2011-01-28
Filing date: 2011-03-29
Publication date: 2012-08-15
Anticipated expiration: 2031-03-29
Also published as: CN102631664B

Abstract

本发明涉及3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸的应用，该化合物由小链霉菌CGMCC No.4027发酵制得，对氨肽酶具有抑制作用，用于制备氨肽酶抑制剂类药物。

Description

3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸的应用

技术领域

本发明涉及3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸的应用。

背景技术

上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司从采集自自然环境中的土壤样品中进行微生物分离，得到了一株新型小链霉菌(Streptomyces parvus)，且在其次级代谢产物中分离出一种新的化合物(专利申请号为201010554703.0)，3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸(3-amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-valyl-isoleucine)具有如下结构：

经研究该化合物能用于制备抑制革兰氏阳性菌的药物，尤其是抑制藤黄微球菌或枯草芽孢杆菌的药物。小链霉菌(Streptomyces parvus)于2010年7月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心正式保藏，保藏号为：CGMCC No.4027，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

发明内容

本发明的目的在于提供3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸(3-amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-valyl-isoleucine)的新的应用。

本申请的发明人经过广泛而深入的研究，在小链霉菌CGMCC No.4027的次级代谢产物中分离出化合物3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸(3-amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-valyl-isoleucine)，发现该化合物具有抑制氨肽酶的作用，可用作氨肽酶抑制剂。

根据本发明，所述氨肽酶抑制剂为氨肽酶N抑制剂。

根据本发明，所述氨肽酶抑制剂用于制备治疗肿瘤的药物。

根据本发明，所述氨肽酶抑制剂用于制备辅助治疗肿瘤的药物。

根据本发明，所述氨肽酶抑制剂用于制备免疫增强药物。

本发明还提供一种氨肽酶抑制剂药物组合物，含有治疗有效量的有效成分和药学上可接受的载体或赋形剂，所述有效成分为3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸。进一步地，所述氨肽酶抑制剂为氨肽酶N抑制剂。

本发明提供的氨肽酶抑制剂药物组合物的应用，用于制备治疗肿瘤的药物、或用于制备辅助治疗肿瘤的药物、或用于制备免疫增强药物。

本发明的3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸(3-amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-valyl-isoleucine)，用于制备氨肽酶抑制剂类药物，有望通过抑制氨肽酶N(APN)的活性，控制肿瘤的侵袭和转移以及血管生成，并提高机体的免疫力。

附图说明

图1为HPLC分析图。

图2为正离子高分辨质谱图。

图3为正离子二级质谱图。

图4为氢谱谱图。

图5为碳谱谱图。

图6为H-H COSY谱图。

图7为HMBC谱谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

本发明所用的菌种为小链霉菌(Streptomyces parvus)，已于2010年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.4027。

以下实施例中所述斜面培养基、所述种子培养基、所述发酵培养基的配方(w/v)如下：

斜面培养基：高氏一号培养基。

种子培养基：葡萄糖(2％)、甘油(2％)、可溶性淀粉(6％)、黄豆饼粉(5％)、磷酸二氢钾(0.02％)、七水合硫酸镁(0.04％)，其余为水。初始pH为7.3-7.5。

发酵培养基：黄豆饼粉(2.2％)、糊精(3.6％)、葡萄糖(0.8％)、六水合硫酸亚铁铵(Fe(NH₄)₂(SO₄)₂6H₂O)(0.1％)，其余为水。初始pH为7.3-7.5。

实施例1化合物的制备

1.1发酵

将菌株CGMCC No.4027从冻干管中接种到高氏一号斜面培养基上，于28℃-30℃培养四天后，转入装有经121℃高压灭菌30min的种子培养基的三角瓶中，置于摇床进行种子培养，其中，摇床转速为200-230rpm，温度为28-30℃，培养时间为46-50h。种子培养结束后再转入装有已灭菌的发酵培养基的5L玻璃发酵罐内。转种量为5％，在发酵罐内进行发酵，搅拌转速为400-500rpm，温度控制在28-30℃，通气量为7-9L/min，培养4-6天后结束发酵。

1.2分离提取

将经发酵后得到的发酵液置于4℃冰箱中过夜，沉淀蛋白。之后将发酵液于4℃、4000rpm离心30min。弃下层沉淀，上清液用大孔吸附树脂吸附，大孔吸附树脂可以采用XAD-1600，SP850，或JD-1，于静态或动态进行吸附皆可。吸附后用两倍柱体积的纯水，10％，30％，50％，75％，100％乙醇依次洗脱，粗品集中在50％乙醇洗脱液中。粗品液用旋转蒸发仪于40℃减压浓缩，再采用中压系统进行粗制。条件如下：粗品浓缩液用30％乙腈稀释10倍，12000rpm离心10min，上清为进样样品。上样量为15-25ml，采用中压柱(型号：Biotage Si 25+M 1603-2，USA)进行分离，柱温自然，流动相为30％乙腈500ml，等度洗脱。流速约3-5ml/min，样品集中于200-400ml的洗脱液中。洗脱液用旋转蒸发仪于40℃减压浓缩后采用DIONEXP680双元泵制备液相系统或制备型Agilent 1100 DAD单泵液相系统进行制备，收集到的制备液于40℃旋蒸浓缩至干获得目标化合物纯品，得到的纯品为淡黄色粉末，易溶于甲醇，乙醇，水，乙腈。不溶于氯仿。液相制备条件如下：

制备柱：YMC CombiPreP ODS-A 5μm 20×250mm

柱温：自然检测器：DAD(210nm，223nm，254nm，280nm)

流动相(体积比)：25％乙腈+75％含0.1％TFA的水溶液

流速：8ml/min 进样量：60-700μl

等度洗脱

实施例2化合物的结构鉴定

将经制备液相系统制备收集的纯品上分析型Agilent 1100 DAD双元泵液相系统进行分析，条件如下：

分析用柱：菲罗门C18柱5μm 4.6×250mm

柱温：30℃ 检测器：VWD 210nm

流动相(体积比)：25％乙腈+75％含0.1％TFA的水溶液

流速：1ml/min 进样量：5μl

等度洗脱

如图1所示，目标化合物在此条件下出峰保留时间在8.6min左右，除去3min左右的两个溶剂峰，纯度＞95％。

经高分辨质谱检测(图谱如图2所示)，目标化合物精确分子量为407.2522，分子式为C₂₁H₃₃N₃O₅。进一步，经二维质谱(图3)检测，结合目标化合物的氢谱(图4)、碳谱(图5)及COSY谱(图6)、HMBC谱(图7)进行结构分析，核磁数据如表1所示。

表1 NMR核磁数据

对其结构进行分析，确定了所有碳原子和氢原子的归属，得到了小链霉菌的次级代谢产物的结构如下：

实施例3化合物的活性分析

本实施例参照文献J.Microbiol.Biotechnol.，1995，5(1)：36-40报道方法对实施例1～2得到的化合物3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸(3-amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-valyl-isoleucine)进行活性分析。Bestatin是典型的APN抑制剂，作为白血病治疗药物已经上市多年，在本实施例中作为对照组。具体实验步骤为：在96孔板中加入底物(L-亮氨酰对硝基苯胺)100μl(1mg/ml in a0.1M Tris-HCl，pH 7.0)，不同浓度(0.86，1.71，2.57，4.29，8.57μg/ml)梯度的待测化合物20μl(0.1M Tris-HCl，pH 7.0)，37℃，3min反应，再加入氨肽酶N(L5006-25UN，Sigma)溶液20μl(2mU，0.1M Tris-HCl，pH 7.0)，37℃，30min反应，后于405nm波长处测定吸收值。

按照如下公式计算抑制率：

抑制率＝(A-B)/A*100％

其中A为不含抑制剂的反应体系测得的吸收度，B为含有不同浓度待测化合物的反应体系测得的吸收度，用0.1M Tris-HCl，pH 7.0的缓冲液调零，结果如表2所示，为5个浓度下对照品与本发明的化合物对氨肽酶N的抑制率。

表2氨肽酶N的抑制率

化合物浓度(μg/ml)	0.86	1.71	2.57	4.29	8.57
						对照组抑制率(％)	41.61	44.37	47.13	52.65	66.45
实验组抑制率(％)	42.02	51.40	65.14	70.79	77.91

从上表可以看出，本发明从小链霉菌CGMCC No.4027的次级代谢产物中分离出的化合物3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸(3-amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-valyl-isoleucine)具有氨肽酶N抑制活性，且在同浓度下对氨肽酶N的抑制活性比Bestatin好。

氨肽酶N(APN)是一种含锌离子的膜结合型外肽酶，在肿瘤细胞表面有大量的APN表达。对原发肿瘤和继发肿瘤的生长，和血管生成密切相关，甚至对肿瘤细胞的增殖分化过程也起促进作用。对恶性肿瘤细胞的侵袭和转移过程起重要作用，可使细胞基质(ECM)的主要成分降解，促进肿瘤细胞的生长和转移，另外，它还能够表达于抗原递呈细胞表面，降解多种免疫活性物质，使机体免疫力下降，削弱巨噬细胞和NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力。因此，通过抑制APN的活性可以对肿瘤的侵袭和转移以及血管生成进行干预，同时增强粒细胞的趋化性，提高机体的免疫力。APN已经成为抗肿瘤抗病毒药物发挥作用的一个重要靶点，开发高效低毒、高选择性的APN抑制剂，可用于治疗肿瘤。Bestatin是从橄榄网状链霉菌(Streptomyces olivoreticuli)的培养液中发现的具有氨肽酶抑制活性的化合物，作为APN抑制剂类抗肿瘤药物于1987年上市，对急性白血病、恶性黑色素瘤等有显著疗效。

由本实施例的实验结果可知，与Bestatin相比，化合物3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸对氨肽酶N的抑制活性更好，能作为氨肽酶抑制剂，用于制备治疗肿瘤、或辅助治疗肿瘤、或增强免疫药物。进一步地，本领域技术人员可知，这些药物中除了包含治疗有效量的3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸外，还能包含药学上可接受的载体或赋形剂、如溶剂、稀释剂等，3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，从而形成药物制剂，用于治疗肿瘤、或辅助治疗肿瘤、或增强免疫。

Claims

1.3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸在制备氨肽酶抑制剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氨肽酶抑制剂为氨肽酶N抑制剂。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述氨肽酶抑制剂用于制备治疗肿瘤的药物。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述氨肽酶抑制剂用于制备辅助治疗肿瘤的药物。

5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述氨肽酶抑制剂用于制备免疫增强药物。

6.一种氨肽酶抑制剂药物组合物，其特征在于，含有治疗有效量的有效成分和药学上可接受的载体或赋形剂，所述有效成分为3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸。

7.如权利要求6所述的氨肽酶抑制剂药物组合物，其特征在于，所述氨肽酶抑制剂为氨肽酶N抑制剂。

8.如权利要求6或7所述的氨肽酶抑制剂药物组合物的应用，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物。

9.如权利要求6或7所述的氨肽酶抑制剂药物组合物的应用，其特征在于，用于制备辅助治疗肿瘤的药物。

10.如权利要求6或7所述的氨肽酶抑制剂药物组合物的应用，其特征在于，用于制备免疫增强药物。