CN102618612B - 一种用于化疗减毒增效的乌骨鸡肽的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种用于化疗减毒增效的乌骨鸡肽的制备方法及其应用，在于包括以下三个步骤：(1)乌骨鸡可溶性蛋白提取；(2)控制酶解；(3)干燥。本发明涉及的乌骨鸡肽制备方法首先提取乌骨鸡可溶性蛋白，进而对可溶性蛋白实施酶解。其中可溶性蛋白提取得率显著高于传统方法。本发明方法制备的乌骨鸡肽氨基酸组成中，甘氨酸质量占氨基酸总质量的23.54±2.27%，谷氨酸质量占氨基酸总质量的14.51±2.14%，脯氨酸质量占氨基酸总质量的12.00±2.52%，丙氨酸质量占氨基酸总质量的8.51±1.88%，精氨酸质量占氨基酸总质量的8.35±2.04%，天冬氨酸质量占氨基酸总质量的7.63±2.21%。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于化疗减毒增效的乌骨鸡肽的制备方法及其应用。
背景技术
全球癌症发病率持续升高，死亡率也逐年攀升。除了癌症本身，放化疗副作用是导致癌症死亡率逐年攀升的重要原因。化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也将正常细胞一同杀灭。故化疗引起的正常细胞损伤已经成为放化综合治疗实施的障碍，甚至会延长治疗周期，影响治疗效果，缩短肿瘤病人的寿命。
乌骨鸡是我国特有珍禽，被列为国家级珍贵品种资源。乌骨鸡不仅是一种营养丰富的滋补食品，还是一种特有的药用鸡种，具有食用安全性，被历代医家延用。
乌骨鸡肽的制备方法也有报道。如授权公告号为CN 100569794C 的《一种乌骨鸡活性肽的制备方法》以乌骨鸡为原料，通过酶解、初滤、精滤、超滤或超滤和纳滤，制得分子量小于6000 Da的乌骨鸡多肽。其制备乌骨鸡多肽的步骤繁琐，能耗大。授权公告号为CN 1168394C的《一种乌鸡营养成分的提取工艺》将乌鸡去毛及内脏后，加3~4倍量水煮沸2小时，降温至50~60 ℃，调pH值5.5~7.0，加木瓜蛋白酶对乌鸡肉糜酶解，酶解时间为5 小时，而后灭酶，去渣，虫蜡去脂，活性炭脱苦，过滤，加防腐剂，得营养液。该方法将乌鸡加水煮沸后，以乌鸡肉糜为酶解底物，底物复杂多样，大大降低了酶解效率。且步骤繁琐，生产周期长，不适合工业化生产。以上传统酶解方法均是对乌骨鸡肉糜实施酶解，得率较低，因此，研究生产流程简单，产物得率高、活性高的适合工业化生产的乌骨鸡肽的制备方法具有重要经济意义。
目前，已有文献报道乌骨鸡肽具有某些生理功能，但其在化疗减毒增效方面的作用还未见报道。临床上也未见乌骨鸡肽用于肿瘤化疗辅助治疗的报道。
发明内容
针对上述现有情况，本发明提供一种用于化疗减毒增效的乌骨鸡肽的制备方法，由此方法得到的乌骨鸡肽，以及该乌骨鸡肽在化疗减毒增效中的应用。
本发明的技术方案为：以乌骨鸡为原料，采用蒸煮的方法提取乌骨鸡可溶性蛋白，对可溶性蛋白实施控制酶解，酶解液浓缩、干燥处理，得乌骨鸡肽。其具体步骤为：(1)乌骨鸡可溶性蛋白提取：乌骨鸡宰杀，去毛、内脏、头、爪，洗净，用绞肉机制成肉泥。取乌骨鸡肉泥，蒸煮处理。蒸煮后，将可溶性蛋白与剩余固形物分离，除油，得乌骨鸡可溶性蛋白。(2)控制酶解：对分离后的可溶性蛋白实施酶解。酶解后升温灭酶，得酶解液。(3)干燥：酶解液浓缩、干燥，得乌骨鸡肽。
步骤(1)中，乌骨鸡可溶性蛋白的提取可以是如下两种方法，但不限于此：
第一种，将乌骨鸡宰杀，去毛、内脏、头、爪，洗净，用绞肉机制成肉泥。取一定量乌骨鸡肉泥，按固液比1:1~1:5的比例加水，置于高压锅内，在100 ℃~135 ℃温度下，高压20 min~120 min。分离可溶性蛋白与剩余固形物，除油，可溶性蛋白收集备用。按此方法共高压提取1~4次。
第二种，将乌骨鸡宰杀，去毛、内脏、头、爪，洗净，用绞肉机制成肉泥。取一定量乌骨鸡肉泥，按固液比1:1~1:5的比例加水，于普通锅中，在80 ℃~100℃温度下，水煮20 min~120 min。分离可溶性蛋白与剩余固形物，除油，可溶性蛋白收集备用。按此方法共水煮提取1~4次。
步骤(1)中，可以采用真空抽滤、板框过滤分离可溶性蛋白与剩余固形物，采用管式离心除油，得可溶性蛋白，但不限于此。
步骤(2)采用复合酶解的方式，具体地采用木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶两两组合的复合酶解方式。加酶量为可溶性蛋白质量的0.5 ‰~5 ‰，两种酶的质量份数比为10%:90%~90%:10%，酶解温度为40 ℃~65 ℃，酶解时间为1~8 h。酶解后升温灭酶，得酶解液。
步骤(3)干燥可以采用真空干燥或喷雾干燥或冷冻干燥，浓缩可以采用多级闪蒸，但不限于此。
由步骤(1)制备乌骨鸡可溶性蛋白，其平均提取率为10.45%，远远高于传统酶解方法制备乌骨鸡肽8%左右的提取率。对比活性试验证实，本发明方法制备的乌骨鸡肽是确定能够起到化疗减毒增效作用的。具体表现为能够有效减轻化疗药物—5-氟尿嘧啶对人成纤维细胞的损伤、抑制多种癌细胞的增殖、协同5-氟尿嘧啶抑制多种癌细胞的增殖。传统酶解方法制得的乌骨鸡肽以及可溶性蛋白提取剩余固形物酶解产物在对比活性试验中没有显示出化疗减毒增效作用。
本发明方法制备的乌骨鸡肽氨基酸组成中含量较高的前6种氨基酸质量占氨基酸总质量的72.18%，含量从高到低依次为甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸。传统酶解方法制备的乌骨鸡肽、可溶性蛋白提取剩余固形物酶解产物以及乌骨鸡鲜肉氨基酸组成中含量较高的前6种氨基酸质量分别占氨基酸总质量的59.82%、60.00%、58.30%。本发明方法制备的乌骨鸡肽中，甘氨酸：谷氨酸：脯氨酸：丙氨酸：精氨酸：天冬氨酸为31%：20%：16%：12%：11%：10%；传统酶解方法制备的乌骨鸡肽中，谷氨酸：亮氨酸：赖氨酸：甘氨酸：天冬氨酸：丙氨酸为23%：18%：16%：15%：15%：13%；可溶性蛋白提取剩余固形物酶解产物中，谷氨酸：甘氨酸：亮氨酸：天冬氨酸：精氨酸：丙氨酸为24%：19%：17%：16%：12%：12%；乌骨鸡鲜肉中谷氨酸：脯氨酸：赖氨酸：天冬氨酸：甘氨酸：亮氨酸为24%：18%：16%：15%：14%：13%。
本发明方法制备的乌骨鸡肽氨基酸组成中含量较高的前6种氨基酸分别占氨基酸总质量的百分比如表1。测定5个不同批次制备的乌骨鸡肽，结果显示：甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸质量分别占氨基酸总质量的23.54±2.27%，14.51±2.14%，12.00±2.52%，8.51±1.88%，8.35±2.04%，7.63±2.21%。
表1 本发明方法制备的乌骨鸡肽氨基酸组成测定结果
氨基酸组成及比例是判断蛋白质或肽的一级化学结构的首要因素。本发明方法制备的乌骨鸡肽是一系列肽的混合物，其氨基酸序列和具体一级化学结构是不可知的，故氨基酸组成及比例（即氨基酸种类和相对比例）是表征本发明方法制备的乌骨鸡肽的重要指标，也是区分它与传统酶解方法制备的乌骨鸡肽和可溶性蛋白提取剩余固形物酶解产物异同的重要指标。
本发明方法制备的乌骨鸡肽氨基酸组成中含量较高的前6种氨基酸种类和相对比例明显区别于传统酶解方法制备的乌骨鸡肽和可溶性蛋白提取剩余固形物酶解产物。说明本发明方法制备的乌骨鸡肽是与传统酶解方法制备的乌骨鸡肽和可溶性蛋白提取剩余固形物酶解产物完全不同的。
除鸡酶解方法制备的乌骨鸡肽、点化建设进程。留甲比例鸡是我国特有珍禽，被列为国家级珍贵品种资源。传统酶解方法制备的乌骨鸡肽氨基酸组成中含量较高的前6种氨基酸种类与相对比例和可溶性蛋白提取剩余固形物酶解产物和乌骨鸡鲜肉相似，对比活性试验中传统酶解方法制备的乌骨鸡肽和可溶性蛋白提取剩余固形物酶解产物没有显示出化疗减毒增效作用。说明本发明方法是对于获得具有化疗减毒增效作用的乌骨鸡肽有特殊意义和有创造性的。
示eiy本发明还涉及所述制备的乌骨鸡肽用于化疗减毒增效的作用，是发明人通过大量创造性劳动获得的。
具体实施方式
下面通过实施例和试验例进一步阐明本发明涉及的乌骨鸡肽的制备，以及其用于化疗减毒增效的应用。
实施例1
将乌骨鸡宰杀，去毛、内脏、头、爪，洗净，用绞肉机制成肉泥。取20千克乌骨鸡肉泥，按固液比1:1加水，搅匀后，置于高压锅内，设置高压温度为100 ℃，高压时间为20 min。高压结束后，真空抽滤分离可溶性蛋白与剩余固形物，管式离心除油。可溶性蛋白收集备用。
高压得到的可溶性蛋白共1.952千克(提取率9.76%)。维持其温度在40 ℃±0.5 ℃。加入木瓜蛋白酶和风味蛋白酶共0.976克(可溶性蛋白质量的0.5 ‰)，其中木瓜蛋白酶0.0976克，风味蛋白酶0.878克(木瓜蛋白酶:风味蛋白酶=10%:90%)。酶解1小时。酶解结束后， 85 ℃灭酶20 分钟。将酶解液浓缩，喷雾干燥，即得乌骨鸡肽。
实施例2
将乌骨鸡宰杀，去毛、内脏、头、爪，洗净，用绞肉机制成肉泥。取20千克乌骨鸡肉泥，按固液比1:3加水，搅匀后，置于高压锅内，设置高压温度为120 ℃，高压时间为37 min。高压结束后，板框过滤分离可溶性蛋白与剩余固形物，管式离心除油，可溶性蛋白收集备用。剩余固形物称重，按固液比1:3加水，搅匀，置于高压锅内，设置高压温度为120 ℃，高压时间为37 min。高压结束后，板框过滤分离可溶性蛋白与剩余固形物，管式离心除油，可溶性蛋白收集备用。剩余固形物称重，按固液比1:3加水，搅匀，置于高压锅内，设置高压温度为120 ℃，高压时间为37 min。高压结束后，板框过滤分离可溶性蛋白与剩余固形物，管式离心除油，可溶性蛋白收集备用。
三次高压得到的可溶性蛋白共1.996千克(提取率9.98%)。维持其温度在50 ℃±0.5 ℃。加入木瓜蛋白酶和复合蛋白酶共5.988克(可溶性蛋白质量的3 ‰)，其中木瓜蛋白酶2.395克，复合蛋白酶3.593克(木瓜蛋白酶: 复合蛋白酶=40%:60%)。酶解2小时。酶解结束后， 85 ℃灭酶20 分钟。将酶解液浓缩，真空干燥，即得乌骨鸡肽。
实施例3
将乌骨鸡宰杀，去毛、内脏、头、爪，洗净，用绞肉机制成肉泥。取20千克乌骨鸡肉泥，按固液比1:5加水，搅匀后，置于高压锅内，设置高压温度为135 ℃，高压时间为120 min。高压结束后，真空抽滤分离可溶性蛋白与剩余固形物，管式离心除油，可溶性蛋白收集备用。剩余固形物称重，按固液比1:5加水，搅匀，置于高压锅内，设置高压温度为135 ℃，高压时间为120 min。高压结束后，真空抽滤分离可溶性蛋白与剩余固形物，管式离心除油，可溶性蛋白收集备用。剩余固形物称重，按固液比1:5加水，搅匀，置于高压锅内，设置高压温度为135 ℃，高压时间为120 min。高压结束后，真空抽滤分离可溶性蛋白与剩余固形物，管式离心除油，可溶性蛋白收集备用。剩余固形物称重，按固液比1:5加水，搅匀，置于高压锅内，设置高压温度为135 ℃，高压时间为120 min。高压结束后，真空抽滤分离可溶性蛋白与剩余固形物，管式离心除油，可溶性蛋白收集备用。
四次高压得到的可溶性蛋白共2.09千克(提取率10.45%)。维持其温度在65 ℃±0.5 ℃。加入复合蛋白酶和风味蛋白酶共10.45克(可溶性蛋白质量的5 ‰)，其中复合蛋白酶9.41克，风味蛋白酶1.05克(复合蛋白酶: 风味蛋白酶=90%:10%)。酶解8小时。酶解结束后， 85 ℃灭酶20 分钟。将酶解液浓缩，85 ℃真空干燥，即得乌骨鸡肽。
实施例4
将乌骨鸡宰杀，去毛、内脏、头、爪，洗净，用绞肉机制成肉泥。取20千克乌骨鸡肉泥，按固液比1:1加水，搅匀，于普通锅内，在80 ℃温度下水煮 20 min。水煮结束后，真空抽滤分离可溶性蛋白与剩余固形物，管式离心除油，可溶性蛋白收集备用。
水煮得到的可溶性蛋白共1.794千克(提取率8.97%)。维持其温度在40 ℃±0.5 ℃。加入木瓜蛋白酶和风味蛋白酶共0.897克(可溶性蛋白质量的0.5 ‰)，其中木瓜蛋白酶0.090克，风味蛋白酶0.807克(木瓜蛋白酶:风味蛋白酶=10%:90%)。酶解1小时。酶解结束后， 85 ℃灭酶20 分钟。将酶解液浓缩，喷雾干燥，即得乌骨鸡肽。
实施例5
将乌骨鸡宰杀，去毛、内脏、头、爪，洗净，用绞肉机制成肉泥。取20千克乌骨鸡肉泥，按固液比1:3加水，搅匀，于普通锅内，在90 ℃温度下水煮 90 min。水煮结束后，真空抽滤分离可溶性蛋白与剩余固形物，管式离心除油，可溶性蛋白收集备用。剩余固形物称重，按固液比1:3加水，搅匀，于普通锅内，在90 ℃温度下水煮 90 min。水煮结束后，真空抽滤分离可溶性蛋白与剩余固形物，管式离心除油，可溶性蛋白收集备用。剩余固形物称重，按固液比1:3加水，搅匀，于普通锅内，在90 ℃温度下水煮 90 min。水煮结束后，真空抽滤分离可溶性蛋白与剩余固形物，管式离心除油，可溶性蛋白收集备用。
三次水煮得到的可溶性蛋白共1.896千克(提取率9.48%)。维持其温度在50 ℃±0.5 ℃。加入木瓜蛋白酶和复合蛋白酶共5.688克(可溶性蛋白质量的3 ‰)，其中木瓜蛋白酶2.275克，复合蛋白酶3.4128克(木瓜蛋白酶: 复合蛋白酶=40%:60%)。酶解2小时。酶解结束后， 85 ℃灭酶20 分钟。将酶解液浓缩，真空干燥，即得乌骨鸡肽。
实施例6
将乌骨鸡宰杀，去毛、内脏、头、爪，洗净，用绞肉机制成肉泥。取20千克乌骨鸡肉泥，按固液比1:5加水，搅匀，于普通锅内，在100 ℃温度下水煮 120 min。水煮结束后，板框过滤分离可溶性蛋白与剩余固形物，管式离心除油，可溶性蛋白收集备用。剩余固形物称重，按固液比1:5加水，搅匀，于普通锅内，在100 ℃温度下水煮 120 min。水煮结束后，板框过滤分离可溶性蛋白与剩余固形物，管式离心除油，可溶性蛋白收集备用。剩余固形物称重，按固液比1:5加水，搅匀，于普通锅内，在100 ℃温度下水煮 120 min。水煮结束后，板框过滤分离可溶性蛋白与剩余固形物，管式离心除油，可溶性蛋白收集备用。剩余固形物称重，按固液比1:5加水，搅匀，于普通锅内，在100 ℃温度下水煮 120 min。水煮结束后，板框过滤分离可溶性蛋白与剩余固形物，管式离心除油，可溶性蛋白收集备用。
四次水煮得到的可溶性蛋白共2.01千克(提取率10.05%)。维持其温度在65 ℃±0.5 ℃。加入复合蛋白酶和风味蛋白酶共10.05克(可溶性蛋白质量的5 ‰)，其中复合蛋白酶9.05克，风味蛋白酶1.01克(复合蛋白酶: 风味蛋白酶=90%:10%)。酶解8小时。酶解结束后， 85 ℃灭酶20 分钟。将酶解液浓缩，喷雾干燥，即得乌骨鸡肽。
试验例1 乌骨鸡肽对化疗药物诱导正常细胞损伤的减毒作用
取对数期人成纤维(HSF)细胞，制成单细胞悬液，并调整细胞浓度到1×105个/mL。取100 μL/孔，接种于96孔培养板，于CO2培养箱中37℃，5％CO2条件下培养24小时。
细胞贴壁后，进行如下处理：(1)正常对照组：给予细胞培养液100 μL。(2)模型组：给予细胞培养液100 μL。(3)肽Ⅰ组(本发明方法制备的乌骨鸡肽)：分别给予终浓度为2 μg/mL,10 μg/mL, 50 μg/mL, 250 μg/mL本发明方法制备的乌骨鸡肽100 μL。(4)肽Ⅱ组(传统酶解方法制备的乌骨鸡肽)：分别给予终浓度为2 μg/mL,10 μg/mL, 50 μg/mL, 250 μg/mL传统酶解方法制备的乌骨鸡肽100 μL。(5)肽Ⅲ组(可溶性蛋白提取剩余固形物酶解产物)：分别给予终浓度为2 μg/mL,10 μg/mL, 50 μg/mL, 250 μg/mL可溶性蛋白提取剩余固形物酶解产物100 μL。每组设6个复孔。37℃，5％CO2条件下培养24小时。
24小时后,将各孔上清吸出，并做如下处理：(1)正常对照组：给予细胞培养液200 μL。(2)模型组：给予细胞培养液100 μL，终浓度为100 μg/mL的5-氟尿嘧啶100 μL。(3) 肽Ⅰ组：分别给予终浓度为2 μg/mL,10 μg/mL, 50 μg/mL, 250 μg/mL本发明方法制备的乌骨鸡肽100 μL，终浓度为100 μg/mL的5-氟尿嘧啶100 μL。(4) 肽Ⅱ组：分别给予终浓度为2 μg/mL,10 μg/mL, 50 μg/mL, 250 μg/mL传统酶解方法制备的乌骨鸡肽100 μL，终浓度为100 μg/mL的5-氟尿嘧啶100 μL。(5) 肽Ⅲ组：分别给予终浓度为2 μg/mL,10 μg/mL, 50 μg/mL, 250 μg/mL可溶性蛋白提取剩余固形物酶解产物100 μL，终浓度为100 μg/mL的5-氟尿嘧啶100 μL。37℃，5％CO2条件下培养24小时。
培养结束，每孔加入5 mg/mL的MTT 20??L，37℃，5％CO2温育4h。去上清，加入150 ??L DMSO，室温下振荡反应10 min，于多功能酶标仪490nm处测吸光值。细胞存活率的计算公式如下：
细胞存活率(%)=实验组OD/正常对照组OD×100%
结果见表2。肽Ⅱ、肽Ⅲ组细胞存活率与模型组相比无显著差异，肽Ⅰ组细胞存活率与模型组相比有显著性差异，说明本发明方法制备的乌骨鸡肽对5-氟尿嘧啶致人成纤维细胞的损伤有减毒作用，且随着浓度的增加，减毒作用增强。
表2 乌骨鸡肽对5-氟尿嘧啶致人成纤维细胞损伤的减毒作用
(
±s，n=6)
* P<0.05 ** P<0.01
试验例2 乌骨鸡肽对多种癌细胞增殖的抑制作用
分别取对数期人肝癌细胞(HepG2)、人黑色素瘤细胞(A375-S2)、人结肠癌细胞(HCT116)，人乳腺癌细胞(MCF-7)制成单细胞悬液，并调整细胞浓度到1×105个/mL。取100 μL/孔，接种于96孔培养板，于CO2培养箱中37℃，5％CO2条件下培养24小时。
24小时后，做如下处理：(1)正常对照组：给予细胞培养液100 μL。(2) 肽Ⅰ组(本发明方法制备的乌骨鸡肽)：分别给予终浓度为2 μg/mL,10 μg/mL, 50 μg/mL, 250 μg/mL本发明方法制备的乌骨鸡肽100 μL。(3) 肽Ⅱ组(传统酶解方法制备的乌骨鸡肽)：分别给予终浓度为2 μg/mL,10 μg/mL, 50 μg/mL, 250 μg/mL传统酶解方法制备的乌骨鸡肽100 μL。(4) 肽Ⅲ组(可溶性蛋白提取剩余固形物酶解产物)：分别给予终浓度为2 μg/mL,10 μg/mL, 50 μg/mL, 250 μg/mL可溶性蛋白提取剩余固形物酶解产物100 μL。每组设6个复孔。37℃，5％CO2条件下培养24小时。
培养结束，用MTT法测细胞抑制率。细胞抑制率的计算公式如下：
细胞抑制率(%)=(1-实验组OD/正常对照组OD)×100%
表3 乌骨鸡肽对多种癌细胞增殖的抑制作用
(±s，n=6)
结果见表3。结果表明本发明方法制备的乌骨鸡肽能够更为有效的抑制多种癌细胞的增殖，其最大抑制率为15.34%。
试验例3 乌骨鸡肽对化疗药物抑制癌细胞增殖的协同作用
取对数期人肝癌细胞(HepG2)、人黑色素瘤细胞(A375-S2)、人结肠癌细胞(HCT116)，人乳腺癌细胞(MCF-7)制成单细胞悬液，并调整细胞浓度到1×105个/mL。取100 μL/孔，接种于96孔培养板，于CO2培养箱中37℃，5％CO2条件下培养24小时。
24小时后，做如下处理： (1)正常对照组：给予细胞培养液200 μL。(2)模型组：给予细胞培养液100 μL，终浓度为10 μg/mL或100 μg/mL的5-氟尿嘧啶100 μL。(3) 肽Ⅰ组(本发明方法制备的乌骨鸡肽)：分别给予终浓度为2 μg/mL,10 μg/mL, 50 μg/mL, 250 μg/mL本发明方法制备的乌骨鸡肽100 μL，终浓度为10 μg/mL 或100 μg/mL的5-氟尿嘧啶100 μL。(4) 肽Ⅱ组(传统酶解方法制备的乌骨鸡肽)：分别给予终浓度为2 μg/mL,10 μg/mL, 50 μg/mL, 250 μg/mL传统酶解方法制备的乌骨鸡肽100 μL，终浓度为10 μg/mL 或100 μg/mL的5-氟尿嘧啶100 μL。(5) 肽Ⅲ组(可溶性蛋白提取剩余固形物酶解产物)：分别给予终浓度为2 μg/mL,10 μg/mL, 50 μg/mL, 250 μg/mL可溶性蛋白提取剩余固形物酶解产物100 μL，终浓度为10 μg/mL 或100 μg/mL的5-氟尿嘧啶100 μL。37℃，5％CO2条件下培养24小时。
培养结束，MTT法测细胞抑制率。
结果见表4、表5。结果表明5-氟尿嘧啶终浓度为100 μg/mL时，肽Ⅰ能够协同5-氟尿嘧啶对HepG2细胞增殖的抑制作用，而肽Ⅱ、肽Ⅲ会在一定程度上起营养癌细胞的作用。5-氟尿嘧啶终浓度为10 μg/mL时，肽Ⅰ能够协同5-氟尿嘧啶抑制多种癌细胞的增殖，与模型组相比，有显著性差异，且抑制率随着浓度的增大而增加。
表 4 乌骨鸡肽对5-氟尿嘧啶抑制HepG2细胞增殖的协同作用
(5-氟尿嘧啶终浓度100 μg/mL)， (
±s，n=6)
表5乌骨鸡肽对5-氟尿嘧啶抑制多种癌细胞增殖的协同作用
(5-氟尿嘧啶终浓度10 μg/mL)
(
±s，n=6)
* P<0.05 ** P<0.01
Claims (2)
1. 一种用于化疗减毒增效的乌骨鸡肽的制备方法，包括以下三个步骤：(1)乌骨鸡可溶性蛋白提取；(2)控制酶解：对分离后的可溶性蛋白进行酶解，酶解后升温灭酶，得酶解液；(3)干燥：酶解液浓缩、干燥，得乌骨鸡肽；其特征是步骤(1)中乌骨鸡可溶性蛋白提取的方法为：将乌骨鸡宰杀，去毛、内脏、头、爪，洗净，用绞肉机制成肉泥，取一定量乌骨鸡肉泥，按固液比1:1~1:5的比例加水，置于高压锅内，在100 ℃~135 ℃温度下，高压20 min~120 min，分离可溶性蛋白与剩余固形物，除油，可溶性蛋白收集备用，按此方法共高压提取1~4次；所述步骤(2)中控制酶解，是采用木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶两两组合的复合酶解，加酶量为可溶性蛋白质量的0.5 ‰~5 ‰，两种酶的质量份数比为10%:90%~90%:10%，酶解温度40 ℃~65 ℃，酶解时间1~8 h。
2.根据权利要求1所述的一种用于化疗减毒增效的乌骨鸡肽的制备方法，其特征是所得乌骨鸡肽氨基酸组成中，甘氨酸质量占氨基酸总质量的23.54±2.27%，谷氨酸质量占氨基酸总质量的14.51±2.14%，脯氨酸质量占氨基酸总质量的12.00±2.52%，丙氨酸质量占氨基酸总质量的8.51±1.88%，精氨酸质量占氨基酸总质量的8.35±2.04%，天冬氨酸质量占氨基酸总质量的7.63±2.21%。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| composition of fatty acids in the muscle of blcak-bone silky chicken(gallus gellus demesticus brissen) and its bioacticity in mice;Yinggang Tian et al;《food chemistry》;20111231(第126期);第479至483页 * |
| determination of carnosine in black-bone silky fowl(gallus gallus domesticus brisson) and common chicken by HPLC;Yinggang Tian et al;《eur food res technol》;20071231(第226期);第311至314页 * |
| 乌骨鸡与非药用鸡种鸡肉总脂质含量及脂肪酸组成的比较;田颖刚等;《食品与生物技术学报》;20070531;第26卷(第3期);第29至32页 * |
| 泰和乌骨鸡活性肽对小鼠骨髓有核细胞的增殖作用;刘建华等;《食品与生物技术学报》;20110331;第30卷(第2期);第172至177页 * |
| 泰和乌骨鸡鸡肉总磷脂含量及其侧链脂肪酸组成的特性;田颖刚等;《食品科学》;20071231;第28卷(第4期);第48至51页 * |
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