CN102586121B - 一种产乙酰胆碱酯酶抑制剂的真菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产乙酰胆碱酯酶抑制剂的真菌及其用途,分类命名为海洋赭曲霉AspergillusochraceusSH0701,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2012年1月10日,保藏编号为CCTCC No.M2012003。该真菌发酵后得到的发酵产物、以及发酵液提取物和菌体提取物均有具有显著的乙酰胆碱酯酶抑制活性。乙酰胆碱酯酶抑制活性的特性使得该真菌发酵产物和发酵产物的提取物可以用于制备治疗阿尔茨海默病的药物。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,具体地说,涉及一种产乙酰胆碱酯酶抑制剂的真菌及其应用。
技术背景
阿尔茨海默病是一种常见的老年性脑神经退行性病变,发病率较高,已成为现代社会严重威胁老年人生命的疾病之底前脑胆碱能功能障碍和皮层、海马广泛的神经元丢失和突触形态的改变。该疾病典型的病理变化包括β淀粉样蛋白沉积形成老年斑,神经纤维缠结基底前脑胆碱能功能障碍和皮层、海马广泛的神经元丢失和突触形态的改变。
研究发现阿尔茨海默病患者脑内皮层及海马区的病变比较明显,以前脑基底核胆碱能神经元破坏最多。因此,通过增加乙酰胆碱的含量,或作用于胆碱受体,可增强和改善中枢胆碱能系统的功能,从而达到促智治病的目的)。乙酰胆碱酯酶抑制剂就建立是建立在这种理论基础上开发出来的临床上用于阿尔茨海默病治疗最早最成熟的一类药物,该类药物对轻、中度阿尔茨海默病患者疗效确切,可使其认知功能及其它症状得到部分改善。目前多种乙酰胆碱酯酶抑制剂已经用于阿尔茨海默病的治疗。但此类药物的疗效依赖于胆碱能神经元的完整程度,不适于重度病人。同时,该类药物只能提高乙酰胆碱的含量,不能阻止中枢胆碱能神经元的进行性退化死亡,随着病情的发展,中枢胆碱能神经元进行性退化死亡,乙酰胆碱酯酶抑制剂的药效也会逐渐降低。因此,寻找既能抑制乙酰胆碱酯酶活性又能阻止中枢胆碱能神经元退化死亡的新型乙酰胆碱酯酶抑制剂成为寻找阿尔茨海默病治疗药物的关键。
在海洋中,由于环境条件极为复杂与独特,如压力、温度、含氧量、光线、盐度、营养状况等与陆地相异,在那里存在着许多新的微生物,其代谢产物的化学结构丰富多样,新颖独特,是陆地生物所不具备的。另外,海洋微生物生长周期短,容易培养可以用发酵罐进行工业化生产,实现高新技术产业化。因此,海洋微生物作为巨大的潜在药物和化学的资源,具有广阔的研究和开发前景,成为近年来寻找新药的研究热点。从海洋中分离海洋微生物并从其发酵产物中分离纯化结构新颖的乙酰胆碱酯酶抑制剂,对抗阿尔茨海默病药物的研发和海洋生物资源的开发利用具有重要的意义。
发明内容
为了寻找新型的乙酰胆碱酯酶抑制剂,本申请的发明人从江苏连云港海域分离海洋微生物并制取其发酵产物,然后对获得的发酵产物的乙酰胆碱酯酶抑制活性进行了研究,结果找到了一株海洋真菌SH0701。该海洋真菌菌株SH0701是发明人从中国江苏连云港海域的海底沉积物中分离到的一株真菌,发酵产物具有较强的乙酰胆碱酯酶抑制活性,经鉴定表明它属于赭曲霉Aspergillus ochraceus。本发明所述的的海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701已于2012年1月10日保藏在中国典型培养物保藏中心(其简称CCTCC),保藏编号为CCTCCM 2012003。
上述的海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701的生物学形态描述为:在海水PDA培养基上,菌落圆形呈放射状,菌丝白色透明、稀疏,孢子细密、浅黄色,如图1所示;显微观察显示,菌丝透明,有分枝和分隔,有假根,有分生孢子梗,分生孢子梗无横隔,光滑,顶囊半球形或球形,小梗呈放射状,产生分生孢子、细小圆形,如图2、图3、图4所示。
上述的海洋曲霉Aspergillus ochraceus SH0701的遗传学特征,该海洋真菌的ITS序列为:
GGCTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGAGTGAGGGTCCCTCGGGGCCCAACCTCCCACCCGTGTATACCGTACCTTGTTGCTTCGGCGAGCCCGCCCCCTTTTTCTTTTAGGGGGCACAGCGCTCGCCGGAGACACCAACGTGAACACTGTCTGAAGTTTTGTCGTCTGAGTCGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAATTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCACCCCCTGGTATTCCGGGGGGTATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCCAGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTTGTAGGCCCGGCCGGCTGCTGGCCGACGCTGAAAAGCAACCAACTATTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA
该序列与NCBI核酸数据库(Genbank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)BLAST比对结果显示,该真菌的ITS序列与曲霉Aspergillus sepultus、Aspergillus ostianus及Aspergillus ochraceus同源性最高,达到100%。
微管蛋白(β-tubulin)基因序列为:
5’-GCTATCCAGGATCATCTTCGATACCTTAGGACTTATGACTCTCAATCCTTGATACTTGTTTACTGATAGGTGAATAGGCAAAACATCTCTGGCGAGCACGGCCTTGACGGCGCCGGTGTGTAAGTACATCCCGCGTTTACACCCATCGAAATCAGAGTCGAAAATAGAGGAAAAGAAAGAAACGACCATGGTGGGATTGATTGTCTGATGGGATGAACAGTTACAATGGCTCCTCCGACCTTCAGCTGGAGCGCATGAACGTCTACTTCAACGAGGTTCGTTGCCCGAAAATTTTCTATCTCCTTTCGCCTATTCGAAACGCCCCGTACAAAGCTCTAACCCACGCTTTTTTCTTCATCTTCTAGGCTTCCGGTGGCAAGTATGTTCCCCGTGCCGTTCTGGTCGATCTTGAGCCCGGTACCATGGACGCTGTCCGTGCCGGTCCCTTCGGTCAGCTTTTCCGCCCCGACAACTTCGTCTTCGGCCAGTCTGGTGCCGGTAACAACTGGGCCAAGGGTCACA-3’
该序列与NCBI核酸数据库(Genbank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)BLAST比对结果显示,该真菌的微管蛋白序列与Aspergillus ochraceus相似度最高,达到99%。
前述海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701菌株的发酵产物、发酵产物的提取物经检测发现均具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的特性。发酵产物的提取物包括:发酵液提取物、极性段提取物、菌体提取物。经检测发现这三种提取物均具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的特性。
发酵液提取物:发酵产物经管式离心机离心固液分离,得到发酵液和菌体;将发酵液减压蒸馏浓缩至原体积的三分之一后用等体积的乙酸乙酯萃取3次,再将乙酸乙酯层减压干燥后得到发酵液提取物。
极性段提取物:将前述的发酵液提取物以1∶5(W/V)悬浮在水中,再采用液-液分配萃取法用石油醚或氯仿或乙酸乙酯或正丁醇按照1∶1比例萃取得到极性段提取物,极性段提取物为石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物或水提取物。
菌体提取物:发酵产物经管式离心机离心固液分离,得到发酵液和菌体;菌体在烘箱中50℃干燥得干燥的菌体;干燥的菌体按1∶20(W/V)加入甲醇萃取3次,合并甲醇提取液,减压蒸馏干燥得到菌体提取物。
前述获得海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701菌株的发酵产物的发酵方法包括:菌种活化过程、种子液制备过程和发酵培养过程。
菌种活化过程:取所述保藏菌种,采用划线法接种于海洋PDA斜面培养基上,培养得到产生孢子的斜面培养物,培养温度为28℃,培养时间5天。
种子液制备过程:将上述的斜面培养物加无菌陈海水后,在无菌条件下刮取孢子,制备孢子悬液;再将孢子悬液接种于海洋PDA培养基中,震荡培养获得种子液。其中,前述孢子悬液的接种按5%接种量接种于海洋PDA培养基;震荡培养环境参数为:温度28℃、每分钟150-180转;培养时间为3-4天。
发酵培养过程:在通气搅拌式发酵罐内加入海洋PDA发酵培养基,灭菌后接入种子液搅拌发酵,获得发酵产物。其中,灭菌的方法为:在121℃下放置30min;种子液的接入按接种量5%接入;搅拌发酵环境参数为:通气量1∶0.5,温度为28℃,搅拌速度为每分钟250转;发酵时间为:7天。
前述发酵方法中的海洋PDA斜面培养基的配置方法为:将马铃薯去皮切成小块,于海水中煮沸后过滤;然后在滤液中加入蔗糖和琼脂粉,加热溶解后,加海水定容,再经灭菌后获得海洋PDA斜面培养基。其中,马铃薯小块煮沸时间为30min;灭菌方法为:121℃下放置25min;马铃薯和海水的比例为:200g马铃薯对应1000mL海水;蔗糖和马铃薯的比例为:20g蔗糖对应200g马铃薯;琼脂粉和马铃薯的比例为:15-20g琼脂粉对应200g马铃薯;加海水定容后培养基体积和马铃薯的比例为:1000mL对应200g马铃薯。
前述发酵方法中的海洋PDA发酵培养基的配置方法为:将马铃薯去皮切成小块,于海水中煮沸后过滤;然后在滤液中加入蔗糖,加热溶解后,加海水定容,再经灭菌后获得海洋PDA发酵培养基。其中,马铃薯小块煮沸时间为30min;灭菌方法为:121℃下放置25min;马铃薯和海水的比例为:200g马铃薯对应1000mL海水;蔗糖和马铃薯的比例为:20g蔗糖对应200g马铃薯;加海水定容后培养基体积和马铃薯的比例为:1000mL对应200g马铃薯。
如上所述,本发明的海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701菌株发酵产物、发酵产物的提取物具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的特点。因此,发酵产物、发酵产物的提取物用于治疗阿尔茨海默病或治疗阿尔茨海默病的药物,或者可用于提取分离具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的化合物用于治疗阿尔茨海默病或治疗阿尔茨海默病的药物。该治疗阿尔茨海默病的药物包含上述发酵产物,或发酵产物的提取物,或由发酵产物的提取物提炼的提炼物。
附图说明
图1为海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701菌株的菌落形态。
图2为海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701菌株的菌丝体。
图3为海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701菌株的产孢结构。
图4为海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701菌株的分生孢子。
图5为海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701菌株发酵液提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性。
具体实施方式
以下通过实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。
实施例1 海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701(CCTCC M 2012003)的分离培养方法
选择性海洋PDA培养基:200g马铃薯去皮切成2cm3左右小块,于1000mL陈海水中煮沸30min,过滤,在滤液中加入20g蔗糖和15-20g琼脂粉,用陈海水定容至1000mL,pH自然。分装于250mL三角瓶中,于121℃灭菌25min。灭菌后,待冷至约45℃时,加入氨苄青霉素、硫酸链霉素的无菌水稀释液(终浓度为100μg/mL)混合均匀后分别倒平板,冷却后备用。
海洋PDA斜面培养基:200g马铃薯去皮切成2cm3左右小块,于1000mL陈海水中煮沸30min,过滤,在滤液中加入20g蔗糖和15-20g琼脂粉,加热溶解后,用陈海水定容至1000mL,pH自然。分装于试管中,于121℃灭菌25min后,摆斜面,备用。
从连云港燕尾港港口采集海底淤泥,取1g海底淤泥悬浮在5mL无菌海水中。取上清液1mL加入盛有9mL无菌海水的大试管中充分混匀,然后从此试管中吸取1mL加入另一盛有9mL无菌水的试管中,混合均匀,以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的溶液。从不同稀释度的试管中吸取100μL溶液,小心地滴在选择性海洋PDA培养基平板表面中央位置。用无菌玻璃涂布棒涂开,将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展,使之分布均匀。室温下静置5~10分钟,使菌液浸入培养基。每个梯度涂4至5皿,作为重复;
该平板置于25-28℃培养4~7天;挑取单菌落接种于海洋PDA斜面培养基上即获得纯培养物。
纯培养物在28℃培养箱中培养4天后,放在4℃冰箱中保存。
实施例2 海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701(CCTCC M 2012003)的发酵方法
1、海洋PDA发酵培养基:200g马铃薯去皮切成2cm3左右小块,于1000ml陈海水中煮沸30min,过滤,在滤液中加入20g蔗糖,用陈海水定容至1000ml,pH自然。分装,于121℃灭菌25min,备用。
2、海洋PDA斜面培养基:200g马铃薯去皮切成2cm3左右小块,于1000ml陈海水中煮沸30min,过滤,在滤液中加入20g蔗糖和15-20g琼脂粉,加热溶解后,用陈海水定容至1000ml,pH自然。分装于试管中,于121℃灭菌25min后,摆斜面,备用。
3、菌种活化:取海洋赭曲霉(Aspergillus ochraceus SH0701)斜面保藏菌种,采用划线法接种于海洋PDA斜面培养基上,在28℃条件下培养5天得到产生孢子的斜面培养物。利用此法将菌种连续活化三次以上备用。
4、种子液制备:移取5mL无菌陈海水到培养好的海洋赭曲霉斜面培养物上,在无菌条件下再用接种针刮取海洋赭曲霉孢子,制备海洋赭曲霉孢子悬液(107个/ml)。按5%接种量,取海洋赭曲霉孢子悬液10ml,接种到已灭菌含有200mL海洋PDA培养基的500mL三角瓶中,于温度为28℃、转速150~180转/分钟的电热全温震荡培养箱中,震荡培养3天,获得种子液。
5、发酵培养:于50L通气搅拌式发酵罐内加入30L海洋PDA发酵培养基,在121℃下灭菌30min后冷却至28℃,按接种量5%接入种子液。在通气量1∶0.5,温度为28℃,搅拌速度为250转/分钟条件,发酵7天,获得发酵产物。
实施例3 海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701(CCTCC M 2012003)在实施例2的基础上,从发酵产物提取具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的提取物的方法
发酵液提取物的提取方法:
1.发酵产物经过管式离心机离心固液分离,得到发酵液和菌体。
2.发酵液减压蒸馏浓缩至原体积的三分之一后用等体积的乙酸乙酯萃取3次。
3.乙酸乙酯层减压干燥得到发酵液提取物。
极性段提取物提取方法:
将上述得到的发酵液提取物以1∶5(W/V)悬浮在水中,再采用液-液分配萃取法依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇按照1∶1比例萃取,把发酵液提取物分成石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水5个极性段。极性段提取物分别为:石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物。
菌体提取物提取方法:
a.将发酵液提取物提取方法中步骤1得到的.菌体在烘箱中50℃干燥得干燥的菌体。
b.干燥的菌体按1∶20(W/V)加入甲醇萃取3次,合并甲醇提取液。
c.减压蒸馏干燥得到菌体提取物。
实施例4 乙酰胆碱酯酶的抑制活性检测
本实施例测试实施例2中海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701发酵产物和实施例3中发酵液提取物、发酵液提取物的极性提取物及菌体提取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性。发酵产物直接取发酵产物10μL进行测试,发酵液提取物及干燥菌体提取物溶解在甲醇中配置成不同浓度的溶液,取样品10μL进行测试。
1、活兔处死后迅速取出大脑,用冷生理盐水将脑组织表面漂洗干净,轻轻用滤纸吸干表面水份,称重后按W/V为1∶4的比例与含有0.1mol/L磷酸缓冲液(PH值7.4)混合,在冰浴条件下,用玻璃匀浆器充分匀浆后,装入离心管中置于高速冷冻离心机在4℃条件下10000r·min-1离心30min,取上清液,即得酶液,记录体积并在4℃的冰箱中保存备用。
2、在96孔板中加入140μL的磷酸盐缓冲溶液,10μL酶液,20μL显色剂(DTNB),20μL底物(ATCI)和10μL待测物溶液。96孔板置于酶标仪,在波长412nm的可见光下,每隔1.5min记录反应液的A412nm值,持续9min。所有样品都重复三次。以未加样品孔(加入相应体积的用培养基或甲醇)的光密度值作为100%,样品测定孔的光密度与之比较,降低的百分率即为酶抑制率。在IC50测试中,每个样品测5个浓度梯度对乙酰胆碱酯酶的抑制活性,通过化合物浓度对数对抑制率作图求IC50值(抑制50%酶活性时化合物的浓度)。
如图5所示,发酵液提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性呈现剂量依赖关系,不同浓度下发酵液提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制率见表1。其抑制乙酰胆碱酯酶的IC50值为7.8±2.8μg/mL。
表1不同浓度的发酵液提取对乙酰胆碱酯酶的抑制作用
浓度(μg/mL) | 抑制率(%) |
1000 | 96.34±2.10 |
100 | 85.98±4.27 |
10 | 66.97±0.82 |
1 | 19.96±7.48 |
0.1 | 3.17±3.26 |
0.01 | 1.48±4.75 |
发酵培养过程中每隔12小时取样监测一次,如表2所示,在发酵过程中,发酵开始时,随着发酵时间的进行发酵液的乙酰胆碱酯酶抑制活性迅速升高,发酵到2天时发酵液的乙酰胆碱酯酶抑制活性达到最高值。其后,发酵液的乙酰胆碱酯酶活性略有下降,但变化不大。
表2不同发酵时间段发酵液对乙酰胆碱酯酶的抑制活性
发酵时间(h) | 抑制率(%) |
0.5 | 0.58±0.78 |
1 | 24.60±7.45 |
1.5 | 63.94±4.80 |
2 | 81.62±1.70 |
2.5 | 76.82±6.51 |
3 | 76.626±5.10 |
3.5 | 71.88±2.78 |
4 | 71.55±5.89 |
4.5 | 67.51±4.31 |
5 | 83.23±3.97 |
5.5 | 66.10±5.99 |
6 | 67.18±5.61 |
6.5 | 67.53±2.53 |
发酵液提取物用不同极性的溶剂分段后,各极性段的乙酰胆碱酯酶抑制活性不同(见表3),在5μg/mL浓度下,乙酸乙酯极性段具有最高的乙酰胆碱酯酶抑制活性,氯仿相次之。因此,海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701(CCTCC M 2012003)发酵产物中的乙酰胆碱酯酶抑制剂主要分布在中等极性大小的极性段。干燥菌体提取物在100μg/mL时对乙酰胆碱酯酶的抑制率65.2%。
表3发酵液提取物的不同极性段对乙酰胆碱酯酶的抑制活性
抑制率(%) | |
石油醚极性段 | 51.84±9.07 |
氯仿极性段 | 65.06±2.46 |
乙酸乙酯极性段 | 71.55±6.27 |
正丁醇极性段 | 19.02±1.82 |
水极性段 | 5.43±4.46 |
Claims (10)
1.一种产乙酰胆碱酯酶抑制剂的真菌,分类命名为海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701, 保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2012年1月10日,保藏编号为CCTCC M 2012003。
2.一种具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的发酵产物,其特征在于,所述的发酵产物由权利要求1所述的真菌发酵获得。
3.一种具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的提取物,其特征在于,所述的提取物由权利要求2所述的发酵产物提炼获得。
4.根据权利要求3所述的提取物,其特征在于,所述的提取物是由权利要求2所述的发酵产物提炼获得的发酵液提取物。
5.根据权利要求3所述的提取物,其特征在于,所述的提取物是由权利要求2所述的发酵产物提炼获得的极性段提取物。
6.根据权利要求3所述的提取物,其特征在于,所述的提取物是由权利要求2所述的发酵产物提炼获得的菌体提取物。
7.根据权利要求2所述的发酵产物的发酵方法,其特征在于,包括:菌种活化过程、种子液制备过程和发酵培养过程;
所述菌种活化过程为:取所述保藏菌种,采用划线法接种于海洋PDA斜面培养基上,培养得到产生孢子的斜面培养物;
所述种子液制备过程为:将上述的斜面培养物加无菌陈海水后,在无菌条件下刮取孢子,制备孢子悬液;再将孢子悬液接种于海洋PDA培养基中,震荡培养获得种子液;
所述发酵培养过程为:在通气搅拌式发酵罐内加入海洋PDA发酵培养基,灭菌后,接入种子液搅拌发酵,获得发酵产物。
8.根据权利要求7所述的发酵方法,其特征在于,所述的海洋PDA斜面培养基的配置方法为:将马铃薯去皮切成小块,于海水中煮沸后过滤;然后在滤液中加入蔗糖和琼脂粉,加热溶解后,加海水定容,再经灭菌后获得海洋PDA斜面培养基。
9.根据权利要求7所述的发酵方法,其特征在于,所述的海洋PDA发酵培养基的配置方法为:将马铃薯去皮切成小块,于海水中煮沸后过滤;然后在滤液中加入蔗糖,加热溶解后,加海水定容,再经灭菌后获得海洋PDA发酵培养基。
10.一种治疗阿尔茨海默病的药物,其特征在于,包含权利要求2所述的发酵产物或其提炼物,或包含权利要求3所述的提取物或其提炼物,或包含权利要求4所述的提取物或其提炼物,或包含权利要求5所述的提取物或其提炼物,或包含权利要求6所述的提取物或其提炼物。
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