CN115287236A - 一类昆虫共生放线菌来源的生物碱化合物的制备方法和用途 - Google Patents

一类昆虫共生放线菌来源的生物碱化合物的制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物工程技术领域，具体涉及从黑翅土白蚁体表链霉菌(Streptomyces tanashiensis)BYF112的液体发酵物中提取的一类生物碱化合物及其制备方法和应用。具体而言，本发明公开4种新天然生物碱类化合物，其结构式为：
Figure DDA0003797902770000011
其中化合物1为新天然产物，2‑4为新化合物。该生物碱类化合物能通过保藏号为CCTCC M 2019474的链霉菌(Streptomyces tanashiensis)BYF‑112制备而得。该生物碱类化合物1和2可作为除草剂，具体表现为可以抑制稗草根的生长；化合物1和2对癌细胞有一定的毒活性；化合物1可作为抗菌药，具体表现可以抑制四联球菌、金黄色葡萄球菌以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长。

Description

一类昆虫共生放线菌来源的生物碱化合物的制备方法和用途
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及从黑翅土白蚁体表链霉菌(Streptomycestanashiensis)BYF-112液体发酵物中提取一类新天然生物碱的制法和应用。
背景技术
2020年3月美国国家癌症研究所天然产物部的David J.Newman主任讨论了1981-2019年间天然产物在新药研发中的贡献：发现已经批准的1394个小分子药物中，天然产物直接来源的占比5.1％，植物药占比1％，天然产物衍生物药占比27.5％(Newman D.J.,Cragg G.M.Journal of Natural Products,2020,83(3):770-803.1)。由此可见，天然产物是新药研究的重要来源。值得注意的是，相当数量的天然产物药物或者其先导物实际上是微生物或者与其分离宿主相互作用产生的，因此微生物天然产物研究领域值得大力拓展。
当前人们主要关注来自土壤，植物以及河流、海洋源微生物的代谢产物，而关于特境微生物(昆虫共生菌)的天然产物越来越受到重视。近年来研究发现昆虫共生菌特殊生境中的链霉菌具有代谢产物特殊、化学结构新颖、生物活性强等作为药用资源的巨大潜力(Chevrette M.G.,Carlson C.M.,Ortega H.E.,et al.Nature Communications,2019,10(1).https://doi.org/10.1038/s41467-019-09248-0.)。本研究以黑翅土白蚁共生菌Streptomyces tanashiensis为研究对象分离到1个新天然产物，3个新化合物，结果为丰富以昆虫共生菌为来源获得新活性天然产物，提供了理论依据。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种黑翅土白蚁共生链霉菌(Streptomycestanashiensis)BYF-112及其产生的具有抗癌活性化合物的制备与用途-作为一种抗癌先导化合物。
为了解决上述技术问题，本发明提供链霉菌产生的具有抗癌活性化合物，其结构式为：
Figure BDA0003797902750000011
本发明还同时提供了一株具有较强抗癌活性的链霉菌BYF-112，保藏号为CCTCC M2019474，保藏日期为2019年06月20日，保藏地址为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
本发明还同时提供了上述新天然生物碱的抗菌活性代谢产物制备方法，包括如下步骤：
1)、保藏号为CCTCC M 2019474的链霉菌BYF-112接种到高氏培养基上，于摇床上，在160～200rpm(较佳为180rpm)、27.5～28.5℃(较佳为28℃)条件下培养2～3天作为种子液；
2)、将种子液接种于YMS培养基中，在160～200rpm(较佳为180rpm)27.5～28.5℃(较佳为28℃)条件下发酵6.5～7.5天(较佳为7天)；
一般而言，每10mL种子液接种于350～450mL(较佳为400mL的YMS培养基中)；
3)、将步骤2)所得发酵液过滤(经两层纱布过滤)，滤液用乙酸乙酯萃取(共萃取3次，每次乙酸乙酯的用量＝发酵液的体积量)，真空浓缩干燥(于0.1个负压的真空度，45℃干燥30-50分钟)，得浸膏(呈黑色)；
4)、将步骤3)所得浸膏进行硅胶柱层析分段，采用二氯甲烷/甲醇进行梯度洗脱，所述二氯甲烷与甲醇的体积比依次为100:0、100:1、100:2、100:4、100:8；从而分别得到5个洗脱部分F1-F5；
5)、将步骤4)所得组分F3干燥处理后，重新上硅胶柱，有机溶剂梯度洗脱后，得到组分F3-1、F3-2、F3-3。F3-1和F3-2经凝胶LH-20柱进一步分离，分别得到化合物2和3。
6)、将步骤4)所得组分F4干燥处理后在二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中析出固体物质，得到化合物1。
7)、将步骤4)组分F5经过凝胶色谱LH-20分离，在甲醇溶剂中，析出化合物4单体。
进一步的，步骤(1)中，将链霉菌(Streptomyces tanashiensis)BYF-112经YMS固体培养基活化后接种于YMS液体培养基中发酵培养6.5～7.5d，温度为27.5～28.5℃(较佳为28℃)，转速为160～200rpm(较佳为180rpm)。
本发明所使用的YMS液体培养基为，10.0g可溶性淀粉，1.0g KNO3,1.5g酵母提取物，用蒸馏水配制1L，pH 7.0～8.0。
本发明还同时提供了上述次级代谢产物的活性应用，所述化合物可作为制备抗肿瘤、抗菌、除草的药物。
上述化合物可作为抑制黑色素细胞瘤、胃癌、乳腺癌和卵巢癌细胞生长、抑制金黄色葡萄球菌生长、抑制稗草根生长的药物。
本发明所述链霉菌，链霉菌的分类学命名为Streptomyces tanashiensis BYF-112，分离于中国江苏江阴郊区，该菌株于2019年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2019474。保藏单位地址为中国武汉。
本发明具有如下有益效果：
1.本发明的链霉菌BYF-112次级代谢产物1是新天然产物，2-4是新化合物。化合物1，可以作为具有抑制人黑色素细胞瘤、胃癌、乳腺癌和卵巢癌细胞生长、抑制四联球菌，金黄色葡萄球菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长、以及抑制稗草根生长的先导化合物；化合物2可以作为抑制卵巢癌细胞、胃癌生长的先导化合物。
2.本发明的链霉菌BYF-112次级代谢产物可以利用微生物进行液体发酵生产，工艺简便，周期短，成本低，来源有保证。
3.本发明利用生物法合成链霉菌BYF112次级代谢产物对环境无污染。
保藏信息
保藏时间：2019年6月20日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
保藏编号：CCTCC M 2019474；
保藏单位地址：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学；
分类命名：Streptomyces tanashiensis BYF-112。
附图说明
图1为本发明实施例提供的4种新天然生物碱类化合物的结构式。
图2为本发明实施例提供的化合物2-amino-8-hydroxymethyl-3H-phenoxazin-3-one(1)的1H NMR(Agilent DD2，DMSO-d6)光谱图。
图3为本发明实施例提供的化合物2-amino-8-hydroxymethyl-3H-phenoxazin-3-one(1)的13C NMR(Agilent DD2，DMSO-d6)光谱图。
图4为本发明实施例提供的化合物2-amino-8-hydroxymethyl-3H-phenoxazin-3-one(1)的HR-ESI-MS图。
图5为本发明实施例提供的化合物exfoliazone B(2)的1H NMR(Agilent DD2，DMSO-d6)光谱图。
图6为本发明实施例提供的化合物exfoliazone B(2)的13C NMR(Agilent DD2，DMSO-d6)光谱图。
图7为本发明实施例提供的化合物exfoliazone B(2)的DEPT(Agilent DD2，DMSO-d6)光谱图。
图8为本发明实施例提供的化合物exfoliazone B(2)的COSY(Agilent DD2，DMSO-d6)光谱图。
图9为本发明实施例提供的化合物exfoliazone B(2)的HMQC(Agilent DD2，DMSO-d6)光谱图。
图10为本发明实施例提供的化合物exfoliazone B(2)的HMBC(Agilent DD2，DMSO-d6)光谱图。
图11为本发明实施例提供的化合物exfoliazone B(2)的HR-ESI-MS图。
图12为本发明实施例提供的化合物exfoliazone C(3)的1H NMR(Agilent DD2，DMSO-d6)光谱图。
图13为本发明实施例提供的化合物exfoliazone C(3)的13C NMR(Agilent DD2，DMSO-d6)光谱图。
图14为本发明实施例提供的化合物exfoliazone C(3)的DEPT(Agilent DD2，DMSO-d6)光谱图。
图15为本发明实施例提供的化合物exfoliazone C(3)的COSY(Agilent DD2，DMSO-d6)光谱图。
图16为本发明实施例提供的化合物exfoliazone C(3)的HSQC(Agilent DD2，DMSO-d6)光谱图。
图17为本发明实施例提供的化合物exfoliazone C(3)的HMBC(Agilent DD2，DMSO-d6)光谱图。
图18为本发明实施例提供的化合物exfoliazone C(3)的HR-ESI-MS图。
图19为本发明实施例提供的化合物exfoliazoneglycoside(4)的1H NMR(AgilentDD2，DMSO-d6)光谱图。
图20为本发明实施例提供的化合物exfoliazoneglycoside(4)的13C NMR(AgilentDD2，DMSO-d6)光谱图。
图21为本发明实施例提供的化合物exfoliazoneglycoside(4)的DEPT(AgilentDD2，DMSO-d6)光谱图。
图22为本发明实施例提供的化合物exfoliazoneglycoside(4)的COSY(AgilentDD2，DMSO-d6)光谱图。
图23为本发明实施例提供的化合物exfoliazoneglycoside(4)的HMQC(AgilentDD2，DMSO-d6)光谱图。
图24为本发明实施例提供的化合物exfoliazoneglycoside(4)的HMBC(AgilentDD2，DMSO-d6)光谱图。
图25为本发明实施例提供的化合物exfoliazoneglycoside(4)的HR-ESI-MS图。
图26为本发明实施例提供的化合物对稗草根的生长抑制图。
图27为本发明实施例提供的化合物对稗草根的生长抑制效率图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例进一步说明，但本专利的保护内容不仅限于此。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。
实施例1：链霉菌(Streptomyces tanashiensis)BYF-112分离与纯化
链霉菌BYF112的分离：
分离前让黑翅土白蚁饥饿24h，用无菌镊子分别取出年轻工蚁(20头)置于灭菌离心管中。加入1mL pH7.4的无菌PBS缓冲液，震荡得到漂洗液。用无菌水对震荡液梯度稀释成10-1、10-2、10-3，分别取各梯度稀释液0.1mL涂布于M3培养基平板上，28℃恒温箱中培养4天。待菌落长出后，从组织块菌落边缘挑取少量菌丝，再次转接高氏培养基平板上，经纯化得到单菌落，经形态学与分子生物学鉴定为田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)BYF112。
高氏培养基：20g可溶性性淀粉,0.5g KNO3,0.5g K2HPO4·3H2O,0.5g MgSO4·7H2O,0.5g NaCl,0.01g FeSO4·7H2O，用蒸馏水配制1L，pH 7.0～8.0，1.1个大气压，121℃下灭菌20min(为常规灭菌)。
上述链霉菌(Streptomyces tanashiensis)BYF-112进行了保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏名称为：Streptomyces tanashiensis BYF-112，保藏地址：中国武汉，武汉大学；保藏日期：2019.06.20；保藏号为CCTCC M 2019474。
上述链霉菌(Streptomyces tanashiensis)BYF-112可接种至高氏斜面试管保存备用。
实施例2：昆虫共生菌--田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)BYF-112的液体发酵
将新鲜的链霉菌(Streptomyces tanashiensis)BYF-112的菌丝体块(约2～3g)接种到250mL锥形瓶中，每瓶含有150mL的高氏培养基，接种10～15瓶于摇床上，在180rpm、28℃条件下培养2～3天作为种子液，然后将10mL种子液接种于装有400mL的YMS液体培养基的1000mL锥形瓶中，共接种39瓶，在180rpm、28℃条件下发酵7天。
备注说明：田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)BYF-112经常规的高氏培养基活化后，即可得新鲜的田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)BYF-112。
所述YMS培养基的配方为：10.0g可溶性淀粉，1.0g KNO3,1.5g酵母提取物，用蒸馏水配制1L，1.1个大气压，121℃下灭菌20min(为常规灭菌)。
实施例3、链霉菌BYF-112次级代谢产物的提取与分离
将实施例2制备而得的15.6L发酵液经两层纱布过滤，滤液用乙酸乙酯萃取3次(乙酸乙酯每次的用量为50L)，所得的萃取液真空浓缩干燥(于0.1个负压的真空度，45℃干燥30-50分钟)得黑色浸膏。发酵结束后，将培养液用4层纱布过滤，所得发酵液用乙酸乙酯萃取等体积萃取3遍，减压浓缩乙酸乙酯部分，获得YMS培养基发酵的得BYF112粗浸膏，用少量甲醇溶解粗浸膏，并与100-200目的干燥硅胶粉按照质量1:1进行拌样，混合样品干燥后，按照样品质量:硅胶粉质量为1:12的比例，进行硅胶装柱；以二氯甲烷：甲醇(体积比：100:0，100:1，100:2，100:4，100:8，100:16)进行硅胶柱梯度洗脱，200mL/馏分减压浓缩干后，用少量二氯甲烷/甲醇混合溶剂溶解，并进行薄层层析(TLC)点板，经紫外灯254nm和365nm，以及25％硫酸乙醇显色分析，合并相同馏分，共得5个组分F1-F5。
所得组分F3重新上硅胶柱，有机溶剂梯度洗脱后，得到组分F3-1、F3-2、F3-3,其中F3-1和F3-2经凝胶LH-20柱进一步分离，分别得到化合物2和3；组分F4在二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，析出固体物质，得到化合物1；组分F5经过凝胶色谱LH-20分离，在甲醇溶剂中，析出化合物4单体，综合利用NMR(COSY、HSQC、DEPT135、HMBC)、高分辨电喷雾质谱(HR-ESI-MS)及相关数据库检索和文献比对，对分离获得的化合物进行结构解析鉴定。其结构式为：
Figure BDA0003797902750000061
实施例4田无链霉菌BYF-112代谢产物的结构解析
化合物1为棕色固体化合物，高分辨质谱HR-ESI-MS在m/z[M+H]+243.0757给出离子峰(如图4所示)，推测化合物的分子式为C13H10N2O3。对该化合物的1H NMR(如图2所示)和13C NMR(如图3所示)分析发现该化合物与化学合成化合物2-amino-8-hydroxymethyl-3H-phenoxazin-3-one一致，确定该是一个新的天然产物。
化合物2为黑红色固体粉末，高分辨质谱HR-ESI-MS在m/z[M+H]+285.0874给出离子峰(如图11所示)，推测化合物的分子式为C15H12N2O4。对该化合物的1H-NMR(如图5所示)和13C-NMR谱图(如图6所示)分析发现与化合物exfoliazone具有相同的母核结构，唯一区别是化合物2中存在一个同氨基相连的乙醛基。通过二维DEPT 135(如图7)、COSY(如图8所示)、HSQC(如图9所示)、和HMBC(如图10所示)的谱图分析，最终确定化合物的结构如式(1)中所示。化合物2命名为exfoliazone B(2)，该化合物的1H和13C-NMR(DMSO-d6)归属如表1所示。
表1化合物2的1H和13C NMR数据
Figure BDA0003797902750000071
化合物3为红棕色粉末，高分辨质谱HR-ESI-MS在m/z[M+Na]+428.1218给出离子峰(如图18所示)，推测其分子量为C22H19N3O5。对该化合物的1H-NMR(如图12所示)和13C-NMR谱图(如图13所示)分析发现与文献中报道的phenoxazinone类生物碱()非常相近，但化合物3与之相比多了一个亚甲基信号。通过二维DEPT 135(如图14)、COSY(如图15所示)、HSQC(如图16所示)、和HMBC(如图17所示)的谱图分析，最终确定化合物的结构如式(1)中所示。化合物2命名为exfoliazone C(3)，该化合物的1H和13C-NMR(DMSO-d6)归属如表2所示。
表2化合物3的1H和13C NMR数据
Figure BDA0003797902750000072
Figure BDA0003797902750000081
化合物4为红色不定型粉末，高分辨质谱HR-ESI-MS在m/z[M+H]+447.1378，[M+Na]+469.1205，给出离子峰(图25)，推测其分子式为C21H22N2O9。对该化合物的1H-NMR(如图19所示)和13C-NMR谱图(如图20所示)分析发现与化合物1骨架接近，但化合物4相比1多了己糖信号。通过二维DEPT 135(如图21)、COSY(如图22所示)、HSQC(如图23所示)、和HMBC(如图24所示)的谱图分析，最终确定化合物的结构如式(1)中所示。化合物4命名为exfoliazoneglycoside(4)，该化合物的1H和13C-NMR(DMSO-d6)归属如表3所示。
表3化合物4的1H和13C NMR数据
Figure BDA0003797902750000082
Figure BDA0003797902750000091
实施案例5化合物的细胞毒性活性测定
使用MTT法[85]评估量多的4个新代谢物对人恶性黑色素瘤细胞系A375，人卵巢癌细胞SKOV-3，人乳腺癌细胞MDA-MB231，人胃癌细胞MGC-803以及人正常肝细胞L-02的细胞毒性。
表4 BYF-112部分次级代谢产物的细胞毒活性
Figure BDA0003797902750000092
注：a:阳性对照。A375：人恶性黑色素癌细胞。SKOV-3：人卵巢癌细胞。MDA-MB231：人乳腺癌细胞。
MGG-803：人胃癌细胞。L-02：正常细胞。
由表4可以看出化合物1对SKOV-3(人卵巢癌细胞)的IC50值为22.33±3.78μM，与阳性对照0.72±0.12μM相比，细胞毒性一般。同时，化合物1对A375(人恶性黑色素瘤细胞)，MDA-MB231(人乳腺癌细胞)，MGG-803(人胃癌细胞)及正常细胞的IC50值分别为67.70±4.31，55.85±7.47，50.18±7.01，72.01±7.22μM，与阳性对照比较活性较弱。化合物2对SKOV-3(人卵巢癌细胞)IC50值为75.78±5.77μM，对MGG-803(人胃癌细胞)IC50值为69.88±1.94μM，与阳性对照相比活性也较弱，但其对正常细胞L-02没有毒性。化合物3和4对4种癌细胞株均没有细胞活性。
实施案例6化合物的抑菌活性测定
采用滤纸片扩散法检测化合物对大肠杆菌，四联球菌，金黄色葡萄球菌以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑菌活性。将化合物和硫酸庆大霉素、左氧氟沙星用DMSO溶解浓度为6mg/mL的溶液，用0.22μm的有机相微孔滤膜过滤除菌。将活化好的测试菌，挑取至含有无菌水的离心管中，制成菌悬液，并利用比浊管，调整菌液浓度至106cfμ/mL，并取100μL涂布于LB固体培养基中。待培养基凝固后，将事先准备好的直径为6mm的灭菌滤纸片贴于培养基表面，准确量取30μL测试药品，滴加至滤纸片中，操作完成后，将培养皿置于37℃恒温培养24h，采用十字交叉法，测量抑菌圈直径，每组重复三次，以左氧氟沙星为阳性对照，溶剂DMSO为阴性对照。
表5 BYF-112次级代谢产物的抗细菌活性(mm)
Figure BDA0003797902750000101
注：a:阳性对照30μg/滤纸片。b：没有抑制效果。
测定结果如表5所示，化合物1无论对金黄色葡萄球菌敏感型还是耐药性均有抑制活性，抑菌圈直径分别为10.6mm和11.9mm，与阳性对照左氧氟沙星相比，化合物1的抗菌效果中等。此外，化合物1对四联球菌也具有中等活性，其抑菌圈为10.0mm。而化合物2和4无论是对金黄色葡萄球菌敏感型还是耐药性菌株均无活性。
实施案例7化合物对稗草根生长抑制测定
采用滤纸-培养皿法测定化合物对稗草根生长的抑制活性。操作如下：(1)首先使用25％84消毒液处理稗草种子20分钟，随后使用灭菌水清洗三次；处理好的种子，均匀地放置于含水的滤纸培养皿中，并置于28℃恒温培养箱中，进行萌发。(2)准确称取待测化合物，配置成浓度为20mL浓度为100μg/mL的样品(含有1％的DMSO以及0.1％的吐温80的水溶液)，并分别取5mL均匀地覆盖至培养皿中的滤纸上，备用；(3)选取上述刚露白的稗草种子，均匀的置于含药培养皿中，每皿20粒，处理完成后置于28℃恒温培养箱中培养1天，分别以1％的DMSO以及0.1％的吐温80的水溶液，100μg/mL的2,4-D(含有1％的DMSO以及0.1％的吐温80的水溶液)作为空白对照和阳性对照，每处理3个重复；(4)一天后测量稗草种子的根长，计算抑制率，平均生长抑制率(％)＝(对照平均根长-处理平均根长)/对照平均根长×100％。
如图26可以看出单体化合物1，2对稗草根生长抑制活性。在100μg/mL的浓度下，化合物1，2化合物均对稗草根生长有明显的抑制作用(图27)，其中1对稗草根生长的抑制率达到66.1％，化合物2的抑制率达到65.6％，但比阳性对照2,4-D的活性弱(抑制率为100％)。

Claims (4)

1.链霉菌(Streptomyces tanashiensis)BYF-112，该菌种于2019年6月20日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC M 2019474。
2.一类生物碱化合物的制备方法，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
1)、将权利要求1所述的链霉菌BYF-112接种到高氏培养基上，在160-200rpm，27.5～28.5℃条件下培养2～3天作为种子液；
2)、将种子液接种于YMS培养基中，在160～200rpm、27.5～28.5℃条件下发酵6.5～7.5天，即得发酵液；
3)、将步骤2)所得发酵液过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，真空浓缩干燥，得粗浸膏；
4)、将步骤3)所得粗浸膏进行硅胶柱层析分段，采用二氯甲烷/甲醇进行梯度洗脱，所述二氯甲烷与甲醇的体积比依次为100:0、100:1、100:2、100:4、100:8；从而分别得到5个洗脱部分F1～F5；
5)、将步骤4)所得组分F3重新上硅胶柱，有机溶剂梯度洗脱后，得到组分F3-1、F3-2、F3-3，其中F3-1和F3-2经凝胶LH-20柱进一步分离，分别得到化合物2和3；组分F4在二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，析出固体物质，得到化合物1；组分F5经过凝胶色谱LH-20分离，在甲醇溶剂中，析出化合物4单体，综合利用NMR(COSY、HSQC、DEPT135、HMBC)、高分辨电喷雾质谱(HR-ESI-MS)及相关数据库检索和文献比对，对分离获得的化合物进行结构解析鉴定。化合物1-4分别具有如下结构式：
Figure FDA0003797902740000011
3.根据权利要求2所述的化合物1-4的制备方法，其特征在于，发酵培养基的成份为/L：YMS：10.0g可溶性淀粉，1.0g KNO3,1.5g酵母提取物，pH 7.2。
4.如权利要求2所述的化合物1-4的用途，其特征是：其中化合物1为新天然产物，2-4为新化合物。该生物碱类化合物能通过保藏号为CCTCC M 2019474的链霉菌(Streptomycestanashiensis)BYF112制备而得。该生物碱类化合物1和2可作为除草剂，具体表现为可以抑制稗草根的生长；化合物1和2对癌细胞有一定的毒活性；化合物1可作为抗菌药，具体表现可以抑制四联球菌、金黄色葡萄球菌以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长。
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