CN102590501A

CN102590501A - 燕窝胶体金免疫试纸条及其制备方法

Info

Publication number: CN102590501A
Application number: CN2012100697420A
Authority: CN
Inventors: 赖心田; 杨国武; 张世伟; 刘小青; 李芸; 严琼英; 陈血剑; 张秦蕾; 陈国培; 陈雁; 叶秀玲
Original assignee: Shenzhen Academy Of Metrology & Quality Inspection
Current assignee: Shenzhen Academy Of Metrology & Quality Inspection
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2012-03-30
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2032-03-30
Also published as: CN102590501B

Abstract

本发明提供一种燕窝胶体金免疫试纸条，包括样品垫、结合垫、反应垫、吸水垫和PVC背衬，所述PVC背衬上依次粘附有样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；所述结合垫粘附于所述样品垫之上，并与所述反应垫相搭接；所述反应垫与所述吸水垫相搭接；所述结合垫包被有抗唾液酸糖蛋白抗体胶体金标记物，所述反应垫分别包被有唾液酸糖蛋白抗原构成的检测线和羊抗鼠IgG构成的质控线。本发明可对燕窝及其相关产品进行定性检测，适用范围广，特异性好，抗基质干扰效果好，可实现燕窝及其相关产品的现场快速鉴别，检测成本低。

Description

燕窝胶体金免疫试纸条及其制备方法

技术领域

本发明涉及燕窝及其相关产品的检测，尤其涉及一种燕窝胶体金免疫试纸条及其制备方法。

背景技术

燕窝是由雨燕科金丝燕及同属类的唾液或者绒羽等混唾液凝结而成的巢窝，其产地分布于东南亚一带，如中国、印尼、泰国、越南和马来西亚等。燕窝是一种名贵中药，具有养阴润燥，补中益气，入胃补脾，化痰止咳等功能；燕窝含有丰富的活性糖蛋白，钙、铁、磷、碘及维生素等天然营养物和矿物质，还具有的防止流感病毒，促进细胞生长和加强免疫系统功能等作用。由于燕窝的营养价值和经济价值均较高，而且消费者对其需求日益增长，因此一些商贩通过染色、漂白，或以银耳、猪皮、琼脂、果胶等掺假伪造。假冒伪劣的燕窝及其制品频繁被曝光，而检测燕窝及其相关产品的标准方法尚属空白，因此，为保障消费者的合法权益和生命健康，完善市场秩序，完善燕窝及其相关产品的检测方法迫在眉睫。

现有的燕窝及其相关产品检测方法主要有：

（1）PCR方法：利用燕窝中特定基因片段进行PCR检测，该方法特异性好，但检测时间长，需要昂贵的设备和专业的操作人员，且燕窝制成品往往需要热加工，容易导致样品中DNA降解，从而使检测结果出现假阴性；

（2）电泳方法：基于燕窝蛋白质图谱进行分析，但抗基质干扰能力差，灵敏度低，仅限于对燕盏进行检测，无法用于燕窝制成品的检测；

（3）特定组份分析法：利用色谱、光谱等手段，通过分析燕窝中各种化学组份如特定元素、氨基酸、唾液酸、糖类等的含量鉴定其真假，但其特异性不高，易于被人为添加物干扰。

因此，现有的检测技术存在特异性不强，容易受人为添加物的干扰，适用范围窄，无法对燕窝含量不高、需高温加工且基质干扰较大的燕窝制成品进行有效的检测，检测操作繁琐，检测时间长，需要配备大型分析仪器且要求专业的操作人员等缺点。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，发明人预料不到地发现，通过提取唾液酸糖蛋白作为抗原，制备高度特异的抗燕窝唾液酸糖蛋白抗体，构建的胶体金免疫试纸条可广泛应用于燕窝及其相关产品的检测，无需使用分析设备，可实现燕窝及其相关产品的现场快速鉴别，且具有特异性好，灵敏度高，抗基质干扰效果好，操作简单、快捷，检测成本低等优点。

本发明提供一种燕窝胶体金免疫试纸条，包括样品垫、结合垫、反应垫、吸水垫和PVC背衬，所述PVC背衬上依次粘附有样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；所述结合垫粘附于所述样品垫之上，并与所述反应垫相搭接；所述反应垫与所述吸水垫相搭接；所述结合垫包被有抗唾液酸糖蛋白抗体胶体金标记物，所述反应垫分别包被有唾液酸糖蛋白抗原构成的检测线和羊抗鼠IgG构成的质控线。

采用上述技术方案，可对燕窝及其相关产品进行的定性检测，无需使用分析设备，根据肉眼分辨检测条带出现与否即可得出检测结果，可实现燕窝及其相关产品的现场快速鉴别，特异性好，灵敏度高，抗基质干扰效果好，操作简单、快捷，检测成本低。

作为本发明的进一步改进，所述反应垫采用硝酸纤维素膜，作为C/T线的承载体，也是免疫反应的发生处。

作为本发明的进一步改进，所述结合垫采用玻璃纤维素膜，有利于燕窝胶体金免疫试纸条性能的优化。

作为本发明的进一步改进，所述样品垫设置有样品孔，将样品检测溶液加入样品孔中，可减少样品检测溶液的扩散浪费。

作为本发明的进一步改进，所述检测线与所述质控线的距离为5mm~10mm，有利于检测结果的快速鉴别。

本发明还提供燕窝胶体金免疫试纸条的制备方法，包括如下步骤：

A）燕窝唾液酸糖蛋白的分离和纯化；

B）抗唾液酸糖蛋白抗体的制备和纯化；

C）胶体金的制备；

D）抗唾液酸糖蛋白抗体胶体金标记物的制备；

E）结合垫的制备；

F）反应垫的制备；

G）样品垫的处理；

H）燕窝胶体金免疫试纸条的组装。

作为本发明的进一步改进，所述反应垫采用硝酸纤维素膜，来源广泛。

作为本发明的进一步改进，所述结合垫采用玻璃纤维素膜，来源广泛。

本发明的检测原理为：利用各类燕窝共有的唾液酸糖蛋白作为抗原，运用胶体金免疫竞争法的原理进行检测。检测时，样品溶液加入样品垫后，如果样品溶液中存在一定量的燕窝成分，样品溶液中的燕窝唾液酸糖蛋白与胶体金标记抗唾液酸糖蛋白抗体（简称金标抗体）相结合，进而封闭金标抗体上唾液酸糖蛋白的抗原结合点，阻止金标抗体与硝酸纤维素膜上唾液酸糖蛋白包被物结合，使之显色较弱，甚至不显色；反之，如果样品溶液中没有燕窝成分，则不能阻止金标抗体与硝酸纤维素膜上的唾液酸糖蛋白包被物结合，从而显色较强。在试纸条的中央判读区喷有检测线（T线）和质控线（C线），检测线靠近样品垫一端，质控线靠近吸水垫一端。

检测结果判断：若T线显色比C线强，或显色与C线相近，且C线出现显色条带，则结果判断为阴性样品，样品溶液中燕窝唾液酸糖蛋白的浓度小于检测限；若T线显色比C线浅很多或完全不显色，且C线出现显色条带，则结果判断为阳性样品；若C线没有显色条带出现，则该检测结果无效。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：抗唾液酸糖蛋白抗体针对的抗原决定簇耐热，可实现燕窝及其相关产品的现场快速鉴别，适用范围广，有利于消费者合法权益的保障；特异性好，灵敏度高，抗基质干扰效果好；样品的前处理简单，检测操作简单、快捷，无需使用分析设备，无需专业的操作人员，检测成本低。

附图说明

图1为燕窝唾液酸糖蛋白电泳图；图1-a为燕窝唾液酸糖蛋白SDS-PAGE图，其中，1泳道为Marker，2泳道为纯化的燕窝唾液酸糖蛋白，3泳道为燕窝总蛋白；图1-b为纯化的燕窝唾液酸糖蛋白2-D PAGE图。

图2为燕窝唾液酸糖蛋白与抗燕窝唾液酸糖蛋白单克隆抗体Western-Blotting图；其中，1泳道为Marker，2泳道为纯化的燕窝唾液酸糖蛋白，3泳道为燕窝总蛋白。

图3为燕窝胶体金免疫试纸条的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例一目标抗原的分离纯化。

目标抗原为燕窝唾液酸糖蛋白，该蛋白由具有相同抗原决定簇但糖基化修饰程度不同的分子量分别为106kDa和128kDa的两个蛋白组成，等电点≤3.0。

将燕窝经过7M尿素超声提取10min，离心取上清，使用液相等点聚焦仪进行分离纯化，目标蛋白在正极沉淀，经过去离子水洗涤后得到目标蛋白。该目标蛋白通过SDS-PAGE和2-D PAGE验证，结果如图1所示，未见其他杂蛋白条带，纯度满足免疫要求。

实施例二抗唾液酸糖蛋白抗体的制备和纯化。

用燕窝唾液酸糖蛋白分别免疫6周雌性balb/c鼠，每组3只。首次免疫注射时，分别100μg/mL的免疫抗原100μL，与等量弗氏完全佐剂充分乳化，腹腔直接注射。间隔两周后，取用样的抗原，与100μL不完全佐剂乳化，同样方法注射。

在细胞融合前1d或当天拉颈处死昆明鼠，浸泡在70％酒精中，体表消毒；用大头针固定昆明鼠在蜡板上，超净工作台上剪开腹部，用小镊子挑起腹膜，注入5mL RPMI-1640完全培养液（由GIBICO RPMI-1640基础培养液加入15%体积百分比浓度的胎牛血清而得），用手轻轻揉动腹腔，将其体内液体用无菌吸管移入75mL HAT完全培养液（由74.25mL RPMI-1640完全培养液加入0.75mL 100×HAT液而得）中，用吸管混匀，铺24孔板，每孔加0.5mL，置于37℃ CO₂培养箱中。

小鼠眼眶放血，收集血清，拉颈处死，70%酒精浸泡消毒体表，无菌取出脾脏，放入RPMI-1640基础培养液（购自GIBICO，货号为A10491-01）中，并小心剔除筋膜及脂肪，剪碎，置于100目的不锈钢筛内，无菌研磨，释放出单个脾细胞，吸取含有脾细胞的液体置于50mL无菌离心管中，离心。

将骨髓瘤细胞和上述制备好的脾细胞以个数5：1的比例加入同一50mL的离心管中，加入37℃温浴的RPMI-1640不完全培养液（购自GIBICO，货号为61870-036）20mL，混合均匀，1500r/min离心6min，弃去上清，用手指轻击离心管底部，使沉淀混匀如糊状；用移液管取37℃预热的PEG 1mL，滴入离心管，静置1min后，于37℃水浴中在2min内滴加RPMI-1640完全培养液10mL，1000r/min离心6min，弃去上清，加75mL HAT培养液，轻轻混匀，将混匀悬液分装于有饲养细胞的24孔板中，每孔0.5mL，于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中孵育。

融合后6~9d，用HAT培养液半量换液1次，在12~14d后根据增殖情况改用RPMI-1640完全培养液；待细胞贴壁至占板孔1/3时，计杂交瘤细胞生长的孔数及细胞总数，取上清液，间接ELISA选择效价高和间接竞争ELISA选择药物抑制强的阳性杂交瘤细胞。

采用间接ELISA和间接竞争ELISA法进行阳性杂交瘤细胞筛选，显示阳性并出现竞争抑制反应的孔为产燕窝唾液酸糖蛋白抗体的孔，并可用于进一步的亚克隆。

无菌条件下，洗脱阳性孔内的细胞，用弯头吸管将细胞转移至预先以饲养细胞铺板的96孔培养板中，每个原始孔克隆成8孔，待细胞贴壁长满1/2~1/3孔底后，取上清液，间接ELISA检测；取呈阳性强的亚克隆，如此反复2~5次，待所克隆的8个孔上清液中抗体阳性率为100％时，挑取单细胞克隆，检测为全阳性者转移至24孔细胞培养板或25mL细胞培养瓶扩大培养，建株并以分装、冻存。提前一周注射0.5mL降植烷至Balb/c小鼠腹腔。取冻存细胞株，复苏后，经大量培养繁殖，收集细胞，用不完全培养基洗涤二次后，再用10mL不完全培养基悬浮，计数；将细胞（每只小鼠1mL，含3.1×10⁷个细胞）腹腔注射小鼠腹部，10~15d后，待小鼠腹部明显膨大时用16号注射器无菌采集腹水；2000r/min离心10min，去除上层脂肪和下层纤维蛋白及细胞，收集中层，分装-70℃冻存备用。

取腹水离心后的中层部分3mL，加入2倍体积的0.06mol/L、pH 4.5醋酸钠缓冲液。将正辛酸逐滴慢慢加入样品中，至终浓度33μg/mL腹水，边加边搅拌，加完后继续搅拌30min，4℃下10000r/min离心30min，去沉淀（白蛋白和其它非IgG蛋白）。取上清经0.45 μm微孔膜过滤，与1/10体积10×PBS混合（10×PBS由80gNaCl、2g KCl、11.5g Na₂HPO4、2g KH₂PO4、0.5845g EDTA用950mL蒸馏水溶解后，调pH至7.4并定容至1000mL而得），用1mol/L NaOH溶液调pH值到7.4。上清冷却到4℃，加硫酸铵至终浓度为0.277g/mL。搅拌30min，4℃下10000 r/min离心30min，弃上清。用少量PBS溶液溶解沉淀，用50~100倍体积的PBS透析过夜，换液3次。得到纯化后的抗唾液酸糖蛋白抗体，4℃下贮藏备用。纯化后的抗唾液酸糖蛋白抗体经Western-Blotting检测，结果如图2所示，该抗体和燕窝唾液酸糖蛋白特异性结合，未和燕窝其他蛋白产生交叉反应。

实施例三胶体金的制备。

取1%氯金酸溶液1ml，加99ml超纯水成终浓度0.01% 的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1%柠檬酸三钠1.6ml一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，调pH5.9～6.2，超纯水定容至100mL。

实施例四抗唾液酸糖蛋白抗体胶体金标记物的制备。

在磁力搅拌下，将100μg/mL抗唾液酸糖蛋白抗体溶液10mL加入10mL pH5.9～6.2的胶体金溶液中，加入抗唾液酸糖蛋白抗体溶液时应逐滴加入。分别取1ml抗唾液酸糖蛋白抗体胶体金标记物（实验组）和1ml胶体金原液（对照组）于试管中加10%氯化钠溶液0.1ml，室温静置1h，观察结果：如果对照组试管溶液由红色转为蓝色，甚至可以看到聚合物沉淀，而实验组溶液仍保持红色，无沉淀，方可继续下一步实验。最后，在实验组中加入终浓度为0.2%的聚乙二醇（PEG MW20000），继续搅拌30min，得到抗唾液酸糖蛋白抗体胶体金标记物溶液。

实施例五结合垫的制备。

使用PBS溶液稀释抗唾液酸糖蛋白抗体胶体金标记物至工作浓度10μg/mL，均匀浸于玻璃纤维素膜，-20℃冻存，冷冻真空干燥后，得到结合垫，4℃密封保存。

实施例六反应垫的制备。

取2mg/ml的燕窝唾液酸糖蛋白用0.01mol/L的PBS缓冲液（pH 7.2）以250μg/ml间隔，经BIO-DOT型XYZ3000点样仪dispenser线形包被于硝酸纤维素膜的观察结果的测试反应区，定义为检测线，距离检测线5mm远的质控线用dispenser线形包被2mg/ml的正常羊抗鼠IgG，37℃干燥2h，得到反应垫，4℃密封保存。

实施例七样品垫的处理。

将样品垫浸泡于含BSA的0.01mol/L PBS缓冲液中30min，37℃烘干，真空封装，4℃密封保存。其中，牛血清白蛋白（BSA）的终浓度为2%质量百分比浓度。

实施例八燕窝胶体金免疫试纸条的组装。

依次将样品垫1、结合垫2、反应垫3和吸水垫4粘附于PVC背衬5上，样品垫设置有样品孔11，反应垫包被有检测线31和质控线32，如图3所示。结合垫粘附于样品垫之上，并与反应垫相搭接，反应垫与吸水垫相搭接，真空封装，4℃密封保存，可保质1年以上。

实施例九燕窝胶体金免疫试纸条对燕窝及其相关产品进行检测。

样品前处理：

1、燕盏：将燕盏研磨至粉状，称取0.1g，加入10mL 0.01M pH7.4的PBS超声连续提取2min，离心，取上清液稀释1000倍后，得到样品检测溶液；

2、燕窝制成品：将燕窝制成品均质，称取1g，加入20mL 0.01M pH7.4的PBS超声连续提取2min，离心，取上清液为样品检测溶液，如果样品检测溶液的检测结果超过线性范围上限，需再酌情稀释。

燕窝胶体金免疫试纸条进行检测：取出燕窝胶体金免疫试纸条，用移液器取样品检测溶液80μl（或用滴管取3-4滴）滴入样品垫的样品孔中，5~10min观察检测结果。

实施例十燕窝胶体金免疫试纸条的特异性。

使用燕窝胶体金免疫试纸条对牛血清白蛋白、卵清蛋白和银耳提取物等常见掺假物进行检测，结果如表1所示。从表1可知，燕窝胶体金免疫试纸条与牛血清白蛋白、卵清蛋白、溶菌酶、明胶、海藻酸钠、银耳提取物、卡拉胶和琼脂均无交叉反应，特异性好，试纸条对含有质量浓度1%的银耳提取物、猪皮提取物、鱼漂提取物、胶原蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、卡拉胶、果胶或海藻糖的阴性样本检测结果正确率为100%。

Figure 2012100697420100002DEST_PATH_IMAGE001

实施例十一燕窝胶体金免疫试纸条的基质效应。

使用燕窝胶体金免疫试纸条对燕窝样品（包括阴性样品和阳性样品）中NaCl、葡萄糖和果糖等一些常见干扰物进行基质效应的检测，结果如表2所示。由表2可知，在对阴性样品和阳性样品的检测中，质量浓度1%的葡萄糖、1%的果糖、1%的淀粉、1%的氯化钠对检测结果均无影响，说明本发明提供的燕窝胶体金免疫试纸条抗基质干扰效果好，只需对样品进行超声提取和稀释，即可完成样品前处理。

Figure 2012100697420100002DEST_PATH_IMAGE002

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种燕窝胶体金免疫试纸条，其特征在于：包括样品垫、结合垫、反应垫、吸水垫和PVC背衬，所述PVC背衬上依次粘附有样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；所述结合垫粘附于所述样品垫之上，并与所述反应垫相搭接；所述反应垫与所述吸水垫相搭接；所述结合垫包被有抗唾液酸糖蛋白抗体胶体金标记物，所述反应垫分别包被有唾液酸糖蛋白抗原构成的检测线和羊抗鼠IgG构成的质控线。

2.根据权利要求1所述的燕窝胶体金免疫试纸条，其特征在于：所述反应垫采用硝酸纤维素膜。

3.根据权利要求1所述的燕窝胶体金免疫试纸条，其特征在于：所述结合垫采用玻璃纤维素膜。

4.根据权利要求1所述的燕窝胶体金免疫试纸条，其特征在于：所述样品垫设置有样品孔。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的燕窝胶体金免疫试纸条，其特征在于：所述检测带与所述质控带的距离为5mm~10mm。

6.根据权利要求1所述的燕窝胶体金免疫试纸条的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

燕窝唾液酸糖蛋白的分离和纯化；

抗唾液酸糖蛋白抗体的制备和纯化；

胶体金的制备；

抗唾液酸糖蛋白抗体胶体金标记物的制备；

结合垫的制备；

反应垫的制备；

样品垫的处理；

燕窝胶体金免疫试纸条的组装。

7.根据权利要求6所述的燕窝胶体金免疫试纸条的制备方法，其特征在于：所述反应垫采用硝酸纤维素膜。

8.根据权利要求6所述的燕窝胶体金免疫试纸条的制备方法，其特征在于：所述结合垫采用玻璃纤维素膜。