CN102580158A - 一种荧光标记特性的纳米磷灰石/生物高分子复合支架的制备方法 - Google Patents
一种荧光标记特性的纳米磷灰石/生物高分子复合支架的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种荧光标记特性的纳米磷灰石/生物高分子复合支架的制备方法,通过制备稀土离子掺杂的纳米磷灰石溶胶、并进行后处理,然后制备纳米磷灰石/生物高分子支架,最终得到荧光标记特性的纳米磷灰石/生物高分子复合支架。该支架中的磷灰石颗粒在生物高分子基体中分散良好,且具有光学稳定性和良好发光性能的光标记特性,解决了现有支架材料难以进行有效的体外和体内试验的检测、诊断等问题。本法工艺简单,操作简捷,易于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学材料和光功能材料技术领域,具体涉及一种具有光标记特性的纳米磷灰石/生物高分子复合支架的制备方法。
背景技术
骨组织工程支架材料是指能与成骨细胞结合并能植入生物体的材料,它是组织工程化骨的最基本构架,被认为是在进行骨修复和替代治疗的最有前景的一种生物材料。目前,骨组织工程支架材料主要分为生物衍生材料、陶瓷材料和高分子材料三类,但是都存在一些问题而难以应用,如生物衍生材料常常会引起剧烈的免疫排斥反应,羟基磷灰石是等陶瓷材料力学性能较差、降解难控制,高分子材料的力学强度及降解速度难以满足临床的要求。因此,为了弥补上述材料的缺点,从骨的成分和结构仿生制备骨组织工程支架材料,即采用磷灰石与胶原、壳聚糖、明胶等生物高分子制备复合支架材料是该研究领域的一个主要发展方向。目前磷灰石/生物高分子复合支架的研究通常集中在改善材料的性能和生物学性能,而忽略了支架材料的体外和体内试验的检测、诊断等重要评价手段。
稀土发光材料与相应的非稀土发光材料相比,其发光效率及光色等性能都更好,因此近几年稀土发光材料得到了广泛的研究,其用途越来越广泛,目前已有少量稀土离子掺杂磷灰石发光材料的相关研究。例如:Han Yingchao, Wang Xinyu等,柠檬酸溶胶凝胶燃烧法合成铽掺杂的磷酸钙纳米晶[J].溶胶凝胶科学与技术学报,(Synthesis of terbium doped calcium phosphate nanocrystalline powders by citric acid sol-gel combustion method [J]. Journal of Sol-Gel Science and Technology)2009,49: 125-129,该文采用柠檬酸溶胶凝胶法燃烧的方法制备了铽掺杂的磷酸钙纳米晶,主相为羟基磷灰石,次相为beta-TCP,该晶体表现出了铽的发光特性。Long, Mei, Hong Fashui等,尺寸相关微结构及铕位点对Eu3+掺杂的Ca10(PO4)6(OH)2纳米晶荧光性能的影响 [J].发光学报,(Size-dependent microstructure and europium site preference influence fluorescent properties of Eu3+-doped Ca10(PO4)6(OH)2 nanocrystal[J]. Journal of Luminescence)2008,128: 428-436,该文采用热分解前躯体的方法制备了铕掺杂具有不同粒度的Ca10(PO4)6(OH)2纳米晶,并认为室温下的光致发光性依赖于尺寸效应,以及材料中Eu3+占据Ca(II)或者Ca(I)位点。Ternane R,Trabelsi-Ayedi M等, Eu3+ 在羟基磷灰石中的发光特性[J].发光学报,(Luminescent properties of Eu3+ in calcium hydroxyapatite [J]. Journal of Luminescence)1999,81: 165-170,该文采用沉淀反应制备了Eu3+时间分辨发光特性的Ca5(PO4)3OH,其发光光谱说明发光性能与材料中Eu3+的不同晶格位点相关。上述方法制备了具有发光性能的荧光粉用纳米磷灰石,并证实了材料的发光性能与稀土离子在磷灰石晶格中的位置有关。在发光性能与材料的内部结构相关的基础上,通过材料发光性能监测及成像技术对材料的位置、结构以及环境变化等进行监控。
因此,稀土掺杂的磷灰石发光材料有望解决现有支架材料难以进行有效的体外和体内试验的检测、诊断等问题。目前几乎没有将稀土离子掺杂磷灰石用于制备具有光标记特性的纳米磷灰石/生物高分子复合支架材料的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中难以进行有效的体外和体内试验的检测、诊断等问题,通过研发一种形貌和结晶程度可控、高度分散、生物相容性好的稀土离子掺杂的纳米磷灰石溶胶,提供一种将上述溶胶与胶原、壳聚糖等生物高分子基体复合得到具有光标记特性的纳米磷灰石/生物高分子复合支架材料的制备方法,通过下列技术方案实现。
一种荧光标记特性的纳米磷灰石/生物高分子复合支架的制备方法,其特征在于包括下列各步骤:
A.在质量浓度为0.01~10%的聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入含钙化合物,配成浓度为0.01~3mol/L的含钙化合物与聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液Ⅰ;
B.在质量浓度为0.01~10%的聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入磷酸盐或磷酸,配成浓度为0.006~1.8mol/L的磷酸盐或磷酸与聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液Ⅱ;
C.将步骤A和B所得混合溶液Ⅰ和混合溶液Ⅱ在搅拌速度为100~8000转/分下以超声处理进行混合,并用碱液控制pH值为10~12,形成纳米羟基磷灰石溶胶Ⅲ;此时纳米羟基磷灰石溶胶Ⅲ中钙磷摩尔比达1.6~1.7︰1;
D.在步骤C所得溶胶中,用浓度为0.5~1.5mol/L的盐酸调节pH值至6~7,再按稀土离子︰(稀土离子+钙离子)的摩尔比=0.5~10︰100,滴加浓度为0.005~0.1mol/L的稀土盐溶液;
E.将步骤D所得溶液在20~200℃下,经常规陈化24~48小时,再用去离子水洗涤,然后经离心处理,得到纳米磷灰石溶胶;
F.用质量浓度为2%的醋酸溶液加入生物高分子,配成生物高分子溶液;
G.按纳米磷灰石溶胶︰生物高分子溶液溶质的质量比为0.1~0.9︰1,将生物高分子溶液与步骤E所得的纳米磷灰石溶胶进行混合,得到纳米磷灰石与生物高分子的混合液Ⅳ;
H.将步骤G所得的混合液Ⅳ静置去除气泡,再注入模型,置于-5~-80℃下冷冻24~48小时,然后冷冻干燥24~48小时,即得到纳米磷灰石/生物高分子支架;
I.将纳米磷灰石/生物高分子支架用碱液或者缓冲溶液浸泡3~4小时,然后再用去离子水浸泡3~5小时,每半小时换一次水;
J.将步骤I所得纳米磷灰石/生物高分子支架置于-5~-80℃下冷冻24~48小时,再冷冻干燥24~48小时,即得到荧光标记特性的纳米磷灰石/生物高分子复合支架。
所述步骤A中聚乙烯吡咯烷酮的类型为K15、K30、K60或K90。
所述步骤A的含钙化合物为硝酸钙、氯化钙或氢氧化钙。
所述步骤B的磷酸盐为磷酸氢二铵、磷酸氢二钠或磷酸氢二钾。
所述步骤C的碱液为氨水、氢氧化钠或氢氧化钾溶液。
所述步骤D的稀土盐为硝酸铕、硝酸铽、硝酸铥、硝酸钇或硝酸镝。
所述步骤E的常规陈化是将溶液自然陈化或者置于高压釜陈化或蒸发回流装置中陈化。
所述步骤F的生物高分子为壳聚糖或胶原。
所述步骤F配成的生物高分子溶液,是壳聚糖溶液时质量浓度为1~4%,是胶原溶液时浓度为3~20mg/mL。
所述步骤I的碱液是氨水、氢氧化钠或氢氧化钾溶液;缓冲溶液是磷酸氢二钠或碳酸氢钠溶液。
本发明与现有技术相比,具有如下突出的优点:
(1)本发明制备的具有光标记特性的纳米磷灰石/生物高分子复合支架,是稀土离子掺杂的纳米磷灰石以溶胶状态与生物高分子溶液充分混合分散,注模成型的,使得磷灰石颗粒在生物高分子基体中分散良好且与基体之间能形成稳定的键合,并具有光学稳定性和良好发光性能的光标记特性。本发明弥补了现有技术中没有光标记特性的纳米磷灰石/生物高分子复合支架制备方法的空白,解决了现有支架材料难以进行有效的体外和体内试验的检测、诊断等问题,实现了通过材料发光性能监测及成像技术对材料的位置、结构变化以及环境变化等进行监控;
(2)本发明改进并优化了工艺,制备过程中磷灰石的形貌和结晶程度可控,进而实现发光性能的可控,具有光学稳定性和良好的发光性能,因此用途广泛,特别适用于生物医学材料及其临床的诊断和监测领域;
(3)本发明制备工艺简单,操作简捷,易于推广应用。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明作进一步地详细说明,但实施方式并不仅限于此。
实施例1
A.在质量浓度为0.01%的K15型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入氢氧化钙,配成浓度为0.01mol/L的氢氧化钙与聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液Ⅰ;
B.在质量浓度为0.01%的K15型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入磷酸,配成浓度为0.006mol/L的磷酸与聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液Ⅱ;
C.将步骤A和B所得混合溶液Ⅰ和混合溶液Ⅱ在搅拌速度为100转/分下以超声处理进行混合,并用氨水控制pH值为10,形成纳米羟基磷灰石溶胶Ⅲ;此时纳米羟基磷灰石溶胶Ⅲ中钙磷摩尔比达1.6︰1;
D.在步骤C所得溶胶中,用浓度为0.5mol/L的盐酸调节pH值至6,再按铕离子︰(铕离子+钙离子)的摩尔比=0.5︰100,滴加浓度为0.005mol/L的硝酸铕溶液;
E.将步骤D所得溶液在20℃下,经自然陈化24小时,再用去离子水洗涤,然后经离心处理,得到纳米磷灰石溶胶;
F.用质量浓度为2%的醋酸溶液加入壳聚糖,配成质量浓度为1%的壳聚糖溶液;
G.按纳米磷灰石溶胶︰壳聚糖溶液溶质的质量比为0.1︰1,将壳聚糖溶液与步骤E所得的纳米磷灰石溶胶进行混合,得到纳米磷灰石与壳聚糖的混合液Ⅳ;
H.将步骤G所得的混合液Ⅳ静置去除气泡,再注入模型,置于-5℃下冷冻24小时,然后冷冻干燥24小时,即得到纳米磷灰石/生物高分子支架;
I.将纳米磷灰石/生物高分子支架用质量百分比浓度为0.5%的氨水浸泡3小时,然后再用去离子水浸泡3小时,每半小时换一次水;
J.将步骤I所得纳米磷灰石/生物高分子支架置于-5℃下冷冻48小时,再冷冻干燥36小时,即得到荧光标记特性的纳米磷灰石/生物高分子复合支架。
实施例2
A.在质量浓度为0.5%的K30型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入硝酸钙,配成浓度为0.1mol/L的硝酸钙与聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液Ⅰ;
B.在质量浓度为0.5%的K30型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入磷酸氢二钠,配成浓度为0.06mol/L的磷酸氢二钠与聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液Ⅱ;
C.将步骤A和B所得混合溶液Ⅰ和混合溶液Ⅱ在搅拌速度为2000转/分下以超声处理进行混合,并用氢氧化钠控制pH值为11,形成纳米羟基磷灰石溶胶Ⅲ;此时纳米羟基磷灰石溶胶Ⅲ中钙磷摩尔比达1.65︰1;
D.在步骤C所得溶胶中,用浓度为0.8mol/L的盐酸调节pH值至6.2,再按铽离子︰(铽离子+钙离子)的摩尔比=1︰100,滴加浓度为0.01mol/L的硝酸铽溶液;
E.将步骤D所得溶液在80℃下,置于蒸发回流装置中陈化36小时,再用去离子水洗涤,然后经离心处理,得到纳米磷灰石溶胶;
F.用质量浓度为2%的醋酸溶液加入壳聚糖,配成质量浓度为2%的壳聚糖溶液;
G.按纳米磷灰石溶胶︰壳聚糖溶液溶质的质量比为0.5︰1,将壳聚糖溶液与步骤E所得的纳米磷灰石溶胶进行混合,得到纳米磷灰石与生物高分子的混合液Ⅳ;
H.将步骤G所得的混合液Ⅳ静置去除气泡,再注入模型,置于-20℃下冷冻24小时,然后冷冻干燥24小时,即得到纳米磷灰石/生物高分子支架;
I.将纳米磷灰石/生物高分子支架用浓度为0.05mol/L的磷酸氢二钠溶液浸泡3小时,然后再用去离子水浸泡5小时,每半小时换一次水;
J.将步骤I所得纳米磷灰石/生物高分子支架置于-20℃下冷冻24小时,再冷冻干燥36小时,即得到荧光标记特性的纳米磷灰石/生物高分子复合支架。
实施例3
A.在质量浓度为2%的K60型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入硝酸钙,配成浓度为0.5mol/L的硝酸钙与聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液Ⅰ;
B.在质量浓度为2%的K60型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入磷酸氢二钾,配成浓度为0.03mol/L的磷酸氢二钾与聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液Ⅱ;
C.将步骤A和B所得混合溶液Ⅰ和混合溶液Ⅱ在搅拌速度为5000转/分下以超声处理进行混合,并用氢氧化钾溶液控制pH值为11.5,形成纳米羟基磷灰石溶胶Ⅲ;此时纳米羟基磷灰石溶胶Ⅲ中钙磷摩尔比达1.67︰1;
D.在步骤C所得溶胶中,用浓度为1mol/L的盐酸调节pH值至6.5,再按铥离子︰(铥离子+钙离子)的摩尔比=3︰100,滴加浓度为0.05mol/L的硝酸铥溶液;
E.将步骤D所得溶液在100℃下,置于高压釜陈化中陈化48小时,再用去离子水洗涤,然后经离心处理,得到纳米磷灰石溶胶;
F.用质量浓度为2%的醋酸溶液加入壳聚糖,配成质量浓度为4%的壳聚糖溶液;
G.按纳米磷灰石溶胶︰壳聚糖溶液溶质的质量比为0.9︰1,将壳聚糖溶液与步骤E所得的纳米磷灰石溶胶进行混合,得到纳米磷灰石与壳聚糖的混合液Ⅳ;
H.将步骤G所得的混合液Ⅳ静置去除气泡,再注入模型,置于-40℃下冷冻36时,然后冷冻干燥24小时,即得到纳米磷灰石/生物高分子支架;
I.将纳米磷灰石/生物高分子支架用浓度为1mol/L碳酸氢钠溶液浸泡4小时,然后再用去离子水浸泡3小时,每半小时换一次水;
J.将步骤I所得纳米磷灰石/生物高分子支架置于-40℃下冷冻36小时,再冷冻干燥48小时,即得到荧光标记特性的纳米磷灰石/生物高分子复合支架。
实施例4
A.在质量浓度为5%的K90型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入氯化钙,配成浓度为1mol/L的氯化钙与聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液Ⅰ;
B.在质量浓度为5%的K90型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入磷酸氢二铵,配成浓度为0.6mol/L的磷酸氢二铵与聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液Ⅱ;
C.将步骤A和B所得混合溶液Ⅰ和混合溶液Ⅱ在搅拌速度为5000转/分下以超声处理进行混合,并用氢氧化钾溶液控制pH值为11.5?,形成纳米羟基磷灰石溶胶Ⅲ;此时纳米羟基磷灰石溶胶Ⅲ中钙磷摩尔比达1.67︰1;
D.在步骤C所得溶胶中,用浓度为1mol/L的盐酸调节pH值至6.8,再按钇离子︰(钇离子+钙离子)的摩尔比=5︰100,滴加浓度为0.1mol/L的硝酸钇溶液;
E.将步骤D所得溶液在150℃下,自然陈化48小时,再用去离子水洗涤,然后经离心处理,得到纳米磷灰石溶胶;
F.用质量浓度为2%的醋酸溶液加入胶原,配成浓度为3mg/mL的胶原溶液;
G.按纳米磷灰石溶胶︰胶原溶液溶质的质量比为0.1︰1,将胶原溶液与步骤E所得的纳米磷灰石溶胶进行混合,得到纳米磷灰石与胶原的混合液Ⅳ;
H.将步骤G所得的混合液Ⅳ静置去除气泡,再注入模型,置于-20℃下冷冻36小时,然后冷冻干燥36小时,即得到纳米磷灰石/生物高分子支架;
I.将纳米磷灰石/生物高分子支架用氢氧化钠溶液浸泡3小时,然后再用去离子水浸泡3小时,每半小时换一次水;
J.将步骤I所得纳米磷灰石/生物高分子支架置于-20℃下冷冻24小时,再冷冻干燥48小时,即得到荧光标记特性的纳米磷灰石/生物高分子复合支架。
实施例5
A.在质量浓度为10%的K90型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入氯化钙,配成浓度为3mol/L的氯化钙与聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液Ⅰ;
B.在质量浓度为10%的K90型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入磷酸氢二钾,配成浓度为1.8mol/L的磷酸氢二钾与聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液Ⅱ;
C.将步骤A和B所得混合溶液Ⅰ和混合溶液Ⅱ在搅拌速度为8000转/分下以超声处理进行混合,并用氢氧化钠控制pH值为12,形成纳米羟基磷灰石溶胶Ⅲ;此时纳米羟基磷灰石溶胶Ⅲ中钙磷摩尔比达1.7︰1;
D.在步骤C所得溶胶中,用浓度为1.5mol/L的盐酸调节pH值至7,再按镝离子︰(镝离子+钙离子)的摩尔比=10︰100,滴加浓度为0.1mol/L的硝酸镝溶液;
E.将步骤D所得溶液在200℃下,自然陈化48小时,再用去离子水洗涤,然后经离心处理,得到纳米磷灰石溶胶;
F.用质量浓度为2%的醋酸溶液加入胶原,配成浓度为20mg/mL为胶原溶液;
G.按纳米磷灰石溶胶︰生物高分子溶液溶质的质量比为0.9︰1,将生物高分子溶液与步骤E所得的纳米磷灰石溶胶进行混合,得到纳米磷灰石与生物高分子的混合液Ⅳ;
H.将步骤G所得的混合液Ⅳ静置去除气泡,再注入模型,置于-80℃下冷冻48小时,然后冷冻干燥48小时,即得到纳米磷灰石/生物高分子支架;
I.将纳米磷灰石/生物高分子支架用氢氧化钾溶液浸泡3小时,然后再用去离子水浸泡3小时,每半小时换一次水;
J.将步骤I所得纳米磷灰石/生物高分子支架置于-80℃下冷冻24小时,再冷冻干燥24小时,即得到荧光标记特性的纳米磷灰石/生物高分子复合支架。
Claims (10)
1.一种荧光标记特性的纳米磷灰石/生物高分子复合支架的制备方法,其特征在于包括下列各步骤:
A.在质量浓度为0.01~10%的聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入含钙化合物,配成浓度为0.01~3mol/L的含钙化合物与聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液Ⅰ;
B.在质量浓度为0.01~10%的聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入磷酸盐或磷酸,配成浓度为0.006~1.8mol/L的磷酸盐或磷酸与聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液Ⅱ;
C.将步骤A和B所得混合溶液Ⅰ和混合溶液Ⅱ在搅拌速度为100~8000转/分下以超声处理进行混合,并用碱液控制pH值为10~12,形成纳米羟基磷灰石溶胶Ⅲ;
D.在步骤C所得溶胶中,用浓度为0.5~1.5mol/L的盐酸调节pH值至6~7,再按稀土离子︰(稀土离子+钙离子)的摩尔比=0.5~10︰100,滴加浓度为0.005~0.1mol/L的稀土盐溶液;
E.将步骤D所得溶液在20~200℃下,经常规陈化24~48小时,再用去离子水洗涤,然后经离心处理,得到纳米磷灰石溶胶;
F.用质量浓度为2%的醋酸溶液加入生物高分子,配成生物高分子溶液;
G.按纳米磷灰石溶胶︰生物高分子溶液溶质的质量比为0.1~0.9︰1,将生物高分子溶液与步骤E所得的纳米磷灰石溶胶进行混合,得到纳米磷灰石与生物高分子的混合液Ⅳ;
H.将步骤G所得的混合液Ⅳ静置去除气泡,再注入模型,置于-5~-80℃下冷冻24~48小时,然后冷冻干燥24~48小时,即得到纳米磷灰石/生物高分子支架;
I.将纳米磷灰石/生物高分子支架用碱液或者缓冲溶液浸泡3~4小时,然后再用去离子水浸泡3~5小时,每半小时换一次水;
J.将步骤I所得纳米磷灰石/生物高分子支架置于-5~-80℃下冷冻24~48小时,再冷冻干燥24~48小时,即得到荧光标记特性的纳米磷灰石/生物高分子复合支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤A中聚乙烯吡咯烷酮的类型为K15、K30、K60或K90。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤A的含钙化合物为硝酸钙、氯化钙或氢氧化钙。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤B的磷酸盐为磷酸氢二铵、磷酸氢二钠或磷酸氢二钾。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤C的碱液为氨水、氢氧化钠或氢氧化钾溶液。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤D的稀土盐为硝酸铕、硝酸铽、硝酸铥、硝酸钇或硝酸镝。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤E的常规陈化是将溶液自然陈化或者置于高压釜陈化或蒸发回流装置中陈化。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤F的生物高分子为壳聚糖或胶原。
9.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤F配成的生物高分子溶液,是壳聚糖溶液时质量浓度为1~4%,是胶原溶液时浓度为3~20mg/mL。
10.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤I的碱液是氨水、氢氧化钠或氢氧化钾溶液;缓冲溶液是磷酸氢二钠或碳酸氢钠溶液。
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