CN102584956A - 一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因ifna2的新突变蛋白、编码基因及其应用 - Google Patents
一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因ifna2的新突变蛋白、编码基因及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2的新突变蛋白、编码基因及其应用。本发明的慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2的新突变蛋白是在慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2蛋白的氨基酸序列第120位丙氨酸突变为苏氨酸,同时得到了该突变蛋白的编码基因,建立了基于IFNA2基因及其突变体的诊断试剂盒,该试剂盒可以对临床上慢性乙肝患者进行基因水平的诊断,还可以对其临床用药情况予以指导和个体化治疗。从长远看,对慢性乙型病毒性肝炎进行IFNA2基因的突变检测使我们有可能在今后通过纠正突变的基因疗法或其它针对这一突变的生物学效应的方法去治疗本病,在临床治疗方面有深远意义和应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程及医学技术领域,具体涉及一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2的新突变蛋白、编码基因及其应用。
背景技术
慢性乙型病毒性肝炎(慢性乙肝)是由乙型肝炎病毒(HBV)感染而引起的以肝脏损害为主要表现的传染性疾病,是关系到我国乃至全球公共卫生的重大疾病。宿主的遗传背景在其易感性及免疫应答中起重要作用。而人群对乙肝免疫力的高低存在明显的个体差异。
中国专利200810004159.5公开了一种与肝细胞癌相关的乙型肝炎病毒基因组标志物以及预测HBV感染个体发展成肝细胞癌(HCC)的遗传素因的试剂盒。该试剂盒包括一种或更多种探针,当其与HBV基因组接触时,如果所述基因组为IFNA2基因型、且包括至少一种对应于某段核苷酸序列上的核苷酸(170C;和/或2170G2;和/或2441C;和/或799G)时会选择性地与所述基因组杂交。
发明内容
本发明的目的在于提供一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2的新突变蛋白。
本发明的另一目的是提供上述慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2的新突变蛋白的编码基因。
本发明的又一目的是提供上述慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2的新突变蛋白、该突变蛋白的编码基因的应用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的:
一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2的新突变蛋白,是在慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2蛋白的氨基酸序列第120位丙氨酸Ala突变为苏氨酸Thr,本发明中用p.Ala120Thr表示。
上述慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2的新突变蛋白,氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
上述慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2的新突变蛋白的编码基因。该编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:2所示。
慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2的新突变蛋白在制备慢性乙型病毒性肝炎的检测试剂中的应用。
慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2的新突变蛋白的编码基因在制备慢性乙型病毒性肝炎的检测试剂中的应用。
一种慢性乙型病毒性肝炎检测试剂盒,由以下成分组成:核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物,PCR反应液,PCR产物纯化盒和测序反应液;
所述PCR反应液为溶解了Tag DNA聚合酶、dNTPs、镁离子(如MgCl2)、PCR反应缓冲液(如10×Taq Buffer),以上试剂均可直接购买相应商品,如(10mM)dNTPs购自上海生工生物工程技术服务有限公司;Tag DNA聚合酶及其配套的10×Taq Buffer、MgCl2购自Fermentas公司。各试剂的用量及浓度均为本领域常规值,如1u/μL Tag DNA聚合酶1μL、2mmol/L 的dNTP(即浓度均为2mmol/L 的4种dNTP的混合物)3μL、25mmol/L MgCl2 3μL、10×Taq Buffer(内含(NH4)2SO4)3μL、灭菌ddH2O 17μL。
所述PCR产物纯化盒为纯化PCR产物的溶液和DNA吸附柱Labell;所述纯化PCR产物的溶液为:1u/μL虾碱性磷酸酶(SAP,可购于Fermentas公司)0.6μL、20u/μL外切酶(Exo I,可购于Fermentas公司)0.15μL和灭菌ddH2O 1.25-1.75μL,或按上述比例配制的其他体积的混合液。纯化PCR产物的溶液优选2-2.5μL。
所述测序反应液为BigDye(购自ABI公司)和5×Sequence buffer(购自ABI公司)的混合液,BigDye和5×Sequence buffer的体积比优选为1:2,如1μLBigDye与2μL5×Sequence buffer混合。
上述慢性乙型病毒性肝炎检测试剂盒,优选核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物浓度分别为3.2μmol/L。
本发明的慢性乙型病毒性肝炎的相关基因IFNA2及其新突变p.Ala120Thr,是通过对“相对极端性状的”50例慢性乙肝患者及40例未注射过乙肝疫苗正常对照进行全基因组外显子测序,通过生物信息学分析及进一步的数据筛选找到最有可能的候选基因;然后再对所找到的候选基因进行大样本量的病例-对照(其中慢性乙肝患者1728例,未注射乙肝疫苗正常对照1636例)相关关系研究;最后通过相关基因的作用机理及统计学分析结果(IFNA2基因新突变与慢性乙肝相关的统计学P 值为2.76×10-5,优势比(OR)为4.08,说明两者有显著相关性)最终确定了IFNA2基因新突变与慢性乙型肝炎相关。
本发明的人IFNA2基因核苷酸全长序列(包含突变位点)通常是用聚合酶链式反应(PCR)进行。对于PCR扩增法,可根据IFNA2基因的核苷酸序列,进行引物设计,并以所检测的患慢性乙型肝炎患者抽提的DNA作为模板,扩增目的序列。最后通过测序反应检测及确定相关基因的突变。
由于前期的研究已经证明了慢性乙型肝炎与IFNA2基因新突变的高度相关性,因此检测这个基因的突变可用于鉴定慢性乙型肝炎患者的宿主遗传背景的易感性及对免疫应答的反应能力,进一步地用于之后靶向个体化治疗,如在患有慢性乙型肝炎患者中检测到了IFNA2基因的突变,我们可以进一步采取用干扰素来治疗本病。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
我们通过全基因组外显子测序及大样本量的相关研究,发现了与慢性乙型病毒性肝炎的相关基因——IFNA2及其新突变。因此,找寻及检测慢性乙肝相关基因及其突变,不仅是了解及阐明本病的发病机理的必要途径,同时也为建立鉴定本病的基因诊断和个体化治疗提供了新的契机。在已了解与本病相关的IFNA2基因及其突变之后,我们可以建立起基于IFNA2基因及其变异的诊断技术,以期对临床上慢性乙肝患者进行基因水平的诊断,还可以对其临床用药情况予以指导和个体化治疗。由于基因的突变是导致本病遗传背景发生改变从而致使其易感性及免疫应答发生改变的重要因素,从长远看,对本病进行IFNA2基因的突变检测使我们有可能在今后通过纠正突变的基因疗法或其它针对这一突变的生物学效应的方法去治疗本病。因此,从长远看,与本病相关的IFNA2基因突变的发现在临床治疗方面有深远的意义和前景。
附图说明
图1:IFNA2基因的部分测序结果,其中上面部分为IFNA2野生型的测序结果,下面部分为IFNA2 p.Ala120Thr杂合性突变的测序结果(箭头所示为突变位点)。
图2:IFNA2 p.Ala120Thr突变型蛋白整体的结构模拟图,第120位苏氨酸和第116位天冬酰胺处用虚线圆圈框起。
具体实施方式
以下实施例中如无特殊说明均为本领域常规试剂和试验方法。
实施例1 病例收集
来自中山大学附属第三医院传染科的1728例慢性乙型肝炎患者和来自同一地区的1636例未注射乙肝疫苗或自报疫苗注射史不明的健康自愿者,在取得上述患者、自愿者及家属知情同意后,取外周血于EDTA抗凝管中备用。用Qiagen公司生产的QIAamp DNA Blood Mini Kits(试剂盒)从抗凝外周血中提取DNA,TE溶解,-80℃保存,备用。
实施例2 IFNA2基因的突变检测
IFNA2基因的mRNA序列来自Genbank(NM_000605)。Genomic DNA序列来自UCSC数据库(http://genome.ucsc.edu/)和Ensembl数据库(http://asia.ensembl.org/index.html)。
主要步骤:
1. PCR扩增:PCR反应体积为30μL:10×Taq Buffer(内含(NH4)2SO4)3μL,25mmol/L MgCl2 3μL,2mmol/L dNTP混合物3μL,3.2μmol/L上、下游引物各1μL,1u/μL Taq DNA聚合酶1μL,实施例1提取的DNA模板1μL,灭菌ddH2O补足体积至30μL。PCR反应条件:95℃预变性3min;95℃ 30s,引物特异性退火温度1min,72℃ 45s,36个循环;最后72℃ 延伸10min。
检测IFNA2基因突变位点的上游引物P1(SEQ ID NO:3)的序列为:5’- CTTTGAAATGGCAGATCATAA -3’,下游引物P2(SEQ ID NO:4)的序列为:5’- AAATGTAAACGAGTATGTTCCC -3’。
2. 测序反应方案
(1)预反应:反应体积共3μL:1u/μL虾碱性磷酸酶(SAP)0.6μL、20u/μL外切酶(Exo I)0.15μL (Fermentas公司)、PCR产物0.5-1.0μL、灭菌ddH2O补足体积至3μL。反应混合物在PCR仪上反应,37℃温浴15min,85℃ 15min灭活酶。反应完毕后反应混合物直接作为测序反应的模板用。
(2)测序反应:用ABI公司的96孔板,在GeneAmp 9700 PCR仪上进行。反应体积共10μL:3μL的预反应产物、2μL的5×Sequence buffer(ABI公司)、1μL的BigDye(ABI公司)、1μL的引物(3.2μmol/L),3μL的灭菌ddH2O。反应条件:98℃ 2min;96℃ 10s,50℃ 5s,60℃ 4min,30个循环;最后4℃保存。
(3)测序纯化:直接在96孔板上进行。
a) 测序反应完毕后,配无水乙醇6mL+3mol/L醋酸钠(pH5.2)240μL混合溶液(即无水乙醇:醋酸钠体积比=25:1),每个样品中加入50μL混合溶液。用锡箔纸封闭,并振荡混匀。
b) 将测序产物放于-20℃避光静置20min以上。
c) 20℃,3700 rpm离心30min。
d) 倒去上清液,倒扣在四层吸水纸上,360rpm离心10s。
e) 配75%乙醇(无水乙醇7.5mL+ddH2O 2.5mL混合溶液的比例),每个样品中加入90μL混合溶液。用锡箔纸封闭,并振荡混匀。
f) 将测序产物放于-20℃避光静置20min以上。
g) 20℃,3700 rpm离心30min。
h) 倒去上清液,倒扣在四层吸水纸上,360rpm离心10s。
i) 室温通风处,避光晾干,30min以上。
j) 每个样品中加ddH2O 10μL,用锡箔纸封闭,振荡后离心。
k) 待测样品放于4℃避光静置1.5h以上,以充分溶解,上ABI3730测序仪进行测序。
3. 测序结果分析:用ABI序列分析软件进行分析
发明人对来自中山大学附属第三医院传染科的1728例慢性乙型肝炎患者和来自同一地区的1636例未注射乙肝疫苗或自报疫苗注射史不明的健康自愿者进行IFNA2基因的突变检测。结果如下:
突变位点为:发生在IFNA2基因的氨基酸序列中第120位丙氨酸突变为苏氨酸(p.Ala120Thr),突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。其中有36例患者和9例正常对照存在杂合性突变。在1728例病例和1636例对照研究中,其风险等位基因的个数分别是36个和9个,优势比值(OR值)为4.08,P值为2.76×10-5。多基因遗传病的研究中,通常是通过关联分析来确定其风险基因的,本实验结果中,P值有显著差异,且OR值为4.08,说明该基因的突变是导致该病的危险因素。测序结果见图1。
实施例3 IFNA2 p.Ala120Thr突变型蛋白结构预测
方法:用the program PyMol (http://pymol.org)、Discovery Studio 3.0 (Accelrys Inc.)、the programs MultAlin (Corpet F. Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic. Acids. Res. 1988; 16, 10881-10890) 及 ESPript软件 (Gouet P, Robert X, Courcelle E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic. Acids. Res. 2003; 31, 3320-3323) 预测IFNA2 p.Ala120Thr突变型蛋白的结构及功能域。
蛋白质结构预测结果见图2。对IFNA2基因编码的蛋白质结构域的预测,发现第120位亲水性的丙氨酸突变为了疏水性的苏氨酸后,新生成的第120位苏氨酸的OG与其主链上与之毗邻的第116位天冬酰胺的羰基氧(carbonyl oxygen)之间形成了一氢键。且由于第120位的氨基酸残基正好位于C螺旋结构域的C末端,此位置的氨基酸替换可能会影响到C螺旋结构域的构造,最终可触发与之相连的整个Loop结构域的改变。此外,由于在野生型的IFNA2蛋白中螺旋结构A和C上的相互毗邻的氨基酸残基Cys24和Cys121之间会形成二硫键,因此倘若第120位的丙氨酸发生突变可能也会破坏其附近形成的二硫键,最终使得A螺旋结构发生改变。
实施例4IFNA2基因突变检测试剂盒的制备
制备—试剂盒,具体成分见表1
表1
试剂名称 | 具体成分 |
上游引物P1 | (SEQ ID NO:3),干粉 2 OD,溶解后浓度:3.2μmol/L,体积:1μL |
下游引物P2 | (SEQ ID NO:4),干粉 2 OD,溶解后浓度:3.2μmol/L,体积:1μL |
PCR反应液 | 1u/μL Taq DNA聚合酶1μL(购自Fermentas公司)、2mmol/L dNTP 3μL、25mmol/LMgCl2 3μL(Taq DNA聚合酶配套试剂)、10×Taq Buffer(内含(NH4)2SO4,Taq DNA聚合酶配套试剂)3μL 、灭菌ddH2O 17μL。 |
PCR产物纯化盒 | 2-2.5μL 纯化PCR产物的溶液(内含1u/μL虾碱性磷酸酶(SAP,购自Fermentas公司)0.6μL、20u/μL外切酶(Exo I,购自Fermentas公司)0.15μL和灭菌ddH2O 1.25-1.75μL),DNA吸附柱Labell |
测序反应液 | 含1μL BigDye和2μL 的5×Sequence buffer(均购自ABI公司) |
上述试剂盒的使用方法:抽取待检测患者的血液2mL,使用常规方法(或特定的DNA提取试剂盒)从血液中提取DNA。将IFNA2基因突变检测试剂盒中的PCR引物稀释至3.2μmol/L,以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。使用检测试剂和所提供的PCR产物纯化盒对PCR产物进行纯化。将纯化的产物进行测序反应后直接测序。观察测序所得到的序列是否存在错义突变,即SEQ ID NO:1所示氨基酸序列第120位丙氨酸(Ala)是否发生突变。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2的新突变蛋白、编码基因及其应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys
1 5 10 15
Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu
20 25 30
Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser
35 40 45
Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu
50 55 60
Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His
65 70 75 80
Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser
85 90 95
Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr
100 105 110
Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Thr Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val
115 120 125
Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys
130 135 140
Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro
145 150 155 160
Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu
165 170 175
Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
180 185
<210> 2
<211> 567
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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gctgtgagga aatacttcca aagaatcact ctctatctga aagagaagaa atacagccct 480
tgtgcctggg aggttgtcag agcagaaatc atgagatctt tttctttgtc aacaaacttg 540
caagaaagtt taagaagtaa ggaatga 567
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctttgaaatg gcagatcata a 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaatgtaaac gagtatgttc cc 22
Claims (8)
1.一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2的新突变蛋白,其特征在于在慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2蛋白的氨基酸序列第120位丙氨酸突变为苏氨酸。
2.根据权利要求1所述慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2的新突变蛋白,其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求2所述慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2的新突变蛋白的编码基因。
4.根据权利要求3所述慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2的新突变蛋白的编码基因,其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.权利要求1所述慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2的新突变蛋白在制备慢性乙型病毒性肝炎的检测试剂中的应用。
6.权利要求4所述慢性乙型病毒性肝炎相关基因IFNA2的新突变蛋白的编码基因在制备慢性乙型病毒性肝炎的检测试剂中的应用。
7.一种慢性乙型病毒性肝炎检测试剂盒,其特征在于由以下成分组成:核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物,PCR反应液,PCR产物纯化盒和测序反应液;
所述PCR反应液为溶解了Tag DNA聚合酶、dNTPs、镁离子的PCR反应缓冲液;
所述PCR产物纯化盒由纯化PCR产物的溶液和DNA吸附柱Labell组成,所述纯化PCR产物的溶液为1u/μL虾碱性磷酸酶、20u/μL外切酶Exo I和灭菌ddH2O的混合液;
所述测序反应液为BigDye和5×Sequence buffer的混合液。
8.根据权利要求7所述慢性乙型病毒性肝炎检测试剂盒,其特征在于所述核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物浓度分别为3.2μmol/L。
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